生物反应工程原理复习资料
生物反应过程与化学反应过程的本质区别在于有生物催化剂参与反应。
生物反应工程是指将实验室的成果经放大而成为可提供工业化生产的工艺工程。
酶和酶的反应特征
酶是一种生物催化剂，具有蛋白质的一切属性；具有催化剂的所有特征；具有其特有的催化特征。
酶的来源：动物、植物和微生物
酶的分类：氧化还原酶、水解酶、裂合酶、转移酶、连接酶和异构酶
酶的性质：1）催化共性：①降低反应的活化能②加快反应速率③不能改变反应的平衡常数。
2)催化特性：①较高的催化效率 ②很强的专一性 ③温和的反应条件 易变性和失活
3）调节功能：浓度、激素、共价修饰、抑制剂、反馈调节等
固定化酶的性质
固定化酶：在一定空间呈封闭状态的酶，能够进行连续反应，反应后可以回收利用。
与游离酶的区别：
游离酶----一般一次性使用（近来借助于膜分离技术可实现反复使用）
固定化酶--能长期、连续使用（底物产物的扩散过程对反应速率有一定的影响；一般情况下稳定性有所提高；以离子键、物理吸附、疏水结合等法固定的酶在活性降低后，可添加新鲜酶溶液，使有活性的酶再次固定，“再生”活性）
固定化对酶性质的影响：底物专一性的改变 、稳定性增强 、最适pH 值和最适温度变化、动力学参数的变化
单底物均相酶反应动力学
米氏方程
快速平衡法假设：（1）CS>>CE ，中间复合物ES 的形成不会降低CS （2）不考虑
这个可逆反应（3） 为快速平衡， 为整个反应的限速阶段，因此ES 分解成产物不足以
破坏这个平衡
稳态法假设：（1）CS>>CE ，中间复合物ES 的形成不会降低
CS （2）不考虑
双倒数法（Linewear Burk ）： 对米氏方程两侧取倒数 得 以 作图 得一直线，直线斜率为 ，截距为 根据直线斜率和截距可计算出Km 和rmax
抑制剂对酶反应的影响：
失活作用（不可逆抑制）
抑制作用（可逆抑制 ）：竞争抑制 、反竞争抑制 、非竞争抑制 、 混合型抑制
竞争抑制反应机理：
非竞争抑制反应机理：
可逆抑制各自的特点：P37
多底物均相酶反应动力学 (这里讨论：双底物双产物情况 )
强制有序机制
顺序机制 西-钱氏机制
双底物双产物反应机制： 随即有序机制
乒乓机制
注意
在工业级反应中， 反应速度一般是由改变所用酶浓度和（或）反应时间，而不是改变底物浓度来控制的，并且要测定的最重要参数是可测的转化率，而不是反应速度
酶失活的因素有哪些？
酶会由于种种因素发生失活。其中热失活最重要。酶的热失活随温度升高而失活程度加剧。物理因素有：加热、冷却、机械力 化学因素有：酸、碱、盐、溶剂、表面活性剂、重金属、蛋白酶。
酶失活过程的动力学
S m C r K r r 111max max
+=S C r 1~1Q P B A +→+P E ES +←ES S E ?+P E ES +→0=dt dC ES
未反应时的失活动力学 表征方法（数学模型）：一级失活模型 注: E --具有活性的酶
D --失活的酶
kd --衰变常数
模型中：
δ＝1时，底物对酶失活无影响
δ＝0时，酶完全被底物所保护
0<δ<1时，底物对酶有部分保护作用
δ>1时，底物加速酶的失活
因此，称δ为底物对酶稳定性影响系数
影响固定化酶促反应的主要因素:
子构象的改变、位阻效应、微扰效应、分配效应 （可用Kp 定量描述）、扩散效应 （可定量描述） 评价酶反应器指标：转化率、产率、选择性、停留时间 均相酶反应器的分类：
批式反应器（间歇反应器）
按操作方式 连续反应器
半间歇反应器
批式反应器 将底物一次加入反应器内，在反应的过程中无底物和产物的输入和输出，底物和产物的浓度
随反应时间变化
连续反应器 底物等连续输入反应器，产物连续从反应器输出，反应器的任何部位的各组分均不随反应时
间变化（稳定态）
半连续反应器 在一次反应的过程中，底物分次补入
批式全混型反应器（间歇式搅拌罐反应器）（batch stirred-tank reactor ， BSTR ）
连续全混型反应器（连续式搅拌罐反应器）（continuous stirred-tank reactor ，CSTR ）
活塞流反应器（plug flow reactor ，PFR ）
全混流——流入的液体在装置内瞬间完全混合。也就是说，各组分的浓度及粒子的分散无论在什么地方都完全相
同。
活塞流——反应器内反应液象活塞样的流动。通过装置的液体在垂直于从入口到出口的流向的方向上的速率完全相同，在流动方向上既没有混合也没有扩散。
非均相酶反应器
用于由固定化酶催化的非均相反应的反应器
非均相酶反应器的类型及结构设计要考虑：固定化酶更换操作难易 底物性质 反应体系粘度 PH 值范围控制等因素
非均相酶反应器有：
搅拌罐反应器
可以是：批式的BSTR （一般只适用于实验室研究，如用于工业生产，则每批反应结束都要进行固液分离）
连续式的CSTR （更适宜与工业生产，但应在出口处设置过滤器防止固定化酶颗粒的流失）
固定床反应器 是最广泛适用的固定化酶反应器。
缺点：对固定化酶颗粒的强度要求高；液相的连续流动致温度和PH 控制难。
优点：连续操作、负载力大、效率高、生产能力大等
操作：液相的流速和Re 数都采用较小值、延长停留时间将有利于达到一定的转化率
流化床反应器 流化流速范围窄，不易工业应用。
缺点：流化态要求流体流速必须提高到一定程度致停留时间不足、转化率不能足够高（克服办法：部分反应液回补再循环）
优点：1液相和固相的微环境较易控制2传热、传质性能好3不会堵塞4 能处理微小粉末状底物
5固定化酶颗粒可以做得足够小（ 可以足够高）
细胞反应工程
D
E d k →
细胞的基本特征：
菌体成分：由80%左右的水分，以及蛋白质、糖、脂类、核酸、维生素和无机物等构成。
物理性质：
密度：单细胞微生物的密度会因培养条件而异；菌体絮凝物及菌丝团的湿密度近似于水（流化速率低）；低浓度单细胞菌体悬浮液为牛顿流体；一般，含菌丝的培养液显示非牛顿流体特性；分泌了大量高分子化合物的菌体悬浮液为非牛顿流体（非牛顿流体的搅拌和通气效果很差）
微生物反应的特征：
特点：常温常压不爆炸、主要原料碳源价廉源广、反应过程受生物的自控 、产高分子和特异反应易进行、细胞本身也是产品、遗传改变可大幅度改良性能或获得新性能
但是 ：1底物相当多地用于繁殖；2副产物较多、反应条件影响产品品质；
3容易发生遗传变异，有利于维持性能稳定的固定化技术不成熟
细胞反应的计量
得率系数
细胞（菌体）得率：
YX/S=生成菌体的干重 / 消耗底物的质量=微生物生长速率 / 底物消耗速率
产物得率：YP/S=代谢产物的生成量 / 底物消耗量
碳得率（碳转化率）：
YC=生成物含碳量/消耗的碳量=生成的菌体量×菌体含碳量/消耗的碳源量×碳源的含碳量
细胞反应的化学平衡通式
对忽略产物生成的细胞生长过程的计量关系可表示为
C m H n O l +a O2+b NH3 c C αH βO δN γ+d CO2+e H2O
底物碳源 氮源 细胞
对C 元素： （1）
对H 元素： （2）
对O 元素： （3）
对N 元素： （4）
上述4个细胞反应的计量方程，不足以计算a 、b 、c 、d 、e 等5个未知量，因而再寻找1个方程
如在好氧型培养时，可定义呼吸商（仪器测定）作为第5个方程；
（5）
或采用还原度平衡的方法（C=4，H=1，N=-3，O=-2，P=5，S=6）
联立1～5式，有 解得细胞反应方程的a 、b 、c 、d 、e 等5个系数 例：某以葡萄糖为底物的微生物细胞培养过程，有2/3的碳转化为细胞。其细胞培养的反应方程为 C6H12O6+a NH3+b O2=c C4.4H7.3O1.2N0.86+d H2O+e CO2 葡萄糖 微生物细胞
（1）试确定计量系数a 、b 、c 、d 、e ；
（2）试计算其细胞对底物的得率YX / S ；
（3）试计算呼吸商RQ 。
解：（1）细胞反应的方程式系数的计算
1mol 葡萄糖所含有的C 元素为72g ，根据题意
1mol 葡萄糖转化为微生物细胞的C 元素为： g 则有：转化为CO2的C 元素为： g 则： ，
对N 元素平衡，有：
对H 元素平衡，有： 对O 元素平衡，有： ，
所以：
a = 0.782，
b =1.473，c=0.909，d =3.855，e =2 d
