乳酸菌活菌制剂对动物免疫调节作用研究进展
黑龙江省科学院微生物研究所曹亚斌
Fuller于1989年首次给益生菌下的定义是“益生菌是通过改善肠道菌群平衡而对宿主健康产生有益作用的活菌添加剂。”FAO和WHO 给出益生菌的定义为“当摄人足够数量时可对宿主起有益健康作用的活的微生物。”不少地方采用这一概念，但随着研究的进行逐渐发现了这个定义的局限性，不同的研究者也不断提出应对益生菌概念进行调整和完善。在有益菌中，主角是乳酸菌，各国科学家对活性乳酸菌的研究取得诸多成果。
活性乳酸菌对动物机体有众多的有益作用，如协调和维持胃肠道微生态平衡；和病原体竞争肠黏膜的吸附位点，致使病原菌无法在肠黏膜上定植，促进营养成分的吸收，抗肿瘤作用，刺激免疫细胞的活性，提高机体的免疫力等，其中最引人注目的是活性乳酸菌对于机体免疫力的影响。
一、活性乳酸菌发挥免疫调节作用应具备的条件
对于活性乳酸菌菌株的选择应建立在它能够促进肠内免疫反应而不会改变肠内动态平衡的基础上。要胜任这个使命，乳酸菌应具有以下特点：①应具有较高的活性，必须能耐受低pH以及胆汁酸；②如果菌株不能在肠道内定植，应能够在肠道内持续存在（可通过持续摄人而满足）；③能够附着到肠上皮以抵抗肠蠕动的冲洗作用；④应该能够和肠相关的免疫细胞相互作用或者发出信号。
1、乳酸菌的活性
一般认为活性乳酸菌要对免疫系统起作用，它们必须保证是存活状态的，可以在肠道内增殖并存活下去，包括FAO和WHO的概念中都认为益生菌应该是活的微生物。试验证实和活性的德氏乳杆菌组相比，无活性的德氏乳杆菌组激活分泌细胞子的细胞数量要少。
另有一些试验结果明确地显示，被摄取的菌株并役有成为肠道正常菌群的固定成员而只是在摄取期间存在或者是在给料后维持相当短的一段时间。另外，乳酸菌的代谢产物中的乳酸及一些可溶性因子也会发挥作用。从8种冻干乳酸菌株组成的乳酸菌混合物VSL3中提取的DNA可引起上皮细胞和免疫细胞的非炎性反应。在一个同样使用(VSL3)混合物的相似的研究中发现，这种乳酸菌的染色体DNA通过TLR9信号途径对右旋糖酐硫酸酯钠引起的小鼠大肠炎模型有抗炎作用。
试验证明，只有活性乳酸菌，在肠内存在至少48 h～72 h才能发挥作用，这是所有颗粒性抗原要诱导肠内免疫促进作用所必须的。这一结果提示了对于每一种动物来说每天定量的活性乳酸菌摄人对于其发挥免疫作用是非常重要的。这类研究有助于阐明关于活性乳酸菌对免疫调节的分子基础。
2、益生菌的黏附性
关于益生菌的黏附性也受到较多的关注，对宿主细胞或黏滚的黏附能力被认为对益生菌来说是必须的。因为只有黏附到肠道内表面才能抵抗肠道的蠕动而不被很快的排出，只有黏附之后才有和肠上皮和相关免疫细胞相互作用的可能。然而对于活性乳酸菌的黏附性，尤其
是对上皮细胞的黏附性的认识主要是建立在体外试验的基础上。而这种体外试验只是在很小一部分上模拟了复杂的肠内生态系统。对于黏液凝胶以及它作为一个防御实体的重要性的认知还非常有限。因为常规的肠组织固定方法（乙醛固定法），通常是伴随其表面黏液的脱离和丧失。这种体外试验的局限性已被Matsuo K等证实，他们用卡诺依氏固定液保证人直肠石蜡样品中表面黏液的存在。观察发现细菌被限定在外层唾液黏蛋白和硫黏蛋白之间，这显示出黏液凝胶是阻止肠内菌黏附到上皮表面的一个重要屏障。对大多数试验使用的体外培养系统中，不分泌黏液的上皮细胞系是否有实际的生理意义，同时也提出了对于活性乳酸菌黏附性研究的新方向。不过，这些简化了的系统对于研究可能存在的细胞通路以及分子标记仍然是有用的重要工具，在大量的研究中还是观察到上皮细胞对黏附性乳酸菌株所做出的反皮。对于乳酸菌的黏附性的研究还有待进一步的深入，还需要更多的研究来确定在体内是否有特定的菌株能够到达并且黏附到上皮上，最终产生一定的生理学效应。
二、活性乳酸菌诱导免疫的机制
1、活性乳酸菌的内化
活性乳酸菌可诱导黏膜免疫应答，要完成这个过程，活性乳酸菌必须和上皮细胞以及肠相关免疫细胞进行相互作用，以启动免疫信号网络，活性乳酸菌的内化途径对于激活免疫细胞和启动免疫反应有重要作用。活性乳酸菌可以通过在派伊氏结或绒毛中的M细胞而内化，也可能被树突状细胞以整个细胞或它们的抗原片段的形式而被捕获。
Galdeano M C等用荧光标记技术在小鼠的体内试验证实了几种活性乳酸菌的内化途径，观察到在派伊氏结、小肠绒毛固有层及大肠淋巴结内的活性乳酸菌及其和肠相关细胞的相互作用。树突状细胞定植于上皮细胞之间，它可穿过上皮间连接而捕获肠腔内的微生物，有证据显示，固有层树突状细胞对活性乳酸菌或它们的片段的摄取可能是通过Toll样受体和CD-206甘露糖受体完成的。完整的细菌内化到绒毛的途径可能是通过绒毛里的M细胞，而细菌碎片的内化，可能和Toll 样受体2或CD-206受体有关，因为观察到在这个过程中固有层相关的免疫细胞中或派伊氏结细胞中的这两种受体数量都显著的增加。另外一个可使活性乳酸菌穿过上皮的途径是细菌对于覆盖在派伊尔氏结表面的M细胞的黏附。利用阴沟肠杆菌作为模型细菌，研究发现这个捕获过程实际上可能是特化的M细胞而发生的，在研究中可观察到M细胞下的上皮下凸点区可发现一些活着的正常菌。可进行原位检测和鉴定的经过遗传标记的重组菌株可极大的促进对于M细胞捕获及和益生菌相互作用的具体过程的深入研究。
2、活性乳酸菌诱导的肠内局部免疫反应
和肠内相关细胞相互作用后，活性乳酸菌或其片段被内化，之后最早和它们相互作用的细胞有抗原递呈细胞(APC)、巨噬细胞、肠固有层相连的树突状细胞，和这些细胞接触后，细胞因子被释放并对免疫应答进行调节。活性乳酸菌和上皮细胞相互作用后诱导白细胞介素一6 (IL-6)的释放。巨噬细胞和树突状细胞吞噬益生菌或它们的碎片后被诱导产生细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素(IFN)。在进
