一、蔗糖合成酶、淀粉去支酶和淀粉分支酶
（1）蔗糖合成酶主要负责降解卸载到籽粒中的蔗糖，从而为淀粉合成提供原料。相关研究表明蔗糖合成酶既可催化蔗糖分解又可催化蔗糖合成，是一种可逆酶，一般认为其主要起分解蔗糖的作用。
（2）淀粉去支酶能特异性地水解淀粉中的α(1，6)-糖苷键，属于淀粉水解酶家族。
（3）淀粉分支酶酶是淀粉体内合成支链淀粉的关键酶，它能切开α-1,4-葡聚糖直链供体(直链淀粉或支链淀粉的直链区)的α-1,4-糖苷键并同时催化
所切下的短链与受体链(原链或其他链)间α-1,6-糖苷键的形成，从而产生分支。
可见，蔗糖合成酶是蔗糖进入各种代谢途径所必需的关键酶之一，淀粉去支酶和淀粉分支酶是决定淀粉链长的分布的两种酶类。
二、基因视角下的圆粒豌豆和皱粒豌豆
皱粒豌豆DNA中插入了一段外来的DNA序列，打乱了编码淀粉分支酶的基因，淀粉分支酶不能合成，蔗糖不能合成为淀粉，蔗糖含量升高，淀粉含量低的豌豆由于失水而显得皱缩。而圆粒豌豆编码淀粉分支酶的基因正常，淀粉分支酶正常合成，蔗糖合成为淀粉，淀粉含量升高，淀粉含量高，有效保持水分，豌豆显得圆鼓鼓。
三、豌豆中的直链淀粉的形成
首先焦磷酸化酶催化1-磷酸葡萄糖和ATP反应生成ADP-葡萄糖，焦磷酸化酶表达受抑制或过量表达会引起淀粉含量的下降或增加。然后淀粉粒结合型淀粉合成酶催化从ADP-葡萄糖合成直链淀粉的反应，它利用支链淀粉的外部长支链作为合成直链淀粉的引物，当链延伸到足够长时从支链淀粉上断开，形成直链淀粉分子。淀粉粒结合型淀粉合成酶是决定籽粒中直链淀粉含量的关键酶。
结论：支链淀粉是豌豆淀粉的主要成分，而淀粉分支酶是其合成的关键酶。淀粉需通过焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶催化的连续反应生成，也就是说淀粉的合成过程是在多种酶的协调作用下进行的。故淀粉分酶支酶合成异常，会导致淀粉的合成受阻，而作为原料的蔗糖的含量则升高。
淀粉酶(AMS)测定试剂盒说明书 (碘-淀粉比色法) 一、 原理： 淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物浓度已知并且过量的情况下，家人碘液与未水解的淀粉结合生成蓝色复合物，根据蓝色的深浅可推算出水解的淀粉量，从而计算出AMS 的活力。 二、 试剂组成与配制：（100T ） 1、0.4mg/ml 底物缓冲液：60ml ×1瓶，4℃冰箱保存6个月。 2、0.1mol/L 碘贮备液：7ml ×1瓶，4℃避光保存6个月。 0.01mol/L 碘应用液的配制：将碘贮备液：蒸馏水=1:9稀释，现用现配4℃避光保存。 三、 操作表： 测定管（u 管） 空白管（0管） 底物缓冲液（ml ）37℃预温5分钟 0.5 0.5 待测样本（ml ） 0.1 混匀，37℃水浴，准确反应7.5分钟 碘应用液（ml ） 0.5 0.5 蒸馏水（ml ） 3.0 3.1 混匀，660nm 波长，1cm 光径，蒸馏水调零，测各管吸光度。 *注：不同样本批量测试前需要做预实验，确定最佳取样浓度，将 （空白OD-测定OD 控制在0.05～0.150之间） 四、 计算： 1、 单位定义：100ml 血清（浆）中的AMS ，在37℃与底物作用30分钟，水解10mg 淀粉为1个单位。 2、公式： 样本测试前稀释倍数空白管吸光度 测定管吸光度空白管吸光度样本测试前稀释倍数分钟分钟空白管吸光度测定管吸光度空白管吸光度??-=?????-=801 .01005.730105.04.0dl AMSu （此公式适用于测定血清中淀粉酶）
血清淀粉酶的含量测定 一、实验准备： 1、实验器材：移液枪（100~1000ul、10~100ul、1000~5000ul、2~20ul）、5mlEP管、0.5mlEP 管、比色皿、100ml烧杯、漩涡仪、水浴箱，分光光度计、计时器。 2、实验药品：NaCl、蒸馏水、0.4mg/ml底物缓冲液、0.1mol/L碘贮备液。 二、实验步骤： 1、0.01mol/L碘应用液的配制： 将碘贮备液：蒸馏水=1:9稀释，现用现配4℃避光保存。 2、生理盐水的配置： 称取9gNaCl置100ml烧杯，加入100ml蒸馏水，溶解即得。 3、样品最佳取样浓度摸索： 取待测血清用生理盐水稀释成不同比例（2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍等倍数进行稀释），取0.1ml进行检测。 取两个5mlEP管，标记为空白、血清所稀释的倍数，分别加入底物缓冲液0.5ml，其中带有倍数的EP管加入相应的稀释好的血清0.1ml，于漩涡仪上混匀，同时放入37℃水浴箱反应7.5分钟，取出后各加入0.5ml 0.01mol/L 碘应用液，空白管加入3.1ml蒸馏水，带有倍数的EP管加入3.1ml蒸馏水，混匀，蒸馏水调零，迅速于660nm波长测定吸光度，控制空白OD-测定OD在0.05~0.150之间。 4、样品测定： 将所需测定样品按摸索确定的倍数稀释，同法测定吸光度，记录数据。 5、数据处理：按给定公式计算待测血清淀粉酶含量。 注：加入碘应用液后不能长时间放置，否则碘见光分解后影响测定结果
可溶性淀粉合成酶试剂盒使用说明 分光光度法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC1850 规格：25管/24样 产品说明： SSS（EC2.4.1.21）通常以游离态存在于质体基质中，催化淀粉链延长，主要负责支链淀粉的合成。SSS催化ADPG与淀粉引物(葡聚糖)反应，将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生成ADP，在反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化NADP+还原为NADPH，NADPH生成量与前一步反应中ADP生成量呈正比，340nm下测定NADPH 增加量即可计算SSS活性。 需自备的的仪器和用品 紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 产品组成： 提取液：液体30mL×1瓶，4℃保存； 液体一：7mL×1瓶，4℃保存； 液体二：4mL×1瓶，4℃保存； 液体三：8mL×1瓶，4℃保存； 粉剂一：1支，4℃保存； 粉剂二：1支，4℃保存； 粉剂三：1支，-20℃保存； 粉剂四：1支，4℃保存；