c m +?=αe c b n 23+?=?+βe
d c a l ++?=+22δc b ?=γ
a d RQ /=???????? ??=???????? ??????????? ??----0001000010120220300100l n m e d c
b a RQ γδβα()483/272=?909.0124.448=?=
c 244872
=-e 1224=2=e 782.086.0==c a d c a 23.7312+=+e d c b 22.126++=?+
即：
C6H12O6+0.782NH3+1.473O2=0.909C4.4H7.3O1.2N0.86+3.855H2O+2CO2
（2）细胞对底物的得率YX / S 的计算
（3） 呼吸商RQ 的计算
呼吸商的计算
比消耗速率
比生成速率
微生物反应动力学
模型的分类： 有，按是否对细胞的生长进行平衡生长化假设，分的类型：结构模型、非结构模型（非平衡生长时，采用结构模型）
有，按是否考虑细胞群体中的个体的随机（即时）变化，分的类型：随机性模型、确定性模型（当细胞浓度在104个/ml 以下时，需足够重视个体的影响，采用随机性模型如，灭菌动力学；发酵过程中，细胞浓度经常在107~1010个/ml 范围内，可忽略个体的影响，采用确定性模型）
平衡生长条件下微生物细胞的生长速率rx 的定义式为
式中X 为微生物的浓度，μ为微生物的比生长速率，其除受细胞自身遗传信息支配外，还受环境因素所影响。
由上式可知，μ与倍增时间(doubling time) td 的关系为： 定义，比生长速率 （1/h ）： 为细胞的生长速率（g.DCW/L.h ）； 为细胞的质量浓度（g.DCW/L ） Monod 方程
注： --------比生长速率（h-1）
--------最大比生长速率（h-1） --------
饱和常数（g/L ） --------限制性底物浓度（g/L ）
代谢产物的生成动力学根据产物生成速率与细胞生成速率之间的关系，将其分成三种类型。
相关模型,是指产物生成与细胞生长呈相关的过程。产物是细胞能量代谢的结果。此时产物通常是基质的分解代谢产物。例如：乙醇、葡萄糖酸等。
部分相关模型,反应产物生成与基质消耗仅有间接的关系。产物是能量代谢的间接结果。在细胞生长期内，基本无产物生成。属于这类的有柠檬酸和氨基酸的生产等。
非相关模型,产物的生成与细胞的生长无直接关系。在微生物生长阶段，无产物积累，当细胞停止生长，产物却大量生成。属于这类的有青霉素等二级代谢产物的生产。
微生物反应器操作
深层培养的几种方式：
? 分批式操作（batch operation ）：是指基
质一次性加入反应器内，在适宜条件下将微
生物菌种接入，反应完成后将全部反应物料
取出的操作方式
? 半分批式操作（semi-batch operation ）：又
称流加操作，是指先将一定量基质加入反应器
内，在适宜条件下将微生物菌种接入反应器中，
反应开始，反应过程中将特定的限制性基质按
照一定要求加入到反应器内，以控制限制性基
质保持一定，当反应终止时取出反应物料的操
作方式 。
? 反复分批式操作（repeated batch operation ）：
指分批操作完成后，不全部取出反应物料，剩余部分重新加入一定量的基质，再按照分批式操作方式，反复进行。
? 反复半分批式操作（repeated semi-batch operation ）：是指流加操作完成后，不全部取出反应物料，剩余部d
d t t 693.02ln ==μ][X r X ≡μ]
[X [][]
S K S S +=max μμμm ax
μS K []S
分重新加入一定量的基质，再按照流加操作方式进行，反复进行。
连续式操作（continuous operation)：是指在分批式操作进行到一定阶段，一方面将基质连续不断地加入
反应器内，另一方面又把反应物料连续不断的取出，使反应条件（如反应液体积等）不随时间变化的操作方式。
分批式培养过程的状态方程式（环境过程的状态方程式）可表示为：
基质：基质（底物）消耗速率
基质（底物）比消耗速率 菌体：dX/dt=μX 产物：产物的生成速率 产物的比生成速率 流加操作的2种方式：无反馈和有反馈各有什么特点？
前者包括定流量流加、指数流加和反馈控制流加操作等。后者分间接控制、直接控制、定值控制和程序控制等流加操作。
连续操作有两大类型，即CSTR （continuous stirred tank reactor ）型和CPFR(continuous plug flow tulular reactor ）型。
根据达成稳定状态的方法不同，CSTR 型连续操作，大致可分为三种。一是恒化器法（chemostat ），二是恒浊器法（第三是营养物恒定法）。各有什么特点？
恒化器法是指在连续培养过程中，基质流加速度恒定，以调节微生物细胞的生长速率与恒定流量相适应的方法。 恒浊器法是指预先规定细胞浓度，通过基质流量控制，以适应细胞的既定浓度的方法。
营养物恒定法是指通过流加一定成分，使培养基中的营养成分恒定的方法。实际应用中多采用恒化器法 。（注意：恒化培养的冲出现象）
（恒化器法连续）
变化量=流入量+生成量-流出量
F 为反应液流入与流出速度L/h ，
V 为反应器内反应液的体积L ，
Sin 为流入液中限制性底物的浓度mol/L ，
S 为反应器内和流出液中限制性底物浓度mol/L ，
其余符号同前。
D 称为稀释率：
物质传递
以液相浓度为基准可得下式：
kL 为液膜传质系数；
kG 为气膜传质系数；
Ci 为气液界面上的平衡浓度；
C 为反应液主流中氧的浓度；
C*为与气相氧分压相平衡的氧浓度；
H 为亨利常数；
KL 为以液膜为基准的总传质系数。 气液界面附近氧传递的双膜理论模型
影响物质传递的因素？
如何提高氧的传质速率？
营养通过细胞膜的传递形式有：被动传递、主动传递、促进传递
体积传质系数的测定方法：亚硫酸盐法、溶氧电极法（包括动态法、稳态法）
生物反应器的放大
放大原则：即使是最常用的通气搅拌罐，其规模放大仍然存在许多问题，在很大程度上还需要逐级放大数据和实际经验应用理论分析和实验研究相结合的方法，总结生物反应系统的内在规律及影响因素，重点研究解决质量传递、动量传递和热量传递问题，使在反应器放大过程中尽可能维持生物细胞的生长速率、代谢产物的生成速率 细胞反应器放大的具体方法：
1几何尺寸的放大（Di ）；2通气量的放大（Q/V 、μs ）； 3以单位体积的通气量相同的原则放大
s s X S q x r C V V ≡==s s p p p q Y x r q ?==V F D /=
；4以通气线速度相同的原则放大；5以KL α相同的原则放大；6搅拌功率的放大（n ）； 7以流体雷诺数相同的原则放大；8以搅拌桨叶尖速度相同的原则放大；9以单位体积液体消耗功率 P/V 相等的原则放大。 几何尺寸的放大（Di ） D------------- 反应器直径 Di ------------- 搅拌器直径 V-------------- 反应器的装料容积 通气量的放大（Q/V 、μs ）
由
知：大罐的Q 要比小罐的小得多
以KL α相同的原则放大 经过实验和有关准数的整理，可把Q 与KLa 关联如下： 注： KLa-------体积溶氧系数（1/h ）
Q---------通风量（m3/min 、或vvm ）
V---------发酵液体积（m3）
HL--------发酵液深度（m ）
醒：实际反应体系KLa 的关联式具有随反应器结构和发酵体系的多变性
搅拌功率的放大（n ）
搅拌功率的放大实际上是n 和Di 的放大。若几何相似，则Di 一定，放大问题就只是选择搅拌转速n 的问题 （以流体雷诺数相同的原则放大） 细胞反应器中，此方法很少采用
得： 以搅拌桨叶尖速度（即剪切力）相同的原则放大
如果在小型设备中搅拌器所产生的最大剪切力已接近微生物的剪应力极限，这时就必须按搅拌器末端线速度相等来进行放大
这在利用丝状菌（霉菌、放线菌）进行的发酵过程中尤为明显，保证剪切力才利于菌丝体的分散和气泡的破裂细碎，才利于溶氧传质等维持反应正常进行的因素的达到
通常对大多数的生物发酵，搅拌叶尖线速度宜取2.5~5.0 m/s
