第37卷第3期2016年3月
发光学报
CHINESE JOURNAL OF LUMINESCENCE
Vol.37No.3
Mar.,2016
文章编号:1000-7032(2016)03-0310-05
利用聚丙烯酸钠-Nafion混合膜增强三联吡啶钌
掺杂SiO2纳米粒的电化学发光信号及其生物标记陈哲1,豆兴茹1,2,葛芝莉1,郭莉萍3,谢洪平1*
（1.苏州大学药学院,江苏苏州215123; 2.苏州大学第一附属医院,江苏苏州215123;
3.重庆科技学院化学化工学院,重庆401331）
摘要:对于三联吡啶钌（Ru（bpy）32+）掺杂的SiO2纳米粒,以聚电解质聚丙烯酸钠和成膜物质Nafion的混合液对纳米粒进行包覆,制备了聚丙烯酸钠和Nafion混合膜包覆的电化学发光（ECL）纳米粒三结果表明:混合膜包覆的纳米粒,相对于Nafion膜的ECL信号增强了13倍三同时,混合膜表面可交换阳离子显著增加,能够通过离子交换固载大量的Ru（bpy）32+,纳米粒的ECL信号可进一步增强约3倍三混合膜还具有另外一个显著的优势,即通过混合膜的疏水相互作用可以方便地标记生物大分子,标记抗体仍然具有良好的免疫活性三关键词:信号增强;电化学发光纳米粒;聚丙烯酸钠;Nafion混合膜;生物标记
中图分类号:O482.31;O614.82 文献标识码:A DOI:10.3788/fgxb20163703.0310
Electrochemiluminescence Signal Enhancement of Ru（bpy）32+-doped SiO2Nanoparticles Based on Sodium Polyacrylate-Nafion Mixing
Membrane and Their Bio-labeling
CHEN Zhe1,DOU Xing-ru1,2,GE Zhi-li1,GUO Li-ping3,XIE Hong-ping1*
（1.College of Pharmaceutical Sciences,Soochow University,Suzhou215123,China;
2.First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou215123,China;
3.College of Chemistry and Chemical Engineering,Chongqing University of Science and Technology,Chongqing401331,China）
*Corresponding Author,E-mail:hpxie@https://www.doczj.com/doc/804174668.html, Abstract:Ru（bpy）32+-doped SiO2nanoparticles were covered with the mixture of polyelectrolyte sodium polyacrylate and membrane-forming substance Nafion,and then the electrochemilumines-cence（ECL）nanoparticles were acquired.The results show that ECL intensity of the polyacrylate-Nafion mixing membrane covered nanoparticles is enhanced13times,compared with the Nafion membrane covered nanoparticles.At the same time,there is an obvious increase of the exchangeable cation on the surface of the mixing membrane,and more Ru（bpy）32+can be immobilized on the surface of the nanoparticles based on ion exchanging,and the corresponding ECL intensity can be enhanced about3times.Another significant advantage of the mixing membrane is that the as-pre-pared nanoparticles can label bio-macromolecule more easily based on the hydrophobic interaction. The results show that the labelled antibody still has good immune activity.
