实验五. 葡聚糖凝胶层析
【实验目的】
1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。
2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
【实验原理】
凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。
葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。可分离的分子量范围从几百到几十万不等。
葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。
本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝。蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106，而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。
【实验材料】
1.实验器材
层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶(带下口的三角瓶，250m1)；试管及试管架；量筒10m1；721型分光光度计
2.实验试剂
(1) Tris—醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900m l，用浓醋酸调pH至7.0，加蒸馏水至1000m1。
(2) 溴酚蓝溶液：称取溴酚蓝10毫克，溶于5毫升乙醇中，充分搅拌使其溶解，然后逐滴加入Tris—醋酸缓冲液(pH7.0)至溶液呈深蓝色。
(3) 蓝色葡聚糖—2000溶液：称取蓝色葡聚糖—200010毫克，溶于2毫升Tris—醋酸缓冲液(pH7.0)中即成。
(4) 样品溶液：取溴酚蓝溶液0.1毫升，蓝色葡聚糖—2000溶液0.5毫升混匀后为上柱样品溶液。
(5)葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex-G-25)
【实验操作】
1.实验凝胶的制备：商品凝胶是干燥的颗粒，使用时需经溶胀处理，称取4克葡聚糖凝胶G—25，加50毫升蒸馏水，搅拌均匀，在室温溶胀6小时，或沸水浴溶胀2小时，一般采用后一种方法。再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，用蒸馏水反复洗涤几次，再以缓冲溶液(pH7.0的Tris—醋酸溶液)洗涤2—3次，使pH和离子强度达到平衡，最后抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡，凝胶可保存在缓冲液内。
2.装柱：将层析柱洗净，垂直固定在铁支架上，选择有薄膜端作为层析柱下口，将下口
接上乳胶管并用螺旋夹夹紧。层析柱中加入洗脱液，打开下口螺旋夹，让溶液流出，排除残留气泡，最后保留约2厘米高度的洗脱液，拧紧螺旋夹。将凝胶轻轻搅动均匀，用玻璃棒沿层析柱内壁缓缓注入柱中，待凝胶沉积到柱床下已超过l厘米时，打开下口螺旋夹，继续装柱至柱床高度达到8厘米,关闭出口。装柱过程中严禁产生气泡，尽可能一次装完，避免出现分层。再用洗脱液平衡l至2个柱床体积，凝胶面上始终保持有一定的洗脱液。平衡后，拧紧下端螺旋夹。
3.加样品：打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出，直至床面与液面刚好平齐为止，关闭下端出口。取溴酚蓝及蓝色葡聚糖—2000混合液0.3毫升，小心地加于凝胶表面上，切勿搅动层析柱床表面。打开下端出口，使样品溶液进入凝胶内，并开始收集流出液。当样品溶液恰好流至与凝胶表面平齐时，关闭下端出口。用少量洗脱液清洗层析柱加样区，共洗涤三次，每次清洗液应完全进入凝胶柱内后，再进行下一次洗涤。最后在凝胶表面上加入洗脱液，保持高度为3—4cm。
4.洗脱与收集：连接好凝胶柱层析系统，调节洗脱液流速为每分钟1毫升，进行洗脱。仔细观察样品在层析柱内的分离现象，收集洗脱液，每收集3毫升即换一支收集管(试管预先编号)，收集约20管左右，样品即可完全被洗脱下来。将各收集管中的洗脱液分别用721型分光光度计在波长540nm处测定其光密度。
5.凝胶回收处理方法：将样品完全洗脱下来后，继续用三倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶后，将柱下口放在小烧杯中，慢慢打开，再将上口慢慢松开，使凝胶全部回收至小烧杯中，备用。
【实验结果】
以洗脱管号为横坐标，以光密度为纵坐标作图即得洗脱曲线。分析曲线图并讨论实验结果。
【思考题】
1.葡聚糖凝胶层析为何能分离不同的样品？
2.葡聚糖凝胶层析操作时应注意哪些问题？
Experiment 5. Sephadex Gel Chromatography
【Purpose】
1. Study the characterization of Sephadex gel and main principle of gel chromatography
2. Master the basic operational techniques of gel chromatography.
【Principle】
Gel filtration (also called molecular exclusive chromatography or gel sieve) is a kind of chromatography technique based on the difference of molecular weight and is one of the effective and mild methods extensively used to isolate and analyze the biomacromocular substances. The solid phase vector of this chromatography is gel particle, which has the effect of molecular sieve; at present the most widely used gel has various apertures, such as dextran gel (trade name: Sephadex), and agarose gel (tradename: Sepharose).