得： 以单位体积液体消耗功率 P/V 相等的原则放大 P/V 与KLa 有密切的关系且容易测量和计算。实践表明，对于溶氧速率控制发酵反应的非牛顿发酵液，把P/V 相等作为放大准则效果较好
早期的青霉素发酵生物反应器的放大就是根据几何相似和P/V 恒定的方法进行的，这种方法应用得非常成功 重点 得：
通风发酵设备（了解，自己看一下方面）
植物和动物细胞
植物细胞的培养操作
培养方式：
根据所处状态的不同，分为悬浮培养与固定化植物细胞培养法，
根据操作方式的不同，又分为分批式、反复分批式和连续式培养3种。
动物细胞培养方法有两种类型：
非贴壁依赖性细胞的培养：采用类似微生物培养的方法进行悬浮培养。
贴壁依赖性细胞的培养：大多数动物细胞。需要附着于适量正电荷的固体或半固体的表面上生长。
细胞反应器类型及其特征：
通气搅拌罐；气升式；液体环流式
按底物加入方式分
间歇、连续、流加
按流体流动或混合状况分
连续操作的理想状态（恒化器、恒浊器、恒速器）
全混流（CSTR ）、 31121212???? ??==V V D D D D i i 32L L H V Q a K ?∝2Re i L
L D n ??=μ
ρ11221i i D n D n ??=2112i i D D n n =
平推流（PFR）
非理想状态
连续--停留时间分布、微混合、轴向或径向弥散、操作振荡、等
间歇--混合时间、剪切力分布、浓度及温度分布、等
细胞反应器的类型
按结构特征及动力输入方式分
按主要结构：
罐（釜）（三种操作方式都可采用）、管、塔（一般适用于连续操作）、膜
按动力输入：
机械搅拌（搅拌为动力来源）、气流搅拌（压缩空气为动力来源）、液体环流（外部液体循环泵为动力来源）
绪论 1.生物技术产品的生产过程主要由哪四个部分组成？ （1）原材料的预处理； （2）生物催化剂的制备； （3）生化反应器及其反应条件的选择和监控； （4）产物的分离纯化。 2.什么是生化反应工程,生化反应工程的研究的主要内容是什么? 定义：以生化反应动力学为基础，运用传递过程原理及工程学原理与方法，进行生化反应过程的工程技术分析、开发以及生化反应器的设计、放大、操作控制等综合边缘学科。 主要内容：生物反应动力学和生物反应器的设计，优化和放大 3. 生物反应过程的主要特点是什么？ 1.采用生物催化剂，反应过程在常温常压下进行，可用DNA重组及原生质体融合技术制备和改造 2.采用可再生资源 3.设备简单，能耗低 4.专一性强，转化率高，制备酶成本高，发酵过程成本低，应用广，但反应机理复杂，较难控制，反应液杂质较多，给提取纯化带来困难。 4. 研究方法 经验模型法、半经验模型法、数学模型法；多尺度关联分析模型法（因次分析法）和计算流体力学研究法。 第1章 1. 酶作为生物催化剂具有那些催化剂的共性和其独特的催化特性？谈谈酶反应专一性的机制。 催化共性:降低反应的活化能，加快生化反应的速率；反应前后状态不变. 催化特性:高效的催化活性;高度的专一性; 酶反应需要辅因子的参与;酶的催化活性可被调控;酶易变性与失活。 机制：锁钥学说；诱导契合学说 2. 什么叫抑制剂？ 某些物质，它们并不引起酶蛋白变性，但能与酶分子上的某些必需基团（主要是指活性中心上的一些基团）发生化学反应，因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使酶反应速率降低，能引起这种抑制作用的物质称为抑制剂。 3. 简单酶催化反应动力学（重点之重点） 4．酶动力学参数的求取方法(L-B法、E-H法、H-W法和积分法) L-B法: E-H法： H-W法： 积分法： S S ) (1) S c mI s m s s I I m i K C K ↓ ?++
实验一 蛋白质及氨基酸的颜色反应 一、目的意义 1、学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。 2、学习和了解一些鉴定蛋白质的特殊颜色反应及其原理。 二、实验原理 1、双缩脲反应 当尿素加热到180℃左右时，2分子尿素发生缩合放出1分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。 蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键，因此也具有双缩脲的颜色反应。借此可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量。应当指出，双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应，因为凡含有肽键的物质并不都是蛋白质。 2、茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色化合物，此反应为一切蛋白质及α-氨基酸（除脯氨酸 和羟脯氨酸）所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反应。 该反应十分灵敏，1:浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。因此，此反应广泛用于氨基酸的定量测定。 3、黄色反应 含有苯环侧链的（特别是含酪氨酸）蛋白质溶液与硝酸共热时，呈黄色（硝基化合物），再加碱则变为橙黄色，此反应也称为黄蛋白反应。 OH + HNO 3 HO NO 2 + H 2O HO NO 2 + O N OH OH
三、仪器与试剂 1、试剂 (1) 蛋白质溶液：取10mL鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100mL，搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。 (2) 0.3%色氨酸溶液、0.3%酪氨酸溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液、0.5%苯酚溶液。 (3) 0.1％茚三酮－乙醇溶液：称取0.1g茚三酮，溶于100mL 95％乙醇。 (4) 10％NaOH溶液、1％硫酸铜溶液、尿素、浓硝酸。 2、仪器：试管及试管夹、酒精灯。 四、操作方法 1、双缩脲反应 (1) 取一支干燥试管，加入少量尿素，用微火加热使之熔化，待熔化的尿素开始变硬时停止加 热。此时，尿素已缩合为双缩脲并放出氨气（可由气味辨别）。待试管冷却，加入约1mL10％NaOH溶液，振荡使其溶解，再加入1滴1％硫酸铜溶液。混匀后观察出现的粉红色。(2) 另取1支试管，加入1mL蛋白质溶液，再加入2mL 10％NaOH溶液摇匀，然后再加入2 滴1％的硫酸铜溶液。摇匀观察其颜色变化。 (3) 注意事项 加入的硫酸铜不可过量，否则会产生蓝色的氢氧化铜，从而掩盖了双缩脲反应的粉红色。 (4) 记载上述实验过程和结果，并解释现象。 2、茚三酮反应 (1) 取3支试管，分别加入蛋白质溶液、0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液各1mL，再加0.5mL 0.1％茚三酮－乙醇溶液，混匀后在小火上加热煮沸1－2min，放置冷却，观察颜色变化。 (2) 在滤纸的不同部位分别滴上一滴0.3%脯氨酸溶液、0.5%甘氨酸溶液，风干后再在原处滴 一滴0.1％茚三酮－乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察斑点出现及其颜色。 (3) 记载上述实验过程和结果，并解释现象。 3、黄色反应 向6个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。
