第九章植物细胞培养物的超低温保存及种质库建立
第一节植物细胞培养物超低温保存的概念与作用
植物细胞全能性的发现和证实为植物的种质保存开辟了新的途径。随着植物细胞工程技术的长足发展，植物细胞培养物超低温保存及种质库的建立日益引起人们的重视，并已取得明显进展。
一、植物细胞培养物超低温保存的概念
种质资源低温保存的英文名称是cryopreservation，从词义看，低温所涉及的温度范围是不确定的。一般而言，人们将－80℃以下的低温称为超低温，干冰温度即－70℃称为极低温，低温则从4℃往下推（李广武等，1998）。对植物而言，低温常常是指那些比常温稍低一些的温度。目前，冷冻诱导保护性脱水的超低温保存和玻璃化处理的超低温保存是常用的植物细胞培养物超低温保存方法。
二、植物细胞培养物超低温保存的作用
1. 保持细胞培养物的遗传稳定性
在细胞培养物的不断继代培养过程中，染色体和基因会发生改变，从而引起基因型的改变，如产生多倍体、非整倍体及染色体消失和染色体易位等。这些变化导致培养细胞全能性的丧失，即失去形态发生的潜能，或一些具有特殊产物的细胞系和具有某种抗逆性的细胞系有可能在继代培养中丢失重要的性状。已有的研究表明，细胞培养物在液氮超低温保存中不仅能长期保持形态发生的潜能，而且还能保持遗传性状的稳定性，为细胞克隆遗传稳定性的保持提供了一种理想的方法。
2. 植物种质资源的长期保存
农业的未来取决于人类对植物种质资源的占有和利用程度，但由于农业土地的急剧开发，天然植物种质资源日益遭到严重破坏，尤其是那些稀有、珍贵和濒危植物资源。因此，建立长期保存植物种质资源库势在必行。由于细胞培养物能在超低温保存后再生完整的新植株，为植物种质资源的长期保存提供了一条可行而又理想的途径。体细胞种质库的建立是植物种质资源保存的一个重要方面，因为体细胞能够在人工试管条件下大量迅速繁殖，可以节省种子保存过程中资金的耗费。
3. 农作物优良品种及亲本材料种质的长期保存
种子低温保存是防止良种衰变的一条重要途径，但需要大规模基本建设，且耗资较多。体细胞培养物超低温保存，体积小，无需大规模基本建设，耗资少，且在低温保存后能迅速大量繁殖。因此，超低温保存体细胞培养物是农作物优良品种及亲本种质长期保存比较经济的途径。
第二节植物材料超低温冻存的细胞学基础
植物细胞中水分约占细胞总重量的60～90％，而游离水又约占细胞水分的90％，易于冻结。理论上讲，一般细胞外水的冻结温度为－5～－15 ℃，细胞内游离水的冻结在－25℃。在－30 ℃时细胞几乎没有非冻结状态的游离水存在，在－100℃温度下结合水并不冻结。根据Luyet的冻结理论（Luyet 1937），认为细胞游离水的冻结温度－30℃是细胞冻存的安全温度，作为细胞冻存两步冻结法的基础温度。
细胞超低温保存有三个重要操作步骤：一是细胞预冻；二是细胞在－196℃下长期贮存；三是细胞解冻。
第三节植物细胞超低温冻存的设备与方法
一、主要仪器设备
①用于组织培养的全套设备；
②普通电冰箱；
③－60?C～－80?C的低温冰箱；
④程序降温器；
⑤装材料的玻璃或塑料试管（5 mL或10 mL，要求封盖严密，不进液氮）；
⑥液氮罐；
⑦光学显微镜和紫外荧光显微镜，后者用于活细胞荧光染色观察；
⑧分光光度计。
二、基本程序
①选择生理年龄和生长状态合适的材料用于超低温保存。
②预培养。目的是提高细胞抗寒能力，培养时间为3～4周。包括加速传代、提高培养基渗透压和低温锻炼三个过程。第一，加速传代以提高分裂细胞的比例。细胞分裂时体积小，细胞内自由水含量下降，细胞的抗寒力相对提高。第二，用甘露醇和糖等提高培养基渗透压，从而提高培养组织和细胞的渗透压以增强抗寒能力。第三，加入脯氨酸或二甲基亚砜（DMSO）进行短期预冷处理20～60 min，然后逐渐降低温度，直至接近0?C，进行低温锻炼。
③冷处理。第一，保存材料的温度必须降至0?C。第二，加入0?C预冷的冷冻防护剂（甘油、甘露醇、脯氨酸、糖类、二甲基亚砜等），放置30～45 min。
④慢速降温至－30?C～－40?C，停留1～3 h。
⑤投入液氮中－196?C保存。
⑥保存后化冻：37?C～40?C水浴快速化冻。
⑦ TTC法（氯化三苯四氮唑还原法）检测细胞活力。
⑧再培养与遗传稳定性分析，即观察细胞恢复生长速度、生长量、存活率和植株再生，并进行遗传稳定性分析。
第四节植物细胞超低温保存的影响因素
1. 植物材料的选择
研究表明，植物基因型、抗冻性、器官组织和细胞的年龄以及生理状态等对超低温保存的效果影响很大；材料的种类和生理状态与冰冻保护剂、降温冰冻和化冻速度有密切关系，一种冰冻保护剂对某种材料有很好的保护效果，而对另一种材料则可能无效。因此，应选择适宜的材料用于超低温保存，同时采取符合材料特性的各种措施，以保证超低温保存效果。
细胞组织培养物的再培养年龄明显影响超低温保存后的存活率，指数生长期和滞后期的幼龄细胞抗冻能力强，存活率高。一般液体悬浮培养细胞以再培养5～7天为宜；固体培养基培养的愈伤组织为10～15天。体细胞胚的超低温保存以幼龄球形胚的存活率最高，心形胚次之，子叶形胚存活率最低。
2. 材料的预处理
为使保存材料达到超低温保存所要求的生理状态，常对要保存的材料进行预处理，以促进细胞分裂与分化的同步化，减少细胞内自由水的含量，增强细胞的抗寒能力。
预处理的方法：
①调控细胞分裂与分化同步化，提高指数生长期细胞数量。Withers等（1977）指出，
有丝分裂前或稍后的细胞抗冻能力强，处于这个时期的细胞在超低温保存后存活率高。
②将保存材料在糖浓度较高的培养基上或在加有诱导抗寒力物质或冰冻保护剂（如脱落酸、山梨醇、脯氨酸和二甲基亚砜等）培养基上预培养，提高超低温保存效果。
③低温锻炼以提高液氮保存后细胞存活率。
3. 冰冻保护剂
冰冻保护剂的类型很多，常用的有二甲基亚砜、甘油、糖和糖醇类物质、一些氨基酸、多肽及聚乙二醇等，在超低温保存过程中可以降低冰点、促进过冷却和“玻璃态化”的形成；提高溶液的粘滞性，阻止冰晶的生长；使膜物质分子重新分布，防止细胞内结冰的伤害；稳定细胞内大分子结构，尤其是膜结构，防止低温伤害。研究认为，采用复合冰冻保护剂能显著提高超低温保存后细胞和组织的存活率。如10% 或5% 二甲基亚砜与一定浓度的甘油或糖和糖醇结合，可明显提高超低温保存后材料的存活率。应用复合冰冻保护剂可使各种成分的保护作用得到综合协调发展，产生累加效应，而且彼此间可以减小或消除单一成分对细胞的毒害作用。
提示：
