简述全内反射荧光显微术原理与应用
柳正(10589537)
北京大学医学部基础医学院生物物理系
【摘要】全内反射荧光显微术(Total internal reflection fluorescence microscopy TIRFM)是利用全内反射产生的消逝波激发样品,从而使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光团受到激发,荧光成像的信噪比大大提高。可以看到样品表面，单分子的活动情况。近年来，全内反射荧光显微术被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光成像中。文章综述全内反射荧光显微技术的基本知识，介绍几个运用全内反射荧光显微镜技术研究生物单分子的实例。
【关键词】:全内反射荧光显微镜消逝波单分子蛋白相互作用构像变化
1引言
从单分子水平上对生物分子行为（包括构象变化、相互识别、等）的实时﹑动态检测以及在此基础上的操纵等，研究者籍此可以深入理解生物活动的机制与产生生物分子效应过程。生物单分子成像技术在生物系统研究中已经广泛使用。随着生物单分子研究深入，越来越要求发展超高分辨率的成像与高信噪比成像技术。近些年来，发展前景被看好的单分子光学成像技术有全场相衬显微术、共焦荧光显微术，近场光学扫描显微术和全内反射荧光显微术[1]。这些技术在分子生物学、分子化学及纳米材料等领域受到广泛关注。其中，全内反射荧光显微术是利用全内反射产生的消逝波来照射样品，从而致使在样品表面数百纳米级厚度的光学薄层内的荧光团受到激发，使单分子成像。
全内反射荧光显微术发展历程，Hirsch field于1965年完成了第一个全内反射荧光实验,这是首次尝试用全内反射荧光法测液体中的单个分子的荧光。将全反射理论与生物细胞的荧光成像技术相结合是一种全新的突破。虽然它的具体应用还不到10年的时间,但是它在单分子探测中已显示出强大的生命力.1995年,Yanagida小组用TIRFM技术首次在液体溶液中得到了荧光标记的单个蛋白质分子的成像.1996年,Moerner小组又用这项技术实现了限制在丙烯酰胺胶体的纳米孔中的单分子的三维成像。至今该项技术已经应用到许多单分子的研究中，如肌球蛋白酶活性测量[2]，肌收缩力的产生，荧光标记驱动蛋白动态研究[3]。另外蛋白的构像的动态变化[4][5]，人工膜中膜蛋白的研究等[6][7]。
2. 全内反射的基本原理
全内反射是一种普遍存在的光学现象。一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射率为n2的介质中。入射光在界面上一部分发生反射，另一部分则发生透射见图1。入射角i和透射角r之间满足关系式
n1sini=n2sinr (1)
图1
图2
若n1大于n2，例如折射率为n1的是玻璃，折射率为n2的是液体溶液。当入射角增大，增大到临界角θc时，这时的透射角为90°，当入射角大于或者等于临界角时，光不再透射进溶液，而是发生全反射，如图2所示。由Snell定律可知θ2=90° θc=sin-1(n2/n1) (2)
由上式可知，当n1大于n2时，全反射就可能发生。如果玻璃的折射率取为1.52，溶液的折射率取为1.33(生物细胞的折射率范围是1.33～1.38)，则玻璃/界面处的临界角为61.74°。
从几何光学的角度来看，当光发生全反射时，光会在玻璃界面上完全反射而不进入液体溶液中。实际上，由于波动效应，有一部分光的能量会穿过界面渗透到溶液中，是一种非均匀波，它沿着入射面上的介质边界传播，而振幅随离界面的距离ｚ作指数衰减。可以看出，透射电磁场的振幅随进入样品的深度ｚ减小得非常快，这种电磁场只存在于界面附近一薄层内，因此，我们称此非均匀场为消逝场(evanescent field)。其在第二介质中的有效进入深度约为一个波长[8]。消逝波激发在一个波长范围之内的荧光分子发出荧光消逝波。消逝波是一种非均匀波，它沿着入射面上的介质边界传播，在平行界面方向以平行波场方式传播而在垂直界面方向则是呈指数衰减。透射强度和浸透深度公式如公式（3）所示。由公式知，对于可见光波长而言，浸透深度为～100nm。
(3)
3. 全内反射的仪器组成[9]
到目前，研究者已经发展了多种全内反射荧光显微成像系统。其中最为普遍的两种类型是棱镜型图3所示和物镜型图4所示。棱镜型成像系统的消逝失场是通过入射光经棱镜发生全反射产生的，而物镜型的是通过入射光经物镜本身全反射产生。消逝波激发生物样品的荧光分子，荧光分子所发射的荧光经过物镜成像到照相机或CCD上实现对生物样品的记录。
图3棱镜型全内反射荧光显微镜示意图
图4 物镜型全内反射荧光显微镜示意图
两种形式的显微镜各有优缺点，对于棱镜型而言，实现起来相对简单，同时它的缺点也很明显：由于要达到较高的光学分辨率，要求接收荧光的物镜工作距离较短，这样留给生物样品和物镜之间的空间较小，所以在此仪器上安装一些诸如原子力显微镜、近场光学显微镜等其他探测仪器非常困难。物镜式显微镜的物镜既作为收集样品荧光信号的接受器，同时又作为发生全反射的光学器件。如图4所示，激光聚焦到物镜后焦面并经过物镜边缘入射，物镜出射光为平行光并斜入射至盖玻片上，调节激光入射位置和角度，即可达到全内反射要求，从而实现消逝波照明。消逝激发的荧光仍旧经过物镜接收，通过双色镜滤掉除荧光以外的其它波长的光，成像在物镜后方的照相机或CCD上，实现对生物样品的荧光记录。由于样品上方空间完全空出，并且所接受的荧光没有被样品干扰，所以目前大多数生物学家采用物镜式全内反射荧光显微镜[10]
4在生物研究中的应用
细胞内的很多至关重要的生命活动过程如信号转导，蛋白质转运，病原体侵入均与细胞表面有关，如果我们可以直接对这些细胞表面的过程进行观测，而不受到来自细胞内深层区域信号的干扰，这对细胞生物学研究来说，将是具有重大意义的突破。全内反射荧光显微
术正是凭借其独特的优势,它的荧光激发深度只在～200ｎｍ的薄层范围内,从而成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术[11]。
4.1蛋白分子相互作用