生物反应工程原理复习资料 生物反应过程与化学反应过程的本质区别在于有生物催化剂参与反应。 生物反应工程是指将实验室的成果经放大而成为可提供工业化生产的工艺工程。 酶和酶的反应特征 酶是一种生物催化剂，具有蛋白质的一切属性；具有催化剂的所有特征；具有其特有的催化特征。 酶的来源：动物、植物和微生物 酶的分类：氧化还原酶、水解酶、裂合酶、转移酶、连接酶和异构酶 酶的性质：1）催化共性：①降低反应的活化能②加快反应速率③不能改变反应的平衡常数。 2)催化特性：①较高的催化效率 ②很强的专一性 ③温和的反应条件 易变性和失活 3）调节功能：浓度、激素、共价修饰、抑制剂、反馈调节等 固定化酶的性质 固定化酶：在一定空间呈封闭状态的酶，能够进行连续反应，反应后可以回收利用。 与游离酶的区别： 游离酶----一般一次性使用（近来借助于膜分离技术可实现反复使用） 固定化酶--能长期、连续使用（底物产物的扩散过程对反应速率有一定的影响；一般情况下稳定性有所提高；以离子键、物理吸附、疏水结合等法固定的酶在活性降低后，可添加新鲜酶溶液，使有活性的酶再次固定，“再生”活性） 固定化对酶性质的影响：底物专一性的改变 、稳定性增强 、最适pH 值和最适温度变化、动力学参数的变化 单底物均相酶反应动力学 米氏方程 快速平衡法假设：（1）CS>>CE ，中间复合物ES 的形成不会降低CS （2）不考虑 这个可逆反应（3） 为快速平衡， 为整个反应的限速阶段，因此ES 分解成产物不足以 破坏这个平衡 稳态法假设：（1）CS>>CE ，中间复合物ES 的形成不会降低CS （2）不考虑 这个可逆反应（3）中间复合物ES 一经分解，产生的游离酶立即与底物结合，使中间复合物ES 浓度保持衡定，即 P E ES S E k k k +→+?-2 1 1 P E ES +←ES S E ?+P E ES +→P E ES +←0=dt dC ES
生物化学实验讲义 赵 国 芬 2010年9月
实验之前说明 1.各班学习委员将成员分成10个大组,每个大组中2人一小组,大组采用循环实 验的方法,同时开出不同的10个实验. 2.共开出10个不同的实验 实验一温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响 实验二牛奶中蛋白质的提取与鉴定 实验三血液葡萄糖的测定-福林（Folin）-吴宪氏法 实验四双缩脲测定蛋白质的含量 实验五血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳 实验六植物组织中还原糖和总糖的含量测定 实验七应用纸层析法鉴定动物组织中转氨基作用 实验八植物组织中维生素C的定量测定 实验九琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察 实验十植物组织中DNA的提取和鉴定 3.穿着要利索,做好实验记录 4.注意实验室卫生和安全. 一. 实验室规则:按照实验室的规则给学生讲解. 二. 生物化学所用的实验技术 1.样品: :血液、血浆、血清、组织 植物样品：果实、花蕾、茎等 无论用什么做材料，为了提取物质，需匀浆 2．移液管的使用： 移液管吸管 移液管 奥氏吸管 读数时视线与凹面相平，取液时要用吸管嘴吸，放出液体时注意嘴部液体的残留问题。 3．离心机的使用： 平衡（管平衡、机器平衡）缓起和慢停 4．分光光度计 机器原理和测定原理（比尔定律） 5．水浴锅的使用 三、实验报告的书写（用教务处统一印刷的报告纸写） 目的、原理、仪器、药品、步骤、结果及结论、讨论
实验一、温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响 一、实验目的 通过本实验了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十分重要的意义。 二、实验原理 酶的化学本质是蛋白质。凡是能够引起蛋白质变性的因素，都可以使酶丧失活性。此外，温度、pH和抑制剂、激活剂对酶的活性都有显著的影响。酶的活性通常是用测定酶作用底物在酶作用前后的变化来进行观察的。 本实验用唾液淀粉酶作用的底物—淀粉，被唾液淀粉酶分解成各种糊精、麦芽糖等水解产物的变化来观察该酶在各种环境条件下的活性。 淀粉被酶水解的变化，可以用遇碘呈不同颜色来观察。淀粉遇碘呈蓝色;糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色;最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈现颜色反应。 三、试剂 1.0.5%淀粉溶液 2.碘化钾－碘溶液 3.1%尿素溶液。 4.1%CuSO4溶液 5.磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液pH5.0-8.0: 6.0.5%NaCl溶液。 7.唾液淀粉酶制备每人用自来水漱口3次，然后取20m1蒸馏水含于口中，半分钟后吐入烧杯中，纱布过滤，取滤液lOml，稀释至2Oml为稀释唾液，供实验用。 四、操作步骤 一、温度对酶活性的影响 （一）淀粉酶的观察 1、取3支大试管，编号后按表操作 2、在白色比色板上，置碘液2滴于各孔中，每隔1分钟，从第二管中取出反应
生物化学实验报告 姓名： 专业： 院系： 学号：
实验一蛋白质分子量测定------凝胶层析法 一、实验原理 凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分开的一种方法，又叫做分子筛层析法，排阻层析法。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒放在适宜溶剂中浸泡，使其充分戏液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的缝隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，无论是天然凝胶还是人工凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶，人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶和葡聚糖凝胶，后者的商品名为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。 这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低得孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。 以下进一步来说明凝胶层析的原理。将凝胶装载柱后，柱床总体
积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，即Vt=Vi+Vg+Vo。Vo称为“孔隙体积”或“外体积”又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面孔隙之间的水相体积，相应于一般层析柱法中内流动相体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，Vg为凝胶本身的体积，因此Vt-Vo等于Vi+Vg。 洗脱体积与Vo及Vi之间的关系可用下式表示： Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无光，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd 可通过实验求得，上式可改写成： Kd=(Ve-Vo)/Vi 上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液通过实际测量求出；Vi可由g.Wr求得。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积Ve就可算出它的Kd值。 Vo表示外体积；Vi内体积；Ve II、Ve III分别代表组分II和III的洗脱体积。Kd可以有下列几种情况： 1、当Kd=0时，则Ve=Vo。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质，洗脱体积等于空隙体积。