行活性乳酸菌的研究时发现其对这两种因子的作用是最显著的。活性乳酸菌诱导的TNF-a是启动黏膜相关的免疫细胞和肠上皮细胞相互作用所必须的，IFN-y被证实是一些免疫细胞成熟所必须的。这些细胞因子又增强上皮细胞的刺激作用，启动所有相关免疫细胞的相互作用。肥大细胞也被激活而释放IL-4。另外，所有活性乳酸菌都存在刺激调节性细胞因子IL-10分泌的增加。1L-6可以促进分泌IgA+B细胞的增殖，增加分泌IgA的细胞的数量以及它们向肠固有层浆细胞靠近的通路。IL-6和IL-4以及转化生长因子(TGF-p)可以诱导B细胞表面非胸腺依赖性的IgM向IgA的转化，并能通过这种途径增加肠固有层IgA+B细胞的数量。体外研究发现，活性乳酸杆菌的一些不明成分可能对T细胞有抗增殖作用并对T细胞分泌细胞因子也有抑制作用。肠内T细胞反应是被局部和其相互作用的树突状细胞（DC细胞）调节的，而DC细胞又可以被活性乳酸菌所影响，所以活性乳酸菌可通过调节T细胞而影响机体的免疫反应过程。
3、活性乳酸菌所诱导的系统免疫反应
活性乳酸菌或其片段在派伊氏结中被M细胞内化后，和巨噬细胞及树突状细胞相互作用，这两种细胞被激活而产生细胞因子。在免疫应答的感应部位，免疫细胞被细菌刺激后，细胞因子的分泌增强，IgMB细胞向IgA B细胞的转化也增强。免疫细胞分泌的IL-10、IL-6、IL-4和TGF-p，也可以增强这种非胸腺依赖性免疫球蛋白的辖换。益生菌的刺激可以诱导IgA循环，增加离肠较远处的黏膜部分的IgA+细胞的数量。IgA+细胞转移到肠系膜淋巴结，并通过胸导管进入循环，
到达支气管、乳腺和尿生殖道[19-20]等处的粘膜发挥作用，从而实现对机体系统免疫反应的调节。在派伊氏结中，因活性乳酸菌刺激而释放的细胞因子是激活系统免疫反应的复杂的信号。
4、活性乳酸菌对机体自身免疫的影响
活性乳酸菌除可增强机体对于外来抗原的免疫力，启动黏膜和系统免疫反应外，对于机体自身免疫也发挥着作用，研究者用多种自身免疫疾病的模型研究了活性乳酸菌对于自身免疫的调节作用。如非肥胖型糖尿病I型小鼠模型可出现自身反应性CD8+T细胞对胰岛的浸润，这可看做是一种自身反应性疾病的模型。当它们摄入含有0. 05%的(Lactobacillus casei Shirota株，LcS)的日粮后和对照组相比糖尿病的发病率得到了有效的控制和降低，并且进行病理分析发现，在LcS 处理组CD8+T在脾脏里的比例下降，也显示了对自身反应的抑制。在类风湿关节炎疾病模型中，口服活性乳酸菌可通过抑制相应抗体及IFN-，y的产生降低自身免疫性。活性乳酸菌通过调节自身反应性辅助T细胞亚群间的平衡来抑制自身免疫疾病。使用致癌药物人工诱导的致癌作用试验中，活性乳酸菌的摄入可激活机体固有免疫系统中的相关免瘦细胞，如自然杀伤(NK)细胞等抑制致癌作用。在这些研究中对于活性乳酸菌的摄入途径的认识和前面所述都是一致的，即活性乳酸菌必须通过内化过程后和相应细胞发生相互作用而发挥免疫调节作用，调节机体对外源及自体抗原的识别，调节机体的免疫平衡状态。
三、结语
要更好的使用活性乳酸菌，首先应弄清楚它们作用的机制。虽然
目前关于活性乳酸菌对于机体的有益作用越来越受到人们的重视，但是对其作用机理尤其是其不同免疫调节作用的确切分子基础还有待进一步的深入研究。
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乳酸菌的分离与发酵实验 生命科学学院2009级四班2组 傅盛晟 摘要：本文对乳酸菌的分离与发酵实验进行阐述，从市售酸乳中分离保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，并进行分离与鉴定，最后进行酸乳的发酵实验！实验主要是分离与纯化，鉴定与发酵，最后用分离的菌进行酸乳发酵在与市售酸乳混合菌种进行比较。 关键词：酸奶，乳酸菌，分离鉴定，发酵 微生物在厌氧条件下，分解己糖产生乳酸的作用，称为乳酸发酵。能够引起乳酸发酵的微生物种类很多，其中主要能利用可发酵糖生产乳酸的细菌，即乳酸细菌。常见的乳酸细菌属于链球菌属（Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobaterium)和明串珠菌属(Leuconostoc)等。乳酸细菌多是耐氧菌，只在厌氧条件下才进行乳酸发酵，所以在筛选乳酸茵或需要进行乳酸发酵的情况下，应保证提供厌氧条件。 酸奶是以全脂牛奶等为原料，经乳酸细菌发醇而成的一种具有较高营养价值和特殊风味的发醇制品，是具有一定保健作用的食品。酸奶发酵过程通常是由双菌或多菌的混合培养实现的。其中的杆菌先分解酪蛋白为氨基酸和小肽．由此促进了球菌的生长，而球菌产生的甲酸又刺激了杆菌产生大量乳酸和部分乙醛，此外球菌还产生了双乙酰这类风味物质，因此，达到了稳定状态的彻合发酵。酸乳发酵的基本原理是通过乳酸细菌发酵牛奶中的乳糖产生乳酸，乳酸使牛奶中的酪
蛋白(在全乳中的质量分数为2．9％，在乳蛋白中的质量分数为85％)变性凝固而使整个奶液呈凝乳状态。同时，通过发酵还可以形成酸奶特有的风味和香味(与形成乙醛、丁二酮等有关)。酸奶发酵中的主要生物化学变化是：乳酸菌将牛奶中的乳糖发酵成乳酸使其PH降至酪蛋白等电点(4.6)附近(4.0~4.6)从而使牛奶形成凝胶状；其次，乳酸菌还会促使部分酷蛋内降解、形成乳酸钙和产生一些脂肪、乙醛、双乙酰和丁二酮等风味物质。这就是酸奶具有良好的保健作用和适合广大乳糖不耐症患者饮用的主要原因。按凝固状态可将酸奶分为搅拌型酸奶和凝固型酸奶，两者工艺过程基本相似，本实验主要是凝固型酸奶的制作方法。 一，材料与方法 1.材料和用具 1）菌种，嗜热乳酸链球菌，保加利亚乳酸杆菌，这两类菌种可从市场销售的各种新鲜酸乳或酸乳饮料中分离。 2）培养基参照相关文献和老师的建议以及乳酸菌生长需要复杂营养物质和多种生长因子，我们选用如下培养基： 分离纯化培养基：脱脂乳平板培养基 鉴定培养基：脱脂乳试管 其他：脱脂乳粉或脱脂牛奶，蔗糖等 3）仪器及用具恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，培养皿，试管，三角瓶若干 2.培养条件 培养温度：40℃ 厌氧条件：由于乳酸菌的发酵与分离纯化都需要厌氧条件，而实验室没有专门的厌氧培养箱，所以我们采用在培养皿和发酵杯上套上保鲜膜制造无氧环境。 培养时间：在培养基上分离培养的时间为2天左右，酸乳发酵为12个小时左右 方法和步骤 1）乳酸菌的分离纯化 101-~105-，取其中的 (1)分离。取市售新鲜酸乳或泡菜的酸液稀释 104-、105-2个稀释度的稀释液各0.1~0.2mL，分别接入脱脂乳琼脂培养基上，用无菌玻璃刮铲依次涂布，或者直接用接种环沾取原液，平板划线分离，置40℃下培养48h，如出现圆形稍扁平的淡黄色菌落及其周围培养基变为黄色者，可初步定为乳酸菌。 (2)鉴别。选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养8~24h。若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞呈杆状或链球状(两种形状的菌种均分别选入)，革兰氏染色阳性，则可将其接种到试管斜面上连续传代4~6次，最终选择出在3~6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。 2）乳酸菌饮料—酸乳的发酵