Sephadex gel is a kind of macromolecular compound composed of dextran of some molecular weigh dextrose - glycoside and chloroacetone and it has multiple reticulation structure. The gel of different "mesh" can be acquired by controlling the ratio of chloroacetone and dextran in cross- linking agent, and by controlling the condition of cross - link reaction to control the cross - linked degree. The higher the cross-link degree, the tighter the mesh structure, and vise versa. Mesh size determines the molecular range at which the isolated material could enter into the internal gel freely. By this means, the molecular weigh of the isolated material could range from several hundred to several hundred thousand.
Sephadex gel chromatography is based on the principle that when the substances being isolated flow through the chromatography column, each component shifts at different rate because of the different molecular weight and the difference of obstruction in solid phase. The material molecular is larger than what can permissively enter into the gel mesh will be excluded completely; so it can not enter into the interior of gel particle, and the effect of exclusion is low; its course is short and shift rate is rapid, so it first flows out of the chromatography column with the solvent flowing between gel particles. On the contrary, the material of smaller molecular weigh penetrate into gel particle completely, so its effect of exclusion is high, its course is long and shift rate is slow, and as a result it flows out of the column later. If the molecular of the material is between that of completely excluded and that of completely penetrated, the material will flow out of the column between them. So we can isolate materials by this means.
In this experiment, we use Sephadex G-25 as phase vector to separate Blue Sephadex-2000 and bromophenol blue. The molecular weight of blue sephadex-2000 is approximately 2×106, while the molecular weight of bromophenol is about 670. Because of the obvious molecular difference, the former can be excluded completely and the latter can enter into the gel particle, so they can be separated by different elution time.
【Materials】
1. Apparatus
Chromatography column (1×20cm) with latex tubing and clips, A beaker of 100ml, Test tubes and test tube shelf, Measuring cylinder 10ml, 721 type spectrophotometer
2. Reagents
(1) Tris-Acetate buffer ( pH7.0)
Take 0.01mol/L Tris solution (contains 0.1mol/L KCl) 900ml, adjust pH value to 7.0 by acetate, then add distilled water to 1000ml.
(2)Bromophenol solution
Weigh 10mg bromophenol, dissolved in 5ml ethanol, stir to make it effectively solve, then add Tris-acetate buffer(pH7.0) gradually till the solution becomes dark blue.
(3)Blue sephadex-2000 solution:
Take blue sephadex-2000 10mg, dissolved in 2ml Tris-acetate buffer (pH7.0).
(4)Sample: Take the mixture of 0.1ml bromophenol and 0.5ml Blue sephadex-2000
(5)Sephadex G-25
【Procedures】
1. Gel preparation
The gel we buy is dry particles, so before using it, expand it. In this experiment, add 4g Sephadex G-25 to 50ml distilled water, stir, expand 6 hours at room temperature, or 2 hours in boiling, commonly we choose boiling. Remove the upper water and small particles with pour method, wash gel with distilled water several times, then wash it with tris-acetate buffer (pH7.0) several times to make the pH and ion concentration reach balance. Finally remove bubble in the gel and also solution, and then the gel can be preserved in the buffer.
2. Stuffing
Fix a clean chromatography column on the iron bracket vertically, choose the membrane end as the bottom part, add latex tube and clip it. Add eluent, open the exit to let the solution flow out, remove the bubbles, and then fix the clip when there is eluent about 2 cm higher than the gel surface. Stir the gel gently, add it with glassy stick along the inner wall of column, open the exit when the height of the gel deposited in the bottom of the column reaches 1cm, continue stuffing till the column bed reaches 10cm, shut off the exit. It should be ensured that there is no bubble or layers of the column bed in the process, or again. After filling, wash the column bed with eluent (about 1 to 2 column volume) and keep steady eluent on the surface of gel. After balancing it, shut off the exit.
3. Loading sample
Open the exit to make the eluent flow out till the bed surface meets the liquid surface, shut off the exit. Load 0.3ml sample, the mixture of bromophenol and blue sephadex-2000, carefully on the gel surface, do not stir the column bed surface. Open the exit to let the sample enter into the gel and begin to collect the eluent. When the sample solution flows to the surface of gel, shut off the exit. Wash the sampling region with little eluent three times and on each time, make sure the washing eluent flow completely into the gel. Finally ass eluent on the gel surface and keep the height of eluent 3-4cm higher than the gel surface.