粉剂五：1支，4℃保存； 粉剂六：1支，-20℃保存； 粉剂七：1支，-20℃保存； 粉剂八：1支，4℃保存； 粉剂九：1支，4℃保存； 粉剂十：1支，-20℃保存； 试剂一：液体×1支，-20℃保存；临用前加入250μL蒸馏水，充分溶解备用，用不完的试剂4℃保存； 试剂二：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入250μL蒸馏水，充分溶解备用，用不完的试剂4℃保存； 反应液Ⅰ的配制：临用前取液体一、粉剂一、粉剂二和粉剂三各一支，依次把粉剂一、粉剂二和粉剂三转移到液体一中混合溶解。 反应液Ⅱ的配制：临用前取液体二、粉剂四、粉剂五、粉剂六和粉剂七各一支，依次把粉剂四、粉剂五、粉剂六和粉剂七转移到液体二中混合溶解。 反应液Ⅲ的配制：临用前取液体三、粉剂八、粉剂九和粉剂十各一支，依次把粉剂八、粉剂九和粉剂十转移到液体三中混合溶解。 操作步骤： 一、粗酶液制备 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。10000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 二、测定步骤 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、在EP管中按顺序加入下列试剂
淀粉颗粒形态及结构 1.1 淀粉颗粒的形态结构 淀粉是植物经过光合作用形成的，不同植物来源的淀粉，形状和大小都不相同（见表1-1）。小麦有两种不同形状和大小的淀粉颗粒：扁豆形的大颗粒，直径15~35um称为A淀粉；呈球形的小颗粒，直径2~10um，称为B淀粉，经研究这两种淀粉的化学组成相同。小麦淀粉扫描电镜图见图1-1和1-2，其他淀粉的形态如下表 表1-1 淀粉来源作物特性形态直径（um） 小麦谷物双型小扁豆形（A型）15~35um 圆球形（B型）2~10um 大麦谷物双型 A型15~25um B型2~5um 黑麦谷物双型 A型10~40um B型5~10um 燕麦 （易聚合）谷物单型多角形3~16um 80um（复合粒） 普通玉米谷物单型多角形2~30um 糯性玉米谷物单型球形5~25um 高直链玉米谷物单型不规则形2~30um 大米谷物单型多角形3~8um（小颗粒） 150um（复合粒 高粱谷物单型球形 5~20um 豌豆种子单型椭圆形5~10um 土豆块茎单型椭圆形5~100um 木薯(不易老化) 根类单型椭圆形5~35um 1.2 淀粉颗粒的晶体结构 淀粉粒由直链淀粉分子（Am）和支链淀粉分子（Ap）组成，但所有淀粉粒的共性是具有结晶性，用X射线衍射法证明淀粉粒具有一定形态的晶体构造，用X--射线衍射法和重氢置换法，可测得各种淀粉粒都有一定的结晶化度，见表1-2 表1-2 种类结晶化度（%）测定法 马铃薯 25 X--射线衍射法 小麦36 稻米38 玉米39 糯玉米39 高直链淀粉 19 甘薯37 X--射线衍射是物质分析鉴定，尤其是研究分析鉴定固体物质的最有效普遍的方法，X--射线的波长正好与物质微观结构中原子、离子间的距离（一般为1~10埃）相当，所以它能被晶体衍射。借助晶体物质的衍射图是迄今为止最有效能直接观察到物质微观结构的实验手段。
Thermomonospora curvata淀粉分支酶的过量表达 及其催化反应机理研究 范琴1,2，谢正军2，金征宇1,2，田耀旗1 （1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122）（2.江南大学食品学院，江苏无锡 214122）摘要：本文以质粒pET-22b(+)为载体，Thermomonospora curvata淀粉分支酶基因(TcSBE)为客体，采用构建重组大肠杆菌BL21(pET-22b(+)-TcSBE)的方法,实现TcSBE过量表达。目标分支酶经分离纯化，酶活达90.28 U/mg，并分别以长直链淀粉和短直链糊精为底物，研究了TcSBE作用淀粉机理。结果表明：TcSBE以链间反应模式催化长直链淀粉生成大分子的支链淀粉和小分子的低聚糖；以短直链糊精为底物时，TcSBE通过水解作用和转糖基作用同时作用于底物，反应初期，水解作用较强，将底物随机水解成聚合度不等的小分子直链糊精，所需供体链的最低聚合度（DP）为12，随着反应的进行，水解作用不断减弱，转糖基作用增强，将DP 3~8的短链糊精通过α-1,6糖苷键与产物相连接，使产物中分支侧链含量增加，反应12 h后，TcSBE作用产物的α-1,6糖苷键含量达到0.9 mM。 关键词：淀粉分支酶；过量表达；作用机理；转糖基反应 文章篇号：1673-9078(2016)6-70-76 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.6.012 Overexpression of Starch Branching Enzyme from Thermomonospora curvata and Its Catalytic Mechanism Research FAN Qin1,2, XIE Zheng-jun2, JIN Zheng-yu1,2, TIAN Y ao-qi1 (1.State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) (2.School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) Abstract: A gene (TcSBE) encoding starch branching enzyme from Thermomonospora curvata was cloned into the plasmid of pET-22b(+) and overexpressed in Escherichia coli BL21.The recombinant