!""#! 实验与实习卫生职业教育$%&’(#())*+%’# 酸奶采用鲜奶和白砂糖为主要原料，经严格消毒后加入活性乳酸菌发酵制作而成。与普通牛乳比较，其中的蛋白质、脂肪经发酵后，易被人体消化吸收，同时还能提高钙、磷、铁的利用率，有利于防止婴儿佝偻病和老人骨质疏松病,"-。同时还具有治疗神经性厌食症、抗毒、抗癌及防止细胞老化，增强机体免疫力等功能,(-。乳酸菌是一类能利用可发酵的糖产生大量乳酸的细菌通称。这类细菌广泛分布在土壤，植物根、茎，湖泊及动物的体内。其从形态上可分为球菌和杆菌，并且均为革兰染色阳性、兼性厌氧菌或厌氧性细菌。 酸奶中有大量的乳酸菌，可定居在人体的鼻黏膜或消化道等处，所产生的代谢产物能降低肠道内的./值，抑制肠道中的腐败菌生长，减弱腐败菌在肠道的产毒作用，从而维持体内微环境，尤其是肠道内正常的微生态平衡,012-。 市面上出售的酸奶很多都是利用原始菌种进行逐级扩大的培养方式进行，即活化复壮，再进行扩大培养至乳酸菌的活力达到可用程度后，投入生产，进行发酵。在发酵剂的活化过程中，工序多，技术要求严格，稍有不慎就会污染到杂菌，所以培养基研制非常重要，要求培养出来的活菌数多，且培养时间要短。另外，活性乳酸菌达到一定数量才能起到增强机体免疫功能、延缓机体衰老等保健作用。因此，检测活性乳酸菌的含量成为判断产品质量好坏的重要手段。国际上规定乳酸菌数不得低于"3")456789&,#-。 本文就酸奶配制、培养基筛选及乳酸菌计数法进行讨论，对酸奶质量控制、市场研究和发展有一定的理论参考。 !酸奶配制方面的进展 杜传来,4-研制南瓜酸奶的配制方法是原料乳验收，再进行净化和脂肪标准化、混合、预热均质，:#;<)=1");()9>?杀菌，冷却到2#=，接种，罐装，发酵，冷藏。该产品富含矿物质、氨基酸，不含任何防腐剂、色素、香精等化学合成物质1不仅增加了酸奶的花色品种1而且提高了其营养保健作用。张迅捷,*-介绍大豆酸奶的配制主要是原材料（鲜牛奶@大豆@白砂糖）混合浆定容之后高压均质杀菌、冷却、加香精、接种、混匀、装杯封口 进入主发酵，冷藏后发酵，再检验、出库、包装。有研究人员研制的凝固型蜂蜜酸奶 ,:- ，具有独特的蜂蜜清香。其配制主要是脱 脂乳粉加水溶解，添加其他原料（蜂蜜、琼脂），混合过滤，再脂肪含量标准化，预热均质杀菌，尽快冷却，加入发酵剂之后装罐培养、冷却、冷藏后熟，若干小时后便成为颜色微黄的凝固型蜂蜜酸奶。孙好学等,<-配制的酸奶由于加入蜂蜜、 苹果和花生使酸奶颜色微黄，具有独特的清香。其配制方法是原料乳)过滤)脂肪含量标准化)预热)均质)杀菌)冷却)接种)加糖)添加其他原料（蜂蜜、琼脂、苹果和花生）)培养)冷藏后熟)产品。陈增伦等,")-研制蔬菜酸奶。蔬菜含有的淀粉化合物可以改善酸奶组织形态，使酸奶的营养更加平衡、合理。配制过程就是南瓜、胡萝卜去皮后蒸熟，果蔬机打浆后与牛奶、甜味剂混合，山药去皮后剪切，经过滤)均质)杀菌)加乳酸菌发酵)后熟)成品。枸杞具有清肝、润肺、滋肾、明目等功能。有研究人员利用枸杞研制了凝固型枸杞酸奶,""-。 方法是脱脂奶粉加水溶解成为脱脂乳，再加白砂糖和稳定剂等进行调配，混合预热到<);"))=后再冷却到4);*)=。经预处理后的枸杞浆，与之前已调配好的物料再进行调配，匀浆，无菌罐装，杀菌（:0=，0)9>?），冷却（2(=左右），接种，恒温培养（2";2(=），在2=冰箱中存放(2A ， 即为成品。郭红珍等,"(-研制的金针菇与香菇酸奶，瓷白色，光洁，乳白中略带浅黄色，具清新的金针菇或香菇香味。其研制方法是原料奶,金针菇或香菇浸提液 （白砂糖）：鲜奶-)煮沸)装瓶)杀菌（")#=，0;#9>?）)冷却（2(=）)接种)发酵（0*;2"=，0;#A ）)冷却（2=）)后熟)成品)评定。 以上酸奶，配制的基本方法都一样，但辅料不一样，风味各不相同。至于辅料的添加既可以在接种前加入，也可以在接种时加入。 "培养基筛选方面的进展 黄君红等 ,"0- 在对乳酸菌的培养基进行筛选的实验中，用 BCD 培养基、EFG 培养基、("2号培养基、乳酸菌分离培养基、改良马铃薯培养基、蕃茄汁培养基进行对比实验，并在乳酸菌分离培养基上添加了平菇、马蹄、大葱、胡萝卜、马铃薯、青瓜4种 99999999999999999999999999999999999999999999999999999999999999 摘 要：就酸奶配制、培养基筛选及乳酸菌计数法进行讨论。 关键词：酸奶；配制；培养基；乳酸菌；计数法中图分类号：H2(2’0" 文献标识码：F 文章编号："4*"!"(24I ())*J )#!)""#!)0 黄 雁"，邓海群( I "’韩山师范学院1广东潮州#(")2"K (’潮州*#(()部队机关卫生所1广东潮州#(")))J 酸奶配制及其乳酸菌培养基和计数法的研究进展 学质量提供了新的途径。 参考文献： ,"-柯新华，周世学，周英杰，等’严格培养作风优良的医务工作者,C -’解放军医院管理杂志，())"，:I 2J L (*#;(*4’ ,(-郑红1陈善明1师景波1等’我院如何做好临床教学工作,C -’中华医院管理杂志1"<<<1""L 4#";4#2’ ,0-方立1王莉萍’进修医生临床教学的组织与管理,C -’解放军医院管理杂志1())"，:I (J L ""#;""4’!