①冰冻保护剂应该易溶于水，在适当浓度下对细胞无毒害作用，化冻后容易从组织细胞中清除。
②为了降低冰冻保护剂中某些有毒成分的毒害作用，冰冻保护剂的预处理应该在低温（0?C）下进行，而且处理时间不宜过长，一般以30～45 min为宜。
4. 降温冰冻方法
降温冰冻方法是影响超低温保存效果的一个关键因素。因此，用于超低温保存的材料经冰冻保护剂在0?C预处理30～40 min后，要选择适宜的降温冰冻方法对材料立即降温冰冻，最后保存于液氮中。
目前降温冰冻方法有快速冰冻法、慢速冰冻法、两步冰冻法和逐级冰冻法。快速冰冻法是将材料从0?C或者其他预处理温度直接投入液氮，降温速度在每分钟1 000?C以上。应用该方法的关键在于，利用超速冷冻使细胞内的水分迅速通过冰晶生长的危险温度区，马上降到－196?C的安全温度，避免细胞内结冰。对于种子、花粉、球茎和块根等高度脱水的植物材料及茎尖分生组织，都可以采用快速冰冻法。慢速冰冻法是以每分钟0.1?C～10?C的降温速度，将材料从0?C降到－70?C左右后，立即浸入液氮，或者以此种速度连续降到－196?C。采用该种方法可以使细胞内水分有充足的时间不断流到细胞外结冰，从而使细胞内水分减少到最低限度，达到良好脱水效应，避免细胞内结冰。对于大多数植物的成熟材料而言，采用慢速冰冻法比较适宜。两步冰冻法是将慢速冰冻法与快速冰冻法相结合的慢速冰冻法。第一步是将材料慢速从0?C降到一定的预冻温度，使细胞达到适当的保护性脱水；第二步是将材料迅速投入液氮中冰冻。逐级冰冻法是制备不同等级温度的冰浴，如－10?C、－15?C、－23?C、－35?C或－40?C等，要保存的材料在0?C经冰冻保护剂预处理后，逐步通过这些温度，而且在每一处理温度上停留一定时间，一般4～6 min，然后迅速将材料投入液氮。
5. 化冻方法
化冻方法是影响超低温保存材料效果的又一重要因素。适宜的化冻方法可以避免在化冻过程中产生细胞内的次生结冰，防止在化冻吸水过程中水的渗透冲击对细胞膜体系的破坏。对大多数植物材料而言，一般采用快速化冻方法，即将液氮保存后的材料在37?C～40?C温水浴中化冻。对于木本植物的冬芽，在超低温保存后必须在0?C低温下进行慢速化冻才能达到良好效果。
化冻操作过程中应注意：①冰冻保存后的细胞或组织十分脆弱，操作时应该小心谨慎，避免机械损伤；②发现试管内冰融解，应立即将试管转移到20?C水浴中，进行洗涤和再培养，避免热伤害作用。
作物种质资源保存现状及发展方向 我国是世界上最古老的农业国之一，，有丰富的栽培和野生植物资源，被认为是栽培植物遗传多样性中心之一。据初步统计，我国重要栽培作物有600 多种，其中粮食作物30 多种，经济作物约90 种，蔬菜120 余种，花卉140 余种，果树约150 种，牧草约50 种，绿肥约20 种。在现有作物中起源于我国或在史前已栽培的有237 种。但由于人口迅速增长等原因，我国农业植物资源遭到严重的人为破坏和侵蚀，如野生稻、野生大豆及小麦近缘野生植物在原生长地已很难找到；外来种侵袭使土生土长的植物物种数减少，加上大量病虫天敌的减少，使作物病虫害加重；农业机械化和良种的大面积推广种植导致了大量地方品种被淘汰。在生产上种植的许多作物的骨干品种种质基础日趋狭窄，存在遗传脆弱性和突发毁灭性病害的隐患。为此，近20 年来，作为拓宽育种遗传基础的源头，种质资源的收集、保存及研究一直受到有关部门的高度重视，并取得令人瞩目的成就。种质资源保存过程中需要使用到的仪器有自动数粒仪。 如今，作物种质资源保存利用体系已初步建立，根据作物繁殖方式等生物学特性，实行种质资源原生境保存与非原生境保存相结合的保存策略。原生境保存是指在植物原来的生态环境中建立保护区或保护地，使重要作物野生种及野
生近缘植物就地进行自我繁殖以保存种质。非原生境保存，即将种质保存于该植物原产地以外的地方，包括在低温种质库中进行的种子体保存、在种质圃中的植株保存、在试管苗种质库中的组织培养物保存等。 种子保存技术有好多种，如低温储存技术。利用低 温种质库保存种子，除贮藏温度较低外，作为种质保存的种子，还须经过生活力检测、干燥脱水、密封包装等一系列入库保存前处理。还有离体种质保存技术，许多植物种质资源无法通过种子贮藏达到资源保存的目的，如椰子、油棕、咖啡等是顽拗型种子，它们或不耐干燥脱水和低温贮藏，或作物不产生种子，这种植物不能采用低温库种子贮藏的方式，只能通过种质圃，以植株或块根、块茎等活体方式在田间保存。它包括试管苗组织培养技术和超低温保存技术。 随着人们对种质资源保护的不断认识，国家对种质 资源的研究也不断深入，从“七五”以来，作物种质资源收集保存一直被列入国家科技攻关项目，在1984 年建成我国自行设计建设的国家种质库1 号库（后改为国家种质分发交换库），又在在1986 年和1992 年建成了国家长期库和青海复份长期库。可见国家对种质资源保存的重视。通过国家的科技攻关，我国种质资保存技术研究已进入一个新的阶段，在国家库已建立一套先进的管理和种子入库前处理技术。通过系统地研究，解决了各种作物的安全有效干燥条件
第二章植物组织培养的基本理论、条件与操作技术 第一节植物组织培养的基本理论 一、植物细胞的全能性及其表达 1. 植物组织培养（Plant tissue culture）：在离体条件下，利用人工培养基对植物器官、组织、细胞和原生质体等进行培养，使其生长成完整植株的过程。 外植体（explant)：由活体（in vivo)植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。 分类：广义的组织培养依外植体不同，可分为：器官培养（organ culture）、茎尖分生组织培养(shoot tip culture, shoot apex culture, apical meristem culture)、愈伤组织培养(calluse cultrue)、细胞培养(cell culture)、原生质体培养 (protoplast culture) 2. 植物细胞的全能性（totipotency）：一个具有完整细胞核的植物细胞，拥有该植物的全部遗传信息，在适宜条件下进行表达，具有分化发育成完整植株的潜能，称为~。植物组培诞生的理论基础。 不同类型细胞全能性的强弱： 卵细胞＞茎尖、根尖分生组织＞形成层＞薄壁细胞＞厚壁细胞（木质化）＞特化细胞（筛管等细胞）。 3. 植物细胞全能性的表达 全能性的表达：从离体培养的植物细胞或组织诱导分化成完整植株的过程称为~。
