微生物鉴定的生理生化反应
各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。
一、碳水化合物的代谢试验
1．糖（醇、苷）类发酵试验
（1）原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类
的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。检查细菌
对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。
(2)方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4 ）加入0.5~1.0％（ w/v）的特定糖（醇、苷）类。所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或
低聚糖、多元醇和环醇等，见表 6-4-1。将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，孵
育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。若用微量发酵管，或要求培
养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。
置 35℃
(3)结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变
为黄色），产气的细菌可在小倒管（ Durham 小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。不分
解糖则无变化。
(4)应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不
同细菌可发酵不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃
希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试
验鉴别细菌。
表6-4-1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类
单糖四碳糖：赤藓糖 , 五碳糖：核糖核酮糖木糖阿拉伯糖 , 六碳糖：葡萄糖果糖半乳糖甘露糖
双糖蔗糖（葡萄糖＋果糖）乳糖（葡萄糖＋半乳糖）麦芽糖（两分子葡萄糖）
三糖棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖）
多糖菊糖（多分子果糖）淀粉
醇类侧金盏花醇卫茅醇甘露醇山梨醇
非糖类肌醇
2．葡萄糖代谢类型鉴别试验
(1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降
解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分
解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵（O/F Hugh －Leifson ， HL ）试验，可用于区别细菌的代谢类型。
或
(2) 方法：挑取少许纯培养物（不要从选择性平板中挑取）接种2支管加入高度至少为0.5cm 的无菌液体石蜡以隔绝空气（作为密封管）放管）。置 35℃孵箱孵育48h 以上。。HL 培养管中，在其中一，另一管不加（作为开
(3)结果：两管培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；两管都产酸（变黄）为发酵型；加液体石蜡管不产酸，不加液体石蜡管产酸为氧化型。
(4)应用：主要用于肠杆菌科与其它非发酵菌的鉴别。肠杆菌科、弧菌科细菌为发酵型，非发酵菌为氧化型或产碱型。也可用于鉴别葡萄球菌（发酵型）与微球菌（氧化型）。3．甲基红（ MR ）试验
(1)原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解为甲
酸、乙酸和琥珀酸等，使培养基pH 下降至 4.5 以下时，加入甲基红指示剂呈红色。如细菌
分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其它物质（如醇、醛、酮、气体和水）
养基 pH 在 5.4 以上，加入甲基红指示剂呈桔黄色。
，培
(2) 方法：将待试菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35℃孵育 48h~96h 后，于 5ml 培养基中滴加5~6 滴甲基红指示剂，立即观察结果。
(3)结果判定：呈现红色者为阳性，桔黄色为阴性，桔红色为弱阳性。
(4)应用：常用于肠杆菌科内某些种属的鉴别，如大肠埃希菌和产气肠杆菌，前者为阳性，
后者为阴性。肠杆菌属和哈夫尼亚菌属为阴性，而沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属和变
形杆菌属等为阳性。
4．β－半乳糖苷酶试验（ONPG 试验）
(1)原理：乳糖发酵过程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解。有些细菌只有半乳糖苷酶，因而只能迟缓发酵乳糖，所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌均可快速水解邻硝
基酚 -β-D-半乳糖苷（ O-nitrophenyl- β-D-galactopyranoside,ONPG ）而生成黄色的邻硝基酚。
用于枸橼酸菌属、亚利桑那菌属与沙门菌属的鉴别。
(2)方法：将待试菌接种于 ONPG 肉汤中， 35℃水浴或孵箱孵育 18~24h ，观察结果。
(3)结果：呈现亮黄色为阳性，无色为阴性。
(4)应用：可用于迟缓发酵乳糖细菌的快速鉴定，本法对于迅速及迟缓分解乳糖的细菌均可
短时间内呈现阳性。埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、哈夫尼亚菌属、沙雷菌属和肠
杆菌属等均为试验阳性，而沙门菌属、变形杆菌属和普罗威登斯菌属等为阴性。
5． VP 试验
(1)原理：测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。某些细菌如产气肠杆菌，分解葡萄糖产生
丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧形成乙酰甲基甲醇。在碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙
酰，进而与培养基中的精氨酸等含胍基的物质结合形成红色化合物。即 V-P 试验阳性。
(2) 方法：将待检菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，（95％乙醇溶液） 0.6ml，轻轻振摇试管，然后加
35℃孵育
0.2ml 400g/L
24~48h，加入50g/L
KOH ，轻轻振摇试管
α－萘酚
30s 至
1min ，然后静置观察结果。
(3) 结果：红色者为阳性，黄色或类似铜色为阴性。
(4) 应用：主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。本试验常与MR 试验一起使用，一般情况下，前者为阳性的细菌，后者常为阴性，反之亦然。但肠杆菌科细菌不一定都这样规律，
如蜂房哈夫尼亚菌和奇异变形杆菌的VP 试验和 MR 试验常同为阳性。
6．胆汁七叶苷水解试验
（1）原理：在 10%~40％胆汁存在下，测定细菌水解七叶苷的能力。七叶苷被细菌分解生
成的七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子发生反应形成黑色化合物。
(2) 方法：将被检菌接种于胆汁七叶苷培养基中，35℃孵育 18~24h 后，观察结果。
(3)结果：培养基完全变黑为阳性，不变黑为阴性。
(4)应用：主要用于鉴别 D 群链球菌与其它链球菌的区别，以及肠杆菌科的某些种、某些厌
氧菌（如脆弱拟杆菌等）的初步鉴别。 D 群链球菌本试验为阳性。
7．淀粉水解试验
(1)原理：产生淀粉酶的细菌能将淀粉水解为糖类，在培养基上滴加碘液时，可在菌落周围
出现透明区。
(2) 方法：将被检菌划线接种于淀粉琼脂平板或试管中，35℃孵育18~24h ，加入革兰碘液数滴，立即观察结果。
(3)结果：阳性反应，菌落周围有无色透明区，其它地方蓝色；阴性反应，培养基全部为蓝
色。
(4)应用：用于白喉棒状杆菌生物型的分型，重型淀粉水解试验阳性，轻、中型阴性；芽胞
杆菌属菌种和厌氧菌某些种的鉴定。
8．甘油复红试验
(1)原理：甘油可被细菌分解生成丙酮酸，丙酮酸脱去羧基为乙醛，乙醛与无色的复红生成
醌式化合物，呈深紫红色。
(2) 方法：取被检菌接种于甘油复红肉汤培养基中，于35℃孵育，观察2~8d。应同时做阴性对照。
(3)结果：紫红色为阳性，与对照管颜色相同为阴性。
(4)应用：主要用于沙门菌属内各菌种间的鉴别。伤寒沙门菌、甲（丙）型副伤寒沙门菌、
其猪霍乱沙门菌、孔道夫沙门菌和仙台沙门菌本试验为阴性，乙型副伤寒沙门菌结果不定，它不
常见沙门菌多数为阳性。
9．葡萄糖酸氧化试验
(1)原理：某些细菌可氧化葡萄糖酸钾，生成α-酮基葡萄糖酸。α-酮基葡萄糖酸是一种还原
性物质，可与班氏试剂起反应，出现棕色或砖红色的氧化亚铜沉淀。
(2)方法：将待检菌接种于葡萄糖酸盐培养基中 (1ml) ，置 35℃孵育 48h,加入班氏试剂 1ml ，于水浴中煮沸 10min 并迅速冷却，观察结果。
(3)结果：出现黄到砖红色沉淀为阳性。不变或仍为蓝色为阴性。
(4)应用：主要用于假单胞菌的鉴定和肠杆菌科菌分群。
二、氨基酸和蛋白质的代谢试验
1．硫化氢试验
(1)原理：某些细菌能分解含硫氨基酸生成硫化氢，与亚铁离子或铅离子结合形成黑色沉淀
物。