Key words:signal enhancement;electrochemiluminescence nanoparticles;sodium polyacrylate;Nafion-mixing mem-brane;bio-labelling
收稿日期:2015-10-16;修订日期:2015-12-21
第3期陈哲,等:利用聚丙烯酸钠-Nafion混合膜增强三联吡啶钌掺杂SiO2纳米粒的电化学发光信号及其生物标记311
1 引言
三联吡啶钌（Ru（bpy）32+）是目前研究最为广泛的电化学发光（ECL）活性物质,然而,它本身没有可用于标记的活泼基团,常常通过衍生化或以纳米粒为载体而实现标记三SiO2纳米粒良好的生物相容性和大量的带负电荷的微通道使其可以通过掺杂的方法固载大量的三联吡啶钌,实现ECL信号的放大,提高ECL分析的灵敏度[1-5]三为了实现生物标记,SiO2纳米粒需要进行表面功能化三然而,由于三联吡啶钌良好的水溶性,无论直接掺杂还是以超分子包合物掺杂[6],三联吡啶钌在表面功能化时均易于从纳米粒中泄漏三全氟化树脂Nafion是一种聚阴离子疏水聚合物,易于在纳米粒表面成膜三一些研究者[7-11]在非掺杂的SiO2纳米粒表面包覆Nafion膜,通过膜表面的阳离子交换将Ru（bpy）32+固载于纳米粒上,再利用膜的疏水性区域,通过疏水相互作用即可方便地标记生物大分子三但是,在该类ECL纳米粒中, SiO2纳米粒子仅仅是Nafion膜的载体,并没有直接固载Ru（bpy）32+于纳米粒的微孔中三
若将Nafion膜包覆在Ru（bpy）32+掺杂的SiO2纳米粒（Ru@SiO2）表面,则制备得到的纳米粒（Ru@SiO2/Nafion）既有掺杂于内部的Ru（bpy）32+,又可以利用离子交换固载Ru（bpy）32+于纳米粒表面,固载量将会极大地增加三然而,ECL信号并未显著增强三究其原因,Nafion膜的疏水性结构阻碍了掺杂于内部的电活性物质与电极之间的电化学接触,阻碍了电子转移,使掺杂的Ru（bpy）32+的ECL信号显著减弱三本文以阴离子聚电解质聚丙烯酸钠（PAA-Na）和Nafion的混合液对掺杂纳米粒Ru@SiO2进行包覆,制备了混合膜包覆的复合纳米粒（Ru@SiO2/PAA-Nafion）三相对于Nafion膜,混合膜既有效地克服了电子转移阻碍的问题,又增加了膜表面Ru（bpy）32+的固载量,同时,混合膜的疏水性区域仍然能够通过疏水相互作用方便地标记生物大分子三
2 实验
2.1 试剂与仪器
Ru（bpy）3Cl2四6H2O（>98.0%）购于百灵威科技有限公司;Nafion（5%质量分数）和聚丙烯酸钠（PAA-Na,45%质量分数,M w=8000）购于Sig-ma-Aldrich公司;兔抗小鼠IgG二羊抗兔IgG-FITC 及牛血清白蛋白（BSA）购于生工生物工程（上海）有限公司;正硅酸乙酯（TEOS,AR）和其他化学试剂均购于国药集团化学试剂有限公司;实验用水为自制三蒸去离子水三
实验仪器包括:NICOMP TM380ZLS Zeta电位及粒度分析仪（美国PSS公司）;MPI-A型毛细管电泳电化学发光检测仪（西安瑞迈分析仪器有限责任公司）;RST5000系列电化学工作站（苏州瑞思特仪器有限公司）三
2.2 掺杂纳米粒的制备
在恒温40?水浴磁力搅拌的25mL无水乙醇中加入0.75mL的TEOS,再向其中加入150μL Ru（bpy）32+溶液（25mmol/L）与350μL水的混合溶液,磁力搅拌0.5h后加入1mL NH4OH,继续磁力搅拌1h,再加入0.5mL TEOS,继续搅拌3h后停止反应三高速离心,弃上清,沉淀先后用无水乙醇和三蒸水超声复溶后高速离心洗涤2次,最后复溶于25mL三蒸水中,得浓度为18 mg/mL的Ru（bpy）32+掺杂的SiO2纳米粒溶液,即Ru@SiO2溶液三
2.3 混合膜包覆纳米粒的制备
取浓度为18mg/mL的Ru@SiO2溶液2mL 高速离心,沉淀复溶于5mL无水乙醇中,向其中缓慢地加入500μL质量分数为2%的Nafion与500μL质量分数为5%的PAA-Na的混合液,在冰浴下磁力搅拌4h后停止反应三高速离心,弃上清,沉淀用三蒸水超声,复溶,高速离心,沉淀再复溶于2mL三蒸水中,得浓度为18mg/mL的PAA-Na与Nafion混合膜包覆的Ru@SiO2纳米粒溶液,即Ru@SiO2/PAA-Nafion溶液三
2.4 混合膜包覆纳米粒的抗体标记
在200m L浓度为18mg/mL的Ru@SiO2/ PAA-Nafion中,分别加入20m g/mL兔抗小鼠IgG 200m L和10m L浓度为25mmol/L的Ru（bpy）3Cl2溶液,37?水浴孵化30min,高速离心,沉淀复溶于200m L浓度为0.01mol/L的PBS（pH=7.4）,加入1%的BSA200m L于37?水浴孵化60min,高速离心,沉淀复溶于200m L浓度为0.01mol/L 的PBS（pH=7.4）中,得复合纳米粒标记抗体三2.5 检测样本与ECL检测