enzyme was purified and showed a high specific activity to amylose with 90.28 U/mg. The reaction mechanism of TcSBE was examined relative to its reaction model and transglycosylation for amylose and linear dextrin. The results indicated that TcSBE could catalyze the inter-chain branching of amylose into macromolecular amylopectin and micromolecular oligosaccharides. The enzyme simultaneously catalyzed the hydrolysis and transfer reaction as it was incubated with linear dextrin. The recombinant enzyme cleaved linear dextrin into short chains with different degree of polymerization (DP) at a random mechanism, and the minimal donor chain length was DP 12. As the reaction proceeded, the enzyme exhibited a high transglycosylation activity, and predominantly transferred short chains of DP 3-8 throughout the branching process. After 12 h of incubation, the highly branched product contained 0.9 mM α-1,6 linkages from the enzyme reaction with linear dextrin as the substrate. Key words: starch branching enzyme; overexpression; catalytic mechanism; transglycosylation 淀粉分支酶（SBE, EC 2.4.1.18），是淀粉酶家族GH13中的一种糖基转移酶，它一方面能切断由α-1,4糖苷键连接成的主链，一方面又能将切下的短链通过转糖基作用连接于受体链上，形成α-1,6糖苷键[1~2]。系列产品如多分支淀粉和多分支环糊精具有显著地增收稿日期：2015-08-05 基金项目：国家自然科学基金项目（31571792） 作者简介：范琴（1990-），女，硕士，研究方向：淀粉资源开发与利用 通讯作者：田耀旗(1981-)，男，博士，副教授，硕士研究生导师，研究方向：淀粉资源开发与利用因此，可利用淀粉分支酶制备高分支化淀粉产品。该稠、抗老化以及包埋小分子物质作用，在食品和医疗行业用途广泛[3~4]。 分支酶的来源主要有植物、动物和微生物。目前所发现的淀粉分支酶主要为植物来源，很难用于工业化生产。微生物来源的淀粉分支酶底物专一性高、酶活力强、分支化度大，在工业应用中具有无可比拟的优势[5~6]。然而，天然菌株的产酶能力较低，且目前报道的微生物来源的淀粉分支酶都为胞内酶，存在分离纯化困难等问题[7]。采用构建基因工程菌的方法获取 70
淀粉酶活力测定实验报告 淀粉酶活力测定实验报告实验三、淀粉酶活性的测定实验报告 实验四、淀粉酶活性的测定 一、实验目的: 1、了解α - 淀粉酶和β - 淀粉酶的不同性质及其淀粉酶活性测定的意义; 2、学会比色法测定淀粉酶活性的原理及操作要点。 二、实验原理: 淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。根据α-淀粉酶和β-淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化;β-淀粉酶不耐热，70? 15min 则被钝化。测定时，使其中一种酶失活，即可测出另一种酶的活性。 淀粉在淀粉酶的催化作用下可生成麦芽糖，利用麦芽糖的还原性与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸，测定其吸光度，从而确定酶液中淀粉酶活力(单位重量样品在一定时间内生成麦芽糖的量)。 三、实验用具: 1、实验设备 研钵,具塞刻度试管,离心管，分光光度计，酸度计，电热 恒温水浴锅，离心机，电磁炉。 2、实验材料与试剂 (1)0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液:A液:称取柠檬酸20.01g，定容至 1000ml;B液:称取柠檬酸钠29.41g，定容至1000ml;取A液55ml与B液145ml混匀。 (2)1%可溶性淀粉溶液:1g淀粉溶于100ml 0.1mol/l pH5.6
的柠檬酸缓冲液; (3)1%3,5-二硝基水杨酸试剂:称取3,5-二硝基水杨酸1g、NaOH 1.6g、酒石酸钾钠30g，定容至100ml水中，紧盖瓶塞，勿使CO2进入; (4)麦芽糖标准溶液:取麦芽糖0.1g溶于100ml水中; (5)pH 6.8的磷酸缓冲液: 取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解，用 0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至 6.8，加水稀释至1000ml即得。 (6)0.4mol/L的NaOH溶液; (7)1%NaCl溶液。 (8)实验材料:萌发的谷物种子(芽长约1cm) 四、操作步骤 1、酶液提取:取6.0g浸泡好的原料，去皮后加入10.0mL 1%的NaCl 溶液，磨碎后以2000r/min 离心10min，转出上清液备用。取上清液1.0ml，用pH 为6.8的缓冲溶液稀释5倍，所得酶液。 2、a- 淀粉酶活力测定 (1) 取试管4支,标明2支为对照管,2支为测定管。 (2) 于每管中各加酶液lml ,在 70?士0.5? 恒温水浴中准确加热15min ,取出后迅速用流水冷却。 (3) 在对照管中加入4m1 0.4mol/L氢氧化钠。 (4) 在4支试管中各加入1ml pH5.6的柠檬酸缓冲液。 (5) 将4支试管置另一个40?士 0.5? 恒温水浴中保温15min ,再向各管分别加入40?下预热的1,淀粉溶液 2m1,摇匀,立即放入40?恒温水浴准确计时保温 5min。取出后向测定管迅速加入4ml 0.4mol/L氢氧化钠,终止酶 活动,准备测糖。