(2) 方法：将待检菌接种于含硫化物及亚铁离子的培养基或克氏双糖铁琼脂（KIA ）中， 35 ℃孵育 18~24h，观察有无黑色沉淀出现。或用醋酸铅纸条，悬挂于KIA 管中（白色滤纸，根据试管大小裁剪适当，在热的 50g/L 醋酸铅饱和水溶液中浸泡，然后于 50~60℃烘干， 121 ℃15min 高压灭菌备用）。醋酸铅是最敏感的方法。
(3)结果：有黑色沉淀物为阳性。
(4)应用：主要用于鉴别肠杆菌科细菌，如沙门菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、爱德华
菌属等为阳性，其它菌属大多为阴性。但沙门菌属中亦有部分硫化氢阴性菌株，如甲型副伤寒、仙台、猪霍乱沙门菌等。
2．明胶液化试验
(1)原理：细菌分泌的胞外蛋白水解酶（明胶酶）能分解明胶，使明胶失去凝固能力而液化。
(2) 方法：将待检菌接种于明胶培养基中，35℃孵育 24h 到 7d 或更长时间，每24h 取出放入4℃冰箱约2h 后，观察有无凝固。
(3)结果：如无凝固，则表示明胶已被水解，液化试验阳性。如凝固，则继续培养。
(3)应用：奇异变形杆菌、普通变形杆菌、沙雷菌属和阴沟肠杆菌等到能液化明胶，肠杆菌
科中的其它细菌很少液化明胶。有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。
另外，许多假单胞菌也能产生明胶酶而使明胶液化。
3．吲哚试验（靛基质试验）
(1)原理：某些细菌有色氨酸酶，能分解色氨酸产生吲哚，吲哚与对二甲氨基苯甲醛形成
红色的玫瑰吲哚。
(2) 方法：将待检菌接种于富含色氨酸的蛋白胨水培养基中，35℃孵育 24~48h，加入靛基质试剂，观察结果。
(3)结果：红色为阳性，无色为阴性。
(4)应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定，如大肠埃希菌与产气肠杆菌，肺炎克雷伯菌和产
酸克雷伯菌等的鉴别。
4．苯丙氨酸脱氨酶试验
(1)原理：测定细菌是否产生苯丙氨酸脱氨酶。细菌产生的苯丙氨酸脱氨酶使苯丙氨酸脱氨
后生成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂后产生绿色反应。若延长时间，会引起退色。
35℃孵育18~24h ，滴加100g/L 三氯化铁(2) 方法：将待检菌大量接种入苯丙氨酸培养基中，
试剂 4~5 滴，立即观察菌落生长处有无绿色出现。
(3)结果：有绿色出现为阳性。
(4)应用：变形杆菌属、普罗威登菌属、摩根菌属均为阳性，肠杆菌科其它细菌均为阴性。
5．氨基酸脱羧酶试验
(1)原理：某些细菌可产生氨基酸脱羧酶使氨基酸脱羧生成胺和二氧化碳。由于胺的生成使
培养基变为碱性，可用指示剂指示出来。
(2) 方法：将待检菌分别接种于 1 支氨基酸（赖氨酸，鸟氨酸或精氨酸）脱羧酶试验管和 1 支氨基酸脱羧酶对照管（无氨基酸），各覆盖至少 0.5cm 高度的无菌石蜡油， 35℃孵育 1~4d，观察结果。
(3)结果：若为溴甲酚紫指示剂，则试验管紫色为阳性，黄色为阴性，对照管应为黄色。
(4)应用：主要用于某些细菌种间的鉴别，如赖氨酸用于产气肠杆菌（阳性）与阴沟肠杆菌
（阴性）；鸟氨酸用于阴沟肠杆菌（阳性）和克雷伯菌（阴性）；精氨酸用于阴沟肠杆菌（阳
性）和产气肠杆菌（阴性）等。
6．精氨酸双水解酶试验
(1)原理：精氨酸经两次水解后 ,生成鸟氨酸、氨及二氧化碳。鸟氨酸又在脱羧酶的作用下生成
腐胺。氨及腐胺均为碱性物质，故可使培养基变碱，用指示剂指示出来。
(1)方法：将待检菌接种于试验培养上，置35℃孵箱孵育 1~4d，观察结果。
(2)结果：溴甲酚紫指示剂呈紫色为阳性，酚红指示剂呈红色为阳性。黄色为阴性。
(3)应用：主要用于肠杆菌科及假单胞菌属的鉴定。
7．尿素酶试验
(1)原理：某些细菌能产生尿素酶，分解尿素产生大量的氨，使培养基变碱。
(2) 方法：将待检菌接种于含有尿素的培养基中，35℃孵育 18~24h ，观察结果。
(3)结果：红色为阳性，不变为阴性。
(4)应用：主要用于肠杆菌科变形杆菌属、普罗威登菌属、克雷伯菌属及假单胞菌属的鉴定。
8．霍乱红试验
(1)原理：霍乱弧菌分解色氨酸生成吲哚，并能使硝酸盐还原为亚硝酸盐，当加入硫酸后生
成亚硝酸吲哚，呈红色反应。
(2)方法：将待检菌接种于蛋白胨水中，置35℃孵育 24h，加入浓硫酸数滴，观察结果。
(3)结果：呈红色者为阳性。
(4)应用：霍乱弧菌呈阳性反应，但本试验并非霍乱弧菌所特有。凡能产生吲哚并还原硝酸
盐为亚硝酸盐的细菌，均可呈现阳性反应。
三、碳源和氮源利用试验
1．枸橼酸盐利用试验
(1)原理：某些细菌能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，而在此培养基上生长，并分解枸橼酸盐
生成碳酸钠，使培养基变碱性。。
(2) 方法：将待检菌接种于枸橼酸盐培养基上，置35℃孵育 1~4d，逐日观察结果。
(3)结果：若用溴麝香草酚兰指示剂，斜面出现菌落或菌苔，培养基变蓝色为阳性；无菌落
生长，培养基绿色为阴性。
(4)应用：可用此试验作细菌种属间鉴定。埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属
均为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属通常阳性，粘质和液化沙雷菌和某些变形杆菌及枸橼酸杆
菌阳性。此外，铜绿假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌和嗜水气单胞菌也能利用枸橼酸盐。
2．丙二酸盐利用试验
(1)原理：某些细菌能利用丙二酸盐作为唯一碳源，丙二酸盐被分解生成碳酸钠，使培养基
变碱。
(2) 方法：将待检菌接种于丙二酸盐培养基中，置35℃孵育 24~48h，观察结果。
(3)结果：培养基由绿色变为蓝色为阳性。颜色无变化为阴性。
(4)应用：肠杆菌科中亚利桑那菌和克雷伯菌属为阳性，枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼
亚菌属有不同生物型反应，其它各菌属均为阴性。
3．醋酸钠利用试验
(1)原理：细菌利用铵盐作为唯一氮源，同时，利用醋酸盐作为唯一碳源时，可在醋酸盐培
养上生长，分解醋酸盐生成碳酸钠，使培养基变为碱性。
(2) 方法：将被检菌接种于醋酸盐培养基中，置35℃孵育 2~7d，逐日观察结果。
(3)结果：培养基上有细菌生长，并变为蓝色为阳性。
(4)应用：主要用于大肠埃希菌和志贺菌属的鉴别，前者为阳性，而后者为阴性。
4．马尿酸钠水解试验
(1)原理：某些细菌可具有马尿酸水解酶，可使马尿酸水解为苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸与三
氯化铁试剂结合，形成苯甲酸铁沉淀。
(2) 方法：将待检菌接种于马尿酸钠培养基中，置 35℃孵育 48h，离心沉淀，取上清液 0.8ml ，加入三氯化铁试剂 0.2ml，立即混匀，经 10~15min 观察结果。
(3)结果：出现恒定之沉淀物为阳性。
(5)应用：主要用于 B 群链球菌的鉴定。
5、乙酰胺利用试验
(1)原理：许多非发酵菌产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，使培养
基变碱。
(2) 方法：将被检菌接种于乙酰胺培养基中，置35℃孵育 24~48h，观察结果。
(3)结果：培养基由绿色变为蓝色为阳性。如不生长，或稍有生长，但培养基颜色不变为阴
性。
(4)应用：主要用于非发酵菌的鉴定。铜绿假单胞菌、去硝化产碱杆菌、食酸假单胞菌为阳
性，其它非发酵菌大多数为阴性。
四、酶类试验
1.氧化酶试验
(1)原理：氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素氧化酶系统中的最终呼吸酶。此酶并不
直接与氧化酶试剂起反应，而是先使细胞色素 C 氧化，然后此氧化型细胞色素 C 再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。因此，本试验结果与细胞色素 C 的存在有关。
(2)方法：取洁净滤纸条，沾取菌落少许，加氧化酶试剂（ 10g/L 盐酸四甲基对苯二胺水溶液或
10g/L 盐酸二甲基对苯二胺水溶液） 1 滴， 1min 内观察结果。也可将试剂滴加到菌落上进行试
验。
(3)结果：阳性者立即变粉红色， 5~10s 内呈深紫色。无色为阴性。
(4)应用：用于奈瑟菌属的菌种鉴定，该属细菌均阳性。此外，也用于假单胞菌属与肠
杆菌科细菌的区别，前者阳性，而后者阴性。莫拉菌属、产碱杆菌属等均为阳性。
注意事项：①试验时应避免接触含铁物质，以免出现假阳性。② 10g/L 盐酸四甲基对苯二胺或
10g/L 盐酸四甲基对苯二胺水溶液为无色溶液，在空气中易被氧化而失效，故应经常
更换新试剂，并盛于棕色瓶中，若试剂已变成深蓝色，应弃去不用。
2．触酶试验
(1)原理：触酶又称过氧化氢酶，具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢成为水和原子态
氧，继而形成氧分子，出现气泡。
(2) 方法：取洁净玻片 1 张，用接种环挑取细菌，加3％H 2O2 1 滴，立即观察结果。
(3)结果：若立即出现大量气泡为阳性。无气泡为阴性。
(4)应用：大多需氧和兼性厌氧菌均产生过氧化氢酶，但链球菌科阴性，故常用此试验
来鉴定。此外，金氏杆菌属的细菌也为阴性。分枝杆菌的鉴别则用耐热触酶试验，结核分枝杆菌为阴性，戈氏分枝杆菌和地分枝杆菌为阳性。
注意事项：①3％ H2O2溶液要新鲜配制。②不宜用血琼脂平板上生长的菌落，因红细胞含有触酶，可致假阳性反应，③取对数生长期的细菌。
3．凝固酶试验
(1)原理：凝固酶试验是鉴定葡萄球菌致病性的重要试验。致病性葡萄球菌可产生两种凝固
酶，一种是与细胞壁结合的凝聚因子，称结合凝固酶，它直接作用于血浆中纤维蛋白原，使
发生沉淀，包围于细菌外面而凝聚成块，玻片法阳性结果是由此凝聚因子所致；另一种凝固酶是分泌至菌体外，称为游离凝固酶，它能使凝血酶原变成凝血酶类产物，使纤维蛋白原变为纤维蛋白，从而使血浆凝固。试管法可同时测定结合型和游离型凝固酶。
(2)方法 : ①玻片法：在一张洁净玻片中央加 1 滴生理盐水，用接种环取待检培养物与其混合