L-B 法: E-H法：H-W r p 1 r p 1 K m r max r max 1 C s C s C s r K m K r max r s C s 绪论 1.生物技术产品的生产过程主要由哪四个部分组成？ （1）原材料的预处理； （2）生物催化剂的制备； （3）生化反应器及其反应条件的选择和监控； （4）产物的分离纯化。 2.什么是生化反应工程 , 生化反应工程的研究的主要内容是什么 ? 定义：以生化反应动力学为基础，运用传递过程原理及工程学原理与方法，进行生化反应过程的工程技术分析、开发以及生化反应器的设计、放大、操作控制等综合边缘学科。主要内容：生物反应动力学和生物反应器的设计，优化和放大 3.生物反应过程的主要特点是什么？ 1.采用生物催化剂，反应过程在常温常压下进行，可用DNA重组及原生质体融合技术制 备和改造 2.采用可再生资源 3.设备简单，能耗低 4.专一性强，转化率高，制备酶成本高，发酵过程成本低，应用广，但反应机理复杂，较难控制，反应液杂质较多，给提取纯化带来困难。 4.研究方法经验模型法、半经验模型法、数学模型法；多尺度关联分析模型法（因次分析法）和计算流体力学研究法。 第1章 1.酶作为生物催化剂具有那些催化剂的共性和其独特的催化特性？谈谈酶反应专一性的机制。 催化共性: 降低反应的活化能，加快生化反应的速率；反应前后状态不变. 催化特性:高效的催化活性; 高度的专一性; 酶反应需要辅因子的参与; 酶的催化活性可被调控; 酶易变性与失活。 机制：锁钥学说；诱导契合学说 2.什么叫抑制剂？ 某些物质，它们并不引起酶蛋白变性，但能与酶分子上的某些必需基团（主要是指活性中心上的一些基团）发生化学反应，因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使酶反应速率降低，能引起这种抑制作用的物质称为抑制剂。 3.简单酶催化反应动力学（重点之重点） 4．酶动力学参数的求取方法（L-B 法、 E-H法、 H-W法和积分法）
生物化学实验讲义 化学工程与技术学院 基础部
实验一酪蛋白的制备 一、目的 学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 二、原理． 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 三、器材 1 、离心机2、．抽滤装置 3、精密pH试纸或酸度计 4、电炉 5、烧杯 6、温度计． 四、试剂与材料 1、牛奶2500mL 2、95％乙醇1200mL 3、无水乙醚1200mL
4、0.2mol／L pH 4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL 5、．乙醇—乙醚混合液2000mL 五、操作 1、将100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入 预热至40℃、pH 4.7的醋酸缓冲液100 mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3 000r／min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 2、用水洗沉淀3次，离心10分钟(3000r／min)， 弃去上清液。 3、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬 浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 4、将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯晶。 5、准确称重，计算含量和得率。 含量：酪蛋白g／100mL牛乳(g％)
得率： 测得含量 100 % 理论含量 思考题 1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？ 实验二小麦萌发前 后淀粉酶活力的比较 一、目的 1.学习分光光度计的原理和使用方法。 2.学习测定淀粉酶活力的方法。 3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 二、原理 种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。 2（C6H10O5）n +nH2O nC12H22O11 麦芽糖有还原性，能使3，5---二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计测定。
连续均相管式循环反应器中的返混实验 一、实验目的 在工业生产上，对某些反应为了控制反应物的合适浓度，以便控制温度，转化率和收率，同时需使物料在反应器内有足够的停留时间，并具有一定的线速度，而将反应物的一部分返回到反应器的进口，使其与新鲜的物料混合再进入反应器进行反应，对于这种反应器循环比与返混之间的关系就需通过实验来测定，此研究是很有现实意义的。 本实验通过用管式循环反应器来研究不同循环比下的返混程度。掌握用脉冲法测停留时间分布的方法。改变不同的条件观察分析管式循环反应器中流动特征，并用多釜串联模型计算参数N 。 二、实验原理 在实际连续操作的反应器内由于各种原则，反应器内流体偏离理想流动而造成不同程度的逆向混合，称为返混。通常利用停留时间分布的测定方法来研究反应器内返混程度，但这两者不是完全对应的关系，即相同的停留时间分布可以由不同的流动情况而造成，因此不能把停留时间分布直接用于描述反应器内的流动状况。而必须借助于较切实际的流动模型，然后由停留时间分布的测定求取数学期望，方差，最后求取模型中的参数。 停留时间分布的表示方法有二种，一种称为分布函数，()F t =。 其定义是： ()1 0E F t dt =? 即流过系统的物料中停留时间小于t 的（或说成停留时间介于0—t 之间的）物料的百分率。 另一种称为分布密度E()t 。其定义即在同时进入的N 个流体粒子中其中停留时间介于t t dt +和间的流体粒子所占的分率/dN N 为E()t dt 。 E()()t F t 和之间关系 ()E()dF t t dt = 停留时间分布的测定方法是多种多样的。其中脉冲法最为简单。即当被测定的系统达到稳定后，在系统入口处瞬时注入，定量的示踪剂，同时开始在出口流体中检测示踪物的浓度变化。（本实验用电导仪来检测示踪物的浓度变化，因浓度与电导成正比关系，示踪剂为强电解质）。所以可得停留时间分布密度E()t 的关系，可求得平均停留时间τ 和停留时间分布的离散度2 t σ E()E()t t t t t τ?=?∑∑ 222E()E()t t t t t t σ τ?=-?∑∑ 同样，无因次方差为：2212θσστ =，以N 表示虚拟釜数，则21N θσ=，可以求取模型参数N 。
生物反应工程原理复习资料 生物反应过程与化学反应过程的本质区别在于有生物催化剂参与反应。 生物反应工程是指将实验室的成果经放大而成为可提供工业化生产的工艺工程。 酶和酶的反应特征 酶是一种生物催化剂，具有蛋白质的一切属性；具有催化剂的所有特征；具有其特有的催化特征。 酶的来源：动物、植物和微生物 酶的分类：氧化还原酶、水解酶、裂合酶、转移酶、连接酶和异构酶 酶的性质：1）催化共性：①降低反应的活化能②加快反应速率③不能改变反应的平衡常 数。 2)催化特性：①较高的催化效率 ②很强的专一性 ③温和的反应条件 易变性 和失活 3）调节功能：浓度、激素、共价修饰、抑制剂、反馈调节等 固定化酶的性质 固定化酶：在一定空间呈封闭状态的酶，能够进行连续反应，反应后可以回收利用。 与游离酶的区别： 游离酶----一般一次性使用（近来借助于膜分离技术可实现反复使用） 固定化酶--能长期、连续使用（底物产物的扩散过程对反应速率有一定的影响；一般情况下稳定性有所提高；以离子键、物理吸附、疏水结合等法固定的酶在活性降低后，可添加新鲜酶溶液，使有活性的酶再次固定，“再生”活性） 固定化对酶性质的影响：底物专一性的改变 、稳定性增强 、最适pH 值和最适温度变化、动力学参数的变化 单底物均相酶反应动力学 米氏方程 快速平衡法假设：（1）CS>>CE ，中间复合物ES 的形成不会降低CS （2）不考虑 这个可逆反应（3） 为快速平衡， 为整个反应的限速阶段，因此ES 分解成产物不足以破坏这个平衡 稳态法假设：（1）CS>>CE ，中间复合物ES 的 形成不会降低CS （2）不考虑 双倒数法（Linewear Burk ）： 对米氏方程两侧取倒数 得 以 作图 得一直线，直线斜率为 ，截距为 根据直线斜率和截距可计算出Km 和rmax 抑制剂对酶反应的影响： 失活作用（不可逆抑制） 抑制作用（可逆抑制 ）：竞争抑制 、反竞争抑制 、非竞争抑制 、 混合型抑制 竞争抑制反应机理： 非竞争抑制反应机理： 可逆抑制各自的特点：P37 多底物均相酶反应动力学 (这里讨论：双底物双产物情况 ) 强制有序机制 S m C r K r r 111max max +=S C r 1~1Q P B A +→+P E ES +←ES S E ?+P E ES +→0=dt dC ES