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
精心整理 乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 时，SL 培养基、MS 对乳酸菌无害。一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH 。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h →挑选产生溶
钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。 2.溴甲酚绿指示剂法： 培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液） 筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。 二.菌种的分离筛选 1.培养基： ★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L预先灭菌碳酸钙5-10g/LPH自然（分离用） ★★1.2吐温 ★1.3 酵母膏（分离用） 1.4 1.5 MgSO 4 1.6 ★★1.7 蛋白胨 葡萄糖、琼 脂18.0g 酸钙, 1.8BCP 乳糖5.0g蛋白胨5.0g酵母膏3.0g0.5℅溴甲酚紫10ml自来水1000ml pH6.5-7.0（分离用） 1.9BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒 精溶液0.07ml，0.075Mpa20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏 1.0g溶解后调pH6.5-6.8，0.1Mpa20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀， 倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。
乳酸菌研究进展 摘要:本文对乳酸菌、乳酸菌的应用、乳酸菌菌剂真空冷冻干燥技术、冻干保护剂等多方面进行了阐述。 关键词: 乳酸菌；应用；发酵剂；真空冷冻干燥 1. 前言 早在5000年前人类就已经在使用乳酸菌。今天，利用乳酸菌生产的健康食品已经一跃成为全世界关注的健康食品。到目前为止，人们利用乳酸菌的乳酸发酵，制作泡菜[1]、酸菜、乳酪、酸奶等食品。另外青贮饲料经乳酸发酵后可增加贮藏时间和提高饲料的利用率。在工业上制取乳酸是用淀粉类物质先糖化后，再用乳酸菌进行乳酸发酵生产纯乳酸[2-3]。发酵乳中的乳酸菌有预防肠癌、降低血液胆固醇含量、提高系统免疫功能、减轻过敏反应和防止糖尿病等功能[1-3]。由于乳酸菌所具有的营养、健康的特殊功效，使其风靡欧、美、日、韩等市场，并被广泛应用于乳制品、饮料、肉制品、保健食品等食品及预防医学领域[4-6]。 泡菜产业是我国传统发酵食品中对国民经济具有重要贡献的产业之一。但我国泡菜企业长期沿用自然菌发酵，企业规模小，泡菜生产周期长，产品质量不稳定，食用安全性差。这些问题严重影响和制约了我国泡菜产业的发展。采用现代生物技术，开发泡菜发酵专用复合菌粉生物技术产品，对改造我国传统泡菜产业具有非常重要的现实意义。直投式泡菜发酵专用复合菌粉产品，是泡菜工业化生产的专用发酵剂，但目前市场上还没有见到该产品销售。直投式泡菜发酵专用复合冻干菌粉产品的使用，可以保证泡菜的产品质量，极大地缩短泡菜的发酵时间，提高泡菜的产量和质量。 2. 乳酸菌 2.1 乳酸菌的分类 乳酸菌是指在代谢过程中能产生乳酸的细菌的总称。其中能进行乳酸发酵的大部分是细菌，有些为球菌、有些为杆菌，一般都不会运动。 常见的球形乳酸菌主要有：链球菌属将糖类经双磷酸已糖途径分解产生右旋乳酸，属正型乳酸发酵。多见于动物及动物性制品上；明串珠菌属将糖经单磷酸己糖途径分解产生左旋乳酸及乙醇等物质，属异型乳酸发酵。多见于植物体及植物制品之上；片球菌属将糖类经双磷酸己糖途径分解产生混旋的乳配。多数生活在植物及其制品上。 常见的杆形乳酸菌是乳杆菌属，约有20多种，有些种类产生右旋乳酸、也有产生左旋和混旋的乳酸，动、植物及其制品上均可找到它们。 2.2 乳酸菌特殊生活特点 乳酸菌具有强抗酸能力，大部分乳酸菌还具有很强的抗盐性，都能耐5％以
泛分布,但只有少数省份对其玉米矮花叶病作了毒源鉴定,基本明确为MDMV 2B (SC MV 2MDB ),而其他许多省份的玉米矮花叶病并未作毒源鉴定,它们究竟是属于MD 2MV 2B 株系还是属于SC MV 亚组中其他种类的病毒或为多种病毒的复合侵染还有待明确。因此,需要进一步明确病毒种类,了解玉米矮花叶病的流行规律,为抗病育种打下基础。 参考文献 [1]W illiams E ,Alexander L J 1Phytopathology ,1965,55:802～8041 [2]R osenkranz E 1Phytopathology ,1987,77:598～6071 [3]史春霖,徐绍华1植物病理学报,1979,9(1):35～401 [4]马占鸿,李怀方,裘维蕃1植物病理学报,1998,28(1):25～281 [5]马占鸿,李怀方,裘维蕃,等1玉米科学,1997,5(2):72～761 [6]M cdaniel L L ,G ordon D T 1Phytopathology ,1989,79(1):113～1201 [7]M ackenzie D R ,W ernham C C ,F ord E 1Plant Disease Reporter ,1966,50(11):814～8181 [8]Shukla D D ,Frenkel M J ,M ckern N M 1Archives of Virology ,1992(Suppl 5):363～3731 [9]石银鹿,张 琦,王富荣,等1植物病理学报,1986,16(2):99～1041 [10]吴建宇,盖均镒1南京农业大学学报,1999,22(2):117～1181 [11]G ough K H ,Shukla D D 1Intervirology ,1992,36:181～1921 [12]K ong P ,S teinbiss H H 1Archives of Virology ,1998,143:1791～17991 [13]Murry E ,E lliott G,Capitant A ,et al 1Bio/T echnology ,1993,11:1559～15641 [14]M arie 2Jeanne V ,I oos R ,Peyre J ,et al 1Phytopathology ,2000,148:141～1511 [15]范在丰,陈红运,李怀方,等1农业生物技术学报,2001,9(1):121 3联系人 T el :0571288381111261702 收稿日期:2001210209,修回日期:2001212230 乳酸菌抗菌机理研究进展 李铁军1 李爱云2 张晓峰33 (浙江国邦兽药厂 新昌 312500)1 (浙江大学医学院附属产科医院 杭州 310006)2 (浙江出入境检验检疫局 杭州 310012)3 摘要:乳酸菌的抗菌机理涉及其产生的各种代谢产物,包括酸性物质、乳酸菌素、二氧化 碳和过氧化氢等。