全能性只是一种可能性。完整细胞核具有该植物体全套的遗传信息，是全能性表达的内因。 全能性表达须满足2个条件： 1）脱离整株，切断胞间连丝，解除抑制； 2）营养和激素，使其脱分化与再分化。 二、植物细胞的脱分化与再分化 1. 细胞分化（Cell differentiation） 定义：指在个体发育中，由同一种细胞类群经细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生不同细胞类群的过程。 细胞分化是组织与器官分化的基础。 细胞分化的本质是基因差别表达。 通过组培研究，揭示细胞的分化规律： 1）成熟细胞未表达基因并非永久关闭，条件适宜即表达。 2）生理生化分化先于形态结构分化。 3）完整植株中，细胞发育途径一旦被决定常不再改变，而离体培养可通过脱分化消除这种决定。 4）极性是植物细胞分化的基本现象，即在器官、组织、细胞中，在不同轴向上存在生理生化和形态结构的梯度差异。 5）由不等分裂导致细胞分化的差异，说明细胞质在起作用。 6）有位置效应，可能与生理状态和激素分布有关，导致基因表达差异。 7）植物生长调节剂对细胞分化有关键调节作用。
植物细胞培养 一、定义 ●在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振 荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。 ●植物中含有数量极为可观的次生代谢物质，是各种色素、药物、香精、酶等天然 产物的主要来源。 ●植物细胞培养具有以下优点： 1、提高产率 2、缩短周期 3、提高产品质量 4、易于管理，减轻劳动强度 因此主要用于生产色素、药物、食品、酶、精细化工产品等次生代谢物。 二、培养基 常用MS培养基，另外还有B5、N6、NT、AA、KM8p等培养基 三、单细胞培养 1、制备方法 （1）机械法（机械磨碎、切割） （2）酶解法（目前最有效的获得单细胞方法） （3）愈伤组织诱导法（高频振动愈伤组织） 2、培养方法 （1）平板法（似微生物平板培养） （2）看护培养与饲养层培养法 看护培养：将单个细胞接种到滤纸上再置于愈伤组织之上进行培养。 饲养层培养：用处理过（如X射线）的无活性的或分裂很慢、不具分裂能力的细胞来饲养细胞。 （3）液体浅层静置培养法：将一定密度的悬浮细胞在培养皿中形成浅薄层，封口静止培养。
（4）细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。 ①低温法：冷处理可提高培养体系中细胞同步化程度。 ②分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。 ③饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。 ④抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，如尿苷等，使细胞滞留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期的同步化细胞。 3、保存 （1）继代培养（高等植物、海藻等） （2）低温（ 5℃～10℃） （3）冷冻（ -20℃或液氮） 植物细胞冷冻保存方法： 在冰浴条件下加入预冷的冰冻保护剂，密封，继续冰浴15min，在-40℃停留2h后投入-196℃液氮罐中保存。 植物细胞冷冻保护剂组成： 7.5%二甲基亚砜（DMSO）＋0.5mol／L山梨醇＋5%甘油＋5%蔗糖 四、植物细胞培养的应用 1、生产药用植物代谢产物（紫杉醇、苷类等） 2、生产天然食品、食品添加剂（可可碱等） 3、生产杀虫剂、杀菌剂（鱼藤酮、除虫菊脂） 4、生产饲料、精细化工产品（桑叶、橡胶等） 五、植物细胞的生物反应器大规模培养 1、培养特性 （1）细胞本身特性（生长慢、易结团、易损伤、易污染） （2）培养液流变特性（黏度增高） （3）气体传递与影响（O2与CO2需平衡）
2.1.1植物细胞工程基本技术 【内容与解析】 本节课要学的内容植物细胞工程基本技术指的是植物组织培养，其核心是植物组织培养的原理和过程,由于它还与植物体细胞杂交的原理、植物细胞工程应用的实例等有…紧密的联系,所以在本学科有…重要的地位，。教学的重点是植物组织培养的原理和过程，解决重点的关键是植物组织培养的实验。【教学目标与解析】 1．教学目标 （1）简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术 （2）列举植物细胞工程的实际应用 2．目标解析 （1）简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术就是要学生知道组培过程中的每一个步骤且要明白每个过程中的特点，植物体细胞杂交技术是要学生知道它的定义和如何实现这个过程中的每一步骤。 【问题诊断分析】 在本节课的教学中，学生可能遇到的问题是植物体细胞杂交的原理不理解，产生这一问题的原因是…学生对这类问题的认识尚浅。要解决这一问题，就要…给予学生一定的理论知识，及事例分析。 【教学过程】 问题一：为什么植物的一个花瓣就可以培育出完整的植株呢？ 设计意图：…通过此问题引出植物组织培养 师生活动; 1、什么是细胞的全能性？表现全能性的条件？ 2、为什么运用植物组织培养技术能把植物离体器官、组织或细胞培养成完整植物体？ 3、克隆羊“多莉”的诞生说明了什么？ 4、生物体内的细胞为什么没有表现出全能性，而是分化成不同的组织器官？ 问题二：植物组织培养技术： 问题1．植物组织培养技术的概念是什么？ 问题2．植物组织培养技术的原理是什么？ 问题3．植物组织培养技术通常选用的材料有哪些？ 问题4．植物组织培养的培养基含有哪些成分？ 问题5．分析图2—5，概述植物组织培养技术的基本过程。 问题6．什么是脱分化？什么是再分化？什么是愈伤组织？ 展示马铃薯——番茄杂种植株的图片，根据设想来引出植物体细胞杂交 问题三：植物体细胞杂交技术： 问题1．什么是植物体细胞杂交技术？它具有什么优点？ 问题2．在进行植物体细胞杂交之前，为什么要去除细胞壁？通常用什么方法去除细胞壁？去除细胞壁以后的植物细胞叫什么？ 问题3．怎样诱导两个不同原生质体的融合？原生质体融合完成的标志是什么？这与细胞中哪种细胞器有关？ 问题4．为什么两个原生质体能发生融合，这与细胞膜的什么特性有关？ 问题5．如果两个来源不同的原生质体发生了融合，下一步该做何处理？ 问题6．如何将杂种细胞培育成杂种植株？ 问题7．分析图2—9，概述植物体细胞杂交的基本过程。 1