通过荧光标记的分子共同定位运用全内反射荧光显微镜对分子间相互作用可以直接观察，荧光共聚焦能量转移也能够检测到。伴侣蛋白利用ATP的水解释放的能量协助蛋白质分子的折叠。分子伴侣蛋白GroEL和伴侣辅助分子(co-chaperon)GroES或者其底物乳球蛋白的相互作用已经在单分子水平进行了很好的研究。分别用不同的荧光标记GroEL与相关蛋白，然后观察它们的协同定位。单分子观察发现通过GroEL协助蛋白折叠动态过程[12]。
单配对荧光共聚焦也可以用在单分子水平生物大分子相互作用的成像。只有在供体和受体的荧光团非常接近时候，(距离小于10nm)荧光共振才能够发生。Ishii 等人于1999年测定了用蓝环素3，蓝环素5标记的a原肌球蛋白亚基的连接的荧光共振能量转移。当肌球蛋白亚基形成同型二聚体的时候，它们之间的距离非常的近，非常适宜荧光共振与转移[13]。在核酶分子构像变化观察中，也运用到这种方法[14]。
4.2生物大分子动态构像变化观察
单个的生物大分子的荧光分子特征和动态构像变化要运用到棱镜型的全内反射荧光显微术。如用环境敏感荧光基团标记的肌球蛋白，然后用分光镜检测。肌球蛋白分子上荧光基团发出的荧光光谱随着时间的起伏现象，说明了自发的肌球蛋白单分子构像改变。Suzuki 等于2002年，运用棱镜型全内反射荧光显微术发现另外一种肌球蛋白构型。他们在荧光光学系统中设计了一种特殊的楔形棱镜，从而可以在成像相机设备上获得单个荧光分子光谱像[15]。
4.3离子通道研究
离子通道通过负责神经，肌肉兴奋性细胞的质膜调节离子电流和电化学势。单分子水平通道电流记录可以通过使用膜片钳方法来检测各种通道的电特性。虽然现在离子通道的状态变化与其功能的关系还有待研究，但是Ide和其同事发展了一种同时可以测电流和荧光信号的实验系统。荧光标记的离子通道蛋白包埋到平面脂双层中，然后用物镜型全内反射荧光显微镜观察。利用全内反射荧光显微镜结合后来发展的荧光共振能量转移或者双视角的光镜可以看到离子通道与其配基或者调节子之间的相互作用，同时可以在体内跟踪构像变化与离子电流[16]。
全内反射荧光显微术作为细胞表面单分子成像的一种新兴的技术，研究者在已经的基础上做出了一些改进，一是与其它显微成像技术如荧光相关光谱技术(FCS),荧光寿命成像技术(FLIM)以及原子力显微术(AFM)相结合;另一方面是发展双色和多色TIRFM，采用多种染色来观察活体细胞[17]。另外还有一些的数学方法如统计分析加入到这个对单分子的记录中来。随着仪器设备的改进，与样品制备的技术的提高，全内反射显微镜发挥它的用处将越来越大。
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1 荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。 2 荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。 3 光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1。S为0或1，它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0表示所有电子自旋的角动量代数和为0，即所有电子都是自旋配对的，那么2S+1=1，电子所处的激发态为单重态， 用S i 表示，由此可推出，S 即为基态的单重态，S 1 为第一跃迁能级激发态的单重 态，S 2 为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+1=3，电子 在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i 来表示，T 1 即为第一激发态中 的三重态，T 2 即为第二激发态中的三重态，以此类推。
第一节 叶绿素荧光参数及其意义 韩志国，吕中贤（泽泉开放实验室，上海泽泉科技有限公司，上海，200333） 叶绿素荧光技术作为光合作用的经典测量方法，已经成为藻类生理生态研究领域功能最强大、使用最 广泛的技术之一。由于常温常压下叶绿素荧光主要来源于光系统II 的叶绿素a ，而光系统II 处于整个光合 作用过程的最上游，因此包括光反应和暗反应在内的多数光合过程的变化都会反馈给光系统II ，进而引起 叶绿素a 荧光的变化，也就是说几乎所有光合作用过程的变化都可通过叶绿素荧光反映出来。与其它测量 方法相比，叶绿素荧光技术还具有不需破碎细胞、简便、快捷、可靠等特性，因此在国际上得到了广泛的 应用。 1 叶绿素荧光的来源 藻细胞内的叶绿素分子既可以直接捕获光能，也可以间接获取其它捕光色素（如类胡萝卜素）传递来 的能量。叶绿素分子得到能量后，会从基态（低能态）跃迁到激发态（高能态）。根据吸收的能量多少， 叶绿素分子可以跃迁到不同能级的激发态。若叶绿素分子吸收蓝光，则跃迁到较高激发态；若叶绿素分析 吸收红光，则跃迁到最低激发态。处于较高激发态的叶绿素分子很不稳定，会在几百飞秒（fs ，1 fs=10－15 s ）内通过振动弛豫向周围环境辐射热量，回到最低激发态（图1）。而最低激发态的叶绿素分子可以稳定 存在几纳秒（ns ，1 ns=10－9 s ）。 波长吸收荧光红 B 蓝 荧光 热耗散 最低激发态较高激发态基态吸收蓝光吸收红光能量A 图1 叶绿素吸收光能后能级变化（A ）和对应的吸收光谱（B ）（引自韩博平 et al., 2003） 处于最低激发态的叶绿素分子可以通过几种途径（图2）释放能量回到基态(韩博平 et al., 2003; Schreiber, 2004)：1）将能量在一系列叶绿素分子之间传递，最后传递给反应中心叶绿素a ，用于进行光化 学反应；2）以热的形式将能量耗散掉，即非辐射能量耗散（热耗散）；3）放出荧光。这三个途径相互竞 争、此消彼长，往往是具有最大速率的途径处于支配地位。一般而言，叶绿素荧光发生在纳秒级，而光化 学反应发射在皮秒级（ps ，1 ps=10－12 s ），因此在正常生理状态下（室温下），捕光色素吸收的能量主要用 于进行光化学反应，荧光只占约3%～5%(Krause and Weis, 1991; 林世青 et al., 1992)。 在活体细胞内，由于激发能从叶绿素b 到叶绿素a 的传递几乎达到100％的效率，因此基本检测不到 叶绿素b 荧光。在常温常压下，光系统I 的叶绿素a 发出的荧光很弱，基本可以忽略不计，对光系统I 叶 绿素a 荧光的研究要在77 K 的低温下进行。因此，当我们谈到活体叶绿素荧光时，其实指的是来自光系 统II 的叶绿素a 发出的荧光。