货号：MS3405 规格：100管/96样结合态淀粉合成酶（Granule-bound starch synthase，GBSS） 试剂盒说明书 微量法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： GBSS（EC 2.4.1.21）以束缚态存在于淀粉体中，催化淀粉链的加长反应，主要负责直链淀粉的合成。 测定原理： GBSS催化ADPG与淀粉引物(葡聚糖)反应,将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生成ADP；进一步通过反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化NADP+还原为NADPH，其中NADPH生成量与前一步反应生成的ADP数量呈正比，通过340nm下测定NADPH 的增加量，可以计算GBSS活性。 自备实验用品及仪器： 紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 提取液：液体100mL×2瓶，4℃保存； 试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入14mL试剂一充分混匀备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融； 试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入8mL试剂一充分混匀备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融； 试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入10mL试剂一充分混匀备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融； 试剂五：液体×1支，-20℃保存；临用前加入500μL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融； 试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入500μL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融； 粗酶液制备: 称取0.1~0.2g组织（建议称取约0.1g组织），加入1mL提取液，冰浴中匀浆。10000g ，4℃离心10min，弃上清，在沉淀中加入1mL提取液充分混匀，置冰上待测。 测定步骤: 1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2 第1页，共2页
实验七尿淀粉酶活性测定 淀粉酶（AMY或AMS在体内的主要作用是水解淀粉，它随机地作用于淀粉分子内的 a—1, 4糖苷键生成葡萄糖、麦芽糖、寡糖及糊精。血清中的淀粉酶主要有胰型（P型）和 唾液型（S型）及其亚型同工酶组成，P型淀粉酶主要来源于胰腺，S型淀粉酶主要来源于唾 液腺。正常淀粉酶因分子量小，故可从肾小球滤过而由尿中排出。 【目的】 1、验证淀粉酶的催化作用。 2、观察淀粉及其水解产物分别与碘反应呈现的颜色变化。 【原理】血清及尿中的淀粉酶来源于胰腺和唾液腺，正常血清与尿中有一定活性。 Winslow 氏法测定尿和血清中淀粉酶活性是将试样作等比稀释，观察一系列试样在规定的 37C、30分钟的条件下，恰好能将0.1%淀粉溶液1ml水解（指加入碘液后不再呈蓝色）的 酶量定为淀粉酶的一个活性单位，乘以尿的稀释倍数，即可得知每项ml 尿液中的淀粉酶活性。 【器材】 试管（10mn X 100mr）、试管架、电热恒温水浴箱、吸管、洗耳球、滴管。 【试剂】 1 、 9%NaCl 2、0.3%碘液 3、0.1%淀粉溶液 【操作】 1 、准备尿液（自备）。 2、取 10支试管，编号，用吸管向管中加入0.9%NaCl 1ml。 3、用1ml吸管（注意应用刻度到头的）向第一管加尿液1ml，混合，再将试管中的液 体吸起，然后任其流回试管，如此重复三次，以便全管混匀，并借此冲洗吸管内壁。吸出此混合液1ml 移入第二管中。 4、用同法处理第二管使之混匀，并取出1ml 置于第三管中。依此类推，如此继续稀释 至第九管后，吸出1ml混合液弃之，这样既可获得分别含原尿液为1/2ml,1/4ml,1/8ml, ... 1/512ml 的不同浓度的尿稀释液。第十管不加尿液作为对照管。 5、从第十管起依次向各管迅速准确加入0.1%淀粉液2ml，迅速摇匀（是否充分混匀往