其中酸性物质可以消耗大量细胞能量并影响细胞膜的稳定性;乳酸菌素 可作用于细胞膜,造成膜内物质和能量的泄漏。对于它们抗菌机理的认识有助于我们更好 的将乳酸菌应用到食品的安全生产中。 关键词:乳酸菌,抗菌,酸性物质,乳酸菌素 中图分类号:Q93 文献标识码:A 文章编号:025322654(2002)0520081205 乳酸菌是一类可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称,在自然界和食物中广泛存在。乳酸菌是最早被人类用于食品储藏加工的微生物之一,早在公元前6,000年,人们就懂得利用乳酸菌发酵食物。他们发现食物经过一定的处理和储存就可改善风味、延长储存期和增加食物的安全性。迄今人们已明确了许多乳酸菌在生产安全优质食品中所起重要作用的生物学机理[1～2]:乳酸菌可以发酵食物中碳水化合物,分泌乳酸菌素,
发酵工程学实验报告实验三、乳酸菌的分离和酸奶的制作 学院生命科学学院 专业应用生物教育 班级12应生A班 姓名李顺昌 学号124120218 实验课程乳酸菌的分离和酸奶的制作 指导教师许波 开课学期2014—2015学年下学期
实验三、乳酸菌的分离和酸奶的制作小组合作：是小组成员：李顺昌、李媛媛、方淑萍、周玉坤 一、实验目的 1.掌握分离纯化微生物的基本方法 2.掌握酸奶制作的基本原理 3.学会酸奶的制作方法 二、实验设备与材料 1、仪器设备：三角瓶、平皿、试管、移液管、玻璃涂布棒、灭菌锅、超净工作台、培养箱、恒温摇床、冰箱等。 2、材料：市售酸奶、奶粉、白糖、棉花、酸奶瓶（自备，1个/人）等。 3、培养基：乳酸菌分离用 乳酸菌分离用培养基：牛肉膏：0.5％；酵母膏：0.5％；蛋白胨：1％；葡萄糖：1％；乳糖：0.5％；NaCl：0.5％；琼脂：2.5％；pH6.8。 配制250mL/组，装于2个三角瓶 三、实验原理 1、酸奶制作的基本原理 （1）酸奶：以牛奶为主要原料，接入一定量乳酸菌，经发酵后制成的一种乳制品饮料。 （2）生理生化原理 牛奶（乳糖）→接种乳酸菌→β-D-半乳糖苷酶→乳糖（半乳糖和葡萄糖）→乳酸发酵（葡萄糖）→乳酸→破坏钙-酪蛋白-磷酸复合物的稳定性→蛋白质凝结→酸奶 2、提供适宜的生长条件、采用一定的微生物分离纯化方法，就能够从酸奶中分离出乳酸菌。 3、酸奶中含有乳酸菌的菌体及代谢产物，因而对人体的肠胃消化道疾病有良好的治疗效果。 四、实验方法步骤
（一）乳酸菌的分离纯化——稀释涂布平板法 1、倒平板（约6块/100ml） 2、制备酸奶稀释液 （1）将0.5mL酸奶吸入4.5mL无菌水（自备）中，摇动5min； （2）用无菌吸管吸出0.5mL酸奶悬液，加入盛有4.5mL无菌水的试管中，充分混匀，制备得到10-2稀释液； （3）再从中吸出0.5mL加入盛有4.5mL无菌水的大试管中，混匀后得到10-3稀释液； （4）以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6酸奶稀释液。 3、涂布 用无菌吸管分别吸取10-3、10-4和10-5稀释液各0.1mL，对号放入已经写好记号的平板中央，用无菌玻璃涂棒涂匀（每个稀释度涂2块平板）。 4、培养：37℃倒置培养2-3d 5、观察菌落特征（周二中午） 扁平型菌落：大小为2-3mm，边缘不整齐，很薄，近似透明状，染色镜检为细杆状； 半球状隆起菌落：大小为1-2mm隆起成半球状，高约0.5mm，边缘整齐且四周可见酪蛋白水解透明圈，染色镜检为链球状； 礼帽形突起菌落：大小为1-2mm，边缘基本整齐，菌落中央呈隆起状，四周较薄，有酪蛋白水解透明圈，染色镜检亦为链球状。 6、分离纯化：（周二）挑取符合上述特征的单菌落，划线于平板，37℃倒置培养约2d（下周四中午）；如发现杂菌需重复上述步骤（纯化）直到获得纯培养。 （二）酸奶的制作 1、菌种的制备 （1）将分离纯化所得到的乳酸菌分别接种于LB培养基中（30ml/瓶）（下周4早上）； （2）37℃、200r/min摇瓶培养约48h （下周5晚）。 2、牛奶的配制
酸奶制作及乳酸菌的分离计数 一、实验目的 1、学习自制酸奶的方法。 2、熟悉从酸奶中分离和纯化乳酸菌的一般方法。 3、掌握用浇注平板法分离微生物纯种。 4、了解简便、快速厌氧菌菌落计数法的基本原理。 5、学习用简便、快速厌氧菌菌落计数法对乳酸菌进行活菌计数。 二、实验原理 酸奶又称酸乳，是以牛奶为主要原料，经乳酸菌发酵而制成的一种营养丰富、风味独特、国际流行的保健饮料。酸奶发酵中的主要生物化学变化是：乳酸菌将牛奶中的乳糖发酵成乳酸使其pH降至酪蛋白等电点附件从而使牛奶形成凝固状；其次，乳酸菌还会触使部分酪蛋白降解、形成乳酸钙和产生一些脂肪、乙醛、双乙酰和定二酮等风味物质。酸奶发酵过程通常是由双菌或多菌的混合培养实现的。其中的杆菌先分解酪蛋白为氨基酸和小肽，由此促进球菌的生长，而球菌产生的甲酸又刺激了杆菌产生大量的乳酸和部分乙醛，由此链球菌还产生了双乙酰这类风味的物质，因此，达到了稳定状态的混合发酵。 根据高层半固体培养基具有良好厌氧性能的原理，我们设计了一种适用于乳酸菌等不产气的厌氧菌进行简便快速菌落计数的方法。此法把稀释（在半固体培养基凝固前）和（在半固体培养基凝固后）集中在同一支试管中内，以不易透氧、装有高层半固体培养基的试管代替常规的培养皿平板进行菌落计数，从而使活菌计数操作简化成“试样分散----逐级稀释+常规培养---菌落计数”3步，而传统的方法则需“试样分散----逐级稀释---涂布或浇注平板---厌氧培养---菌落计数”5步。因此，本法不仅有简化操作步骤的优点，还有省略专用厌氧培养装置、缩短培养时间以及节约试剂和材料等优点。 三、实验器材 1、菌种：德氏乳杆菌保加利亚亚种、唾液链球菌嗜热亚菌（可从品牌酸奶商品中自行 分离） 2、培养基：（1）LAB半固体培养基100ml （2）MRS琼脂培养基200ml (3)MRS液体培养基10ml 3、材料：优质全脂牛奶或奶粉（内含脂肪28%，蛋白石27%，乳糖37%，矿物质6%，水分2%），蔗糖：市售优质酸奶（1瓶） 4、器皿：锥形瓶（3个）、空试管（14支）、无菌移液管（1ml*15根，10ml*2根）、培养皿（6套）、涂布棒、量筒、酒精灯、恒温水浴锅，恒温箱，冰箱