（设阳性和阴性对照）制成菌悬液，若经10~20s 内无自凝现象发生，则加入人或兔新鲜血
浆 1 环，与菌悬液混合，观察结果。②试管法：于试管内加1﹕ 4 稀释的兔或人血浆0.5ml ，再加 1~2 个待试菌菌落，置 37℃水浴，每 30min 观察 1 次结果。
(3)结果：①玻片法： 5~10s 内出现凝集者为阳性。②试管法：如有凝块或整管凝集出现为阳
性。 2h 后无上述现象出现，则放置过夜后再观察。
(4)应用：本试验仅用于致病性葡萄球的鉴定。
注意事项：①玻片法为筛选试验，阳性、阴性均需进行试管法测定。②血浆必须新鲜。③应
使用肝素而非枸橼酸盐作抗凝剂抗凝的血浆。④本试验也可用市购的胶乳凝集试验试剂盒测
定。
4． DNA 酶试验
(1)原理：某些细菌能产生 DNA 酶，水解外源性 DNA 使之成为寡核苷酸。 DNA 可被酸沉淀，而寡核苷酸则不会。故在 DNA 琼脂平板上加盐酸后，可在菌落周围形成透明区。
(2)方法：在 DNA 琼脂平板上点种待检菌， 35℃孵育 18~24h，用 1 mol/L 盐酸倾注平
板，观察结果。
(3)结果：如菌落周围有透明区者为阳性，无透明区为阴性。
(4)应用：主要用于肠杆菌科及葡萄球菌属某些菌种的鉴定。沙雷菌、变形杆菌和金黄色葡
萄球菌 DNA 酶均阳性。
5．胆汁溶菌试验
(1)原理：胆汁或去氧胆酸钠能导致某些细菌溶解，一方面是由于胆汁或去氧胆酸钠降低了
细菌细胞膜上的表面张力，使细菌的细胞膜破损或使菌体裂解。另一方面可能与激活细菌体内的
自溶酶有关。
(2)方法：①试管法：用纯培养物制备1ml 生理盐水浓菌悬液，pH 调至7.0，分装两支试管，各0.5ml 。其中一管加 0.5ml 100g/L 去氧胆酸钠为试验管，另一管加 0.5ml 生理盐水作对照。
35℃孵育每小时观察在菌落上加 1 接种环1 次结果。②平板法：在血平板上选取单个可疑菌落，作好标记，直接20g/L 去氧胆酸钠（ pH7.0 ），置 35℃孵育 30min（平板不要翻转）观察
结果。
(3)结果：①试管法：在 3h 内液体透明为阳性。②平板法：如菌落消失，仅留下溶血区为阳
性，菌落不消失为阴性。
(4)应用：用于肺炎链球菌的鉴定。
6．硝酸盐还原试验
(1)原理：硝酸盐还原反应包括两个过程，其一是在合成代谢过程中，硝酸盐还原为亚硝酸
盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其它含氮化合物；另一是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。硝酸盐还原过程可因细菌不同而异。有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌等；有的细菌可使其还原为亚硝酸盐和离
子态的铵；有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如沙雷菌属；有的细菌还可以将其还
原产物在合成性代谢中完全利用。硝酸盐或亚硝酸盐如果还原生成气体的终末产物如氮或氧
化氮，则称为脱硝化或脱氮化作用。某些细菌能还原硝酸盐为亚硝酸盐，亚硝酸盐与醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的对氨基苯磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者与α-萘胺结合生成 N- α萘胺偶苯磺酸。
(2) 方法：将待检菌接种于硝酸盐培养基（内含小倒管）中，35℃孵育 1~4d。将甲、乙等量混合液（用时混合） 0.1ml 加于试管内，立即或10min 内观察结果。
(3) 结果：出现红色为阳性反应。如欲观察有无氮气产生，可于培养基管内加 1 只小倒管，有气泡产生，则表示有氮气生成。如欲检查培养基中硝酸盐是否被分解，可取锌粉少许加入培养基内，如出现红色表明硝酸盐仍存在；若不出现红色，表示硝酸盐已被分解。
(4)应用：本试验广泛用于细菌鉴定。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；假单胞菌
属中有的细菌能产生氮气，如铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、斯氏假单胞菌，有的则能还原硝酸盐为亚硝酸盐，如鼻疽假单胞菌等；厌氧菌如韦荣菌也能还原硝酸盐为亚硝酸盐。
7．卵磷脂酶试验
(1)原理：细菌产生的卵磷脂酶，经钙离子作用，能迅速分解卵黄或血清中的卵磷脂形成混
浊沉淀状的甘油酯和水溶性磷酸胆碱。
(2) 方法：取待检菌划线接种或点种在卵黄琼脂平板上，置35℃孵育 3~6h，观察结果。
(3) 结果： 3h 后在菌落周围形成乳白色混浊，即为卵磷脂酶试验阳性，6h 后该混浊圈可扩大到直径 5~6mm 。
(4)应用：该试验主要用于厌氧的鉴定。产气荚膜梭菌和诺维梭菌为阳性，其他梭菌为阴性。蜡样芽孢杆菌亦为阳性。
8．磷酸酶试验
(1)原理：磷酸酶是磷酸脂的水解酶，可使单磷脂水解，其反应可根据反应基质不同而
异，如用磷酸酚酞为基质，经磷酸酶水解后可释放酚酞，在碱性环境中呈红色。
(2)方法：取待检菌接种于磷酸酚酞琼脂平板上，置35℃孵育 18~24h，于平皿盖内加 1 滴浓氨水，熏蒸片刻，观察结果。亦可用液体培养基，经孵育后，向管内加400g/L 氢氧化钠溶液 1 滴，观察结果。
(3)结果：菌落变为红色者为阳性。
(4)应用：主要用于致病性葡萄球菌与非致病性葡萄球菌的鉴别，前者为阳性，后者为
阴性。
9．脂酶试验
(1)原理：细菌产生的脂酶可分解脂肪为游离脂肪酸。在培养基中加入维多利亚蓝可与脂肪
结合成为无色化合物，如果脂肪被分解，则维多利亚蓝释出，呈蓝色。
(2) 方法：将待检菌接种于含维多利亚蓝的脂酶培养基中，置35℃孵育 24h，观察结果。
(3)结果：培养基变为深蓝色者为阳性，否则可呈无色或粉红色。
(4)应用：主要用于厌氧菌鉴定。在拟杆菌中产黑色素拟杆菌中间亚种产生脂酶，其它拟杆
菌阴性；在梭菌属中诺维梭菌和产芽胞梭菌也产生此酶，其它梭菌为阴性。
10． CAMP 试验
(1) 原理： B 群链球菌（无乳链球菌）产生一种“ CAMP”因子，此种物质能促进葡萄球菌的β- 溶血素的活性。因此，可在两种细菌的交界处溶血力增强，出现箭头型透明溶血区。
(2)方法：在羊血或马血琼脂平板上，先以β-溶血的金黄色葡萄球菌划一横线接种。再将待
检菌与前一划线作垂直接种，两者应相距 1cm，于 35℃孵育 18~24h，观察结果。每次试验应做阴
阳性对照。
(3)结果：两种细菌划线交接处出现箭头型溶血区为阳性。
(4)应用：主要用于 B 群链球菌（阳性）的鉴定，其他链球菌均为阴性。
11．石蕊牛乳试验
(1)原理：由于牛乳内含有丰富的蛋白质和糖类，各种细菌对这些物质的分解能力不同，故
可有数种不同反应，用以鉴别细菌。
(2)将待检菌接种于石蕊牛乳培养基中，若为芽胞梭菌，要在培养基中加入无菌铁末，置 35℃孵
育 18~24h，必要时可延长至 14d。观察结果。
(3)结果：①产酸：发酵乳糖产酸，使指示剂变为粉红色。②产气：发酵乳糖而同时产气，
可冲开上面的凡士林。③凝固：因产酸太多而使牛乳中的酪蛋白凝固。④胨化：将凝固的酪蛋白
继续水解为胨，培养基上层液体变清，底部可留有未被完全胨化的酪蛋白。⑤产碱：乳
糖未发酵，因分解含氮物质，生成胺及氨，培养基变碱，指示剂变为蓝色。
(4)应用：主要用于梭菌、链球菌和丙酸杆菌的鉴定。
五、抑菌试验
1． Optochin 敏感试验
(1)原理： Optochin( 奥普托欣)是盐酸乙基氢化羟基奎宁的商品名。对肺炎链球菌有特异
抑制作用，其作用机制可能是干扰叶酸生物合成作用，而对其它链球菌则无此作用。
(2) 方法：用棉拭子将待检菌的肉汤培养物均匀涂布于血琼脂平板上，贴上一张含托欣纸片，置烛缸或二氧化碳孵箱， 35℃孵育 18~24h ，观察结果。5μg奥
普
(3)结果：抑菌圈直径大于 14mm 为敏感，小于或等于 14mm 为阴性。
(4)应用：主要用于肺炎链球菌（敏感）与其它链球菌（耐药）的鉴别。
2．杆菌肽敏感试验
(1)原理： A 群链球菌对杆菌肽几乎是100%敏感，而其它群链球菌对杆菌肽通常耐药。
故此试验可对链球菌进行鉴别。
(2) 方法：用棉拭子将待检菌的肉汤培养物均匀涂布于血琼脂平板上，稍干后贴一张含0.04U 的杆菌肽纸片，置35℃孵育 18~24h，观察结果。
(3) 结果：抑菌圈直径大于10mm 为敏感，小于10mm 为耐药。
(4) 应用：主要用于 A 群与非 A 群链球菌的鉴别。从临床分离的菌株中有球菌也对杆菌肽敏感，如6%的 B 群链球菌、 7.5%的 C 群链球菌和G
5%~15% 非
群链球菌等。
A 群链
3．新生霉素敏感试验
(1)原理：金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌可被低浓度新生霉素所抑制，表现为敏感，而腐
生葡萄球菌则表现为耐药。
(2) 方法：用棉拭子将待检菌菌悬液均匀涂布于M-H 琼脂平板或血平板上，在平板中央贴含5μ g/片新生霉素诊断纸片一张，置35℃孵育 16~18h ，观察结果。
(3)结果：抑菌圈直径大于 16mm 为敏感，小于或等于 16mm 为耐药。
(4)应用：主要用于葡萄球菌某些种的鉴定。
4． O/129 试验
(1)原理： O/129（ 2，4 二氨基 -6， 7-二异丙基喋啶）能抑制弧菌属、发光杆菌属和邻单胞菌属细菌生长，而气单胞菌属和假单胞菌属细菌则耐药。
片的(2)方法：用棉拭子将待检菌菌悬液均匀涂布于碱性琼脂平板上，将
O/129 诊断纸片贴于平板上，置35℃孵育 18~24h，观察结果。
10μ g/片及150 μ g/
(3)结果：出现抑菌圈者表示敏感，无抑菌圈者为耐药。
(4)应用：主要用于弧菌属、邻单胞菌属与气单胞菌属的鉴别，弧菌属和邻单胞菌属菌为敏
感，气单胞菌属菌为耐药。其它菌属有发光杆菌属为敏感，假单胞菌属为耐药。
5．氰化钾试验
(1)原理：氰化钾可抑制某些细菌的呼吸酶系统。细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶
和过氧化物酶均以铁卟啉作为辅基，氰化钾与铁卟啉结合，使这些酶失去活性，使细菌生长受到抑制。