所检测的ECL物质或纳米粒均溶于1mL浓
312 发 光 学 报第37卷
度为0.01mol /L 的PBS（pH =7.4）中,再加入1
mL TPA 溶液（TPA 浓度为0.05mol /L,溶剂为浓度为0.3mol /L二pH =6.8的PBS 缓冲液）,混合均匀,备用三ECL 检测条件为:扫描电位0~1.4V;电流灵敏度1?10-4A;扫描速率0.1V /s;光电倍增管高压600V,放大级数3三
3 结果与讨论
3.1 ECL 纳米粒的粒径分布
对于Ru（bpy）32+掺杂的SiO 2纳米粒,以其
为核心载体进行膜的包裹及生物连接三由粒径分布图（图1）可知,粒径分布均匀,平均粒径约为
110nm,表明已成功制备了掺杂的ECL 纳米粒三
20
50
100
200
500
1K
10
020*********REL
Diam[nm]
INTENS -WT GAUSSIAN DISTRIBUTION
图1 掺杂纳米粒的粒径分布
Fig.1 Particle size distribution of the doped nanoparticles
3.2 混合膜对掺杂Ru (bpy )32+的ECL 增强
PAA-Na 为阴离子型聚电解质,在溶液中能
够表现出强导电性三这种阴离子型聚电解质与部分磺酸化Nafion（即阴离子型Nafion）的混合液具有两方面的优势:第一,在溶液中由于电荷相同而避免了聚沉;第二,借助Nafion 的良好成膜性,能够将聚电解质大分子固定于膜中,使两者混合成膜,而混合膜中的聚电解质所具有的强电子转移
E C L i n t e n s i t y /a .u .20000.4 1.4
E /V
1500100050000.2
0.60.8 1.0 1.2
a
b
图2 Ru@SiO 2/PAA-Nafion （a）和Ru@SiO 2/Nafion （b）
纳米粒的ECL Fig.2 ECL of Ru@SiO 2/PAA-Nafion（a）and Ru@SiO 2/
Nafion （b）
能力,可望解决Nafion 膜对掺杂Ru（bpy）32+与电极之间电子转移阻碍的问题三我们以相同量的Ru@SiO 2纳米粒子,在相同条件下分别包覆Na-
fion 膜和混合膜,相应的ECL 强度却表现出了明显的差异（图2）三可以发现,相对于纯的Nafion 膜,混合膜包覆的Ru@SiO 2纳米粒的ECL 信号获得了极大的增强,后者是前者的13倍三结果表明,混合膜中的聚电解质PAA-Na 有助于掺杂于内部的电活性物质与电极之间的电子转移,使掺杂的Ru（bpy）32+的ECL 信号显著地增强三3.3 混合膜的生物标记及其标记抗体的免疫反
应性能
Nafion 膜通过其疏水性骨架与生物分子结合而实现生物标记[10-11],预示着本文所制备的Ru@
SiO 2/PAA-Nafion 纳米粒也能够据此实现生物标记,我们选用第二抗体兔抗小鼠IgG（m -IgG）作为研究的模型生物大分子三为了表征被纳米粒标记的m -IgG 的生物反应活性,即免疫反应性能,我们利用了荧光物质FITC 标记的羊抗兔IgG（r -IgG-FITC）能够与纳米粒标记的m -IgG 发生免疫反应的特性,形成了免疫复合物[Ru@SiO 2/PAA-Na-fion]-m -IgG r -IgG-FITC三由于在免疫复合物m -
IgG r -IgG 的两个抗体上分别标记有纳米粒和FITC,而ECL 纳米粒本身也是荧光体,因此,可以用这两种荧光体表征被纳米粒标记抗体m -IgG 的生物反应活性三
用相同量的纳米粒标记不同量的m -IgG 样本
2份,经过量的BSA 封蔽,使标记了抗体的纳米粒表面能够发生疏水相互作用的所有位点均被完全封蔽,再与相同量的二过量的r -IgG-FITC 发生免疫反应,离心分离,复溶于PBS（pH =7.4）,即获得了免疫复合物,相应的荧光光谱如图3所示三从图3可知,来自于纳米粒的荧光强度（601nm）基本相同,表明两个免疫复合物样本中纳米粒的数量是基本一致的三在同一样本中同时出现了纳米粒和FITC（517nm）的荧光,表明纳米粒标记的抗
体m -IgG 能够与FITC 标记的抗体r -IgG 发生免
疫反应,形成了免疫复合物;并且随着纳米粒中加入抗体m -IgG 量的增加,FITC 的荧光也在增强,即免疫复合物的量在增加,表明纳米粒表面结合的抗体m -IgG 量也在增加三结果表明,混合膜包覆的ECL 纳米粒能够标记大量的抗体,标记的抗体具有良好的免疫反应活性三
第3期 陈 哲,等:利用聚丙烯酸钠-Nafion 混合膜增强三联吡啶钌掺杂SiO 2纳米粒的电化学发光信号及其生物标记313
F l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y /a .u .