乳酸菌的分离纯化
乳酸菌的分离与纯化 1.实验目的 2.实验材料 2.1试验设备 天平、牛角匙、电炉、 pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、试管、棉塞、培养基、吸管、牛皮纸、线绳、标签、 500mL 锥形瓶两个、 250mL锥形瓶两个、试管20只、 500mL烧杯两个、 250mL 烧杯两个、 100mL烧杯两个、酒精灯、石棉网、接种针（环）。 2.2实验仪器 50L的高压蒸汽灭菌锅、恒压干热灭菌箱、超镜台、光学显微镜、 75%酒精棉、冰箱。 2.3实验药品 新鲜酸奶、脱脂奶粉或全脂奶粉、蔗糖、 1.6%溴甲酚绿乙醇溶液、酵母膏、琼脂、结晶紫染液、卢戈氏碘液、 95%乙醇、诗坛酸复红染液。 3.试验方法及操作过程 3.1BCG牛乳培养基配方及灭菌 （A）液：脱脂奶粉10克，水50ml，加入1.6%溴甲酚绿乙醇溶液1ml，80℃灭菌20min。 （B）液：酵母膏1克，水50克，琼脂2克，pH6.8，121℃灭菌2.min。 按照配方正确称取所需药品放于烧杯中，在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解，用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照，加琼脂溶化，
加热过程要不断搅拌，可适当补水。琼脂完全溶解后倒入250mL的锥形瓶中，用纱布包扎好（注意不要污染纱布） 再用牛皮纸包扎，贴上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。在高压锅中，在1kg/cm2压力下维持30min。 3.2倒BCG培养基平板的方法 将灭好菌的A液和B液趁热充分混合，点燃酒精灯对周围的空气进行灭菌，并在酒精灯的附近用左手握着平板用拇指和小拇指打开一个小缝，趁热将培养液倒如平板内，倒入的量能使培养基刚要覆盖平板底部，倒好后把平板平放到实验台，轻轻晃动是培养基形成一个平面，等培养基冷却凝固后倒放并贴上标签。（注意：整个实验要在酒精灯附近做，以保证培养基不染菌） 3.3脱脂乳试管的配制与灭菌 直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10克与蔗糖5克，水95克（蔗糖与水的比例在1：10的范围内）的比例配制，装量以试管的1/3为宜，115℃灭菌15min。 3.4乳酸菌的分离纯化 取市场销售的新鲜的酸奶，分别用接种针接入BCG牛培养基琼脂平板上，40℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。 选取乳酸菌典型菌落转致脱脂乳试管中，40℃培养8~24h若牛乳出现凝固，无气泡，显酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代3次，最终选择出在3~6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。 3.5乳酸发酵及检查
乳酸菌活菌制剂对动物免疫调节作用研究进展 黑龙江省科学院微生物研究所曹亚斌 Fuller于1989年首次给益生菌下的定义是“益生菌是通过改善肠道菌群平衡而对宿主健康产生有益作用的活菌添加剂。”FAO和WHO 给出益生菌的定义为“当摄人足够数量时可对宿主起有益健康作用的活的微生物。”不少地方采用这一概念，但随着研究的进行逐渐发现了这个定义的局限性，不同的研究者也不断提出应对益生菌概念进行调整和完善。在有益菌中，主角是乳酸菌，各国科学家对活性乳酸菌的研究取得诸多成果。 活性乳酸菌对动物机体有众多的有益作用，如协调和维持胃肠道微生态平衡；和病原体竞争肠黏膜的吸附位点，致使病原菌无法在肠黏膜上定植，促进营养成分的吸收，抗肿瘤作用，刺激免疫细胞的活性，提高机体的免疫力等，其中最引人注目的是活性乳酸菌对于机体免疫力的影响。 一、活性乳酸菌发挥免疫调节作用应具备的条件 对于活性乳酸菌菌株的选择应建立在它能够促进肠内免疫反应而不会改变肠内动态平衡的基础上。要胜任这个使命，乳酸菌应具有以下特点：①应具有较高的活性，必须能耐受低pH以及胆汁酸；②如果菌株不能在肠道内定植，应能够在肠道内持续存在（可通过持续摄人而满足）；③能够附着到肠上皮以抵抗肠蠕动的冲洗作用；④应该能够和肠相关的免疫细胞相互作用或者发出信号。 1、乳酸菌的活性
一般认为活性乳酸菌要对免疫系统起作用，它们必须保证是存活状态的，可以在肠道内增殖并存活下去，包括FAO和WHO的概念中都认为益生菌应该是活的微生物。试验证实和活性的德氏乳杆菌组相比，无活性的德氏乳杆菌组激活分泌细胞子的细胞数量要少。 另有一些试验结果明确地显示，被摄取的菌株并役有成为肠道正常菌群的固定成员而只是在摄取期间存在或者是在给料后维持相当短的一段时间。另外，乳酸菌的代谢产物中的乳酸及一些可溶性因子也会发挥作用。从8种冻干乳酸菌株组成的乳酸菌混合物VSL3中提取的DNA可引起上皮细胞和免疫细胞的非炎性反应。在一个同样使用(VSL3)混合物的相似的研究中发现，这种乳酸菌的染色体DNA通过TLR9信号途径对右旋糖酐硫酸酯钠引起的小鼠大肠炎模型有抗炎作用。 试验证明，只有活性乳酸菌，在肠内存在至少48 h～72 h才能发挥作用，这是所有颗粒性抗原要诱导肠内免疫促进作用所必须的。这一结果提示了对于每一种动物来说每天定量的活性乳酸菌摄人对于其发挥免疫作用是非常重要的。这类研究有助于阐明关于活性乳酸菌对免疫调节的分子基础。 2、益生菌的黏附性 关于益生菌的黏附性也受到较多的关注，对宿主细胞或黏滚的黏附能力被认为对益生菌来说是必须的。因为只有黏附到肠道内表面才能抵抗肠道的蠕动而不被很快的排出，只有黏附之后才有和肠上皮和相关免疫细胞相互作用的可能。然而对于活性乳酸菌的黏附性，尤其
实习报告 实习名称微生物课程实习 系另生物与化学工程系 年级专业2018级生物工程 学生姓名乐一鸣1040903054指导老师蒋盛岩王瑶琼