(2) 方法：将待检菌接种于氰化钾培养基中，同时接种一支不含氰化钾的对照培养基，置 35℃孵育 24~48h，观察结果。
(3)结果：细菌在氰化钾培养基中生长的（不受抑制）为阳性，不生长（抑制）为阴性。
(4)应用：肠杆菌科中的沙门菌属、志贺菌属和埃希菌属细菌的生长受到抑制，而其它各菌
属的细菌均可生长。
六、其它试验
1．克氏双糖铁或三糖铁琼脂培养基试验
(1)原理：克氏双糖铁 (KIA) 或三糖铁琼脂 (TSI) 培养基制成高层和短的斜面，其中葡萄糖含量
仅为乳糖或蔗糖的十分之一，若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖和蔗糖，分解葡萄糖产
酸使 pH 降低，因此斜面和底层均先呈黄色，但因葡萄糖量较少，所生成的少量酸可因接触空气
而氧化，并因细菌生长繁殖利用含氮物质生成碱性化合物，使斜面部分又变成红色；
底层由于处于缺氧状态，细菌分解葡萄糖所生成的酸类一时不被氧化而仍保持黄色。细菌
分解葡萄糖、乳糖或蔗糖产酸产气，使斜面与底层均呈黄色，且有气泡。细菌产生硫化氢
时与培养基中的硫酸亚铁作用，形成黑色的硫化铁。
(2) 方法：用接种针挑取待检菌的菌落，先穿刺接种到止，再从原路退回，在斜面上自下而上划线，置
KIA 或 TSI 深层，距管底
35℃孵育18~24h，观察结果。
3~5mm 为
(3)结果：常见的 KIA 反应有如下几种：①斜面碱性 /底层碱性：不发酵碳水化合物，系不
发酵菌的特征。如铜绿假单胞菌。②斜面碱性/底层酸性：葡萄糖发酵、乳糖（和TSI 中的蔗糖）不发酵，是不发酵乳糖菌的特征，如志贺菌。③斜面碱性 /底层酸性（黑色）：葡萄糖发酵、乳糖不发酵并产生硫化氢，是产生硫化氢不发酵乳糖菌的特征。如沙门菌、亚利
桑那菌、枸橼酸杆菌和变形杆菌等。④斜面酸性/底层酸性：葡萄糖和乳糖（和TSI中的蔗糖）发酵，是发酵乳糖的大肠菌群的特征，如大肠埃希菌、克雷伯菌属和肠杆菌属。
(4)应用：鉴别肠道杆菌用。KIA 或 TSI 对初分离出的、可疑为革兰阴性杆菌鉴定特别
有用。其反应模式是许多杆菌鉴定表的组成部分，也可作为观察其他培养基反应的有价值
的质控依据。
2．氢氧化钾拉丝试验
(1) 原理：革兰阴性细菌的细胞壁在稀碱溶液中易于破裂，释放出未断裂的 DNA 螺旋，使氢氧化钾
菌悬液呈现粘性，可用接种环搅拌后拉出粘丝来，而革兰阳性细菌在稀碱溶液中没有上述变化。
(2)方法：取 1 滴 40g/L 氢氧化钾水溶液（应新鲜配制）于洁净玻片上，取新鲜菌落少许，与
氢氧化钾水溶液搅拌混匀，并每隔几秒钟上提接种环，观察能否拉出粘丝。
(3)结果：用接种环拉出粘丝者为阳性，仍为混悬液者为阴性。。
(4) 应用：主要用于革兰阴性菌与易脱色的革兰阳性菌的鉴别。大多数革兰阴性菌于5~10s 内出现阳性反应，有的则需30~45s，假单胞菌、无色杆菌、黄杆菌、产碱杆菌、莫拉菌等
大多数在10s 内呈阳性，不动杆菌、莫拉菌反应较慢，大多数菌株在60s 内出现阳性，而革
兰阳性菌在60s 以后仍为阴性。
微生物生理生化反应
实验原理 通过测定微生物细胞内某些酶类的有无、对某些底物的利用能力、代谢产物的类型等来研究微生物代谢的多样性。某些细菌产生色氨酸酶，能分解培养基蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚，当吲哚遇到含有对二甲基氨基苯甲醛试剂，形成红色的玫瑰红吲哚，为吲哚反应阳性。V-P反应也称乙酰甲基甲醇试验。微生物发酵葡萄糖产生丙酮酸，2分子丙酮酸脱羧形成乙酰乳酸，继续脱羧形成乙酰甲基甲醇，后者在碱性条件下与胍类、肌酸类物质反应，形成红色化合物，为V-P反应阳性。有些细菌发酵糖类产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使发酵液的pH下降到4.2以下，当加入甲基红试剂后，使发酵液变红色。某种微生物能以某种糖类为碳源，产酸产气，则判断为发酵这种糖。 实验材料和方法： 材料： 培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖和蔗糖）、酚红半固体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基； 菌种：大肠杆菌（E. coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus arueus）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）； 试剂：V-P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲酚紫指示剂、抗生素； 仪器及用具：酒精灯、接种环、超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、试管、移液管、滴管、杜氏小管、记号笔等。 实验方法： 1.V-P反应 取5只装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管，以无菌操作分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形均、枯草芽孢杆菌菌液0.1mL至上述相应试管的培养基中，空白对照不接种。置于37℃恒温箱中培养48小时。取出培养物，分别从中取出2.5mL培养液，再加入等量V-P试剂，充分震荡后放置在37℃培养箱中温育30min。若培养液呈红色，记录为V-P试验阳性反应；无色者为V-P试验阴性反应；粉红色者为弱阳性。 2.甲基红试验 分别从V-P实验中的培养物中取出2.5mL培养液，分别加入2～3滴甲基红指示剂，立即观察培养液颜色变化。若培养液变成红色，即为阳性反应，橘色或黄色为阴性反应，橘红色为弱阳性。 3.吲哚试验 取5只装有蛋白胨水培养基的试管，以无菌操作分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形均、枯草芽孢杆菌菌液0.1mL至上述相应试管的培养基中，空白对照不接种。置于37℃恒温箱中培养48小时。在通风橱中向培养基中加入乙醚1～2mL，振荡使吲哚尽量被完全萃取至乙醚中，沿管壁缓慢加入5～10滴吲哚试剂，加入后不能摇动。若乙醚层呈现玫瑰红色，即为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。 4.糖发酵试验 取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管个4支，内装有倒置杜氏小管，杜氏小管内
一、实验目的 1.证明不同微生物对各种有极大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。 2.掌握微生物大分子物质水解实验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5.了解IMViC的原理。 二、实验原理 由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。具体的原理如下： 1.淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种两种细菌（枯草杆菌，大肠杆菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。 2.糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 3.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。 （1）吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。本次不做该试验。
（2）甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。 三、实验材料 1.菌种 大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球(Staphyloccocus aureus Rosenbach)，铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis Cohn）， 产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，普通变形杆菌（Proteus.vulgaris)。 2.培养基 固体油脂培养基，固体淀粉培养基，葡萄糖发酵培养基（5支，附德汉式小管），乳糖发酵培养基（5支，附德汉式小管），蛋白胨水培养基。 3.溶液和试剂 革兰氏染色用卢戈氏碘液，甲基红指示剂，乙醚和吲哚试剂，无菌水。 4.仪器和其他用品 平板，试管，接种环，试管架，电子天平，称量纸，玻璃棒，三角瓶，烧杯，药匙，标签纸，酒精灯，滴管。 四、实验步骤 1.淀粉水解实验 （1）培养基制备 将固体淀粉培养基熔化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。