4. Elution and Collection
Adjust the speeding of eluent to about 1ml/min. Observe the seperation process of the sample in the chromatography column, collect the eluent about 3ml per test tube, and number those test tubes. After collecting about 20 test tubes of eluent, the sample can be totally washed out. Inspect the absorbance with 721 type spectrophotometer under the wavelength 540nm of those eluent in each test tube.
5. Regeneration gel
After washing out the sample, wash the gel with the eluent about 3 times of column volume.
Put a glass beaker on the exit end, open bottom end and upper end slowly and respectively, then the gel flows into the beaker and can be used again.
【Results】
The number of test tube is x-axis, and the absorbance is y-axis. Draw the elution curve. Analysis the curve and discuss the experiment result.
【Questions】
1. What is the principle of separating components in mixture with Sephadex Gel Chromatography?
2. What are the attentions in Sephadex Gel Chromatography?
蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用 引言 蛋白FITC标记以及葡聚糖凝胶柱是生物科学研究中常用的实验技术。蛋白FITC标记可以通过将荧光染料FITC（荧光同种异构体）与蛋白质结合，实现对蛋白质的追踪、定位以及分析等应用，并广泛应用于分子生物学、细胞生物学、免疫学等领域。葡聚糖凝胶柱则是一种常见的柱层析技术，可用于分离和纯化蛋白质、核酸以及其他生物大分子。下面将详细介 绍蛋白FITC标记的步骤以及葡聚糖凝胶柱的使用。 一、蛋白FITC标记步骤 1.准备荧光染料FITC溶液：称取一定量的FITC粉末，加入适量的溶 剂（如溶于碳酸氢钠缓冲液），使其溶解成一定浓度的FITC溶液。 2.准备蛋白质样品：选取需要标记的蛋白质样品，可以是纯化的蛋白 质或者生物标志物。 3.标记蛋白质和FITC：将一定比例的FITC溶液与蛋白质样品混合， 通常在暗处、低温水浴条件下反应一定时间（如1-2小时）。注意控制反 应温度和时间，不同的蛋白质可能需要不同的条件。 4.清除未反应的FITC：使用一种合适的方法（如柱层析、超滤等） 将未反应的FITC分离出来。 5.测定标记效率：通过分光光度法测定FITC标记蛋白质的浓度和 FITC的浓度，计算标记效率。
1.制备葡聚糖凝胶柱：按照柱层析的要求，准备合适大小的玻璃柱子，并将葡聚糖填充于柱子内。葡聚糖填充量可根据样品的分离要求进行调整，通常在0.5-1.5倍柱子体积的范围内。 2.提前平衡柱子：将平衡缓冲液（可根据实验需求选择）加入柱子中，持续流通一定时间，达到柱子内外平衡。 3.样品加载：将待分离的样品溶液均匀地加入柱子上部，并加入一定 量的平衡缓冲液，形成样品层。 4.柱洗脱：将平衡缓冲液加入柱子顶部，形成洗脱缓冲液流动，逐步 冲洗样品。 5.收集分离后的样品：分离后的目标物质将会以不同时间点流出柱子，可以根据需要采集不同时间段的洗脱液。 6.分析和应用：通过分析采集的洗脱液，可以进一步对目标物质进行 定性和定量的分析。 结论 蛋白FITC标记和葡聚糖凝胶柱使用是一些常见的生物分子实验技术。蛋白FITC标记可以实现对蛋白质的定位、追踪和分析，而葡聚糖凝胶柱 则可以用于分离和纯化生物大分子。这两种方法在生命科学研究中具有广 泛的应用价值。通过掌握和运用这些技术，可以为生物科学研究提供强大 的支持和帮助。
蛋白FITC 标记及葡聚糖凝胶柱使用 荧光素FITC 标记抗体 纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。当FITC 在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r 氨基与荧光素的硫碳胺键 (thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG 分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG 分子可结合2～8个分子的FITC ，其反应式如下: FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质 → FITC -NS-C-N-H2-蛋白质 FITC 是在荧光素的基础上通过化学反应增加硫氰酸基团得到的，硫氰酸基团可以 荧光标记 步骤： (1)试剂和材料 ①0．01mol ／L(pH7．2)PBS 配法中，校定pH 至7．2。NaCI18g 、Na2HP04 1．15g ，溶于2000ml 蒸馏水 ②0．1mol ／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液配法 取0．5mol ／LNa 2CO 3(5．3％)10ml 加入0．5mol ／LNaHC03(4．2％)90ml ，混合后，校定pH 至9．0。 ③3％碳酸钠水溶液配法 称5g 无水碳酸钠充分溶解于50ml 灭菌蒸馏水中即成。 ④其他试剂和材料 l ％叠氮化钠、离心机及离心管、烧杯(25m1)、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500m1)透析袋等。 (2)方法及步骤 ①取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水(0．15mol ／LNaCl)及缓冲液(0．5mol ／LNaHC03—Na 2C03，pH9．0)稀释使每毫升内含蛋白质1-5mg ，缓冲液为总量的10％，降温至4℃。 ②加入异硫氰酸盐(FITC)荧光素[蛋白：荧光素＝(50—80)mg‘lmg]，在0～4℃下电磁搅拌12～14h 。 ③然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵(用Nessler 试剂测验，至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。 ④将制备好的荧光抗体加叠氮化钠0.01％，分装在lml 安瓿中，或冻干，保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上，-20℃保存可达 2年以上。
1.凝胶的预处理 交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5～10倍的去离子水中，参照相关资料中凝胶溶胀所需时间，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。在许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。 2.装柱 层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去除盐及游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。 凝胶柱的装填方法和要求，基本上与离子交换柱的制备相同。一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后，将带色的兰葡聚糖–2000、细胞色素，或血红蛋白等物质配制成质量浓度为2g/L的溶液过柱，观察色带是否均匀下移，以鉴定新装柱的技术质量是否合格，否则，必须重新装填。 3.加样与洗脱 （1）加样量：加样量与测定方法和层析柱大小有关。如果检测方法灵敏度高或柱床体积小，加样量可小；否则，加样量增大。例如利用凝胶层析分离蛋白质时，若采用28Onm波长测定吸光度，对一根2cm×6Ocm的柱来说，加样量需5mg左右。一般来说，加样量越少或加样体积越小(样品浓度高)，分辨率越高。通常样品液的加入量应掌握在凝胶床总体积的5％～10％。样品体积过大，分离效果不好。 对高分辨率的分子筛层析，样品溶液的体积主要由内水体积(Vi)所决定，故高吸水量凝胶如Sephadex G-200，每mL总床体积可加0.3～0.5mg溶质，使用体积约为0.O2倍总体积；而低吸水量凝胶如Sephadex G–75，每mL总床体积加溶质质量为0.2mg，样品体积为0.Ol倍总体积。 （2）加样方法：如同离子交换柱层析一样，凝胶床经平衡后，吸去上层液体，待平衡液下降至床表面时，关闭流出口，用滴管加入样品液，打开流出口，使样品液缓慢渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面持平时，小心加入数mL洗脱液冲洗管壁。然后继续用大量洗脱液洗脱。 （3）洗脱：加完样品后，将层析床与洗脱液储瓶、检测仪、分部收集器及记录仪相连，根据被分离物质的性质，预先估计好一个适宜的流速，定量地分部收集流出液，每组分一至数mL。各组分可用适当的方法进行定性或定量分析。 凝胶柱层析一般都以单一缓冲溶液或盐溶液作为洗脱液，有时甚至可用蒸馏水。洗脱时
葡聚糖凝胶柱的使用方法： (1) 预处理 称取Sephadex G-25（50－100目）约5g ，加入蒸馏水100ml ，置室温下3h 进行溶胀。 (2) 装柱 凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。同时大开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h 即可加样品分离。 (3) 加样 加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。然后，由柱的上端加水解液2ml ，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。 (4) 洗脱与收集 洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min 。洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml ，共收集10管。据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm ，找出浓度最大的管号。 (5) 凝胶的再生和回收 凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。若使用数次，就需要再生处理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。 实验五. 葡聚糖凝胶层析 【实验目的】 1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。 2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。 【实验原理】 凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex ）和琼脂糖凝胶（Sepharose ）。 葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。可分离的分子量范围从几百到几十万不等。 葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱， 各个组分由于分子量不相同，