邵阳学院 2018 年09月19 日一．实习时间、实习地点和实习单位：2018年9月3日—9月16日邵阳学院李子园校区3栋104室二．实习过程概述：<一）实习动员会2018年9月3日上午<二）实习工作准备1. 时间：2 天2. 内容<1）分组制订详细地实习方案. <2）分组选择和使用所需地仪器. <3）分组配制各种试剂、培养基并进行正确地消毒与灭菌. <三）乳酸菌地分离纯化1. 时间：7 天2．内容<1）无菌操作倒平板、十倍稀释法、划线分离或涂布平板法, 恒温培养<2）菌落观察与镜检<3）筛选生产用菌株⑷菌种传代培养<菌种活化与扩大化）<四）乳酸菌饮料地制作 1.时间：3 天 2. 内容<1）制备发酵液<2）接种发酵菌剂并发酵生产<3）观察发酵情况 ＜4）品尝发酵产品, 进行质量评价 ＜5）记录结果 ＜五）书写实习报告 时间：1天 三．主要实习岗位和实习内容： 1、实验药品新鲜乳酸饮料＜市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液（溴甲酚绿、无水乙醇＞、酵母膏、琼脂、革兰氏染液＜结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl 、碳酸钙；b5E2RGbCAP 0.4gNaOH 固体、 4.2ml 浓 HCL（分析纯＞、 20gCaCO3 固体、酵母膏 20g 、琼脂 30g p1EanqFDPw 香柏油、脱脂奶粉 100g 、蔗糖 10g； 2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、恒压干热灭菌箱、超净工作台、光学显微镜、培 养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿＜? 9或? 12）、试管、300ml三角瓶＜带玻珠）、移液管、天平、牛角匙、电炉、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、棉塞、吸管、线绳、标 签、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯、酒精灯、石棉网、接种针＜环）、擦镜纸DXDiTa9E3d
乳酸菌的分离及酸奶的 制作 -CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
乳酸菌的分离及酸奶的制作 生物科学091 研究背景及意义 乳酸菌是指一群通过发酵糖类，产生大量乳酸的细菌总称。乳酸从形态上可分为球菌和杆菌，并且均为革兰氏染色阳性、在缺少氧气的环境中生长良好的兼性厌氧性或厌氧性细菌。目前，对乳酸菌的应用研究，着重于食品（如发酵乳制品、发酵肉制品和泡菜）和医药工业等人类生活密切相关的领域。 近几年由于广谱和强力的抗菌素的广泛应用，使人体肠道内以乳酸菌为主的益生菌遭受到严重破坏，抵抗力逐步下降，导致疾病越治越多，健康受到极大的威胁。所以，有意增加人体肠道内乳酸菌的数量就显得非常重要。随着人们生活水平的提高和消费观念的转变，在我国生产销售的酸乳及酸乳饮品数量直线上升, 品种花样繁多, 很受消费者的青睐。酸奶是以新鲜牛乳经有效杀菌, 用不同乳酸菌发酵剂制成的乳制品, 味酸甜细腻, 营养丰富, 深受人们喜爱, 专家称它是“21 世纪的绿色食品”, 是一种“功能独特的营养品”。它对人体有较多的好处, 可以维持肠道正常菌群平衡, 调节肠道有益菌群到正常水平等。 因此，从发酵乳制品中分离性能优良的乳酸菌，制作真正的健康、绿色的食品，对促进我国发酵乳制品工业的发展具有重要的意义。 目前市售的各种酸奶制品中, 作为发酵剂的乳酸菌, 通常为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌这两株菌。用嗜热链球菌和保加利亚乳酸杆菌混合培养发酵的乳酸饮品能补充人体肠道内的有益菌，维持肠道的微生态平衡，且含有易于吸收的营养素，具有抑制腐败菌、提高消化率、防癌及预防一些传染病等功效，并能为食品提供芳香风味，使食品拥有良好的质地。 保加利亚乳杆菌（）:长杆形，直径1-3mm左右,能产生大量的乳酸。酸碱度方面,为耐酸或嗜酸性,因低 pH能防止一些微生物的生长;温度方面,为嗜温至少许嗜热,最适生长温度在37-45℃之间,对低温非常敏感。 嗜热链球菌（）：卵圆形，直径－微米，呈对或链状排列，无运动性。为健康人肠道正常菌群，可在人体肠道中生长、繁殖。可直接补充人体正常生理细菌，调整肠道菌群平衡，抑制并清除肠道中对人具有潜在危害的细菌。 本研究对市售主要品牌酸奶中乳酸菌进行了分离鉴定，并进一步探讨制备酸奶条件（温度、时间等），以达到最佳的天然酸奶质量效果，为广大消费者选购高品质酸奶提供理论支撑。
乳酸菌生物技术的应用研究进展 乳酸菌生物技术是21世纪各国竞相开拓的一个尖端领域，乳酸菌是一类能够利用碳水化合物生成乳酸的革兰氏阳性细菌的总称。在分类学中，其可以划分为43个属（包括乳杆菌属、乳球菌属、双歧杆菌属等），210余个种及亚种。乳酸菌生物技术是一门涉及领域宽、涵盖范围广、基础性强的新兴学科，是现代生物学和其他学科交叉融合的产物。下面我从五个不同方面简单介绍乳酸菌的应用，当然它的应用远远不止这些。 一、乳酸菌在青贮中的应用 乳酸菌是促使青饲料发酵的主要微生物，乳酸菌依其发酵糖生产乳酸的能力分为两类，一种是同型发酵乳酸菌；另一类是异型发酵乳酸菌。同型发酵乳酸菌在生产乳酸和青贮饲料方面更有效,耗能更少，而且容易保存营养物质，属于比较经济的发酵类型。青贮能否成功在很大程度上取决于同型乳酸菌能否迅速大量繁殖，筛选并培养最适合的乳酸菌是关键，调节青贮料内微生物区系，调控青贮发酵过程，促进多糖与粗纤维的转化，从而有效地提高青贮饲料的质量。 二、乳酸菌在植物种植中的应用 乳酸菌对植物生长的促进作用，乳酸菌所分泌的有机酸( 乳酸、乙酸和柠檬酸等) 一方面直接溶解土壤中难溶性磷酸盐，另一方面则通过螯合作用释放出土壤磷素，以便于植物吸收利用；同时乳酸菌对植物病害有着调控作用，诸多研究证实乳酸菌可有效防治植物真菌性病害，日本科学家利用乳酸片球菌研制出了防治农作物病害的“乳酸菌农药”。将其制成液态药物，将菠菜种子在药液里浸泡24 h。处理过的种子播种到含菠菜枯萎病病原菌的土壤内，在长出来的菠菜中染病菠菜只占约12%。 三、乳酸菌在动物生产中的应用 在鸡、猪等基础日粮中添加乳酸菌制剂，可以提高肉鸡、猪日增重和肉品质，提高饲料转化率，增强机体免疫机能等；在幼龄反刍动物的饲养过程中使用乳酸菌制剂，有助于幼龄反刍动物瘤胃发育，提高日增重，调节瘤胃ｐＨ；有助于反刍动物肠道微生物的菌群平衡等。帅丽芳等给荷斯坦奶牛饲喂含乳酸菌的发酵乳，结果发现其反刍时间得到显著提高。聂志武（通过给新生犊牛口服假长形双歧杆菌，研究结果发现其增重提高了２５.２％，饲料转化率提高了１１．４％；朱学芝等研究结果发现，乳酸菌的代谢产物能协助虾消化一些不易消化代谢的营养物质，从而促进虾对营养物质的吸收，提高饲料的转化率。 四、乳酸菌在临床中的应用 在人体肠道中，有多达500种约1亿个细菌共生。这之中，包括乳酸菌在内的20个属为优势菌群。人体在健康状态下，肠道内的菌群在种类和数量方面保持相对稳定，形成良好的微生态平衡。乳酸菌在肠道内定殖后可通过调整正常肠道菌群相对含量发挥益生作用。这些作用主要包括缓解乳糖不耐的症状、腹泻、胃溃疡，促进免疫应答，抗过敏和预防结肠癌，增强免疫功能等。 五、乳酸菌在基因芯片中的应用 基因芯片技术是上世纪 90年代兴起的一种对成百上千甚至上万个基因同时进行检测的新技术,具有高通量、并行化的特点,广泛应用于基因表达谱测定、基因功能预测、基因突变检测和多态性分析等方面。多种乳酸菌基因组全序列以及其大量 EST、16S rDNA、16S-23S 基因间区和功能基因序列测定的完成,有力地推动了基因芯片技术在乳酸菌研究中的应用。在我国, 内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室从内蒙古地区酸马奶中分离了一株具有优良特性的干酪乳杆菌(L. caseiZhang), 具有很强的耐酸、耐胆盐、降胆固醇及免疫调节等特性,该菌是国内较为系统开发的益生菌菌株之一,并且和中国科学院北京