酶专题总结[高中苏教版] 一．课本涉及的酶 1.过氧化氢酶：（必修一78页）实验：比较过氧化氢在不同条件下的分解，体现酶的高效性，注意实验的控制变量法。 2.酿酶（必修一81页）毕希纳获得含酶提取液，将这种酶命名为酿酶。 3.脲酶（必修一81页）萨姆纳首次成功提纯酶，并证明其是蛋白质。 4.少数RNA（必修一82页）切赫、奥特曼提出少数RNA有生物催化功能。 5.消化酶（必修一83页）唾液淀粉酶：最适PH 6.2~ 7.4 探究影响酶活性的条件。 胃蛋白酶：最适PH0.9~1.5。 6.荧光素酶（必修一89页）A TP利用：萤火虫发光（选修三20页）。 7.ATP合成酶、ATP水解酶（必修一89页）。 8.氧化型辅酶Ⅰ（NAD+）（必修一94页）呼吸作用。 9.还原型辅酶Ⅰ（NADH）（必修一94页）呼吸作用。 10.辅酶Ⅱ（NADP+）（必修一103页）光合作用。 11.还原型辅酶Ⅱ（NADPH）（必修一103页）光合作用。 12.DNA酶（必修二44页）艾弗里实验。 13.解旋酶、DNA聚合酶（必修二54页）DNA分子复制。 14.RNA聚合酶（必修二64页）DNA转录。 15.rRNA（必修二63页）在核糖体内催化蛋白质和成。 16.RNA复制酶（必修二69页）中心法则的发展：对RNA进行复制。 17.逆转录酶（必修二69页）中心法则的发展。 18.淀粉分支酶（必修二69页）豌豆圆皱粒的形成。 19.腺苷酸脱氨酶（ADA）（必修二94页，选修三23页）基因治疗。 20.脂肪酶麦芽糖酶果胶酶（必修一86、87页）。 21.水解酶（必修一46页）存在于溶酶体中。 22. 缺乏：酶1白化症状a老年白发b白化病（隐性遗传病） 酶3 尿黑酸症酶6 苯丙酮尿症（隐性遗传病） 23.α─淀粉酶（必修三55页）使淀粉转化为麦芽糖。 24.溶菌酶（必修三35页）免疫活性物质、第二道防线一部分、溶解细菌的细胞壁(必修一87） 25.限制性核酸内切酶（限制酶）（选修三4页必修二102页）：EcoRⅠ产生粘性末端。 SmaⅠ产生平末端。 26.DNA连接酶（选修三5页必修三103页）：E.coliDNA连接酶粘性末端。 T4DNA连接酶粘性末端平末端。 27.热稳定DNA聚合酶（Taq酶）（选修三10页）PCR技术。 28.肠乳糖酶、抗凝血酶、α─抗胰蛋白酶（选修三21页）基因工程产品。
(植物中)淀粉酶活性的测定 一实验目的 本实验的目的在于掌握淀粉酶的提取及活性的测定方法。 二实验原理 植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解为麦芽糖。淀粉酶几乎存在于所有植物中，有α－淀粉酶及β－淀粉酶，其活性因植物生长发育时期不同而有所变化，其中以禾谷类种子萌发时淀粉酶活性最强。 α－淀粉酶和β－淀粉酶都各有其一定的特性，如β－淀粉酶不耐热，在高温下容易钝化，而α－淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下容易发生钝化。通常酶提取液中同时存在两种淀粉酶，测定时，可以根据他们的特性分别加以处理，钝化其中之一，即可以测出另一种酶的活性。将提取液加热到70℃维持15分钟以钝化β－淀粉酶，便可测定α－淀粉酶的活性。或者将提取液用pH3.6的醋酸在0℃加以处理，钝化α－淀粉酶，以测出β－淀粉酶的活性。 淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5－二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原成3－氨基-5-硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可以求出麦芽糖到含量。以麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性大小。 三实验材料 萌发的小麦、大麦或者豆类等（芽长1cm左右） 四实验仪器和试剂 1．仪器： 电子天平、研钵、100mL容量瓶（1个）、50mL量筒（1个）、刻度试管[25mL（9个）、10mL（1个）]、试管6支、移液管[1mL（2支）、2mL（2支）、10mL（2支）]、离心机、恒温水浴锅、7220型分光光度计 2．试剂： 1％淀粉溶液、0.4mol/LNaOH、 pH5.6的柠檬酸缓冲液：A、称取柠檬酸20.01g，溶解后稀释至1 000mL；B、称取柠檬酸钠29.41g，溶解后稀释至1 000mL；取A液13.70mL与B液26.30mL 混匀即是。 3,5－二硝基水杨酸：精确称取3,5－二硝基水杨酸1g溶于20mL1mol/LNaOH 中，加入50mL蒸馏水，在加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100mL，盖紧瓶盖，勿让CO2进入。 麦芽糖标准液：称取化学纯麦芽糖0.100g溶于少量蒸馏水中仔细移入100mL 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。 五操作步骤 1．酶液的提取： 称取萌发的水稻种子0.5g（芽长1cm左右，置于研钵中加石英砂研磨成匀浆，移入25mL刻度试管中，用水稀释至刻度，混匀后在温室下放置，每隔数分钟振荡一次，放置20分钟后离心，取上清液备用。 2．α－淀粉酶活性的测定： （1）取三支试管，编号注明1支为对照管，2支为测试管。 （2）于每管中各加入酶提取液1mL，在70℃恒温水浴中（水文的变化不应该超过±0.5℃），准确加热15分钟，在此期间β－淀粉酶受热钝化，取出后迅速在自来水中冷却。
货号：QS3404-50 规格：50管/48样可溶性淀粉合成酶（Soluble starch synthase，SSS）试剂盒说明书 紫外分光光度法 正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： SSS（EC 2.4.1.21）通常以游离态存在于质体基质中，催化淀粉链延长，主要负责支链淀粉的合成。 测定原理： SSS催化ADPG与淀粉引物(葡聚糖)反应，将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生成ADP，在反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化NADP+还原为NADPH，NADPH生成量与前一步反应中ADP生成量呈正比，340nm下测定NADPH增加量即可计算SSS活性。 