《植物生理生化实验》复习习题 一、名词解释： 标准曲线:用标准溶液制成的曲线。 先配制一系列不同浓度的标准溶液， 在溶液最大吸收波长下，逐一测定吸光度， 然后用坐标纸以溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，必然得到一条通过原点的直线，即标准曲线。 斐林（Folin）－酚试剂法:又称lowry法，它结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，是双缩脲方法的进一步发展，可利用其在650nm波长下的特定吸收进行比色测定。 茚三酮显色法: 游离氨基酸与茚三酮共热时，能定量生成紫色的二酮茚-二酮茚胺。其吸收峰在570nm，而且在一不定期范围内吸光度与游离氨基酸浓度成正比，因此可用分光光度法测定其含量。 茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。 氨、茚三酮与还原性茚三酮发生反应，生成紫色化合物。 该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，通过测定570nm 处的光密度，可测定氨基酸的含量。 氮素代谢:氮素及含氮的活体物质的同化、异化、排泄，总称为氮素代谢。 淀粉酶：水解淀粉和糖原的酶类总称 真空渗入: 指将叶片打孔放入注射器中，加水浸没，排出空气后用手指堵住前端小孔，同时把活塞向外抽拉，即可造成减压而排出组织中的空气，轻放活塞，水液即进入组织的方法。 离心技术: 根据物质颗粒在一个实用的离心场中的行为而发展起来的 是1.分离细胞器和生物大分子物质的必备的手段之一， 也是2.测定某些纯品物质的部分性质的一种方法。 差速离心法基于待测物质颗粒大小、密度、沉降速度的不同而得到分离。 电泳:各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的颗粒, 这种带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。 同工酶: 指催化同一种化学反应，但其酶本身分子结构和带电性质却有所不同的一组酶。 迁移率: 指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。 溶液中带电粒子在电场中向着与它电性相反的电极移动，它的移动速度是电场和粒子的有效迁移率(m)的乘积，即：V=mE。
微生物自动化鉴定系统的工作原理 微生物鉴定的自动化技术近十几年得到了快速发展。数码分类技术集数学、计算机、信息及自动化分析为一体，采用商品化和标准化的配 套鉴定和抗菌药物敏感试验卡或条板，可快速准确地对临床数百种常见分离菌进行自动分析鉴定和药敏试验。目前自动化微生物鉴定和药 敏分析系统已在世界范围内临床实验室中广泛应用。 一、微生物数码鉴定法 早在七十年代中期，一些国外公司就研究出借助生物信息编码鉴定细菌的新方法。这些技术的应用，为医学微生物检验工作 提供了一个简便、科学的细菌鉴定程序，大大提高了细菌鉴定的准确性。目前，微生物编码鉴定技术已经得到普遍应用，并早已商品化和 形成独特的不同细菌鉴定系统。如、、、和等系统。这种鉴定系统是自动化鉴定系统的基础。 ( 一)数码鉴定法基本原理 数码鉴定是指通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立数据库或编成检索 本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字（编码），查阅检索本或数据库，得到细菌名称。其基本原理是计算并 比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。随着电脑技术的进步，这一过程已变得非常容易。 1．简要介绍计算步骤： (1)出现频率（概率）的计算：将记录成阳性或阴性结果转换成出现频率：①对阳性特征，则除以100即得。②对阴性特征，除以1
00的商被1减去即可。③说明：对“0”和“100”，因这2个数太超量，为了使结果不出现过小或过大，而用相似值0.01或0 .99值代替。 (2)在每一个分类单位中，将所有测定项目的出现频率相乘，得出总出现频率。 (3)在每个分类菌群中的所有菌的总出现频率相加，除以一个分类单位的总出现频率，乘100，即得鉴定%（） (4)在每个菌群中，再按值大小顺序重新排列。将未知菌单次总发生频率除以最典型反应模式单次总发生频率，得到模式频率T 值，代表个体与总体的近似值。T值越接近1，个体与总体越接近，鉴定价值越大。按大小排序，将相邻两项的之比为R， 代表着首选条目与次选条目的差距，差距越大，价值越大。如果≥80，参考T及R值可作出鉴定。 2．在编码检索本中检索数据谱得出的结果有以下几种形式（以鉴定系统为例）。 (1)有此数码谱:①有一个或几个菌名条目及相应的鉴定值（和T值）。②对鉴定结果好坏的评价，最佳……等。 ③用小括号列出关键的生化结果及阳性百分率。④有时，鉴定结果不佳或有多条菌名条目,需进一步补充试验项目才能得出良好的鉴定结 果。⑤指出某些注意要点，需用“推测性鉴定”，并将此菌送至参考实验室；需用“血清学鉴定”，作进一步的证实等。 (2)无此数码谱：可能有以下原因：①此生化谱太不典型。②不能接受，鉴定值低(＜80.0)。③可疑。需进一步确认是否 纯培养，重新鉴定，可与供应商技术服务部联系。 3. 结果解释
微生物鉴定的生理生化反应 各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。 一、碳水化合物的代谢试验 1．糖（醇、苷）类发酵试验 （1）原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。 (2)方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，见表6-4-1。将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。 (3)结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。不分解糖则无变化。 (4)应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。 表6-4-1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类 单糖四碳糖：赤藓糖, 五碳糖：核糖核酮糖木糖阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖果糖半乳糖甘露糖 双糖蔗糖（葡萄糖＋果糖）乳糖（葡萄糖＋半乳糖）麦芽糖（两分子葡萄糖）三糖棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖） 多糖菊糖（多分子果糖）淀粉 醇类侧金盏花醇卫茅醇甘露醇山梨醇 非糖类肌醇 2．葡萄糖代谢类型鉴别试验 (1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。 (2)方法：挑取少许纯培养物（不要从选择性平板中挑取）接种2支HL培养管中，在其中一管加入高度至少为0.5cm的无菌液体石蜡以隔绝空气（作为密封管），另一管不加（作为开放管）。置35℃孵箱孵育48h以上。。 (3)结果：两管培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；两管都产酸（变黄）为发酵型；加液体石蜡管不产酸，不加液体石蜡管产酸为氧化型。
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微生物鉴定指导原则
本指导原则为非无菌产品微生物限度控制菌检查中疑似菌的鉴定， 以及药物 原料、辅料、制药用水、生产环境、中间体和终产品中检出微生物的鉴定提供指 导。当微生物的鉴定结果有争议时，以《伯杰氏系统细菌学手册》 (《Bergey， s Manual of Systematic Bacteriology》)现行版的鉴定结果为准。 微生物鉴定是指借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其 进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程，它是药 品微生物检验中的重要环节， 药典附录相应章节中对检出微生物的鉴定做了明确 规定，如“非无菌产品的微生物检查:控制菌检查” （通则 1106）中选择培养 基或指示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定； 对“无菌检查法” （通则 1101） 的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定，以判定试验是否重试；药品洁净实验 室微生物监测和控制指导原则（通则 9203）建议对洁净室和其他受控环境分离 到的微生物进行鉴定，以掌握环境微生物污染情况，有助于污染调查。此外，在 药品生产中，有时亦需对药物原料、辅料、制药用水、生产环境、中间产物和终 产品中检出的微生物进行适当水平的鉴定。 微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定和菌株分型。大多数 非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中， 对所检出微生物的常规 特征包括菌落形态学、细胞形态学(杆状、球状、细胞群、孢子形成模式等)、革 兰染色或其它染色法，某些能够给出鉴定结论的关键生化反应(如氧化酶、过氧 化氢酶和凝固酶反应)进行分析，一般即可满足需要；非无菌药品产品的控制菌 检查应达到种的水平；无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培养基灌装） 失败时，对检出的微生物鉴定一般需达到菌株水平。 一、微生物的鉴定程序 微生物鉴定的基本程序包括分离纯化和鉴定，鉴定时，一般先将待检菌进行 初步的分类。鉴定的方法有表型微生物鉴定和基因型微生物鉴定，根据所需达到 的鉴定水平选择鉴定方法。微生物鉴定系统是基于不同的分析方法，其局限性与 方法和数据库的局限性息息相关， 未知菌鉴定时通过与微生物鉴定系统中的标准 微生物（模式菌株）的特征(基因型和/或表型)相匹配来完成。如果数据库中没 有此模式菌株，就无法获得正确的鉴定结果。在日常的微生物鉴定试验中，用户
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福建农林大学考试试卷（A卷） 2006 —2007 学年第二学期 课程名称：植物生理生化实验考试时间90分钟 专业年级班学号姓名___ 一、名词解释（每小题2分，共20分） 1、标准曲线： 2、离心技术： 3、同工酶： 4、酶活力： 5、诱导酶： 6、呼吸速率： 7、种子生活力： 8、抗逆性： 9、超氧化物歧化酶（SOD）： 10、光合速率： 二、填空题（每格1分，共32分） 1、测定植物组织中可溶性蛋白质含量的方法有_______________________、________________和___________________等。 2、在测定植物可溶性蛋白质含量时，绘制标准曲线是以为横坐标，以_ 为纵坐标。 3、用茚三酮显色法测定植物组织氨基酸含量时，茚三酮溶液与氨基酸共热生成_________，