荧光分析法测定维生素B2 一、实验目的 1.学习与掌握荧光光度分析法测定维生素B2的基本原理与方法; 2.熟悉荧光分光光度计的结构及使用方法; 3、学习掌握固体及液体试样的荧光测试方法。 二、实验原理 当用一种波长的光照射某种物质时,这种物质会在极短的时间内,发射出一种比照射光波长较长的光,这种发射出来的光就叫做荧光。当照射光停止照射时,荧光也随之很快地消失。利用某些物质被紫外光照射后所产生的、能够反映出该物质特性的荧光,以进行该物质的定性分析与定量分析,称为荧光分析。 实验证明,荧光通常发生于具有刚性平面的л-电子共轭体系分子中。随着л-电子共轭度与分子平面度的增大,荧光也就越容易产生。因此几乎所有对分析化学有用的荧光体系都含有一个以上的芳香基团,芳环数越多,荧光愈强。能发荧光的纯无机物很少,通常就是利用有机配位体与金属离子形成荧光络合物进行无机离子的分析。 图1.荧光分光光度计的结构原理图
荧光分光光度计工作原理(图1)可简述为:光源发出的光束经激发单色器色散,提取所需波长单色光照射于样品上,由样品发出的荧光经发射单色器色散后照射于检测器上,检测器把荧光强度信号转变为电信号并经放大器放大后,由信号显示系统显示或者记录。 荧光光谱包括激发光谱与发射光谱两种。激发光谱就是就是指发射单色器波长固定,而激发单色器进行波长扫描所得到的荧光强度随激发光波长变化的曲线。荧光发射光谱就是指激发单色器波长固定,发射单色器进行波长扫描所得到的荧光强度随发射光波长变化的曲线。一般所说的荧光光谱实际上仅指荧光发射光谱。这一光谱为分析指出了最佳的发射波长。 荧光定性定量分析与紫外可见吸收光谱法相似。定性时,就是将实验测得样品的荧光激发光谱与荧光发射光谱与标准荧光光谱图进行比较来鉴定样品成分,一般荧光定性的依据就是荧光光谱峰的个数、位置、相对强度及轮廓。 定量分析时,一般以激发光谱最大峰值波长为激发光波长,以荧光发射光谱最大峰值波长为发射波长,测量样品的荧光强度。对同一物质而言,荧光强度F 与该物质的浓度c 有以下的关系: F = 2、303Фf I0 a b c ⑴ Фf－荧光过程的量子效率; a－荧光分子的吸收系数; I0－入射光强度; b－试液的吸收光程。 在I0 与b 不变时,2、303Фf I0 a b为常数,则⑴式可以表示为 F＝Kc ⑵ ⑵即可作为荧光定量检测的依据。 图2 VB2的结构式
荧光显微镜在生命科学中的应用 摘要: 荧光显微镜是在光镜水平上，对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类、脂质以及某些离子等组分进行定性研究的有力工具。本文综述了结构光照明荧光显微镜、隐失波荧光显微镜在生命科学中的应用。关键词: 荧光显微镜;应用 荧光显微镜具有可特异性标记、可对活体细胞进行实时动态成像的优势，在生命科学研究中获得了广泛的应用[1]，利用荧光显微镜观测生物活体和固定的细胞是研究目标蛋白定位和动态的一种重要手段。随着荧光标记和新的显微成像技术，如激光共聚焦显微镜和转盘式共聚焦显微镜的广泛应用，使人们对于细胞中的动态过程有了更深入的了解。 1.结构光照明荧光显微镜突破衍射极限的原理和在生命科学中的应用 结构光照明是一种通过改变照明光空间结构的照明方式，通常照明的结构光是一个载频条纹，这种照明方式可应用于角度、长度、振动等的测量，并广泛应用于三维成像[2-4]。结构光照明荧光显微镜，是在宽场荧光显微镜的基础上，利用特殊调制的结构光照明样品，运用特定算法从调制图像数据中提取焦平面的信息，突破衍射极限的限制，重建出超分辨切层的三维图像。将结构光照明应用于荧光显微镜，具有成像速度快、光路结构简单、对荧光分子无特殊要求、能够应用于活体细胞实时动态三维成像的优势，因而在生物医学成像领域引起
了广泛关注，是应用前景广泛的超分辨荧光显微技术。 荧光显微镜由于其无损、非入侵的观察方式和特异性标记识别的特点，在生命科学研究中应用广泛。但是由于其分辨率受到衍射极限的限制，细胞内许多复杂的精细结构无法观察到。结构光照明荧光显微镜作为一种能够突破衍射极限的荧光显微镜，大大提高了细胞结构成像的分辨率和图像清晰度，有力地促进生命科学研究的发展。 2.隐失波荧光显微镜及其在植物细胞生物学中的应用 应用隐失波荧光显微镜观测细胞膜附近生物学过程的优点是，它只激发生物样品靠近盖玻片附近一薄层区域内的荧光基团。所谓生物学过程包括:追踪单个分子与膜结合以及与膜分离的过程，配体与细胞膜表面受体结合的动力学，胞吞胞吐过程以及其它定位于细胞膜的分子的动态等。 2. 1 细胞膜表面的受体 隐失波荧光显微镜可以用于研究细胞膜表面受体与配体结合的动力学［5］，受体的聚集以及它们的横向运动。细胞膜表面的受体可通过荧光基团标记的配体、抗体或其它小分子进行标记，甚至还可用荧光蛋白( 如 GFP、m Cherry 等)对感兴趣的受体进行标记。 2.2 胞吞与胞吐 迄今为止，已有许多研究利用隐失波荧光显微镜对胞吐过程进行观测，其中包括应用 styryl 染料(如 FM4-64 和 FM1-43)或带有荧光基团的货物标记正在胞吐的囊泡，以观测单个胞吐的过程。通常在观测过程中，只有当胞吐的囊泡进入到隐失波范围内，其荧光基团才