自备实验用品及仪器： 紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存； 液体一：7mL×2瓶，4℃保存； 液体二：4mL×2瓶，4℃保存； 液体三：8mL×2瓶，4℃保存； 粉剂一：2支，4℃保存； 粉剂二：2支，4℃保存； 粉剂三：2支，-20℃保存； 粉剂四：2支，4℃保存； 粉剂五：2支，4℃保存； 粉剂六：2支，-20℃保存； 粉剂七：2支，-20℃保存； 粉剂八：2支，4℃保存； 粉剂九：2支，4℃保存； 粉剂十：2支，-20℃保存； 试剂一：液体×1支，-20℃保存；临用前加入500μL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 试剂二：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入500μL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 反应液Ⅰ的配制：临用前取液体一、粉剂一、粉剂二和粉剂三各一支，依次把粉剂一、粉剂二和粉剂三转移到液体一中混合溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 反应液Ⅱ的配制：临用前取液体二、粉剂四、粉剂五、粉剂六和粉剂七各一支，依次把粉剂四、粉剂五、粉剂六和粉剂七转移到液体二中混合溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 反应液Ⅲ的配制：临用前取液体三、粉剂八、粉剂九和粉剂十各一支，依次把粉剂八、粉 第1页，共2页
淀粉颗粒形态及结构 淀粉颗粒的形态结构 淀粉是植物经过光合作用形成的，不同植物来源的淀粉，形状和大小都不相同（见表1-1）。小麦有两种不同形状和大小的淀粉颗粒：扁豆形的大颗粒，直径15~35um称为A淀粉；呈球形的小颗粒，直径2~10um，称为B淀粉，经研究这两种淀粉的化学组成相同。小麦淀粉扫描电镜图见图1-1和1-2，其他淀粉的形态如下表 表1-1 淀粉颗粒的晶体结构 淀粉粒由直链淀粉分子（Am）和支链淀粉分子（Ap）组成，但所有淀粉粒的共性是具有结晶性，用X射线衍射法证明淀粉粒具有一定形态的晶体构造，用X--射线衍射法和重氢置换法，可测得各种淀粉粒都有一定的结晶化度，见表1-2 表1-2 X--射线衍射是物质分析鉴定，尤其是研究分析鉴定固体物质的最有效普遍的方法，X--射线的波长正好与物质微观结构中原子、离子间的距离（一般为1~10埃）相当，所以它能被晶体衍射。借助晶体物质的衍射图是迄今为止最有效能直接观察到物质微观结构的实验手段。
完整淀粉颗粒具有三种类型的X--射线衍射图谱，分别称为A、B、C形：大多谷物淀粉和支链淀粉呈现A形，高直链淀粉谷物和马铃薯、块茎类淀粉和老化淀粉呈现B形，豆类淀粉和块根类多为C形：C形是A形和B形的混合物。 直链淀粉包和化合物晶体的X--射线衍射图谱呈现V形，在天然淀粉中不存在，仅在淀粉糊化后，与类脂物及有关化合物形成复合物后产生的。A、B、V形的X--射线衍射图谱如图1-3淀粉颗粒的轮纹和偏光十字 在显微镜下观察淀粉粒，看到表面有轮纹结构，像树木年轮，各轮纹层围绕的一点叫“粒心”，又叫“脐”。根据粒心数目和轮纹情况，淀粉粒可分为：单粒、复粒、半复粒三种。 在偏光显微镜下，观察淀粉颗粒会出现黑色的十字，将颗粒分成四个白色区域，称为偏光十字。这是由于淀粉颗粒的有序结构产生的双折射现象。当淀粉粒充分膨胀、压碎或受热干燥时，晶体结构即行消失， 淀粉化学特性 直链淀粉和支链淀粉 淀粉是由α-D-葡萄糖组成的多糖高分子化合物，有直链状和支叉状两种分子，分别称为直链淀粉和支链淀粉。见图2-1,2为直链淀粉和支链淀粉的分子结构。 谷物颗粒中心主要是支链淀粉，外围主要是直链淀粉和酯类； 土豆淀粉：小颗粒中磷脂含量高，大颗粒则低。 小麦淀粉中含戊聚糖 直链淀粉的性质 1. 直链淀粉是线性的α-葡聚糖，结构中99%是以α糖苷键连接，还有1%是以α糖苷键连接，也就是分子中有分叉点。 2. 直链淀粉的分子量一般在105~106之间，每一个淀粉颗粒含有×109个Am。 3. 直链淀粉空间构象是卷曲成螺旋结构，以麦芽糖为重复单元，糖苷键角是117o，每一转由六个葡萄糖苷组成。 4. 当淀粉在水中加热高于糊化温度后，Am从淀粉粒中游离出，溶于水中；温度升高，大分子和带分支的Am被溶出。 5. Am淀粉与碘、有机酸、醇形成螺旋包合物，淀粉溶液中加入正丁醇可使Am淀粉沉淀，形成了不溶性复合物。 6. Am淀粉易老化，即两个螺旋体形成双螺旋。 支链（Ap）淀粉的性质 1. Ap淀粉的支叉位置以α糖苷键连接，其余为α糖苷键连接，约5%为α糖苷键；分子量在107~109。 2. Ap淀粉随机分叉，具有三种形式的链：A--链，由α糖苷键连接的葡萄糖单元，是分子最外端的链；B—链，由α糖苷键和α糖苷键组成；C—链，由α糖苷键和α糖苷键连接的葡萄糖单元再加一个还原端组成。见图2-3为支链淀粉的分子形式。 3. Ap淀粉在水中形成球状颗粒，不易老化，当浓度为%时，就形成双螺旋结构，呈现凝胶状。 玉米和小麦淀粉的Am含量为28%，马铃薯淀粉为21%，木薯淀粉为17%，高直链玉米的Am含量高达70%，糯玉米淀粉的Am只有1%，同一品种间的直支比基本相同。 性质差异 表2-1
淀粉酶活性的测定 一、原理 淀粉酶（amylase）包括几种催化特点不同的成员，其中α－淀粉酶随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶；β－淀粉酶每次从淀粉的非还端切下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶；葡萄糖淀粉酶则从淀粉的非还原端每次切下一个葡萄糖。淀粉酶产生的这些还原糖能使3，5－二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3－氨基－5－硝基水杨酸。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。可以用麦芽糖制作标准曲线，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶活力。几乎所有植物中都存在有淀粉酶，特别是萌发后的禾谷类种子淀粉酶活性最强，主要是α－和β－淀粉酶。Α－淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；而β－淀粉酶不耐热，在70℃15min则被钝化。根据它们的这种特性，在测定时钝化其中之一，就可测出另一个的活力。