250λ/nm
150100500
200a b
517nm
601nm
图3 r -IgG-FITC 与ECL 纳米粒标记的50μg /mL（a）或10μg /mL（b）m -IgG 的免疫复合物荧光光谱
Fig.3 Fluorescence spectra of the immune complexes be-tween r -IgG-FITC and 50μg /mL （a）or 10μg /mL
（b）m -IgG labeled by the ECL nanoparticles 3.4 混合膜对纳米粒离子交换能力的影响及其
ECL 信号增强
在ECL 纳米粒Ru@SiO 2/PAA-Nafion 表面包
覆的混合膜上存在两类可交换的阳离子,分别来
E C L i n t e n s i t y /a .u .150000.2
1.2
E /V
900060003000
00.4
0.6
1.0
120000.8 1.4b a
Fig.4 混合膜（a）和Nafion 膜（b）包覆SiO 2纳米粒固载Ru（bpy）32+的ECL
Fig.4 ECL of Ru（bpy）32+immobilized by the mixing membrane
（a）and Nafion membrane （b）covered nanoparticles 自于阴离子型Nafion 和掺杂在混合膜中的阴离
子聚电解质PAA-Na,并且后者聚电解质具有远远多于前者的可交换阳离子,预示着本文制备的混合膜包覆纳米粒利用阳离子交换可以固载大量的Ru（bpy）32+,实现纳米粒ECL 信号的进一步增强三为了消除掺杂于纳米粒内部的Ru（bpy）32+所产生的ECL 信号对阳离子交换而固载的Ru（bpy）32+的信号干扰,我们以非掺杂的SiO 2纳米粒进行混合膜包覆,以考察混合膜对纳米粒离子交换能力的影响及其对ECL 信号的增强,如图4所示三由图4可知,相对于Nafion 膜包覆SiO 2制备的ECL 纳米粒,混合膜的ECL 强度增加了约3倍,表明混合膜显著地增强了纳米粒的离子交
换能力,进而增强了纳米粒的ECL 信号三
4 结 论
以阴离子聚电解质PAA-Na 与成膜物质阴离子型Nafion 的混合液包覆Ru （bpy）32+掺杂的SiO 2纳米粒,制备了ECL 纳米粒Ru@SiO 2/PAA-
Nafion三相对于单纯的Nafion 膜包覆纳米粒,混合膜表面既有大量的疏水性区域,也存在大量的被膜固载的聚电解质大分子,表现出了三方面的显著优势:第一,极大地减小了电极对掺杂于纳米粒内部的电活性物质Ru（bpy）32+的电化学发光激发的阻碍,增强了ECL 的电子转移能力,使ECL 强度增加了13倍;第二,基于离子交换固载Ru（bpy）32+于纳米粒表面的能力获得了显著的增强,相应的ECL 强度增加了约3倍;第三,基于疏水相互作用能够方便地二大量地标记抗体,并且被标记的抗体仍具有良好的免疫反应活性三参 考 文 献:
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陈哲（1989-）,男,山西运城人,硕士研究生,2013年于苏州大学获得学士学位,主要从事药物分析与药物质量控制方面的研究三E-mail:276088360@qq.
com
谢洪平（1964-）,男,四川西充人,博士,教授,2002年于湖南大学获得博士学位,主要从事药物分析与药物质量控制方面的研究三E-mail:hpxie@https://www.doczj.com/doc/804174668.html,