分子荧光分析法基本原理 一. 分子荧光的发生过程 （一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称“单线态”； 图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C） 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即 ?S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”； 如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1 其多重性： M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”； “三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的 10-6~10-7。 （二）分子去活化过程及荧光的发生： （一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级） 处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为： 1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。
X射线荧光光谱分析 X射线是一种电磁辐射，其波长介于紫外线和γ射线之间。它的波长没有一个严格的界限，一般来说是指波长为0.001-50nm的电磁辐射。对分析化学家来说，最感兴趣的波段是0.01-24nm，0.01nm左右是超铀元素的K系谱线，24nm则是最轻元素Li的K系谱线。1923年赫维西(Hevesy, G. Von)提出了应用X射线荧光光谱进行定量分析，但由于受到当时探测技术水平的限制，该法并未得到实际应用，直到20世纪40年代后期，随着X射线管、分光技术和半导体探测器技术的改进，X荧光分析才开始进入蓬勃发展的时期，成为一种极为重要的分析手段。 1.1 X射线荧光光谱分析的基本原理 当能量高于原子内层电子结合能的高能X射线与原子发生碰撞时，驱逐一个内层电子而出现一个空穴，使整个原子体系处于不稳定的激发态，激发态原子寿命约为10-12-10-14s，然后自发地由能量高的状态跃迁到能量低的状态。这个过程称为驰豫过程。驰豫过程既可以是非辐射跃迁，也可以是辐射跃迁。当较外层的电子跃迁到空穴时，所释放的能量随即在原子内部被吸收而逐出较外层的另一个次级光电子，此称为俄歇效应，亦称次级光电效应或无辐射效应，所逐出的次级光电子称为俄歇电子。它的能量是特征的，与入射辐射的能量无关。当较外层的电子跃入内层空穴所释放的能量不在原子内被吸收，而是以辐射形式放出，便产生X射线荧光，其能量等于两能级之间的能量差。因此，X射线荧光的能量或波长是特征性的，与元素有一一对应的关系。图1-1给出了X射线荧光和俄歇电子产生过程示意图。
K层电子被逐出后,其空穴可以被外层中任一电子所填充，从而可产生一系列的谱线，称为K系谱线：由L层跃迁到K层辐射的X射线叫Kα射线,由M层跃迁到K层辐射的X射线叫Kβ射线……。同样,L层电子被逐出可以产生L系辐射(见图1-2)。
植物体叶绿素荧光测定仪的原理与使用方法 【实验目的】 ?了解目前在光合作用研究中先进的叶绿素荧光技术，了解便携式叶绿素荧光仪测定 植物光合作用叶绿素荧光参数的基本原理和仪器的使用方法。 ?老师演示和学生分组利用便携式叶绿素荧光仪(PAM2100)测定实验植物的叶绿素荧 光基本参数(Fo, Fm, Fv/Fm, Fm’, Fo’, Yield, ETR, PAR, qP, qN等)。 ?了解荧光仪的广泛应用 【实验原理】 仪器介绍和工作原理 叶绿素荧光（Chlorophyll Fluorescence）的产生 ?传统的光合作用测定是通过测量植物光合作用时CO2的消耗或干物质积累计算出 来。叶绿素荧光分析技术通过测量叶绿素荧光量准确获得光合作用量及相关的植物生长潜能数据。 ?叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗 散、分配等方面具有独特的作用，与“表观性”的气体交换指标相比，叶绿素荧光参数更具有反映“内在性”特点。 ?本实验以调制式叶绿素荧光仪PAM-2100（W ALZ）为例，测定植物叶绿素荧光主 要参数。植物叶片的生长状况不同，所处位置的不同，光照不同，叶绿素荧光参数数值也会有所不同，所以不同叶片之间叶绿素荧光产量存在着一定的差异。 【实验内容与步骤】 一、仪器使用步骤讲解 1. 仪器安装连接 将光纤和主控单元和叶夹2030-8相连接。光纤的一端必须通过位于前面板的三孔光纤连接器连接到主控单元，光纤的另一端固定到叶夹2030-B上。同时，叶夹2030-B还应通过LEAF CLIP插孔连接到主控单元。 2. 开机 按“POWER ON”键打开内置电脑后，绿色指示灯开始闪烁，说明仪器工作正常。随后在主控单元的显示器中会出现PAM-2100的表示。从仪器启动到进入主控单元界面大概要40秒。 3. PAM-2100的键盘 PAM-2100主控单元上有20个按键，现分别简要介绍主要按键的功能。
实验荧光光谱分析 一、实验目的与要求： 1. 了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用； 2. 掌握荧光分光光度计的工作原理； 3. 掌握激发光谱、发射光谱及余辉衰减曲线的测试方法。 二、基本概念 1. 发射光谱 是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中，横坐标为波长（或频率），纵坐标为发光相对强度。 发射光谱常分为带谱和线谱，有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。 2. 激发光谱 是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长（或频率）变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。 激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，使材料发出某一波长光的效率。 3. 余辉衰减曲线 是指激发停止后发光强度随时间变化的曲线。横坐标为时间，纵坐标为发光强度（或相对发光强度）。 三、测试仪器 激发光谱、发射光谱及余辉衰减曲线的测试采用日本岛津RF-5301PC型荧光分光光度计。 从150W氙灯光源发出的紫外和可见光经过激发单色器分光后，再经分束器照到样品表面，样品受到该激发光照射后发出的荧光经发射单色器分光，再经荧光端光电倍增管倍增后由探测器接收。另有一个光电倍增管位于监测端，用以倍增激发单色器分出的经分束后的激发光。 光源发出的紫外-可见光或者红外光经过激发单色器分光后，照到荧光池中的被测样品上，样品受到该激发光照射后发出的荧光经发射单色器分光，由光电倍增管转换成相应电信号，再经放大器放大反馈进入A/D转换单元，将模拟电信号转换成相应数字信号，并通过显示器或打印机显示和记录被测样品谱图。 四、样品制备 液体试样