凝胶层析实验报告 一.实验目的:将血红蛋白与鱼精蛋白混合物进行分离 二.实验原理: 凝胶是一种具有多孔,网状结构的分子筛. 分子量不同通过凝胶柱的速度也不同,利用这种凝胶分子筛对大小不同的分子进行层析分离. 当样品溶液通过凝胶柱时,相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙,随着溶剂流动,因此流程较短,向前移动速度快而首先流出层析柱; 反之,相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔,可自由地进出凝胶颗粒的网孔,在向下移动过程中,它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒,如此不断地进入与逸出,使流量增长,移动速率慢而最后流出层析柱.从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱. 这样,经过层析柱,使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离. 三.主要仪器和试剂: 铁架台层析柱胶管交联葡聚糖凝胶G-50 血红蛋白鱼精蛋白混合物(aq) 四.操作步骤: 1 连接装置:将层析柱固定在铁架台上,保持与水平面垂直,底部与胶管连接.胶管下端置于烧杯中. 2 装柱:将尼龙网放入层析柱底部, 使其水平固定;夹住胶管向柱中注水,松手放水,使水流到剩一厘米,让气泡流出,夹住胶管. 3 灌胶:将凝胶搅拌均匀,用玻璃棒引流将凝胶溶液一次性倒入层析柱约20ml;夹住胶管片刻,然后打开夹子,让凝胶沉淀约20分钟(凝胶与水分层),当水流至离凝胶约5mm处时,夹住胶管.用玻璃棒取滤纸一片伸入层析柱,放置于凝胶表面之上水面之下,打开夹子,当露出滤纸,关闭夹子. 4 加样:用胶头滴管取血红蛋白’鱼精蛋白混合液,滴入层析柱,约两滴. 5 洗脱:当待分离混合液渗入滤纸后,加少量水,开夹放水,(水面始终位于滤纸之上),反复两三次;关闭止水夹到入大量水,再开夹.等待分离 6 回收:将洗净的凝胶回收以便再次利用 五.实验现象: 观察看到红色的液体先被分离,流至烧杯中;黄色液体流速很慢,最终流入烧杯.
实验五. 葡聚糖凝胶层析 【实验目的】 1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。 2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。 【实验原理】 凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。 葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。可分离的分子量范围从几百到几十万不等。 葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。 本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝。蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106，而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。 【实验材料】 1.实验器材 层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶(带下口的三角瓶，250m1)；试管及试管架；量筒10m1；721型分光光度计 2.实验试剂 (1) Tris—醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900m l，用浓醋酸调pH至7.0，加蒸馏水至1000m1。 (2) 溴酚蓝溶液：称取溴酚蓝10毫克，溶于5毫升乙醇中，充分搅拌使其溶解，然后逐滴加入Tris—醋酸缓冲液(pH7.0)至溶液呈深蓝色。 (3) 蓝色葡聚糖—2000溶液：称取蓝色葡聚糖—200010毫克，溶于2毫升Tris—醋酸缓冲液(pH7.0)中即成。 (4) 样品溶液：取溴酚蓝溶液0.1毫升，蓝色葡聚糖—2000溶液0.5毫升混匀后为上柱样品溶液。 (5)葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex-G-25) 【实验操作】 1.实验凝胶的制备：商品凝胶是干燥的颗粒，使用时需经溶胀处理，称取4克葡聚糖凝胶G—25，加50毫升蒸馏水，搅拌均匀，在室温溶胀6小时，或沸水浴溶胀2小时，一般采用后一种方法。再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，用蒸馏水反复洗涤几次，再以缓冲溶液(pH7.0的Tris—醋酸溶液)洗涤2—3次，使pH和离子强度达到平衡，最后抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡，凝胶可保存在缓冲液内。 2.装柱：将层析柱洗净，垂直固定在铁支架上，选择有薄膜端作为层析柱下口，将下口
葡聚糖凝胶色谱原理 《葡聚糖凝胶色谱原理》 葡聚糖凝胶色谱原理是一种常用的生物分离和分析技术，它通过用葡聚糖凝胶作为固定相，根据物质在凝胶中的分子尺寸大小的差异实现对样品的分离。葡聚糖凝胶色谱原理在生命科学、药物研发以及食品与环境监测等领域中具有广泛的应用。 葡聚糖是一种天然多糖，它的分子结构呈现网状结构，具有丰富的孔径和分子量选择性。葡聚糖凝胶主要通过孔径选择性来分离分子。孔径较大的凝胶可以分离大分子量的物质，而孔径较小的凝胶则可以分离小分子量的物质。这使得葡聚糖凝胶色谱成为一种有效的生物分离技术，可用于分离和纯化多糖、蛋白质、核酸等生物大分子。 在葡聚糖凝胶色谱中，样品溶液被注入到一个装有葡聚糖凝胶的柱子中。样品中的分子通过在凝胶中扩散和滞留的过程中与凝胶表面发生相互作用，从而实现它们之间的分离。当样品被注入柱中后，大分子将被凝胶阻挡在柱底部，而小分子将通过凝胶较快地沿柱向上运动。这样就实现了分子之间的分离。 葡聚糖凝胶色谱还可以通过改变凝胶的浓度和孔径大小来调节分离的选择性。较浓的凝胶可以提供较强的凝胶网点作用，从而提高分离的效果。而较大孔径的凝胶则可以增加分子在凝胶中扩散的速度，从而加快分离的速度。 葡聚糖凝胶色谱原理具有操作简便、分离效果好、分析速度快等优点。它在实验室中被广泛应用于生物大分子的纯化、结构分析和活性检测等方面。此外，它还可用于药物研发中的分子筛选和纯化，以及食品与环境监测中的残留物检测和分离等方面。 总之，《葡聚糖凝胶色谱原理》是一种有效、高效的生物分离技术，它基于葡聚糖凝胶作为固定相，利用分子尺寸差异实现对样品的准确分离。在生命科学、药物研发以及食品与环境监测等领域中，它发挥着重要的作用，并为科学研究和应用提供了可靠的分析手段。