植物细胞悬浮培养技术 一、基本原理 利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。 一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～12Or/min 的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。 在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。 二、器材 超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、磁力搅拌器、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶、水稻种子 三、操作步骤 1．配制培养基 按照培养基配方取各种药品，最后用蒸馏水定容到所需体积。所配制的培养基经高压蒸汽灭菌后备用，固体琼脂培养基分装在250mL 的锥形瓶内，每瓶约分装30mL。 2．水稻种子的消毒 （1）将种子置于无菌的培养皿内，以体积分数95％的酒精消毒1～2min。 （2）取出后用无菌水冲洗2～3 遍。 （3）将种子放入25.0g/L 的次氯酸钠溶液中轻轻摇动后，浸泡60min 。 （4）取出后用无菌水冲洗，将次氯酸钠溶液充分洗净。 3. 接种 在超净工作台内，将灭菌后的水稻种子接到诱导愈伤组织的固体培养基上，每个培养瓶接5～10 粒种子。接种完毕后用封口膜将培养瓶封好，放在26℃的恒温培养箱中进行黑暗培养。 4．悬浮培养的开始： 当得到愈伤组织后，将其转人到AA 液体培养基中。注意愈伤组织块应小于3mm . 若组织块较大可用无菌解剖刀将其分割成小块。液体培养基分装在250mL 的锥形瓶内．接种完毕后将瓶口用封口膜封好，把培养瓶放到恒温摇床上进行震荡培养。调整摇床的旋转速度，使之为120r/min。培养温度为26℃，在黑暗中培养。 5．悬浮培养物的保持 进行悬浮培养后要不断进行观察，由于培养物的继代培养与培养瓶内培养物的密度及细胞
第二章植物的组织 习题 一、选择题 1.基本分生组织从其性质上看属于（） A.原生之组织 B.出生分生组织 C.次生分生组织 D. 侧生分生组织 E. 居间分生组织 2.位于成熟组织之间，分裂时间有限的分生组织是（） A.顶端分生组织 B.侧生分生组织 C.次生分生组织 D.原分生组织 E.居间分生组织 3.单子叶植物一般不能增粗是因为其没有（） A.原形成层 B.原分生组织 C.原表皮层 D.顶端分升组织 E.侧生分生组织 4.能进行光合作用、制造有机养料的组织是（） A.基本薄壁组织 B.同化薄壁组织 C. 贮藏薄壁组织 D.吸收薄壁组织 E.通气薄壁组织 5.甘蔗茎、葡萄果实表面的白粉状物是（） A.角质 B.毛聋 C.晶体 D.腊被 E.淀粉 6.薄荷等唇形科植物叶上腺鳞的细胞数通常为（） A.8个 B. 6个 C.4个 D.2个 E.1个 7.气孔轴式是指构成气孔的保卫细胞和副卫细胞的（） A.大小 B.数目 C.来源 D.排列关系 E.特化程度 8.茶叶上的气孔多为（） A.直轴式 B.平轴式 C.不等式 D.不定式 E.环式 9.茎的栓内层细胞常含有叶绿体，又称为（） A.复表皮 B.绿皮层 C.初生皮层 D.次生皮层 E.落皮层 10.具有不均匀加厚的初生壁的细胞是（） A.厚角细胞 B.厚壁细胞 C.薄壁细胞 D.导管细胞 E.导管 11.厚角组织细胞多直接位于植物体幼嫩器官的（） A.表皮下方 B.周皮中 C.皮层中 D.维管束中 E.髓中 12.纤维次生壁外层有草酸钙结晶的称（） A.韧性纤维 B.晶纤维 C.晶鞘纤维 D.嵌晶纤维 E.硬纤维 13.纺织用麻类植物的纤维属于（） A.木纤维 B.韧皮纤维 C.髓纤维 D.纤维管胞 E.韧型纤维 14.常含叶绿体的是（） A.纤维 B.石细胞 C.导管 D.管胞 E.厚角细胞 15.石细胞壁上的孔纹是（） A.单纹孔 B.具2个同心圆的具缘纹孔 C.具3个同心圆的具缘纹孔 D.半具缘纹孔 E.以上都不是 16.蜜腺一般位于萼片、花瓣、子房或花柱的（） A.顶部 B.上部 C.中部 D.中下部 E.基部 17.不属于分泌组织的是（） A.腺毛 B.蜜腺 C.乳管 D.油室 E.角质层 18.不纤维仅存在于（） A.体内的木质部中 B苔藓植物 C. 蕨类植物 D. 裸子植物 E.被子植物 F.隐花植物 19.成熟后为无核生活细胞的是（）
植物细胞组织培养技术实验指导书 生物实验教学中心 主编：杨卫民 2009-06-01
目录 实验一、植物组织培养培养基母液的配制 (1) 实验二、植物组织培养的培养基配制 (5) 实验三、康乃馨的离体快繁 (9) 实验四、胡萝卜愈伤组织的建立 (14) 实验五、组织培养物的继代培养 (18)
实验一组织培养基母液的配制 一、仪器及药品 冰箱、天平（0.0001g） 容量瓶:1000ml,500ml、250ml、100ml、25ml 广口储液瓶：500ml、250ml、50ml、25ml 烧杯：1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml 数十根玻璃搅棒、大药勺、小药勺或挖耳勺 标签纸、胶水、50%酒精、95%酒精、1mol/L盐酸、1mol/L NaOH 几种常用的培养基所需的大量元素、微量元素、有机物、激素、铁盐等药品 蒸馏水 二、方法和步骤： 按照培养基配方,把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类,每一类 中各种药品分别称量,如N6培养基各种母液的配制步骤如下： 大量元素母液：包括用量较大的几种化合物〈见N6培养基配方〉，按表中排列顺序,将每种药品的用量扩大10倍，分别称取，分别溶解，然后按照顺序混合在一起。如钙盐等易发生沉淀的药品不能混合，应单位定容，最后加上蒸馏水，定容至1升或500毫升。在定容时注意用蒸馏水洗净烧杯和玻璃搅棒以减少误差。定容后的溶液为大量元素母液，配制培养基时，每配1L培养基需吸取该母液l00ml或50ml。 微量元素母液：因用量少，为了称量精确和方便,常配成100倍或1000倍的母液，即每种药品扩大l00倍或者l000倍。逐个溶解，混合在一起成为微量元素母液，每配1L N6培养基需吸取该母液10ml或者1ml。 铁盐：在N6培养基中需要单独配制，它是由硫酸亚铁（FeSO4?7H2O）2.78g和乙二氨四乙酸二钠（Na2-EDTA）3.73g，分别溶解，混合后，用酒精灯加热半小时以上，冷却后定容至1L。冰箱过夜贮藏无结晶析出，否则重新配制。每配l升N6培养基需加该铁盐母液5 ml。 有机物质：主要指氨基酸，维生素类物质。它们大都是扩大1000倍，分别称量，分别定容和储存，配制培养基时按需要的量加入。 植物激素：常用的有生长素类如：2,4-D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲
国家植物种质资源共享平台 项目年度总结交流会在厦门召开由中国农业科学院作物科学研究所主办，福建省农业科学院承办的国家植物种质资源共享平台项目年度总结交流会，2008年3月14-16日在厦门召开。科技部农村科技司许增泰处长，农业部科教司陈彦宾处长，中国农业科学院刘旭副院长、科技局李建萍处长，作物科学研究所万建民所长、王述民副所长，茶叶研究所江用文副所长，草原研究所王育青副所长，福建省科技厅郭运孝处长、农业厅程书田处长、农科院刘波副院长，以及来自全国91个单位的258位代表出席了会议。 许增泰处长充分肯定了项目在植物种质资源政策法规、规范标准、资源保护、整理整合、信息共享、实物共享和人才队伍建设等方面所取得的重大进展和显著成效，对项目2008年的工作提出了具体要求。陈彦宾处长对项目工作表示满意，强调要进一步加强交流和协作，取得更大的成绩。刘旭副院长要求各子项目进一步加强管理，全面总结平台工作，加强交流，填平补齐，整体推进国家植物种质资源共享平台建设。万建民所长代表项目主持单位感谢科技部、农业部的长期支持，感谢项目参建单位和专家的辛勤工作和无私奉献，表示作物科学所将认真组织好项目的实施与管理，圆满完成项目任务。 王述民研究员代表项目组汇报了项目年度进展和下一步工作安排，曹永生、江用文和王育青研究员分别汇报了农作物种质资源平台、多年生和无性繁殖作物种质资源平台、牧草种质资源平台建设的进展和成效，各参建单位分别汇报了各自任务完成情况和中国农作物种质资源多
样性图谱编制进展，并就项目有关问题进行了热烈的研讨。会议取得了圆满成功，达到了预期效果。 国家植物种质资源共享平台建设是国家自然科技资源共享平台建设的重要组成部分。国家植物种质资源共享平台建设项目涵盖了农作物种质资源、多年生和无性繁殖作物种质资源、林木（含竹藤花卉）种质资源、药用植物种质资源、热带作物种质资源、重要野生植物种质资源及牧草植物种质资源。该项目由中国农业科学院作物科学研究所主持，包括农业部、教育部、国家林业局、国家中医药管理局及中国科学院下属的331个参加单位，参加人员达2630人，其中高级职称938人。
第五节 植物种质资源 按照遗传学的观点，每一个植物种具有不同的遗传特性，均应视为不同的种质。这里主要指的是有价值的植物的种质资源。各种有用植物均归属于不同分类等级的科、属、种，往往具有大量的近缘属种，长期栽培的植物，由于人为的定向培育而有不同程度的特化，与其野生类型的不同栽培区域形成的变型，往往具有不同的种质特性，这些种质资源的收藏、研究对人类的利益十分重要。如国际玉米、小麦改良中心，国际水稻研究中心都建立了收藏种质的“种子库”、“种子银行”，利用不同种质进行杂交育种，获得矮杆、抗性强、蛋白质含量高、高产的新品种，取得了绿色革命的成功。当今由于植被的破坏，种质的损失已越来越严重，有许多植物种类正处于濒危状态，所以重视植物种质的保护是十分必要和重要的，植物园和自然保护区就担负着保护种质资源的重大责任。 全省农作物品种或品系，据以往不完全统计有6455个。其中省内地方品种2787个，省内育成的339个，省外引进的2161种，国外引进的1168个。历史上极负盛名的有宿州? ? 4 3 5
市的“夹沟香稻”和皖东的“明光绿豆”等。 安徽被列为国家重点保护的野生珍稀濒危植物有37种，其中属2级保护的有12种，属3级保护的25种。现分别介绍如下。 一、二级重点保护植物 按国家规定，二级重点保护植物是指科研或经济上有较重要意义的濒危或渐危的种类，安徽有12种。 〔小勾儿茶B e r c h e m i e ll a w i l o s n i i N a k ai〕 鼠李科（R h am n a ce ae）落叶阔叶灌木或小乔木。高3～6米，叶纸质，互生，椭圆形，顶生聚伞总状花序，花淡绿色，萼片、花瓣和雄蕊均为5个。 产安徽霍山县马家河1010米及绩溪县清凉峰等地，多散生，绩溪清凉峰有成片分布。总存数约数百株。分布区极为狭窄，仅湖北兴山地区有少量生长。现仅南京中山植物园等单位有试验性引种。 少型属种，共2种。为东南亚植物区系的特有种，也是中国特有种。该种对研究植物分类和区系有一定价值。列为国家二级保护植物。根可入药，有清热、凉血、利尿、解毒、舒筋络、散瘀、止痛的功效。 〔连香树C e r c i d i p h y ll u m j a po n i c u m S i e b e t Z u c c〕 连香树科（C e r c i d i p h y ll a ce ae）落叶阔叶乔木。高可达40米，胸径达2米多。其叶形颇似扑克中的“红桃”。叶色春紫、夏绿、秋黄。 安徽歙县、绩溪、黄山、岳西、金寨、霍山等地有分布，多散生。安徽金寨县白马寨、天堂寨及霍山县青枫岭等地有成片分布。多见于650～1450米的湿润沟各两侧混交林内。少量“就地保存”于自然保护区之中。 该种为白垩纪遗树种。少型科种。在植物分类系统中有重要科学价值。列为国家二级保护植物。木材结构细致，为优良材用树种。也是较珍贵的绿化观赏树种，叶含焦性儿茶酚，其果主治小儿惊风抽搐、肢冷等症。 〔独花兰C h a n g n i e n i am o e n a C h i e n〕 兰科（O r c h i d a ce ae）多年生草本。高10～18厘米。假鳞茎广卵形，肉质，顶生、叶具细而长的柄。花葶以假鳞茎顶部生出，直立，独生一朵花，淡紫色，花瓣较宽，唇瓣沿蕊柱基部着生，唇盘上具有5枚附属物。 产安徽歙县、祁门、金寨等地。多星散分布，资源较少。垂直分布于海拔1500米以下的中低山地，生长在林下沟各旁阴湿处。少量野生植株“就地保存”于自然保护区中。 独花兰为单型属种，又是兰科中原始类型。在植物系统分类上有较重要的意义，列为国家二级保护植物。是珍稀的观赏植物，假鳞茎可药用，治扁桃腺、毒蛇咬伤等。 〔香果树E m m e n op t e r y s h e n r y i O l i v．〕 茜草科（R ub i a ce ae）落叶阔叶乔木。高可达40米，胸径约3米。叶色翠绿，叶柄绿色透红。花如喇叭状，初开白色，继而淡黄色。圆锥状花序，花略有香味，有的萼片发育成叶状，粉红色。果熟时还不脱落。 产安徽歙县、绩溪、黄山、祁门、休宁、太平、广德、宣城、泾县、岳西、潜山、舒城、金寨、 ? ? 3 5 5