简述全内反射荧光显微术原理与应用 柳正(10589537) 北京大学医学部基础医学院生物物理系 【摘要】全内反射荧光显微术(Total internal reflection fluorescence microscopy TIRFM)是利用全内反射产生的消逝波激发样品,从而使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光团受到激发,荧光成像的信噪比大大提高。可以看到样品表面，单分子的活动情况。近年来，全内反射荧光显微术被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光成像中。文章综述全内反射荧光显微技术的基本知识，介绍几个运用全内反射荧光显微镜技术研究生物单分子的实例。 【关键词】:全内反射荧光显微镜消逝波单分子蛋白相互作用构像变化 1引言 从单分子水平上对生物分子行为（包括构象变化、相互识别、等）的实时﹑动态检测以及在此基础上的操纵等，研究者籍此可以深入理解生物活动的机制与产生生物分子效应过程。生物单分子成像技术在生物系统研究中已经广泛使用。随着生物单分子研究深入，越来越要求发展超高分辨率的成像与高信噪比成像技术。近些年来，发展前景被看好的单分子光学成像技术有全场相衬显微术、共焦荧光显微术，近场光学扫描显微术和全内反射荧光显微术[1]。这些技术在分子生物学、分子化学及纳米材料等领域受到广泛关注。其中，全内反射荧光显微术是利用全内反射产生的消逝波来照射样品，从而致使在样品表面数百纳米级厚度的光学薄层内的荧光团受到激发，使单分子成像。 全内反射荧光显微术发展历程，Hirsch field于1965年完成了第一个全内反射荧光实验,这是首次尝试用全内反射荧光法测液体中的单个分子的荧光。将全反射理论与生物细胞的荧光成像技术相结合是一种全新的突破。虽然它的具体应用还不到10年的时间,但是它在单分子探测中已显示出强大的生命力.1995年,Yanagida小组用TIRFM技术首次在液体溶液中得到了荧光标记的单个蛋白质分子的成像.1996年,Moerner小组又用这项技术实现了限制在丙烯酰胺胶体的纳米孔中的单分子的三维成像。至今该项技术已经应用到许多单分子的研究中，如肌球蛋白酶活性测量[2]，肌收缩力的产生，荧光标记驱动蛋白动态研究[3]。另外蛋白的构像的动态变化[4][5]，人工膜中膜蛋白的研究等[6][7]。 2. 全内反射的基本原理 全内反射是一种普遍存在的光学现象。一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射率为n2的介质中。入射光在界面上一部分发生反射，另一部分则发生透射见图1。入射角i和透射角r之间满足关系式 n1sini=n2sinr (1)
简述全内反射荧光显微术的原理和应用 摘要：全内反射荧光显微术(Total internal reflection fluorescence microscopy TIRFM)是利用全内反射产生的消逝波激发样品,使样品表面数百纳米厚的薄层内 的荧光团受到激发，再用高灵敏度和高时间分辨率的摄像机CCD来捕捉 荧光并用计算机进行显像，从而实现对生物样品观测的一种新生技术。 由于消逝波特点及CCD的优势使全内反射荧光显微镜具有高信噪比和高 时间分辨率，因此它在对单分子的动态观测具有很高的应用价值。本文 将对全内反射荧光显微镜的原理及应用和发展展望作一个简要的介绍。 关键词：全内反射消逝波衍射极限单分子的动态观测 0 引言：人类自诞生以来不但在不断的改进自己的生产工具，同时也在不断的改 进自己观察世界和了解这个世界的工具，其间显微镜的制造应改说为人类 观察微观世界打开了一扇窗户，它可以称得上是人类观察认识世界上的一 次革命。此后各种新的观察工具相继问世，使人类对微观世界的认识达到 了空前的高度。但是传统的光学显微镜由于受到光瞳远场衍射效应的影响, 存在分辨极限,瑞利将之归纳为R ≥0. 61λ/nsinθ,其中λ为成像光波波 长, nsinθ为物透镜的数值孔径,即NA 值，因此光学显微镜空间分辨极限～ 250 nm。于是人们研制了拥有点分辨率: 0.2nm的电子显微镜。进入80年代， 非光学类扫描探针显微术特别是原子力显微镜的出现更是将成像的分辨 率推进到纳米的精度。但这些显微技术在不同程度上存在系统结构复杂、 成像检测环境要求苛刻等困难，尤其是不能象光学显微术那样提供重要的 光学信息（如偏振态、折射率、光谱等）和进行无损伤性生物活体探测， 这些因素均严格限制了它们在高分辨率细胞成像中的应用。近年来人们开 发出了一系列光学显微镜如：目前国际上公认的最有前途的单分子光学成 像技术有全场相衬显微术、共焦荧光显微术，近场光学扫描显微术[1 ,2 ] 和全内反射荧光显微术.其高的空间分辨率和时间分辨率、无损伤、以及对 单分子活体探测的可行性，使得这些技术在分子生物学、分子化学、激光 医学及纳米材料等领域有着广泛应用，并将对未来的光测技术的发展和科 学的进步产生深远的影响。其中，全内反射荧光显微术是近年来新兴的一 种光学成像技术，它利用全内反射产生的隐失场来照明样品，从而致使在 百纳米级厚的光学薄层内的荧光团受到激发，荧光成像的信噪比很高。这 种方法的成像装置简单，极易和其它成像技术、探测技术相结合，目前已 成功的实现100nm甚至更低的空间分辨率。 1：全内反射荧光显微术的基本原理 1.1 全内反射 全内反射是一种普遍存在的光学现象。一束平面光波从折射率为n1的介质 进入到折射率为n2的介质中。入射光在界面上一部分发生反射，另一部分则 发生透射见图1。入射角i和透射角r之间满足关系式 n1sini=n2sinr (1)