_________与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成________________。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成_________，可通过测定__________nm处的光密度，求出氨基酸的含量。 4、在测定淀粉酶的活性时：α－淀粉酶不耐，β－淀粉酶不耐。 5、测定淀粉酶活性时，3，5－二硝基水杨酸试剂（DNS）的作用是_______________________和__________________。 6、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶实验中，电泳存在三大效应，分别是______________、________ ____ 和。 7、测定硝酸还原酶活性的方法有___________________和_________________________。 8、类胡萝卜素吸收光谱最强吸收区在_____ ，它不仅可以吸收传递光能，还具有_______ 的作用。 9、叶绿素溶液在透射光下呈色，在反射光下呈色。 10、在研究植物矿质元素中,常用的植物溶液培养法有__ 、 __ 和 __________。 11、水培时要选用黑色容器装营养液，这是为了防止______ 。 12、常用________ 法确定植物生长的必需元素。 13、用活体法测定硝酸还原酶的材料，取样前叶子需进行一段时间的光合作用，以积累_______________，产生更多________________，加速硝酸盐的还原。 14、植物光合速率测定方法有__________________和_________________等。 三、选择题(每题1分，共10分) ） A、底物浓度必须极大于酶浓度 B、酶浓度必须极大于底物浓度， D、酶能提高反应的平衡点C、与底物浓度无关 2、蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在（）波长处。 A、260nm B、650nm C、540nm D、280nm 3、斐林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质浓度时，应选用的波长是（）。 A、260nm B、650nm C、540nm D、280nm 4、叶绿素提取时，叶片匀浆时加入少许CaCO3，其目的是（） A、使研磨更充分 B、加速叶绿素溶解 C、使叶绿素a、b分离 D、保护叶绿素 5、一般而言，正常植物叶片的叶绿素与类胡萝卜素的比值为（） A、2:1 B、3:1 C、1 :2 D、1:3
实验六微生物的生理生化反应 一、实验目的 掌握细菌鉴定中主要生理生化反应的常规实验法。 二、实验原理 由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。具体个原理如下： 1、淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种两种细菌（1—枯草杆菌，5—大肠杆菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。 2、明胶水解试验：穿刺接种于明胶培养基中的细菌，若能产生明胶酶利用明胶，则该培养基在4摄氏度条件下会处于液体状态，从而区别于正常条件下4摄氏度时固态的明胶培养基。 3、糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 4、IMVC实验包括四个试验，主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水环境的细胞血检查。 ①吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。本次不做该试验。 ②甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙算和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。 ③柠檬酸盐利用试验：有些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一的碳源，而有些细菌则不能利用。由于细菌不断地利用柠檬酸盐并生成碳酸盐，使培养基PH由中性变为碱性，培养基中的指示剂有浅绿色变为蓝色。 ④伏-普试验（乙酰甲基甲醇试验 VP）：某些细菌在代谢过程中，能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸在羧化酶的催化下脱羧后形成活性乙醛，后者与丙酮酸缩合，脱羧形成乙酰甲基甲醇，或者乙醛化合生成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下被空气中的氧气氧化成二乙酰，二乙酰与培养基中含有胍基的化合物起作用生成红色化合物，即为VP试验阳性。 三、材料和器皿 ⑴ 菌种：1号—枯草杆菌，5号—大肠杆菌，7号—产气杆菌； ⑵培养基：淀粉培养基平板（1个），明胶培养基（2个），葡萄糖培养基（2个），葡萄糖蛋白胨水培基（4个），柠檬酸盐培养基斜面（2个）； ⑶试剂：卢氏碘液，溴甲酚紫指示剂，甲基红指示剂，溴麝香草酚兰指示剂，氢氧化钾，α—萘酚。 四、实验步骤
山东大学实验报告2012年 12 月 4日 姓名系年级 2011级生科2班组别四 科目微生物学实验题目微生物的生理生化反应 微生物的生理生化反应 一、【实验目的】 1. 证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。 2.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠细菌坚定中的重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5. 了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 二、【实验仪器与试剂】 菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌培养基：培养基：固体淀粉培养基、固体油脂培养基（大分子水解试验）；葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基（内装有倒置的德汉氏小管）（糖发酵试验）；蛋白胨水培养基（吲哚试验）；葡萄 糖蛋白胨水培养基； 试剂：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水、 仪器：酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管 三、【实验原理】 1.在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程，由于各种 微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。 2.淀粉的水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质 分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。 3.油脂的水解：在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后观察菌苔的颜色，若出现红色斑点，则说 明此中菌可产生分解油脂的酶。 4.糖发酵试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数 细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气. 例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。产酸后再加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 5.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。 （1）吲哚试验：是用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并 非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测