生物反应工程考试试卷标准答案 一、名词解释(10分) 流加式操作：先将一定量基质加入反应器内，在适宜条件下将微生物菌种接入反应器中，反应开始，反应过程中将特定的限制性基质按照一定要求加入反应器内，以控制限制性基质浓度保持一定，当反应终止时取出反应物料的操作方式。 能量生长偶联型：当有大量合成菌体材料存在时，微生物生长取决于ATP 的供能，这种生长就是能量生长偶联型。 返混：不同停留时间的物料的混合，称为返混。 搅拌器轴功率：搅拌器输入搅拌液体的功率是指搅拌器以既定的转速回转时，用以克服介质的阻力所需用的功率，简称轴功率。它不包括机械传动的摩擦所消耗的功率，因此它不是电动机的轴功率。 酶的固定化技术：是指将水溶性酶分子通过一定的方式如静电吸附、共价键等与载体结合，制成固相酶的技术。 二、请列出下列物理量的数学表达式 (10分) 停留时间：f V = τ 呼吸商：22/O CO Q Q RQ = 稀释率：V F D = Da 准数： m m N r Da = 转化率：0 0S S S t -= χ 三、判断题(10分) 1、单罐连续培养稳态下，D=μ。( √ ) 2、流加培养达到拟稳态时，D=μ。( √ ) 3、单罐连续培养，在洗出稀释率下，稳态时罐内底物浓度为零。( ) 4、Da 准数是决定固定化酶外扩散效率的唯一参数，Da 准数越大，外扩散效率越高。( ) 5．酶经固定化后，稳定性增加，活性增大。( )
四、图形题（15分） 图1为酶促反应1/r ~1/S 曲线，指出曲线Ⅰ、Ⅱ中哪条代表竞争性抑制，哪条代表无抑制情况。图2为流体的流变学曲线，试说出每条曲线所代表的流体类型。 图1 图2 图3为连续培养的数学模型，请在图中标出临界稀释率D crit 和最大生产强度下的稀释率D m 。图4为微生物生长模型，请图示说明如何判断限制性基质？ 图3 4 S crit 如图所示。 若S11环境生化实验讲义
实验一蛋白质和氨基酸的呈色反应 一、目的要求 (1)学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。 (2)学习几种鉴定特定氨基酸的特殊颜色反应及其原理。 二、原理 ㈠蛋白质和氨基酸鉴定常用方法 蛋白质所含有的某些氨基酸及其特殊结构，可以与某些试剂反应、生成有色物质。 1．双缩眠反应 当脲(即尿素)加热至l80℃时．两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲(biuret)。 然后在碱性溶液中与铜离子(cu2+)结合生成复杂的紫红色化合物。这一呈色反应称为双缩脲反应。 紫红色铜双缩服复合物分子结构见下页图。 蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双缩脲反应。应当指出，含有—个CS—NH2、一CH2一NH2，一CRH—NH2，一CH2一NH2—CHNH2一CHOH-CH2NH2，-CHOH—CH2NH2等基团的物质，甚至过量的铵盐也干扰本实验。
2．Salkowski(1888)蛋白黄色反应 它是芳香族氨基酸，特别是有酪氨酸和色氨酸蛋白质所特有的呈色反应。苯丙氨酸和苯 反应很困难。皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸变黄，原因在此。 硝基苯衍生物呈黄色，在碱性溶液中，它进一步形成深橙色的硝醌酸钠。参考反应是： 3．茚三酮反应 蛋白质、多糖和各种氨基酸具有茚三酮反应。除无α—氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色 外．其他氨基酸生成紫红色．最终为蓝色化合物。
三、器材与试剂 ㈠器材 ⒈试管及试管架⒉水浴锅⒊量筒⒋滴管⒌滤纸片⒍移液管 ㈡试剂和材料 ⒈10％NaOH溶液⒉1％CuSO4溶液⒊0.5％苯酚溶液⒋浓HNO3 ⒌卵清蛋白溶液（蛋清：水＝1︰20）⒍尿素⒎0.1％茚三酮乙醇溶液 四、操作步骤 1.双缩脲反应 （1）取一支干燥的试管，加入少量尿素，用微火加热使尿素熔化，待融化的尿素重又开始硬化时停止加热，此时尿素已缩合成双缩脲并放出氨（可由其嗅味辨别或见红色石蕊试纸变色）。试管冷却后，加入约1毫升10％氢氧化钠溶液，振荡使双缩脲溶解，再加入2滴1％硫酸铜溶液，混匀后观察有无紫色出现。
名词解释 1，返混:不同停留时间的物料的混合。 2，双膜理论:作为界面传质动力学的理论，该理论较好地解释了液体吸收剂对气体吸收质吸收的过程。一种关于两个流体相在界面传质动力学的理论 3，构象改变:在分子生物学里，一个蛋白质可能为了执行新的功能而改变去形状；每一种可能的形状被称为构象，而在其之间的转变即称为构象改变。 4，分配效应:分配的马太效应（Matthew Effect），是指好的愈好，坏的愈坏，多的愈多，少的愈少的一种现象。 5，酶的固定化技术:酶固定化技术是通过物理或化学的方法将酶连接在一定的固相载体上成为固定化酶，从而发挥催化作用。固定化后的酶在保持原有催化活性的同时，又可以同一般催化剂一样能回收和反复使用，可在生产工艺上实现连续化和自动化，更适应工业化生产的需要。 6，结构模型:就是应用有向连接图来描述系统各要素间的关系，以表示一个作为要素集合体的系统的模型. 7，固定化酶:水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。在催化反应中以固相状态作用于底物。 ￥ 8，停留时间:又称寄宿时间，是指在稳定态时，某个元素或某种物质从进入某物到离开该物所度过的平均时间。 9，恒化器：一种微生物连续培养器。它以恒定的速度流出培养液，使容器中的微生物生长繁殖始终低于最快生长速度。这种容器反映的是培养基的化学环境恒定。而恒浊器反映的是细胞浊度（浓度）的恒定。 10，恒浊器：一种连续培养微生物的装置。可以根据培养液中的微生物的浓度，通过光电系统观控制培养液的流速，从而使微生物高密度的以恒定的速度生长。11，生物反应工程：一个由生物反应动力学与化学反应工程结合的交叉分支学科。着重解决不同性质的生物反应在不同型式的生物反应器中以不同的操作方式操作时的优化条件 12，连续灭菌：就是将配制好的培养基在通入发酵罐时进行加热,保温，降温的灭菌过程，也称连消。 13，间歇灭菌：在100℃条件下，灭菌30分钟，间隔24小时再重复操作三次。 14，有效电子转移：是指物质在氧化过程中伴随着能量释放所进行的电子转移。 15，能量生长偶联型：当有大量合成菌体材料存在时，微生物生长取决于ATP的供能，这种生长就是能量生长偶联型。 16，能量生长非偶联型：在ATP的供能充分，而合成细胞的材料受限制时，这种生长就是能量生长非偶联型。 、 17，不可逆抑制：抑制剂与酶的必需基团或活性部位以共价键结合而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤或凝胶过滤等物理方法去除抑制剂而使酶活力恢复的作用。18，流加式操作：能够任意控制反应液中基质浓度的操作方式。 19，代谢工程：通过基因工程的方法改变细胞的代谢途径。 20，连续培养及稳态：又叫开放培养，是相对分批培养或密闭培养而言的。连续培养是采用有效的措施让微生物在某特定的环境中保持旺盛生长状态的培养方法. 生理学家把正常机体在神经系统和体液以及免疫系统的调控下，使得各个器官、系统的协调活动，共同维持内环境的相对稳定状态，叫做稳态。