乳酸菌得分离、纯化与鉴定 第一部分:乳酸菌得分离、纯化 一、实验器材: 1、实验药品新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1、6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙; 0、4gNaOH固体、4、2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g; 2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤: 1、培养基配制(BCG牛乳培养基): (A)溶液:取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1、6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;(1、6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1、6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成) (B)溶液:酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热溶解,用精密pH试纸调节pH到6、8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2、药品配制 2、1 结晶紫:结晶紫乙醇饱与液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀,放置24小时后过滤即可。 2、2 卢哥氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水300ml即成。 2、3 蕃红溶液:番红2、5g,95%乙醇100ml,溶解后存于密闭得棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。 2、4 0、1%得吕氏美蓝染液:A液:美蓝0、3g,95%乙醇300ml;B液:0、01% KOH 100ml。混合A与B液即成,按1:100稀释即可。 2、4 生理盐水:称取9g氯化钠,溶解在少量蒸馏水中,稀释到1000毫升。 3、菌悬液得配制
乳酸杆菌的研究进展 摘要 乳酸杆菌是一类近年来研究较多的益生素，大量试验结果表明, 乳酸杆菌中的一部分菌种对人和动物的保健和疾病治疗有效果。本文主要介绍了乳酸杆菌的分离与鉴定，菌种的保藏, 代谢产物，生理功能及应用研究，是一种前景广阔的微生态制剂。 乳酸杆菌 乳酸杆菌，是一类能使糖类发酵产生乳酸的细菌，是一群生活在机体内益于宿主健康的微生物。乳酸杆菌存在广泛，其生长温度在20~ 53℃ , 最适温度为30~ 40 ℃；嗜酸性，最适合pH5.5～6.0，在pH3.0～4.5中仍然能生存，在无芽胞杆菌中其耐酸力最强。 乳酸杆菌是一群杆状或球状的革兰氏阳性细菌，不形成芽孢, 触媒阴性,细胞色素缺失,其DNA中G+C含量少于55%。乳酸杆菌绝大多数是厌氧菌或者兼性厌氧的化能营养菌，生长繁殖于厌氧或微好氧、矿物质和有机营养物丰富的微酸性环境中。在污水、发酵生产（如青贮饲料、果酒啤酒、泡菜、酱油、酸奶、干酪）培养物、动物消化道等中乳酸杆菌含量较高。乳酸菌不仅已广泛应用于畜牧业、食品加工业, 随着研究的深入, 也在一些疾病治疗中得以应用, 用于增强患者的免疫、营养、生长刺激等。 乳酸杆菌的分离与鉴定 1 乳酸杆菌的分离 从不同的基质中分离乳酸杆菌时，根据乳酸杆菌所在生长环境的不同以及是否为优势菌可选择不同组分的培养基。主要有以下几种常用的培养基[1]： （1）MRS 培养基 当乳酸杆菌是待分离区系的优势菌时，常用MRS 培养基对其进行分离。目前
MRS 培养基已经成为国标上公认的用于乳酸杆菌分离较好的培养基，常用于从乳酸杆菌发酵制品中分离菌种以及菌种分离后的传代培养。 （2）RSMA 培养基 RSMA 培养基是近几年发展起来用于乳酸杆菌分离的一种非选择性培养基，由于该培养基中加入0.05%的钌红染料,其最大优点是可以使不同菌种在其表面生长并形成颜色各异易于鉴别的菌落。通常情况下, 乳酸杆菌在RSMA 培养基上形成黄色菌落, 而嗜热链球菌为紫红色菌落, 肠球菌是白色菌落。因此, 简单培养后不用通过常规染色和镜检就可以将乳酸杆菌与其他细菌鉴别开来。ELLI 等应用RSMA 培养基成功的从人粪便样品中分离出了乳酸杆菌[2]。但由于此培养基的营养成分比较单一，所以不适于从菌群组成复杂的环境中分离乳酸杆菌。（3）番茄汁琼脂培养基 这是一种传统的用于分离乳酸杆菌的培养基。此种培养基由于含有一定量的番茄汁，为乳酸杆菌的生长提供必要的营养，使得乳酸杆菌在此环境下更容易生长。但由于配置过程中需要制备新鲜番茄汁，所以操作起来较为费时费力，目前已逐渐被MRS 等培养基所代替。 （4）其他培养基 某些选择性培养基可用于从菌群复杂的基质(例如肠道) 内进行乳酸杆菌的分离。APT 培养基通常用于从肉制品中分离乳酸杆菌，改良的RogosaSL 完全选择性培养基则常用于胃肠内容物中乳酸杆菌的分离[3]。Briggs 琼脂培养基和SL 培养基常用于酸奶中乳酸杆菌的分离[4]。 2 乳酸杆菌的鉴定 2.1 属水平的鉴定[1] 乳酸杆菌属水平的鉴定是乳酸杆菌整体鉴定过程中较为简单且最为基本的步骤，常用的方法是对分纯后的乳酸杆菌培养物进行革兰染色、镜检，选择无分叉的G+杆菌。如果这些无分叉G+杆菌经过培养后，在pH4.5 的条件下能够生长，并且过氧化氢试验、硝酸盐还原试验、联苯胺反应、明胶液化试验、吲哚试验、硫化氢试验均为阴性，即可鉴定其为乳酸杆菌属。 2.2 种水平的鉴定---生化鉴定 乳酸杆菌种水平的生化试验主要采用糖醇类发酵试验。不同乳酸杆菌对糖的利用