竭诚为您提供优质文档/双击可除凝胶层析分离混合蛋白实验报告 篇一：凝胶过滤法分离蛋白质实验报告 凝胶过滤法分离蛋白质 一、实验目的 了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。 二、实验原理 凝胶过滤其基本原理是利用被分离的分子大小不同及 固定相（凝胶）具有分子筛的特点：本实验使用交联葡聚凝胶，其具有一定孔径的网络结构。高亲水，在水溶液里吸水可膨胀。当其填充完成后，加入混合分子大小不同的分离液。由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路短，最先流出；而涌入胶粒内部的小分子物质，受迷宫效应的影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出，通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。从而按
大到小的顺序流出实现分离的目的。 三、试剂与仪器 0.1mol/L磷酸缓冲液（ph7.0），0.4%K3Fe(cn)6,交联葡聚凝胶，鸡的抗凝全血 1.5*20cm的层析柱，试管，量筒，大烧杯，玻璃棒 四、实验步骤 1.凝胶溶胀 2.装柱：从层析柱加入缓冲液，打开出口，将气泡赶走，关闭下端开口，然后加入约6cm的缓冲液，灌注凝胶，打开下端开口。使其自然沉降高度约17cm，并使其床面覆盖缓冲液，关闭出口盖上小形圆形滤纸。待凝胶形成后，再用缓冲液洗脱2~3次。 3.样品处理 4.上样和过滤：吸取约0.5ml混合液，在距离床面1mm 处沿管内壁轻轻加入样品。打开出口，让样品溶液慢慢浸入凝胶内。凝胶柱面加上一层磷酸盐缓冲液，并用1~2倍体积的此缓冲洗脱。 5.部分收集：控制速度为0.5ml/min左右，用试管收集洗脱液。并观察柱上的色带，待黄色 篇二：生物化学实验报告：蛋白质分子量的测定——凝胶层析法 实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法
凝胶层析 凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。 葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。可分离的分子量范围从几百到几十万不等。 葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。 制备： Sephadex G200是分子筛填料（sephadex G-200葡聚糖凝胶G-200 分离范围5000-600000 适用于蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定），上柱时只要恒定的流速，不用洗脱的，根据多糖的大小，出峰顺序不一样的，减少上样量、降低流速、增加高径比都能提高分辨率（如果从制备的角度，还要综合考虑分辨率和制备能力capacity ，必要时候需要牺牲一定的分辨率，在过载条件下操作。例如，流速就不是越低越好。） 在制备时，确实应该综合考虑resolution和capacity，如果两者不能很好协调的时候，应该牺牲的是capacity，而不是resolution。 分子筛一般主要是两大用途：除盐和分离，对于前者要求不是很严，sephadex G25 G50 都是专门用来除盐的，载量最高可以达到柱体积的20%，而且对于流速等条件的要求都不高。 分子筛层析如果用来分离不同大小的蛋白或多糖一般是用在后面的精纯化阶段。 平常纯化的时候不到万不得已是不会用到分子筛的，因为它的上样量很小，而且做一次需要的时间也很长，与离子交换、疏水或反向等比起来太费时费力，这时用分子筛来分离首先考虑的就是它的分辨率。当然在保证分辨率的情况下通过增加流速、增加上样量等方法来提高capacity是最好的。如果上述条件的改变影响了resolution和recovery，最好是在保证resolution和recovery的情况下少量多次进行层析分离。 离子交换色谱洗脱主要是两种方式，第一种是增加缓冲中的盐离子浓度，这些离子会和蛋白竞争性的与配基吸附，随着离子强度的增大，洗脱离子依靠数量上的优势优先与配基结合，从而使不同离子特性的蛋白洗脱；第二种方式是通过改变pH的方法改变蛋白自身的带电特性，这时由于蛋白自身带电性质的改变，不用盐离子竞争性吸附，它自身就会从配基上解离。一般离子交换洗脱的时候优先考虑用增加离子强度的方法进行洗脱，因为通过改变pH 的方法使蛋白解离一般会经过蛋白的pI，这时蛋白溶解度降低会降低，会存在沉积到填料上的危险（使用极高或极低的pH应能把蛋白洗脱下来，但同样涉及到蛋白在该pH的稳定性问题）。用增加离子强度的方法进行洗脱有时会使疏水性特别强的蛋白出现盐析，从而沉淀在填料上。这时一味增加盐离子强度无法使蛋白洗脱的，此时只能把盐离子强度降低，用改变pH的方式进行洗脱。 用g200填料分离纯化多糖不用恒流泵的话极慢，并且用恒流泵的话，g200的填料就会漏，在柱下面加了两层膜还有少许的填料漏出。是因为sephadex系列的填料刚性不好，g75以上的填料早就停止生产了，G后面的数字越大、刚性越差。是填料本身性质带来的，漏出来的是破碎的填料。这时难有分离效果的。建议更换填料，如sephacryl S 200或S300之类的刚性要好的多。 一般如果分离的多糖跟填料没有吸附作用的话用水洗托就可以了，如果有吸附可以用0.15的NaCl洗托。用盐还是水来洗脱，主要取决于多糖是否带电荷等情况。假设多糖是中性的，盐的存在与多少对于洗脱影响不大；但是，如果是酸性糖，则可能与基质的非体积排阻效应（主要是电荷相互作用）较大，需要用适当高些的盐溶液来完成。