实验一蛋白质的颜色反应与沉淀反应 蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应。不同蛋白质所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦可不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同的颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物质是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白物质的定量测定的依据。 多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。实验材料与仪器 鸡（或鸭）蛋白 吸管0.5 ml（×1）、1ml（×3）、2 ml（×2）、5ml（×2） 滴管 试管1.5×15cm（×10） 水浴锅 电炉 吸滤瓶500ml（1） 布氏漏斗 试剂 1. 卵清蛋白液：将鸡（或鸭）蛋白用蒸馏水稀释20～40倍，2～3层纱布过滤，滤液冷藏备用。 2. 1%苯酚溶液：苯酚1ml，加蒸馏水稀释至100ml。 3. 1%白明胶液：1g白明胶溶于少量热水，完全溶解后稀释至100ml。 4. 米伦（Millon）试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（比重1.42），水浴加温助溶，溶解后加二倍体积蒸馏水，混匀，静置澄清，取上清液备用。此试剂可长期保存。 5. 0.5%茚三酮溶液：0.5g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100ml。 6. 尿素：如颗粒较粗，最好研成细粉末状。 7. 10%NaOH溶液：10gNaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml。 8. 浓硝酸：比重1.42 9. 1%硫酸铜溶液：硫酸铜1g溶于蒸馏水，稀释至100ml。 10. 硫酸铵晶体：如颗粒太大，最好研碎。 11. 饱和硫酸铵溶液：蒸馏水100ml，加硫酸铵至饱和。 12. 95%乙醇 13. 结晶氯化钠 14. 2～3%醋酸铅（或AgNO3）：2～3g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml。 15. 5%鞣酸溶液：5g鞣酸溶于蒸馏水并稀释至100ml 16. 饱和苦味酸溶液 17. 1%醋酸溶液：冰醋酸1ml用蒸馏水稀释至100ml。 主要内容 （一）米伦氏反应 1. 用苯酚实验：取1%苯酚溶液1ml于试管中，加米伦氏剂约0.5ml，小心加热溶液即出现玫瑰红色。 2. 用蛋白溶液实验：取2ml蛋白溶液，加入0.5ml米伦试剂，此时出现蛋白质的沉淀。小心加热，凝固之蛋白质出现红色。 3. 用白明胶（也是一种蛋白）做上述实验，结果如何？ （二）双缩尿反应 1. 取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素熔化并形成双缩尿，释出之氨可用红色石蕊试纸检测。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10%NaOH溶液1ml摇匀，再
生物化学 实 验 指 导 书 生物化学教研室 2011、2、1
目录 实验须知 实验内容 实验一蛋白质的两性电离和等电点的测定 实验二血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 实验三血清总蛋白测定（双缩脲法、Folin—酚法）实验四 PH与温度对酶活性的影响 实验五激活剂和抑制剂对酶活性的影响 实验六酶的特异性 实验七琥珀酸脱氢酶活性的抑制 实验八分光光度计的使用 实验九血糖的测定（葡萄糖氧化酶法） 实验十肝中酮体生成作用 实验十一血清胆固醇测定（酶法） 实验十二 ALT的测定 实验十三血红蛋白与核黄素的凝胶柱色谱分离 实验十四肝组织核酸的提取、分离和鉴定 实验十五血清尿素氮的测定 实验十六血清胆红素测定 实验十七：总糖的测定---蒽酮比色法 实验十八：饥饿与饱食对肝糖元含量的影响 实验十九：乳酸脱氢酶活力测定
生物化学实验须知 一、实验目的 1．培养学生科学的思维方法和学习作风，独立工作能力。 2．学习基础生物化学实验方法，为今后的学习与研究准备更好的条件。 3．培养学生爱护国家财物、爱护集体、团结互助的优良道德品质。 4．培养学生的书面及口头表达能力。 二、实验的总要求 1．按教研室予先公布的实验进度表，了解各次实验的具体内容，并认真做好预习。弄清各步骤的意义，避免教条或机械式做实验。未预习者不得进实验室。 2．进行实验不仅要求结果良好，而且要求敏捷高效。一切步骤都按正规操作方法进行；样品与试剂勿过量取用；注意力集中，避免差错。 3．实验中观察要仔细，记录要详尽、及时与客观。无论实验成功与失败，都应直接记录在实验报告本中，不得于实验后追记。对于失败的实验，要分析其原因。 4．实验室是集体学习与工作的场所，实验时应保持肃静，不得大声喧哗，以免影响他人的工作与思考。 5．注意保持实验室内的整洁。实验用器具、试剂等应排列整齐有序。实验时切勿将试剂、标本溅洒于实验台面、地面及衣物上，如果有溅出应及时处理。实验后应清洗用过的仪器及清理自己的实验场所。实验所用的器材、设备不得随意乱动。实验室内的一切器材物品严禁携出。 6．实验时使用水、电、火、易燃易爆试剂、化学毒剂及传染标本等应注意安全，防止燃烧或爆炸，防止中毒等事故之发生。 7．对师长尊敬，对同学要团结友爱。 三、实验报告 实验报告的书写是培养学生书面表达能力和科学作风的重要手段之一，实验者应该重视。实验报告的内容包括下列各项：实验名称、实验日期、实验目的、实验原理、实验步骤，实验记录、计算、讨论或小结。实验记录应包括随做随记的原始记录。书写实验报告要字迹工整，语句通顺。书写工整的实验报告，是尊师的重要表现之一。 四、组织与分组
简答题 1、说明动物细胞培养反应器中流体剪切力的主要来源？ P210 主要来源为：机械剪切力、气体搅拌剪切力 2、说明固定化酶反应的Φ模数的物理意义，它与那些变量与参数有关？ P103 Φ = 表面浓度下的反应速率 / 内扩散速率 = 最大反应速率的特征值 / 最大内扩散速率的特征值 一级反应：e 1V P P 1D k S V =Φ Φ1 = Φ1 (V P ，S P ，k V1，D e ) Φ与内扩散速率、反应速率、内扩散阻力、对反应速率的限制程度、有效因子η等有关，而内扩散的有效因子又和颗粒粒度、颗粒活性、孔隙率、孔径、反应温度等有关 3、哪些传递过程特性与流体流动的微观效应有关？ P223，P298 7-30，PPT P1图 4、从反应器内物料混合的角度说明反应器放大过程中传递过程特性的变化？ P235 有流体流变特性、流体剪切作用、传质特性、氧的传递、质量传递 5、说明生物反应器中对流体剪切力的估计参数有哪些？ P210 通过混合，可使反应器中物料组成与温度、pH 分布更趋于均匀，可强化反应体系的传质与传热，使细胞或颗粒保持悬浮状态 (1) 宏观混合：机械搅拌反应物流发生设备尺寸环流，物料在设备尺度上得到混合，对连续流动反应器即为返混 (2) 微观混合：物料微团尺度上的混合，反映了反应器内物料的聚集状态 6、生物反应器操作选择补料分批培养的理由有哪些？ P131，P177 (1) 积分剪切因子 I ．SF = ΔμL / Δx = 2πNd / (D -d) (2) 时均切变率 γave (3) 最小湍流漩涡长度λ 7、说明临界溶氧浓度的生理学意义？ P62，P219 补料分批操作的特点是：可调节细胞反应过程环境中营养物质的浓度，一方面可避免某些营养成分的初始浓度过高而出现底物抑制的现象；另一方面又可防止某些限制性营养成分在反应过程中被耗尽而影响细胞生长及产物形成。同时还可解除产物的反馈抑制及葡萄糖的分解阻遏效应等。故在细胞反应过程中，实施流加操作可有效对反应过程加以控制，以提高反应过程的水平。