常用生化试验 一．糖、醇发酵试验 1.糖、醇发酵试验原理：各种细菌因含有发酵不同糖、醇的酶，所以分解糖、醇的能力个不相同。有的能分解某些糖、醇类，有的则不能分解。有的分解某些糖、醇类发酵产酸产气，有的仅产酸，而不产气。根据这些特点，可鉴别细菌。 培养基：糖发酵试验应用的培养基种类很多，大致可分为液体，半固体，固体（高层、斜面）等几类。可根据试验的要求和细菌的特性来选择。 2.乙酰甲基甲醇试验（V-P 试验） 原理：某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，并将丙酮酸脱羧，变为乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境下，被空气中的氧氧化成二乙酰，二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色的化合物。故在培养基中加入少量含胍基的化合物，如肌酸、肌酐可增加胍基含量。试验中加入的 a -萘酚为催化剂，可加速此反应，使反应颜色增加， 提高反应的敏感性。大肠埃希菌不能将丙酮酸脱羧，故V-P 试验呈阴性。培养基：磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基 3.甲基红试验（MR 试验）原理：许多细菌如大肠埃希菌等，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再次被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，这样使培养基的PH 降至 4.5 以下。这时加入甲基红指示剂呈红色。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醛、气体和水等），则培养基的酸度仍在PH6.2 以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性反应。培养基：磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基 MUG 葡萄糖醛酸苷酶试验 原理：细菌的葡萄糖醛酸苷酶在碱性条件下，作用于4-甲基伞形酮-3 -D葡萄糖醛酸甘 （4-Methylumbelliferyl- 3 -D-glucuronide简称MUG ）的3葡萄糖醛酸甘键，使其水解，释 放的4-甲基伞形酮在366nm 紫外灯下产生蓝白色荧光。 培养基：MUG 培养基 4.3-半乳糖苷酶试验 原理：肠杆菌科细菌发酵乳糖，依靠半乳糖苷渗透酶和3-半乳糖苷酶两种不同的酶作用， 能水解邻硝酸酚-3-D 半乳糖苷（O-nitrophenyl- 3-D-galactopyranoside,ONPG ），而释放出黄色 的邻硝酸酚。发酵乳糖的细菌具有上述两种酶，可迅速分解乳糖。迟缓发酵乳糖的细菌只有 3■半乳糖苷酶，而缺少半乳糖苷渗透酶或是其活性很弱，不能将乳糖很快运送到菌细胞内，
植物生理学实验指导 Prepared on 24 November 2020
植物生理学实验指导
目录
植物材料的采集、处理与保存 植物生理实验使用的材料非常广泛，根据来源可划分为天然的植物材料（如植物幼苗、根、茎、叶、花等器官或组织等）和人工培养、选育的植物材料（如杂交种、诱导突变种、植物组织培养突变型细胞、愈伤组织、酵母等）两大类；按其水分状况、生理状态可划分为新鲜植物材料（如苹果、梨、桃果肉，蔬菜叶片，绿豆、豌豆芽下胚轴，麦芽、谷芽，鳞茎、花椰菜等）和干材料（小麦面粉，玉米粉，大豆粉，根、茎、叶干粉，干酵母等）两大类，因实验目的和条件不同，而加以选择。 植物材料的采集和处理，是植物生理研究测定中的重要环节。在实际工作中，往往容易把注意力集中在具体的仪器测定上，而对于如何正确地采集和处理样品却不够注意，结果导致了较大的实验误差，甚至造成整个测定结果的失败。因此，必须对样品的采集、处理与保存给予足够的重视。 一、原始样品及平均样品的采取、处理 植物生理研究测定结果的可靠性（或准确性），首先取决于试材对总体的代表性，如果采样缺乏代表性，那么测定所得数据再精确也没有意义。所以，样品的采集除必须遵循田间试验抽样技术的一般原则外，还要根据不同测定项目的具体要求，正确采集所需试材。目前，随着研究技术的不断发展，应该不断提高采样技术的水平。 在作物苗期的许多生理测定项目中都需要采集整株的试材样品，在作物中后期的一些生理测定项目中，如作物群体物质生产的研究，也需要采集整株的试材样品，有时虽然是测定植株的部分器官，但为了维持器官的正常生理状态，也需要进行整株采样。 除研究作物群体物质生产外，对于作物生理过程的研究来说，许多生理指标测定中的整株采样，也只是对地上部分的采样，没有必要连根采样，当然对根系的研究测定例外。采样时间因研究目的而不同，如按生育时期或某一特殊需要的时间进行。除逆境生理研究等特殊需要外，所取植株应是能代表试验小区正常生育无损伤的健康植株。
（一）碳水化合物代谢实验 糖（醇、苷）类发酵实验 （1)原理：细菌分解糖的能力与该菌是否含有分解某种糖的酶密切相关，故分解糖的能力各不相同，细菌分解糖类后的终产物亦不一致，在含糖培养基中加入指示剂，若细菌分解糖则产酸或产酸产气，使培养基颜色改变，从而判断细菌是否分解某种糖或其他碳水化合物。（2)基本培养基：在培养基中加入0.5%-1%的糖类（单糖、双糖、或者多糖）、醇类（甘露醇、肌醇）苷类（水杨苷、菊糖等).培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。 （3)实验方法：取某一种细菌的24h纯培养物分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖等培养基内，37℃培养24h，观察结果并记录。 （4)结果判定：如果接种进去的细菌可以发酵某种糖或醇，则可产酸，使培养基由紫色变成黄色，如果不发酵，则仍保持紫色。如发酵的同时又产生气体，则在微量发酵管顶部积有气泡。 （5)应用：是鉴定细菌最主要最基本的实验，特别是对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。 氧化型与发酵型（O/F)的测定 （1）原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必需有氧的参加，称为氧
化型（O），细菌在分解葡萄糖过程中可以进行无氧降解的，称为发酵型(F)。发酵型细菌无论在有氧无氧的环境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的细菌称为产碱型(-)。这在区别微球菌与葡萄球菌、肠杆菌科成员中尤其有意义。 （2）培养基：培养基蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，葡萄糖10g，琼脂3g，1%溴麝香草酚蓝3mL，蒸馏水1000mL。将蛋白胨、盐、琼脂和水混合，加热溶解，校正PH至7.2，然后加葡萄糖和指示剂，加热溶解，分装试管，3-4mL/管；115℃，高压蒸汽灭菌20min，取出冷却成琼脂柱。 （3）试验方法：挑取18-24h的幼龄斜面培养物，穿刺接种，每种细菌接种两管，于其中一管覆盖1mL液体石蜡，37℃培养24h或更长时间。 （4）结果判定： （5）应用：O/F试验主要适用于G-肠道杆菌的鉴别。肠杆菌科的细菌为发酵型，其他肠道菌为非发酵型，非发酵型细菌为氧化型或产
大米和小麦赖氨酸、蛋白质、可溶性糖含量测定 大米和小麦是世界各国的主要粮食，更是我国各地的主食，研究分析它们的营养成分对人们日常生活的膳食有极高的指导意义。赖氨酸是人体必需氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用；蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命增强免疫功能； 糖类是人体新陈代谢的主要能源物质，可溶性糖为植物体内最易被人体吸收的糖。本文分析了大米和小麦赖氨酸、蛋白质和可溶性糖的含量，为大米和小麦的加工和开发利用以及人们日常膳食的搭配提供了参考。 1材料和方法 供示材料为云南农业大学购买的粗米粉和粗面粉，经过一定除杂处理。 赖氨酸含量的测定采用茚三酮法：赖氨酸侧链上的游离氨酸与茚三酮反应生成紫红色络合物，颜色深浅与赖氨酸含量正相关。蛋白质含量的测定采用双缩脲法：双缩脲与蛋白质反应发生紫红色反应，颜色深浅与蛋白质含量正相关。可溶性糖含量测定采用蒽酮法。 2结果与分析 2.1面粉和米粉中的赖氨酸含量 从表1可以看出，面粉和米粉的赖氨酸含量都极低，但很明显面粉赖氨酸含量远高于米粉赖氨酸含量。 表1 面粉和米粉中的赖氨酸含量 材料赖氨酸含量（%） 面粉0.16 米粉0.0369 2.2面粉和米粉中的蛋白质含量 从表2可以很明确的看出面粉和米粉中的蛋白质含量都较高且相差不明显，约在10%——15%之间。 表2 面粉和米粉中的蛋白质含量 材料蛋白质含量（%）
2.3面粉和米粉中的可溶性糖含量 表3 面粉和米粉中的可溶性糖含量 材料可溶性糖含量（%） 面粉 3.6 米粉0.43 显然，面粉和米粉中的可溶性糖含量都不高，相较而言，面粉中的可溶性糖含量远高于米粉。 通过分析3个实验的结果可知，在面粉和米粉中蛋白质含量是极高的，可以有效的补充人体所需蛋白质，赖氨酸和可溶性糖含量相对较低。 3讨论 赖氨酸是人体必须氨基酸，缺乏赖氨酸会造成疲劳，虚弱，恶心，呕吐，头晕，没有食欲，发育迟缓，贫血等。由于大米和小麦中的赖氨酸含量甚低，需要从其他富含赖氨酸的食物中摄取，如：肉类、禽、蛋、奶，鱼、虾、贝类、乳制品和豆类、黑芝麻等。 蛋白质同样是人体必须的物质，蛋白质的缺乏常见症状是代谢率下降，对疾病抵抗力减退，易患病，远期效果是器官的损害，常见的是儿童的生长发育迟缓、体质量下降、淡漠、易激怒、贫血以及干瘦病或水肿，并因为易感染而继发疾病。2000年，中国营养学会重新修订了推荐的膳食营养素摄入量，新修订的蛋白质
微生物常规鉴定技术 一、形态结构和培养特性观察 １、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 ２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。 １）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。 ２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。
革兰氏染色: 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色 步骤： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。 （2）晾干：与简单染色法相同。 （3）固定，与简单染色法相同 （4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。 （5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。 （6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。 （7）水洗：用水洗去碘液。 （8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。 （9）复染：滴加蕃红复染5min。 （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。 （11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 （12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。 （13）实验完毕后的处理： ①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦 去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。c.再用干净的擦镜纸将 镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。 ②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干