第11章种质保存 目的要求： 1、了解种质资源保存的一般概念 2、低温保存和超低温保存技术 第一节种质资源保存的一般概念 种质资源又称遗传资源，习惯上也叫品种资源。它包括栽培、野生及人工创造的粮食作物、经济作物、园艺作物的品种或品系。但现代农业生产中，一般只种植少数几种高产品种，而其它的品种或农家种则因为不适应目前的农业需要，以及科学水平所限或人们还未发现它们的用途而极少种植。但这些资源一旦丢失就永远无法找回。 种质保存，是利用天然或人工创造的适宜环境，保存种质资源，使个体中所含有的遗传物质保持其完整性，有高的活力，能通过繁殖将其遗传特性传递下去。要保存足够的群体，减少繁殖过程中遗传漂移，使繁殖前后保持有最大的遗传相似性。在贮藏过程中，要求表现最低程度的遗传变异。 种质保存分为原地保存和异地保存两种方式。原地保存，指在自然生态环境下，就地保存，自我繁殖种质。这种方式不仅可以保存种质还可以保护不同的生态系统。如各类保护区的建立。世界第一个保护区是1872年美国建立的黄石公园。 异地保存是将种子、植物体保存于该植物原产地以外的地方，主要形式有植物园、种质圃、种子库、组织培养物的试管保存（离体保存）等。其中种子保存所占空间小并能保存多年，且易于干燥和包装便于运输。但处子易受病虫害侵害；遗传性状不稳定有些种子含水量高难于脱水保存。离体保存是将单细胞、原生质体、愈伤组织、悬浮细胞、体细胞胚、试管苗等植物组织培养物储存在使其抑制生长或无生长条件下，达到保存目的的方法。该法具有省时省力，不受自然生态因素影响，便于交流运输等优点。主要有低温保存和超低温保存两种方式 第二节低温保存
低温保存是在低于正常培养温度下保存植物组织培养物的技术，该方法常结合改变培养基成分、控制光照等措施，以减缓保存材料的生长速度，延长继代时间，故又称小生长法。该法简单易行，需要设备少，投资小，技术成熟，可以作为植物种质资源的中长期保存方法。 低温保存的基本特征是保存材料的定期继代培养，不断繁殖更新。保存过程中要选用遗传上稳定的外植体作为起始培养材料，以尽可能地减少遗传变异的机会。所以具有器官分化能力的体细胞胚和植物茎尖分生组织，能够保持发育的完整性，在遗传上也较稳定，适于用做低温保存的起始材料。 低温保存的基本措施是控制保存材料所处的温度和光照。在一定温度范围内材料的寿命随保存温度的降低而延长，一般5～10℃适宜保存温带起源植物的试管苗，15～18℃可用于热带植物试管苗的保存。适当缩短光照时间，降低光照强度，也能减缓材料的生长速度，延长保存时间。但也要防止光照过弱使材料生长纤细，形成弱苗。导致生长不维持。 改变培养基成分，在其中添加脱落酸、矮壮素和甘露醇等生长延缓剂和渗透剂。其中以对材料遗传稳定性影响小的甘露醇为最好，培养基中加入较低含量的甘露醇可以明显提高材料的存活率。 低温保存的技术操作简单。以魔芋为例，选取茎尖分生组织为外植体，建立试管苗无性系；选取生长健壮的、芽大小为1.5cm的材料移入保存培养基，于25℃，光照度1000lx，12h条件下培养一周；转入4℃黑暗中保存。材料每6个月继代培养一次，继代培养时，从形态、经济性状、生理生化等方面进行遗传稳定性鉴定。 第三节超低温保存 超低保存也叫冷冻保存，一般以液态氮（-196℃）为冷源，使温度维持在-196℃。在如此低温下，新陈代谢活动基本停止，处于“生机停顿”（suspended animation）状态。在此状态下材料不可能产生遗传变异。可对材料进行长期保存。 超低温保存1949年成功的应用于动物细胞的保存。20世纪70年代以来，应用于植物材料保存，目前已经有不少成功的例子。在超低温保存中茎尖和幼胚等较为合适。这些材料遗传稳定，再生能力强，解冻后易于成活和种植，对于冷冻和解冻过程中所产生的胁迫忍受能力也强。 一、冷冻的方法 （一）快速冷冻法 本法是将植物从0℃或其他预处理温度直接投入液氮。其降温速度在每分钟1000℃以上。在降温冷冻过程中，从-10℃到-140℃是植物体内冰晶形成和增长的危险温度区，在此以下冰晶不再增生。因此，快速冷冻成功的关键在于利用超速冷冻，使细胞内的水迅速越过冰晶生长的危险温度区。细胞内的水形成“玻璃化”状态。采用快速冷冻方法，要求细胞体
第九章植物细胞培养物的超低温保存及种质库建立 第一节植物细胞培养物超低温保存的概念与作用 植物细胞全能性的发现和证实为植物的种质保存开辟了新的途径。随着植物细胞工程技术的长足发展，植物细胞培养物超低温保存及种质库的建立日益引起人们的重视，并已取得明显进展。 一、植物细胞培养物超低温保存的概念 种质资源低温保存的英文名称是cryopreservation，从词义看，低温所涉及的温度范围是不确定的。一般而言，人们将－80℃以下的低温称为超低温，干冰温度即－70℃称为极低温，低温则从4℃往下推（李广武等，1998）。对植物而言，低温常常是指那些比常温稍低一些的温度。目前，冷冻诱导保护性脱水的超低温保存和玻璃化处理的超低温保存是常用的植物细胞培养物超低温保存方法。 二、植物细胞培养物超低温保存的作用 1. 保持细胞培养物的遗传稳定性 在细胞培养物的不断继代培养过程中，染色体和基因会发生改变，从而引起基因型的改变，如产生多倍体、非整倍体及染色体消失和染色体易位等。这些变化导致培养细胞全能性的丧失，即失去形态发生的潜能，或一些具有特殊产物的细胞系和具有某种抗逆性的细胞系有可能在继代培养中丢失重要的性状。已有的研究表明，细胞培养物在液氮超低温保存中不仅能长期保持形态发生的潜能，而且还能保持遗传性状的稳定性，为细胞克隆遗传稳定性的保持提供了一种理想的方法。 2. 植物种质资源的长期保存 农业的未来取决于人类对植物种质资源的占有和利用程度，但由于农业土地的急剧开发，天然植物种质资源日益遭到严重破坏，尤其是那些稀有、珍贵和濒危植物资源。因此，建立长期保存植物种质资源库势在必行。