黑龙江省实验中学全反射测试题 一、全反射选择题 1．光纤是现代通信普遍使用的信息传递媒介，现有一根圆柱形光纤，光信号从光纤一端的中心进入，并且沿任意方向进入的光信号都能传递到另一端．下列说法正确的有( ) A．光从空气进入光纤时传播速度变小B．光导纤维利用了光的全反射原理 C．光纤材料的折射率可能为2D．光纤材料的折射率可能为1.2 2．如图所示，置于空气中的厚玻璃板，AB、CD分别是玻璃板的上、下表面,且AB∥CD.光线经AB表面射向玻璃砖，折射光线射到CD表面时，下列说法正确的是( ) A．不可能发生全反射 B．有可能发生全反射 C．只要入射角i足够大就能发生全反射 D．不知玻璃折射率，无法判断 3．如图所示，一束复色光从空气中沿半圆玻璃砖半径方向射入，从玻璃砖射出后分成a、b两束单色光，则（） A．玻璃砖对a 光的折射率为1.5 B．玻璃砖对a 光的折射率为 2 2 C．b 光在玻璃中的传播速度比a 光大 D．b 光在玻璃中发生全反射的临界角比a光小 4．如图所示，在等边三棱镜截面ABC内，有一束单色光从空气射向其边界上的E点，已知该单色光入射方向与三棱镜边界AB的夹角为θ=30o，该三棱镜对该单色光的折射率为3，则下列说法中正确的是（）
A．该单色光在AB边界发生全反射 B．该单色光从空气进入棱镜，波长变长 C．该单色光在三棱镜中的传播光线与底边BC平行D．该单色光在AC边界发生全反射 5．右图是一个1 4 圆柱体棱镜的截面图,图中E?F?G?H将半径OM分成5等份,虚线EE1?FF1? GG1?HH1平行于半径O N,O N边可吸收到达其上的所有光线.已知该棱镜的折射率n=5 3 ,若平 行光束垂直入射并覆盖OM,则光线( ) A．不能从圆弧NF1射出B．只能从圆弧NG1射出 C．能从圆弧G H 11射出D．能从圆弧1H M射出 6．如图所示，一束单色光沿半圆柱形玻璃砖的半径垂直ab面入射，有光线从ab面射出。以O点为圆心，将玻璃砖缓慢转过θ角时，恰好没有光线从ab面射出，则该玻璃砖的折射率为() A．B． C．D． 7．如图所示，AOB是截面为扇形的玻璃砖的横截面图，其顶角θ＝75°，今有一束单色光线在横截面内从OA的中点E沿垂直OA的方向射入玻璃砖，一部分光线经AB面反射后恰
X荧光光谱仪的原理结构及应用 【摘要】X荧光分析是一种快速、无损、多元素同时测定的分析技术，已广泛应用于材料、冶金、地质、生物医学、环境监测、天体物理、文物考古、刑事侦察、工业生产等诸多领域，可为相关生产企业提供一种可行的、低成本的、及时的检测、筛选和控制有害元素含量的有效途径。本文就X荧光光谱仪的工作原理及其应用做简单阐述。 【关键词】X荧光；光谱仪；原理；应用 一、X荧光的基本原理： 当一束高能粒子与原子相互作用时，如果其能量大于或等于原子某一轨道电子的结合能，将该轨道电子逐出，对应的形成一个空穴，使原子处于激发状态。此后在很短时间内，由于激发态不稳定，外层电子向空穴跃迁使原子恢复到平衡态，以降低原子能级。当较外层的电子跃迁（符合量子力学理论）至内层空穴所释放的能量以辐射的形式放出，便产生了X荧光。X荧光的能量与入射的能量无关，它只等于原子两能级之间的能量差。由于能量差完全由该元素原子的壳层电子能级决定，故称之为该元素的特征X射线，也称荧光X射线或X荧光。 X荧光光谱法就是由X射线光管发生的一次X射线激发样品，试样可以被激发出各种波长的特征X射线荧光，需要把混合的X射线按波长（或能量）分开，分别测量不同波长（或能量）的X射线的强度，以进行定性和定量分析的方法。该方法是一种非破坏性的仪器分析方法，常用的有能量色散型和波长色散型两种类型。广泛应用于钢铁、铁矿石、炉渣、石灰石、萤石、耐火材料、地质等行业的多种元素的测定。下面我以波长色散型X射线光谱仪为例讲一下它的原理及构造。 二、X荧光光谱仪的原理与仪器构造： 使用X荧光光谱法的仪器叫X射线荧光光谱仪。X荧光光谱仪是一种相对测量仪器，它是通过测量一定数量已知结果的标准样品，建立相应的正确的数学模型后，才能得到准确分析结果的测量。建立正确的数学模型必须依靠一组好的标样，代表性好，有一定的跨度范围，有准确的结果。 1、激发光源—X射线管 X光管可以分成端窗和侧窗二种，但是近代X光荧光光谱仪几乎都只采用端窗一种类型，因为它能接近试样安放，有利于提高测定灵敏度。 如图：管体内为高度真空。管内有阳极，阴极，灯丝，冷却水管，X射线出射窗（铍窗）；尾部有高压电缆接头，冷却水接口和灯丝电缆；头部为X射线出射窗口。
1荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。 2荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。 3光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 3.1 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1 o S为0或1,它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0 表示所有电子自旋的角动量代数和为0,即所有电子都是自旋配对的，那么2S+仁1,电子所处的激发态为单重态，用S i 表示，由此可推出，S0 即为基态的单重态，S1 为第一跃迁能级激发态的单重态，S2为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+仁3,电子在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i 来表示，T1 即为第一激发 态中的三重态，T2即为第二激发态中的三重态，以此类推。 分子跃迁至各个激发态中，状态不稳定，随时会释放出能量，释放能量的类型有两种：一种是辐射跃迁，另一种是非辐射跃迁，释放能量会回到稳定的基态。