食品生物化学实验指导书 食品科学与工程学院
实验一糖的颜色反应及还原性检验 A. 莫氏试验① 一、目的 掌握莫氏（Molisch）试验鉴定糖的原理和方法。 二、原理 糖经浓无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与α-萘酚②生成紫红色缩合物。利用这一性质可以鉴定糖。 三、实验器材 棉花或滤纸；吸管1.0ml（×5）、2ml（×1）；试管1.5cm×15cm（×5）；容量瓶50ml （×5）；烧杯50ml（×5）；棕色瓶50ml（×5）；玻璃棒多根、电炉（配石棉网）多个。 四、实验试剂 莫氏试剂：称取α-萘酚2.5g，溶于95％乙醇并稀释至50ml。此试剂需新鲜配制，并贮于棕色试剂瓶中。 1％蔗糖溶液：称取蔗糖0.5g，溶于蒸馏水并定容至50ml。 1％葡萄糖溶液：称取葡萄糖0.5g，溶于蒸馏水并定容至50ml。 1％果糖溶液：称取果糖0.5g，溶于蒸馏水并定容至50ml。 1％淀粉溶液：将0.5g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混和成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至50ml。 五、操作 于5支试管中，分别加入1％葡萄糖溶液、1％蔗糖溶液、1％果糖溶液与1％淀粉溶液1 mL和少许纤维素（棉花或滤纸少量浸在1ml水中），然后各加莫氏试剂2－3滴①，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸 1.5ml（切勿振摇！！！），硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫红色环出现。 注意：①一些非糖物质（如糠醛、糖醛酸等）亦呈阳性反应。此外，样液中如含高浓度有机化合物，将因浓硫酸的焦化作用，而出现红色，故试样浓度不宜过高。 ②亦可用麝香草酚或其他苯酚化合物代替α-萘酚，麝香草酚的优点是溶液比较稳定，且灵敏度与萘酚一样。 B. 塞氏试验 一、目的 掌握塞氏（Seliwanoff）试验鉴定酮糖的原理和方法。 二、原理 酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应；有时亦同时产生棕色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液②。 三、实验器材 1．吸管0.5ml（×3）、5.0ml（×1）。 2．试管1.5cm×15cm（×3）
生化实验讲义思考题参考答案 实验一淀粉的提取和水解 1、实验材料的选择依据是什么？答：生化实验的材料选择原则是含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低。从科研工作的角度选材，还应当注意具体的情况，如植物的季节性、地理位置和生长环境等，动物材料要注意其年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等，微生物材料要注意菌种的代数和培养基成分的差异等。 2、材料的破碎方法有哪些？ 答：(1) 机械的方法：包括研磨法、组织捣碎法； (2) 物理法：包括冻融法、超声波处理法、压榨法、冷然交替法等； (3) 化学与生物化学方法：包括溶胀法、酶解法、有机溶剂处理法等。 实验二总糖与还原糖的测定 1、碱性铜试剂法测定还原糖是直接滴定还是间接滴定？两种滴定方法各有何优缺点？答: 我们采用的是碱性铜试剂法中的间接法测定还原糖的含量。间接法的优点是操作简便、反应条件温和，缺点是在生成单质碘和转移反应产物的过程中容易引入误差；直接法的优点是反应原理直观易懂，缺点是操作较复杂，条件剧烈，不易控制。 实验五粗脂肪的定量测定─索氏提取法 (1) 本实验制备得到的是粗脂肪，若要制备单一组分的脂类成分，可用什么方法进一步处理？ 答：硅胶柱层析，高效液相色谱，气相色谱等。 (2) 本实验样品制备时烘干为什么要避免过热? 答：防止脂质被氧化。 实验六蛋白质等电点测定 1、在等电点时蛋白质溶解度为什么最低？ 请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。 蛋白质是两性电解质，在等电点时分子所带净电荷为零，分子间因碰撞而聚沉倾向增加，溶液的粘度、渗透压减到最低，溶解度最低。结果中pH 约为4.9 时，溶液最浑浊，达到等电点。 答：
生物工程专业实验讲义(适用于生物工程专业) 袁丽红曹飞 制药与生命科学学院 二零零四年四月
目录 实验一发酵种子的制备 (1) 实验二 E.coli细胞发酵培养 (2) 实验三高速冷冻离心机的使用方法 (3) 实验四固定化生物催化剂的制备 (4) 实验五游离细胞与固定化细胞酶活比较 (5) 实验六固定化生物催化剂的连续生产 (6) 实验七Ｌ－Asp的分离 (7) 实验八离子交换树脂的预处理及交换容量的测定 (8)
实验一发酵种子的制备 一、目的要求 1．了解实验室种子制备过程。 2．掌握实验室不同菌种种子生产方法。 二、原理 实验室种子制备过程包括琼脂斜面、固体培养基扩大培养或摇瓶液体培养。 不同菌种其具体制备方法不同，其过程如下图： 种子扩大培养过程 三、试验及器材 1．菌种：斜面低温保藏的大肠杆菌（E.coli） 2．培养基：牛肉膏0.5% NaCl 0.5% 蛋白胨1% PH 7.6~7.8 若配固体培养基，在其中加2%琼脂。 3．器材：天平、灭菌锅、试管、三角瓶（500mL） 四、操作方法 1．按培养基配方配制100mL固体培养基，分装于试管中。 压力1Kg/cm2灭菌30mins，结束后取出、趁热制成斜面。 2．按培养基配方配制1000mL液体培养基，分装于三角瓶中，每瓶100mL，压力1Kg/cm2灭菌30mins，结束后取出。 3．挑一环斜面低温保藏的E.coli接于液体培养基中，37℃培养24hs。 4．挑斜面长好的E.coli约2环接入液体培养基中，37℃振荡培养24hs，转速约150rpm。 五、思考与讨论 实验室种子制备的原则是什么？
生物反应工程期末总结 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT
绪论 1.生物技术产品的生产过程主要由哪四个部分组成 （1）原材料的预处理； （2）生物催化剂的制备； （3）生化反应器及其反应条件的选择和监控； （4）产物的分离纯化。 2.什么是生化反应工程,生化反应工程的研究的主要内容是什么 定义：以生化反应动力学为基础，运用传递过程原理及工程学原理与方法，进行生化反应过程的工程技术分析、开发以及生化反应器的设计、放大、操作控制等综合边缘学科。 主要内容：生物反应动力学和生物反应器的设计，优化和放大 3. 生物反应过程的主要特点是什么 1.采用生物催化剂，反应过程在常温常压下进行，可用DNA重组及原生质体融合技术制备和改造 2.采用可再生资源 3.设备简单，能耗低 4.专一性强，转化率高，制备酶成本高，发酵过程成本低，应用广，但反应机理复杂，较难控制，反应液杂质较多，给提取纯化带来困难。 4. 研究方法 经验模型法、半经验模型法、数学模型法；多尺度关联分析模型法（因次分析法）和计算流体力学研究法。 第1章 1. 酶作为生物催化剂具有那些催化剂的共性和其独特的催化特性谈谈酶反应专一性的机制。 催化共性:降低反应的活化能，加快生化反应的速率；反应前后状态不变. 催化特性:高效的催化活性;高度的专一性; 酶反应需要辅因子的参与;酶的催化活性可被调控;酶易变性与失活。 机制：锁钥学说；诱导契合学说 2. 什么叫抑制剂 某些物质，它们并不引起酶蛋白变性，但能与酶分子上的某些必需基团（主要是指活性中心上的一些基团）发生化学反应，因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使酶反应速率降低，能引起这种抑制作用的物质称为抑制剂。 3. 简单酶催化反应动力学（重点之重点） 4．酶动力学参数的求取方法(L-B法、E-H法、H-W法和积分法) L-B法: E-H法：H-W法：