由于细胞培养物能在超低温保存后再生完整的新植株，为植物种质资源的长期保存提供了一条可行而又理想的途径。体细胞种质库的建立是植物种质资源保存的一个重要方面，因为体细胞能够在人工试管条件下大量迅速繁殖，可以节省种子保存过程中资金的耗费。 3. 农作物优良品种及亲本材料种质的长期保存 种子低温保存是防止良种衰变的一条重要途径，但需要大规模基本建设，且耗资较多。体细胞培养物超低温保存，体积小，无需大规模基本建设，耗资少，且在低温保存后能迅速大量繁殖。因此，超低温保存体细胞培养物是农作物优良品种及亲本种质长期保存比较经济的途径。 第二节植物材料超低温冻存的细胞学基础 植物细胞中水分约占细胞总重量的60～90％，而游离水又约占细胞水分的90％，易于冻结。理论上讲，一般细胞外水的冻结温度为－5～－15 ℃，细胞内游离水的冻结在－25℃。在－30 ℃时细胞几乎没有非冻结状态的游离水存在，在－100℃温度下结合水并不冻结。根据Luyet的冻结理论（Luyet 1937），认为细胞游离水的冻结温度－30℃是细胞冻存的安全温度，作为细胞冻存两步冻结法的基础温度。
学业分层测评(五) (建议用时：45分钟) [学业达标] 1．下列有关植物细胞全能性的叙述，正确的是( ) A．只有体细胞才具有发育成完整个体所必需的全部基因 B．高度分化的细胞处于离体状态时不能表现出全能性 C．植物细胞的全能性是植物组织培养技术的理论基础之一 D．配子不能表现出全能性的原因是它所含的基因比体细胞减少一半 【解析】配子也具有发育成完整个体所必需的全部基因，花药离体培养证明配子也具有并且能表现出全能性，细胞表达全能性的首要前提是处于离体状态。 【答案】 C 2．通过植物组织培养技术繁育农作物，其优点不包括( ) A．加快繁育速度B．保持亲本优良性状 C．培育出无病毒植株D．改变植物的基因型 【解析】植物组织培养不能改变植物的基因型。 【答案】 D 3．下列属于组织培养的是( ) A．花粉培育成单倍体植株 B．芽发育成枝条 C．根尖分生区发育成成熟区 D．未受精卵发育成植株 【解析】植物组织培养的过程简要概括为：离体的植物器官、组织或细胞经脱分化，形成愈伤组织，然后经再分化，形成根、茎、芽等器官，并进一步培养出完整的植株。花药离体培养是组织培养的新技术，花药细胞具有全能性；芽发育成枝条、根尖分生区发育成成熟区是正常的生长过程；未受精卵发育成植株是孤雌生殖。 【答案】 A 4．要将胡萝卜韧皮部细胞培养成完整植株，不需要( ) A．具有完整细胞核的细胞B．离体状态 C．导入外源基因 D．一定的营养物质和激素 【解析】要将胡萝卜韧皮部细胞培养成完整植株，需要具有完整细胞核的细胞，细胞处于离体状态，培养基中含有一定的营养物质和激素。 【答案】 C 5．离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，下列哪一项条件是不
第十二章植物种质资源离体保存 1植物种质资源离体保存的概念和意义 保持生物多样性(biodiversity)是一个国际性备受重视的问题。由于生态平衡的破坏，大量物种正在逐渐丧失或毁灭。人工选择及良种的推广，品种构成逐渐单一化，致使许多潜在有益的珍贵种质资源被丢失，而种质资源是植物育种工作的基础，因此，搜集和保存种质资源已受到世界各国的重视。 植物种质资源保存的方式有原生境保存(in situ conservation)和非原生境保存(ex situ conservation)，后者包括移地保存(种质圃或植物园保存)、种质库(种子)保存、离体(试管)保存等。原生境保存和移地保存固然有其明显的重要性，但要保存大量种质，则需耗费巨大的人力、物力和土地，在实际上很难实施，而且易受自然灾害、虫害和病害的侵袭，造成植物种质资源的丧失。这两种方式保存的种质也不利于种质资源的交流。而种子保存又存在以下限制因素：①种子生活力随贮存期的延长会逐渐丧失；②无性繁殖的植物(如香蕉)难于采用种子保存；③采用无性繁殖来保持其优良性状的植物(如许多果树)，用种子繁殖后代会发生变异；④顽拗型种子（根据干燥对种子生命力的影响可将热带种子分为两大类：即顽拗型种子与正统型种子。顽拗型种子不能进行干燥处理，在日常温、湿度条件下干燥也会很快丧失生命力，其种子的含水量通常不能降低到 12％以下，否则种子将死亡。这类种子也不能在低温下贮藏。生长在热带的藤黄科、山榄科、龙脑
香科、番荔枝科、无患子科、马钱科等植物都是这类种子）植物不宜用种子保存或保存难度很大；⑤易遭自然灾害袭击而丢失。 基于上述原因，从20世纪60年代开始，人们利用细胞和组织培养再生植株的技术，进行了离体保存种质的研究。种质资源的离体保存(germplasm conservation in vitro)是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。在超低温保存中，也经常直接采用植物茎尖或分生组织、胚、花粉等材料作为保存材料。离体种质保存有以下优点：①所占空间少，节省大量的人力、物力和土地；②便于种质资源的交流利用；③需要时，可以用离体培养方法很快大量繁殖；④避免自然灾害引起的种质丢失。当然，离体种质保存也有一些值得注意的不足之处：①对于限制或延缓生长的处理，需定期转移，连续继代培养；②易受微生物污染或发生人为差错；③多次继代培养有可能造成遗传性变异及材料的分化和再生能力的逐渐丧失。70年代以来，人们把冷冻生物学(cryobiology)和植物离体微繁结合起来，发展了离体种质资源冷冻保存(freezing conservation in vitro)或超低温保存(cryopreservation)的技术。随着离体种质保存技术的不断发展和完善，已经或正在建立离体种质保存库。 2植物种质资源离体保存的方法 2.1限制生长保存 限制生长保存利用限制离体培养物的生长速度来保存种质的方