第十七章荧光光谱分析 当紫外线照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外线停止照射时，所发射的光线也随之很快地消失，这种光线被称为荧光。 西班牙的内科医生和植物学家于1575年第一次记录了荧光现象。17世纪，Boyle和Newton等著名科学家再次观察到荧光现象。17世纪和18世纪，又陆续发现了其它一些发荧光的材料和溶液，但是在荧光现象的解释方面却没有什么进展。1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍长，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念。同时，他由发荧光的矿物“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。1867年，Coppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝-桑色素配合物的荧光进行铝的测定。1880年，Liebeman提出了最早的关于荧光与化学结构关系的经验法则。到19世纪末，人们已经知道了600种以上的荧光化合物。20世纪以来，荧光现象被研究得更多了。例如，1905年Wood发现了共振荧光；1914年Frank 和Hertz利用电子冲击发光进行定量研究；1922年Frank和Cario发现了增感应光；1924年Wawillow进行了荧光产率的绝对测定；1926年Gaviola进行了荧光寿命的直接测定等。 荧光分析方法的发展离不开仪器应用的发展。19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West研制出第一台光电荧光计。早期的光电荧光计的灵敏度是有限的，1939年Zworykin和Rajchman发明光电倍增管以后，在增加灵敏度和容许使用分辨率更高的单色器等方面，是一个非常重要的阶段。1943年Dutton和Bailey提出了一种荧光光谱的手工校正步骤，1948年由Studer推出了第一台自动光谱校正装置，到1952年才出现商品化的校正光谱仪器。 荧光光谱分析法除了可以用作组分的定性检测和定量测定的手段之外，还被广泛地作为一种表征技术应用于表征所研究体系的物理、化学性质及其变化情况。例如，在生命科学领域的研究中，人们经常可以利用荧光检测的手段，通过检测某种荧光特定参数（如荧光的波长、强度、偏振和寿命）的变化情况来表征生物大分子在性质和构象上的变化。 很多化合物由于本身具有大的共轭体系和刚性的平面结构，因而具有能发射荧光的内在本质，我们称这些化合物为荧光化合物。在某些所要研究的体系中，由于体系自身含有这种荧光团而具有内源荧光，人们就可以利用其内源荧光，通过检测某种荧光特性参数的变化，对该体系的某些性质加以研究。但是，如果所要研究的体系本身不含有荧光团而不具有内源荧光，或者其内源性质很弱，这时候就必须在体系中外加一种荧光化合物即所谓荧光探针，再通过测量荧光探针的荧光特性的变化来对该体系加以研究。例如，如果我们要检测体系的极性，便可以将对极性敏感的荧光探针加入到体系中，然后通过对荧光探针的荧光特性的检测，求得体系的极性，或通过探针的荧光特性的变化来表征体系的极性的变化情况。 荧光分析法之所以发展如此迅速，应用日益广泛，其原因之一是荧光分析法具
@ 激发光谱与发射光谱原理及应用 （一）实验目的与要求 目的：1、了解激发光谱与发射光谱在物质定性及定量分析中的原理和方法 2、学习荧光光度计的使用方法 要求：1、掌握激发光谱与发射光谱测定的原理； 2、理解激发光谱与发射光谱在物质定性及定量分析中的基本应用； 3、了解荧光光光度计的基本组成，各部件的作用； 4、学习利用Origin软件处理实验数据。 、 （二）实验原理 利用某些物质受光照射时所发生的荧光的特性和强度，进行物质的定性分析或定量分析的方法，称为荧光光谱分析。当物质吸收了特征频率的光子，就由原来的基态能级跃迁至电子激发态的各个不同振动能级。激发态分子经与周围分子撞击而消耗了部分能量，迅速下降至第一电子激发态的最低振动能级，并停留约10-9秒之后，直接以光的形式释放出多余的能量，下降至电子基态的各个不同振动能级，此时所发射的光即是荧光。产生荧光的第一个必要条件是该物质的分子必须具有能吸收激发光的结构，通常是共轭双键结构；第二个条件是该分子必须具有一定程度的荧光效率，即荧光物质吸光后所发射的荧光量子数与吸收的激发光的量子数的比值。使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所发生的荧光通过发射单色器照射于检测器上,调节发射单色器至各种不同波长处,由检测器测出相应的荧光强度，然后以荧光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图，即为荧光光谱，又称荧光发射光谱。荧光发射光谱反映物质下能级的信息。让不同波长的激发光激发荧光物质使之发生荧光，而让荧光以固定的发射波长照射到检测器上，然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标，所绘制的图即为荧光激发光谱，又称激发光谱。荧光激发光谱反映物质上能级的信息。 紫外－可见光区荧光的产生，是由第一电子激发态的最低振动能级跃迁至电子基态的各个不同振动能级所致，而与荧光物质分子被激发至哪一个能级无关。因此，荧光光谱的形状与激发光的波长无关。