本实验采用加热钝化β－淀粉酶测出α－淀粉酶的活力，再与非钝化条件下测定的总活力（α＋β）比较，求出β－淀粉酶的活力。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：萌发的小麦种子（芽长约1cm）。 （二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 离心机；3. 恒温水浴（37℃，70℃，100℃）；4.具塞刻度试管；5. 刻度吸管；6. 容量瓶。 （三）试剂（均为分析纯）：1. 标准麦芽糖溶液（1mg/ml）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100ml；2. 3，5－二硝基水杨酸试剂：精确称取1g3，5－二硝基水杨酸，溶于20ml2mol/L NaOH溶液中，加入50ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100ml。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用；3.01mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：A液（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7.H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L；B液（0.1mol/L 柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7.2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。取A液55ml与B液145ml混匀，即为0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液；4.1％淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100ml0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。 三、实验步骤 （一）麦芽糖标准曲线的制作：取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表（详教材）加入试剂。摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20ml。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定。以麦芽糖含量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制标准曲线. （二）酶液制备：称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加少量石英砂和2ml蒸馏水，研磨成匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15～20min，每隔数min搅动1次，使其充分提取。然后在3000rpm 下离心10min，将上清液倒入100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液10ml，放入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液。 （三）酶活力的测定：取6支干净的具塞刻度试管，编号，按表（详教材）进行操作。（四）结果计算：淀粉酶活力=C×V T/(W×V s×T)(mg/g/min)。式中，C为从标准曲线上查得的麦芽糖含量（mg）；VT为淀粉酶原液总体积（ml）；Vs为反应所用淀粉酶原液体积（ml）；W为样品重量（g）；t为反应时间（min）。
班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：03 淀粉酶活性的测定 一、研究背景及目的 酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化，所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色，因此对酶的研究有着非常重要的意义。酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的作用方式，可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶等。α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的两种，存在于禾谷类的种子中。β-淀粉酶存在于休眠的种子中，而α-淀粉酶是在种子萌发过程中形成的。 α-淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标,α-淀粉酶活性低的品种抗穗发芽,反之则易穗发芽。目前,关于α-淀粉酶活性的测定方法很多种,活力单位的定义也各不相同,国内外测定α-淀粉酶活性的方法常用的有凝胶扩散法、3 ,5-二硝基水杨酸比色法和降落值法。这3 种方法所用的材料分别是新鲜种子、萌动种子和面粉,获得的α-淀粉酶活性应该分别是延迟(内 二、实验原理 萌发的种子中存在两种淀粉酶，分别是α-淀粉酶和β-淀粉酶，β-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α-淀粉酶不耐酸，在下则发生钝化。本实验的设计利用β-淀粉酶不耐热的特性，在高温下（70℃）下处理使得β-淀粉酶钝化而测定α-淀粉酶的酶活性。 酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的，淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5-二硝基水杨酸试剂测定，由于麦芽糖能将后者还原生成硝基氨基水杨酸的显色基团，将其颜色的深浅与糖的含量成正比，故可求出麦芽糖的含量。常用单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。然后利用同样的原理测得两种淀粉酶的总活性。实验中为了消除非酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差，每组实验都做了相应的对照实验，在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。 在实验中要严格控制温度及时间，以减小误差。并且在酶的作用过程中，四支测定管及空白管不要混淆。