植物生理学实验考试试题
一、名词解释： 1、标准曲线：用标准溶液制成的曲线。先配制一系列不同浓度的标准溶液, 在溶液吸收最大波长下, 逐一测定吸光度,然后用坐标纸以溶液浓度为横坐标, 吸光度为纵坐标作图, 若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律, 必然得到一条通过原点的直线, 即标准曲线。 4、氮素代谢：氮素及含氮的活体物质的同化异化和排泄，总称为氮素代谢。 5、淀粉酶：是水解淀粉和糖原的酶类总称。 6、真空渗入：指将叶片打孔放入注射器中，加水浸没，排出空气后用手指堵住前端小孔，同时把活塞向外抽拉，即可造成减压而排出组织中的空气，轻放活塞，水液即进入组织的方法。 7、离心技术：是根据物质颗粒在一个离心场中的沉降行为而发展起来的。它是分离细胞器和生物分子大分子物质必备的手段之一，也是测定某些纯品物质的部分性质的一种方法。 8、电泳：各种生物大分子在一定pH 条件下，可以解离成带电荷的颗粒，这种带电颗粒在电场的作用下向相反电极移动的现象称为电泳。 9、同工酶：凡能催化同一种化学反应但其分子结构和带电性质不同的一组酶称为同工酶 10、迁移率：指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。 11、聚丙烯酰胺凝胶：是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。 20、超氧化物歧化酶（SOD）：普遍存在动植物体内的一种清除超氧阴离子自由基Ｏ2 的酶。 21、硝酸还原还原酶：是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸。 22、诱导酶：又称适应酶，指植物体内本来不含有，但在特定外来物质的诱导下诱导生成的酶。如硝酸还原酶可为NO3-所诱导生成。 二、填空： 1、测定植物可溶性蛋白质含量时，绘制标准曲线是标准蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标。 2、常用的测定植物可溶性蛋白质含量的方法有：Folin-酚试剂法(Lowry 法) 、双缩脲法、考马斯亮蓝法和紫外吸收法。 4、用滴定法测Vc 含量时，若样品本身带有颜色，则需先将样品用草酸处理。 5、测定淀粉酶活性时，3，5－二硝基水杨酸试剂（DNS）的作用是与还原糖显色生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸和终止酶活性。 6、在测定淀粉酶的活性时：α－淀粉酶不耐_酸_，β－淀粉酶不耐_热_。
微生物的生理生化反应 姓名：王雪学号：201500140130 班级：2015级四班2组同组者：张彬、田文娅 一、实验目的 1、证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不通过的酶系统。 2、掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 3、了解糖发酵的原理，掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 4、了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 二、实验原理 微生物的生理生化反应原理：在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢。代谢过程主要是酶促反应过程。许多细菌产生胞外酶，这些酶从细胞中释放出来，以催化细胞外的化学反应。各种细菌由于具有不同的酶系统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可以利用相同的底物，却产生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别细菌。 大分子水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.将大分子物质分解的过程可以通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。 脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的PH，使PH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后观察菌苔的颜色，若出现红色斑点，则说明此中菌可产生分解油脂的酶。 糖发酵试验：是常用的鉴别微生物的生化反应。某些细菌能利用糖类作为碳源和能源，使糖类分解为产酸产气或产酸不产气。不同种的细菌对于各种糖类利用能力不同，分解产物也不同。大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；普通变形杆菌只能分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（PH6.8）转变为黄色（PH5.2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。 吲哚实验：用来检测吲哚的产生，有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都
1 《植物生理生化实验》综合性实验总结 （2010-2011学年第一学期） 课程：《植物生理生化实验》—生化实验21学时 成绩： NaCl 溶液浸种对水稻种子萌发过程若干生化指标的影响 综 合 性 实验项目 面向专业 09级农学、植保、农资、园艺、设施、茶学、林学、水保、制药、生安等 本项目学时 14学时 （总学时45） 综合性实验总结报告： 题目：NaCl 溶液浸种对水稻种子萌发过程若干生化指标的影响。 摘要：目的：为农作物的耐盐育种和栽培提供试验数据。方法：将水稻种子分别用蒸馏水、60mmol/LNaCl 、600mmol/LNaCl 溶液浸种，本实验通过研究水稻种子在被不同浓度NaCl 浸种和清水浸种后的各种生理活性比较，运用分光光度计、离心机、电泳仪等仪器的使用方法以及电泳技术的基本操作、标准曲线的制作，找出水稻种子的耐盐程度和最适发育环境，探讨了NaCl 溶液浸种对水稻种子萌发过程若干生化指标的影响。结果：表明NaCl 溶液浸种对水稻种子萌发过程若干生化指标的影响与NaCl 溶液的浓度有关。在1~60mmol/L 的NaCl 溶液浸种能提高水稻种子的活力及淀粉酶、过氧化物酶、脂肪酶的活力，提高游离蛋白质的含量和降低游离氨基酸的含量，并且能促进水稻幼苗茎、叶和根系的生长。当浓度超过1~600mmol/L 时，浸种会降低水稻种子的活力及淀粉酶、过氧化物酶、脂肪酶的活力，降低蛋白质的含量和提高游离氨基酸的含量，并且水稻种子的萌发及幼苗的生长受到抑制。结论：低浓度的NaCl 溶液比高浓度的NaCl 溶液的促进效果更好。 关键词：生化指标、高低盐水处理、水稻种子 1.前言： 随着人口的增长和经济的发展，人类对农产品的需求量逐渐增大，由于土地的局限性，所以如何提高农作物的生长及生产的研究程度进一步加大。特别对于中国这个既是人口大国又是农业大国的国家来说，如何提高水稻的萌发及生长和生产的研究是非常重要的。本文研究了研究了高低浓度浸种处理对水稻种子萌发的剂量效应，选择最佳浓度和界定临界浓度，为提高水稻的高产和耐盐育种及栽培提供试验数据。 2.材料与方法： 2.1材料：同品种的60mmol/L 的NaCl 溶液和600mmol/LNaCl 溶液浸泡的新鲜水稻种子。 2.2方法： ①游离氨基酸总量测定②可溶性蛋白质含量的测定③淀粉酶活性的测定④过氧化物酶同工酶测定 2.2.1提取：准确称取分别在60mmol/L 的NaCl 溶液和600mmol/LNaCl 溶液浸泡的新鲜水稻种子1.0g ，置于研钵中，加入2ml 蒸馏水和少量石英砂充分研磨成匀浆。将匀浆倒入离心管中，，并且用蒸馏水洗涤残渣至离心管中。然后放在3000r\min 离心10min,将上清液倒入100ml 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀。 2.2.2检测：①取样品滤液1.0ml,放入20ml 试管中，加入蒸馏水1.0ml 加入0.5ml 乙酸- 氯酸盐缓冲液和3.0ml 水和茚三酮，根据吸光度在曲线上查得用回归方程计算 ②吸取上清液1.0ml 于试管中（另取一只试管加入1.0ml 蒸馏水作为空白），按照标准曲线制作的步骤加入试剂显色并测定其吸光度。 ③取10样品稀释极为淀粉酶稀释液，按照步骤加入试剂和反应后得到酶液，在540nm 波长下比色，记录结果。 ④制作胶体、点样、电泳 、剥胶染色、绘制酶谱条带。 2.2.3计算：①检测公式：氨基酸含量=(C*Vt*100)/(Vs*W) C ——标准曲线上查得的氨 实 验 内 容 简 介 本综合项目以水稻种子为材料，分别用蒸馏水、60ml /LNaCl 和600ml /LNaCl 溶液浸种→催芽→测定不同处理的发芽种子的游离氨基酸、可溶性蛋白质、淀粉酶和同工酶项目。实验要求：掌握分光光度计、离心机、电泳仪等仪器的使用方法以及电泳技术的基本操作、标准曲线的制作，并综合分析NaCl 浸种胁迫对水稻种子生理特性的影响机制。