第二章植物的组织 一、选择题 (一)A型题 1．基本分生组织从其性质上看属于( ) A．原分生组织B．初生分生组织C．次生分生组织 D．侧生分生组织E．居间分生组织 2．位于成熟组织之间，分裂时间有限的分生组织是( ) A．顶端分生组织B．侧生分生组织C．初生分生组织 D．原分生组织E．居间分生组织 3．单子叶植物一般不能增粗是因为其没有( ) A．原形成层B．原分生组织C．原表皮层D．顶端分生组织E．侧生分生组织4．能进行光合作用、制造有机养料的组织是( ) A．基本薄壁组织B．同化薄壁组织C．贮藏薄壁组织 D．吸收薄壁组织E．通气薄壁组织 5．甘蔗茎、葡萄果实表面的白粉状物是( ) A．角质B．毛茸C．晶体D．蜡被E．淀粉 6．薄荷等唇形科植物叶上腺鳞的细胞数通常为( ) A．8个B．6个C．4个D．2个E．1个 7．气孔轴式是指构成气孔的保卫细胞和副卫细胞的( ) A．大小B．数目C．来源D．排列关系E．特化程度 8．茎的栓内层细胞常含有叶绿体，又称为( ) A．复表皮B．绿皮层C．初生皮层D．次生皮层E．落皮层 9．具有不均匀加厚的初生壁的细胞是( ) A．厚角细胞B．厚壁细胞C．薄壁细胞D．导管细胞E．管胞 10．厚角组织细胞多直接位于植物体幼嫩器官的( ) A．表皮下方B．周皮中C．皮层中D．维管束中E．髓中 11．纤维次生壁外层有草酸钙结晶的称（） A．韧型纤维B．晶纤维C．鞘纤维D．嵌晶纤维E．硬纤维 12．纺织用麻类植物的纤维属于( ) A．木纤维B．韧皮纤维C．髓纤维D．纤维管胞E．韧型纤维13．常含叶绿体的是( ) A．纤维B．石细胞C．导管D．管胞E．厚角细胞 14．石细胞壁上的纹孔是( ) A．单纹孔B．具2个同心圆的具缘纹孔C．具3个同心圆的具缘纹孔D．半具缘纹孔E．以上都不是 15．蜜腺一般位于萼片、花瓣、子房或花柱的( ) A．顶部B．上部C．中部D．中下部E．基部 16．不属于分泌组织的是( ) A．腺毛B．蜜腺C．乳管D．油室E．角质层 17．木纤维仅存在于( )体内的木质部中 A．苔藓植物B．蕨类植物C．裸子植物D．被子植物E．隐花植物18．成熟后为无核生活细胞的是( ) A．导管B．筛管C．伴胞D．管胞E．油管 19．由一个成熟细胞转变为分生状态的过程称( )
植物细胞培养技术 植物细胞培养技术就是为了某种目的而在细胞水平上对离体植物细胞或原生质体进行的一系列生物工艺学操作。它包括分离、培养、再生以及一系列相关的操作。就有用化合物的生产来说，它主要是指在无菌条件下通过悬浮培养植物细胞生产有用化合物的过程。 理论与技术基础：植物细胞全能性、微生物液体深层发酵系统、遗传工程 意义： 1）不受地理、季节和气候条件的限制； 2）节省土地，降低成本，生产周期短，可大大提高经济效益； 3）可代替整体植株在工厂内连续生产所需产物； 4）可通过添加抑制剂等使生物合成按照人的意志进行； 5）可通过诱变筛选，获得高产细胞株，并且可以进行特定的生物转化获得新的有用物质。 1. 发展与成果例证 2. 培养基组成 3. 培养条件 1. 发展与成果例证 1959年Tu1ecke和Nickell首次采用大体积〔20升〕的硫酸瓶进行了蔷薇(Rosa sp．)茎段的细胞大量培养。 1967年Kaul和Staba采用多升发酵罐对小阿米(Ammi visnaga)进行了细胞大量培养的研究，并从细胞培养物中得到了第一个药用成分呋喃色酮(visnagin)。 1972年，Kato培养烟草细胞以获得尼古丁，最后放大到在20000升的生物反应器上进行分批和连续培养，其生产能力为5．82kg／m3．d。 1983年，***三井石油化学工业公司利用大规模培养紫草细胞生产紫草宁，产物终浓度达1400mg／L；随后，Ushiyama等在20000升生物反应器中成功地进行了100公斤／月的人参愈伤组织培养。 迄今为止，全世界已对近1000余种植物进行过细胞培养方面的研究，生产的天然产物包括药品、香料、色素、食品、化妆品等500多种。许多植物的细胞培养已完成实验室阶段研究，正向工厂中试过渡，有的已完成工厂化生产规模的实验。如人参、紫草、毛地黄、烟草、肉桂、迷迭香、黄芪等。 2. 培养基组成 培养基的组成对植物细胞的生长和代谢物质的生产影响极大。典型的培养基有Murashige-Skoog(MS),Linsmaier-Skoog(LS)，white和B5等四种。 ---无机盐类：在无机盐中，磷酸根及氮源(NH4+或N03-)的含量对细胞的生长与物质生产有明显的影响。另外，一些金属离子如Ca2+、Cu2+、Mg2+等的含量往往也有重要影响。---碳源：通常使用2—3％的蔗糖作碳源，也有使用葡萄糖或果糖。使用单糖的优点是方便分析测定，且有助于细胞生长动力学分析。 ---植物生长调节物质：植物生长调节物质对植物细胞的生长和代谢物质生产的影响十分大。它可分为两大类：植物生长素类有2，4—D(二氯苯氧基乙酸)、IAA(吲哚基醋酸)、NAA(萘乙酸)等，细胞激动素类有BA(苄基腺凛吟)、动力精和玉米素。 ---其他因素：植物细胞培养的影响因素还有培养系统内气相组成(CO2和乙烯含量)、前体物
第二章知识点答案克隆技术 1、有性繁殖的概念和意义； 概念：经过异性生殖细胞的结合，产生合子，再由合子发育成下一代个体的繁殖方式。 意义：新个体具有双亲的遗传特性，有更强的生活能力和变异性。 2、无性繁殖的概念和意义； 概念：不经过异性生殖细胞的结合，直接由母体产生下一代个体的繁殖方式。 意义：新个体基本上能够保持母体的性状，繁殖速度快。 3、基因克隆的含义； 基因克隆是指某种目的基因的复制、分离过程。 4、细胞克隆的含义； 细胞克隆是指把一个单细胞从群体中分离出来培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术。 5、个体克隆的含义及举例； 个体克隆是指不通过两性细胞结合，从一个单一的细胞繁殖出生物个体的过程。 例：番薯、马铃薯的扦插繁殖；海星个体的一部分从母体上断开而成为一个新个体。 6、克隆技术的发展历程； 7、克隆的三个条件； ①具有包含物种完整基因组的细胞核的活细胞 ②能有效调控细胞核发育的细胞质物质 ③完成胚胎发育的必要的环境条件 8、植物细胞全能性的概念； 植物体的每个生活细胞都具有遗传上的全能性，因而都具有发育为完整植株的潜能 9、植物组织培养的一般程序（4个步骤）； ①配制培养基； ②获得外植体； ③脱分化形成愈伤组织； ④再分化形成新植株。 10、培养基中加入蔗糖的作用； ①提供碳源； ②调节渗透压； ③一定的抑菌作用。 11、脱分化的概念； 已经分化的细胞，经过诱导后，失去其特有的结构和功能而变成未分化的细胞。 12、愈伤组织的概念； 细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的、无定形状态的具有分生能力薄壁细胞。 13、再分化的概念； 脱分化生产的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官的过程。