实验五凝胶层析法脱盐和分离蛋白质实验五凝胶层析法脱盐和分离蛋白质 实验类型:验证型 目的和要求 掌握凝胶层析法的原理及操作。 原理 凡盐析所获得的粗制蛋白质(盐析得到的IgG)中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”(desalthing)。脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长， 且盐不易除尽;凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝 胶过滤后样品体积较大。所以，要根据具体情况选择使用。凝胶达 滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。 凝胶过滤(gel filtration)，又称为凝胶层析(gel chromatography)、分子筛过滤(molecular sieve filtration)、凝胶 渗透层析(gel osmotic chromatography)等。它是20世纪60年代 发展起来的一种层析技术。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相(凝胶)具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。 凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小
于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢;大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱;小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分开。 用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖(商品名为Sephadex)、琼脂糖(商品名为Sepharose)、聚丙烯酰胺凝胶(商品名为Bio–gel)及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物。 下面主要介绍葡聚糖凝胶，这是由葡萄糖的多聚物与1–氯– 2、3–环氧丙烷交连而成。环氧丙烷引入丙三醇基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来，凝胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子和环氧丙烷的比例(交联度)来控制。 葡聚糖具有较强的亲水性，在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性的凝胶，其吸水能力与葡聚糖凝胶的交联度有密切关系。交联度大的，孔径小，吸水少，膨胀的程度小;交联度小的，孔径大，吸水多，膨胀的程度大。因此，葡聚糖凝胶孔径的大小可以其吸水量的大小来表示，常以G–10至G–200号码标记。G 后面的数字是其吸水量(毫升水/克干 胶)乘以10所得的值。如G–25即表示吸水量为2.5ml/2干胶。市售有G–10、G–5、G–50、G–75、G–100、G–150、G–200等型号。G–75以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。G–75以下的称为硬胶。 葡聚糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万。可根据被分离物质的分子大小及目的选择使用。一般说Sephadex G–l0,15通常用于分离肽及“脱盐”。Sephadex G–75,200用以分离各类蛋白质。
葡聚糖凝胶层析实验报告 一、实验目的 1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理； 2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。 二、实验原理 凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。 对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排 阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水 体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的 筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。 分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出 柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小 分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这 些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶 层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。 三、仪器、材料和试剂 1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。 2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。 四、实验步骤 1、装柱 将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让
柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。 2、上样 装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。 3、洗脱和收集 打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。 4、样品的检测 收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。 五、实验结果及分析 1、实验结果： 序号 2 4 6 8 10 12 14 吸光 0．051 0.045 0.051 0.071 0.195 0.127 0.067 度A 序号16 8 吸光 0.055 0.039 0.066 0.027 0.053 0.049 0.011 度A 2、蛋白质样品洗脱曲线：
葡聚糖凝胶使用说明书 一、产品名称 产品名称：葡聚糖凝胶 型号：Gel-300 二、适用范围 葡聚糖凝胶适用于生物实验室、化学实验室、制药厂等场所，用于分离、纯化蛋白质、核酸、肽类等生物分子。 三、使用方法 1. 准备葡聚糖凝胶和缓冲液。根据所需的分离纯化效果，选择合适的缓冲液类型和浓度。 2. 将缓冲液加入玻璃柱或层析柱中，直至填满整个柱子。 3. 加入适量的葡聚糖凝胶，使其均匀分布在柱子的底部。 4. 将样品溶液缓慢地加入柱子中，注意不要过快，以免影响分离效果。 5. 收集洗脱液，并进行分析。根据分离纯化的目的，可以采用不同的收集方法，如分步收集或集中收集。 6. 在每次使用后，及时清洗和保存凝胶柱，以延长其使用寿命。 四、注意事项 1. 在使用葡聚糖凝胶前，应仔细阅读本说明书并遵守操作规程。 2. 避免直接接触皮肤和眼睛，若不慎接触，应立即用清水冲洗。 3. 使用过程中要避免剧烈震动或晃动，以免影响分离效果。 4. 在使用前应确认所需缓冲液的种类和浓度是否合适，避免浪
费和影响分离效果。 5. 不要使用已经过期或变质的凝胶和缓冲液。 6. 在储存和使用过程中要保持环境干燥，避免潮湿和高温。 7. 使用后要及时清洗和保存凝胶柱，以免被污染和变质。 五、常见问题及解决方案 1. 分离效果不佳：可能是由于凝胶或缓冲液质量问题、操作不当等原因引起的。解决方法是检查凝胶和缓冲液的质量和浓度是否合适，确认操作规程是否正确。若问题仍未解决，建议更换新的凝胶柱。 2. 柱子压力过高：可能是由于样品溶液中存在杂质或凝胶柱堵塞等原因引起的。解决方法是检查样品溶液是否含有杂质，或者对样品进行预处理以去除杂质。同时检查凝胶柱是否堵塞，若堵塞则进行清洗或更换新的凝胶柱。 3. 柱子漏液：可能是由于接头松动或密封圈损坏等原因引起的。解决方法是重新拧紧接头或更换新的密封圈。若问题仍未解决，建议联系售后服务与支持部门寻求帮助。 4. 洗脱液中含有杂质：可能是由于样品溶液中存在杂质或缓冲液不纯等原因引起的。解决方法是检查样品溶液是否含有杂质，或者对样品进行预处理以去除杂质。同时检查缓冲液的纯度是否符合要求，若不符合则更换新的缓冲液。 5. 洗脱液颜色异常：可能是由于样品溶液中含有色素或某些物质与缓冲液发生反应等原因引起的。解决方法是检查样品溶液是否含有色素或其他杂质，或者更换新的缓冲液以避免发生反应。若问题仍
实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法 一、实验目的 1.掌握凝胶层析的基本原理。 2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。 二、实验原理 凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。 凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。 将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是由V o，Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积（Ve）与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒
Sephadex G-75 凝胶层析法分离蛋白质 一.实验原理 凝胶层析(gel chromatography)又称为凝胶排阻层析(gel exclusion chromatography)、分子筛层析(molecular sieve chromatography)、凝胶过滤(gel filtration)、凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)等。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。二.试剂器材 Sephadex G-75粉末 洗脱液(10mmol/L Tris，10mmol/L NaCl，：取Tris 1.2114g和NaCl 5.844g分别溶于适量的蒸馏水中，将两种溶液合并，用4mol/L的盐酸溶液调节pH值至，再用蒸馏水定容至1000mL； 其他器材：18mm试管、层析柱、紫外分光光度计、分部收集器等 三.操作步骤 凝胶的制备：
葡聚糖凝胶柱的使用方法： (1) 预处理 称取Sephadex G-25（50－100目）约5g，加入蒸馏水100ml，置室温下3h进行溶胀。 (2) 装柱 凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。同时大开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h即可加样品分离。 (3) 加样 加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。 (4) 洗脱与收集 洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min。洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml，共收集10管。据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm，找出浓度最大的管号。 (5) 凝胶的再生和回收 凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。若使用数次，就需要再生处理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。