一、蔗糖合成酶、淀粉去支酶和淀粉分支酶 （1）蔗糖合成酶主要负责降解卸载到籽粒中的蔗糖，从而为淀粉合成提供原料。相关研究表明蔗糖合成酶既可催化蔗糖分解又可催化蔗糖合成，是一种可逆酶，一般认为其主要起分解蔗糖的作用。 （2）淀粉去支酶能特异性地水解淀粉中的α(1，6)-糖苷键，属于淀粉水解酶家族。 （3）淀粉分支酶酶是淀粉体内合成支链淀粉的关键酶，它能切开α-1,4-葡聚糖直链供体(直链淀粉或支链淀粉的直链区)的α-1,4-糖苷键并同时催化 所切下的短链与受体链(原链或其他链)间α-1,6-糖苷键的形成，从而产生分支。 可见，蔗糖合成酶是蔗糖进入各种代谢途径所必需的关键酶之一，淀粉去支酶和淀粉分支酶是决定淀粉链长的分布的两种酶类。 二、基因视角下的圆粒豌豆和皱粒豌豆 皱粒豌豆DNA中插入了一段外来的DNA序列，打乱了编码淀粉分支酶的基因，淀粉分支酶不能合成，蔗糖不能合成为淀粉，蔗糖含量升高，淀粉含量低的豌豆由于失水而显得皱缩。而圆粒豌豆编码淀粉分支酶的基因正常，淀粉分支酶正常合成，蔗糖合成为淀粉，淀粉含量升高，淀粉含量高，有效保持水分，豌豆显得圆鼓鼓。 三、豌豆中的直链淀粉的形成 首先焦磷酸化酶催化1-磷酸葡萄糖和ATP反应生成ADP-葡萄糖，焦磷酸化酶表达受抑制或过量表达会引起淀粉含量的下降或增加。然后淀粉粒结合型淀粉合成酶催化从ADP-葡萄糖合成直链淀粉的反应，它利用支链淀粉的外部长支链作为合成直链淀粉的引物，当链延伸到足够长时从支链淀粉上断开，形成直链淀粉分子。淀粉粒结合型淀粉合成酶是决定籽粒中直链淀粉含量的关键酶。 结论：支链淀粉是豌豆淀粉的主要成分，而淀粉分支酶是其合成的关键酶。淀粉需通过焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶催化的连续反应生成，也就是说淀粉的合成过程是在多种酶的协调作用下进行的。故淀粉分酶支酶合成异常，会导致淀粉的合成受阻，而作为原料的蔗糖的含量则升高。
第一节：淀粉颗粒的结构与特性 薯类淀粉要大于谷类淀粉：1.薯类中马铃薯淀粉颗粒最大，15~100um 5~35um 椭圆\球形2小麦：25~40um 扁豆形5~10um呈球形化学组成相同 3.玉米和高粱颗粒大小相似，平均15um 多角形和圆型 4.小淀粉特性与玉米相似，平均12um 5.大分燕麦相似，平均2~5um为多角形 1淀粉颗粒：直链分子和支链分子的聚合体。有序的结晶区＋无序的无定形区 结晶区：X射线衍射玉米淀粉，马铃薯淀粉，木薯淀粉三种不同的X-光衍射图谱 大多数谷类呈A型，马铃薯和根类淀粉，老化淀粉B型谷类淀粉多为C型。 2各种不同晶型可转化：A型结构具有较高的热稳定性，通过温热处理B型可转为A型 3 淀粉颗粒的轮纹：①轮纹结构又称层状结构，各轮纹层围绕的一点叫粒心，又叫做脐 ②甲心轮纹：禾谷类淀粉颗粒粒心常在中央偏心轮纹：马铃薯淀粉颗粒粒心常偏于一侧 ③根据粒心及轮纹情况分：单粒多复粒复粒 4偏光十字：在偏光显微镜下观察，淀粉颗粒呈现黑色的十字而把淀粉颗粒分成4个白色的区域。 5淀粉颗粒水分相对湿度为65%，25℃时，多数商品天然淀粉含10%~20%水分。 6影响玉米小麦中高含量脂类化合物的存在会造成①抑制淀粉颗粒膨胀和溶解。②直链淀粉脂类络合物使淀粉糊淀粉膜不透明度或浑浊度增加，影响糊化淀粉增稠力和黏合力。③不饱合的脂类化合物在贮存期因氧化作用而酸败而影响其作用。 7pro含量高，使用时产生臭味或其他气味，蒸煮时易产生泡沫加工时遇水变蓝色 8淀粉的润胀：将干燥的天然淀粉置于冷水中，水分子可简单的进入淀粉颗粒的非结晶部分，分许多无定型部分的亲水基结合或被吸附，使淀粉颗粒在水中膨胀，这一现象较润胀。 9糊化概念：若将淀粉乳浆加热到一定程度55℃以上，淀粉颗粒突然膨胀，因膨胀的体积达到原来的体积的数百倍，所以原乳浆就变成黏稠的胶体溶液，这一现象叫淀粉的糊化。 本质：淀粉中有序或无序（晶体）状态的淀粉分子间的氢键断裂，淀粉分子分散在水中形成亲水性胶体溶液。 10 玉米淀粉生产工艺流程: （自己画） 11 玉米的浸泡目的①降低玉米粒的机械强度。②削弱保持淀粉的连接链。③使玉米粒膨胀，容易胚乳分离④浸提可溶性物质⑤防腐 12破碎：玉米浸泡后水分达40%~45%,玉米胚芽水分达60%左右，胚芽为籽粒一个重要成分40%左右的脂肪，15%~20%蛋白质。②一般采用二次破碎，彻底释放胚芽，第一次为粗磨，第二次为细磨粗破碎→齿磨③固液之比应为1:3，若液相过多，破碎速度快，达不到效果，若固相过多，黏稠大→过度破碎，胚受损。 13玉米麸质分离与淀粉洗涤：细淀粉乳的特征含较多蛋白质脂肪灰分等非淀粉物质。①在精制筛上过滤的淀粉悬浮液含很多杂质6%~10%的蛋白质0.5%~1。0%的脂肪.5~1.5%的可溶物质包括0.1~0.3%可溶性碳水化合物0.2~0.4%灰分，0.03%~0.04%的SO2 0.1%细渣及细砂②淀粉悬浮液由大小不同的粒子组成淀粉5~30um 渣皮＜60um 麸质1~2um ③麸质颗粒在沉淀时，相互凝结在一起，形成100~170um聚积（没写完） 14离心分离法;在离心力作用下，淀粉与麸质相对密度差增几倍分离质量和速度有很大提高。 ①离心机分离法：密度小的麸质，纤维和脂肪所受浮力大于离心力，随水流沿碟片向中心动，通过收集室排出，密度大的喷嘴排出机外。②旋液器分离法:离心力作用下使颗粒大小和相对密度不同的淀粉和麸质得到分离。 15干燥：冷空气→热空气，分淀粉混合温度高：干燥快，会糊化。一般加热后空气130~150℃淀粉→50~60℃