*[基金项目] 国家自然科学基金重点项目(30430270) [作者单位] 1华中科技大学同济医学院病理生理学系,邮政编码 武汉430030; 2 湖北省黄石理工学院医学院; 通讯作者:王建枝, E -mail:W angjz@https://www.doczj.com/doc/80412139.html, 本文2004-10-26收到,2005-01-20修回,2005-03-20接受宽场-共振能量转移-全内反射荧光的显微技术及其应用 * 张少华1 曹福元1 胡茂琼2 综述 王建枝1 审校 [中图分类号] Q6-33 [文献标识码] A [文章编号] 1005-1740(2005)02-0067-03 1 590年世界上第一台光学显微镜诞生,在随后的几百 年间,显微科学取得迅猛发展。人们逐渐地改进了成像质量,而且各种新的光学显微镜也应运而生。生命 科学中大量的事实表明细胞的动力学特征是起源于单个蛋白质分子的聚合和相互作用,对它的研究变得尤为重要。但是传统的光学显微镜由于受到光瞳远场衍射效应的影响,存在分辨极限[1]。光学显微镜空间分辨极限约250nm 。从应用的角度,传统的光学显微术无法满足更高的分辨率要求。还都需要破碎细胞或对细胞造成损伤,无法做到在活细胞生理条件下实时地对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用进行动态研究。而基于强度的影像技术例如荧光共振能量转移(FRET )方法(宽场,共聚焦,双光子),使得研究活细胞内的这些相互作用变得容易了[2]。使许多复杂的研究例如蛋白质功能和加工、基因表达和第二信使传递、胞内信号传导等研究成为可能。显微荧光成像技术可在溶液,细胞悬液,多细胞,单细胞,细胞膜,细胞器等不同层次提供示踪、定性、定量等研究,例如对生物大分子间的相互作用、距离、动力学特性等。本文就基于常规宽场荧光显微技术、荧光共振能量转移显微技术和全内反射荧光显微技术的荧光显微光学实验平台分别进行了介绍和对比评估。1 宽场荧光显微技术 1.1 宽场荧光(Wide F ield Fluorescence,WFF )显微原理 宽场荧光显微术,是整个目标被激发光曝光,贯穿整个样本(焦面和焦外)的发射光被高数值孔径(N A)物镜收集。是荧光显微技术中最简单和最广泛应用的荧光光学平台。1.2 WF F 显微的技术要求 激发光源,常见的有汞灯和氙灯,汞氙复合电弧灯。汞灯的光谱中有丰富的紫外成分,并在某些特定的波长激发能 量存在峰值,因此,可以配合特定的荧光染料得到非常好的信噪比。但也正是由于汞灯光谱特性不平坦,限制了其在定量测量方面的应用,而主要用于形态学观察。对于做定量动态测量的应用,一般选择光谱特性相对平坦的氙灯。在双波长测量Ca 2+,M n 2+等离子浓度的应用中,一般选择氙灯做激发光源。而汞氙复合电弧灯结合了汞灯和氙灯的优点,可以用于定性形态学观察和定量测量复合电弧灯。利用光栅或滤镜可以选择性地得到某个特定波长的激发光,激发光通过聚光器光路和显微镜物镜光路照射到样品平面,激发出样品中荧光生色团的荧光。 显微镜和荧光物镜,在荧光显微技术中,对显微镜透射光照明设备的要求并不高。但对于物镜,则要求很高,需要满足两个基本要求:1)物镜的激发光频段通透性尽可能要好,以便让足够多的激发光达到样本平面。2)物镜的数值孔径尽可能高,由于荧光非常微弱,高数值孔径的物镜可以提高收集效率 [3] 。 检测设备,在宽场荧光显微技术中,一般使用科研级的电荷耦合器件(Charged Coupled Dev ice,CCD)(图像传感器)作为检测设备,要求低暗电流,高光电转换效率(Q E),低读出噪音,高分辨率。在特别弱的荧光检测应用,例如单分子荧光检测中,由于信号极其微弱,需要使用有EM (电子增益)的CCD,将信号在CCD 芯片内部先进行放大,提高信噪比,然后再由读出电路转换出去。这样可以获取极其微弱的荧光信号。在单分子动态成像(曝光时间短)应用中,可以获取有效的动力学信息[3]。1.3 WFF 显微技术的应用 宽场荧光显微技术,在形态学研究、定性鉴定、定量测量等方面都有广泛的应用。利用合适的荧光染料,例如Fura -2,Indo -2,可以研究细胞内钙信号的动力学特性。使用Fura -2染料时,选择双波长(340nm/380nm)激发,单波长(510nm)检测模式;而使用Indo -1染料时,则选择单波长(K )激发,双波长(K )检测模式。可以测量细胞内Ca 2+浓度信号的变化以及细胞间的Ca 2+浓度分布信号,例如与分泌的耦联、钙振荡等等。如果选择荧光蛋白作为荧光标记物,则可以实现宽场荧光共振能量转移(Wide F ield F RET )测量[4]。 微循环学杂志,2005,15(2):67~69 o C 2005 C HINES E JOUR NAL OF MIC ROC IR C ULA TION
全反射 一、教学设计说明 根据新课程理念，一切为了每一位学生的发展，在课堂教学改革中，我坚持让学生成为课堂主人，努力营造民主、平等、和谐、互动的课堂，调整课堂教学的教学方式和学习方式，让学生以学为乐，真正成为学习的主人，从而促进学生全面发展，个性发展，可持续性发展。 二、教学分析 1、教材的地位与作用 全反射是反射和折射的交汇点。全反射现象与人们的日常生活以及现代科学技术的发展紧密相关，所以，学习这部分知识有着重要的现实意义。 2、教学对象分析 学生是教学过程中的主体，这个时期的学生已经逐步体会出教材的思想，但是大多数学生的抽象思维和空间想象能力还比较低，对物理现象和知识的理解、判断、分析、和推理常常表现出一定的主观性、片面性、和表面性，这就要求在教学过程中合理安排、指导和引导学生突出重点、突破难点，提高学生分析、归纳、及抽象思维能力。 三、教学目标 1、知识与技能目标 （1）理解光密介质、光疏介质的概念及全反射现象；掌握临界角的概念和全反射条件；了解全反射的应用。 （2）培养学生观察、分析、解决问题的能力。 2、过程与方法目标 （1）用实验的方法，通过讨论、分析过程，用准确的语言归纳全反射现象；培养学生创新精神和实践能力。 （2）启发学生积极思维，锻炼学生的语言表达能力。 3、情感态度与价值观目标 （1）培养学生学习物理的兴趣，进行科学态度、科学方法教育。 （2）感悟物理学研究中理论与实践的辨证关系。 四、教学重点和难点 1、教学重点：临界角的概念及全反射条件 2、教学难点：全反射现象的应用 五、教学媒体，方法 教学方法采用直观、感性的实验和视频，将演示实验与多媒体的模拟分析有机的结合起来。课堂上，尽可能多的留给学生参与教学的思维空间。恰当的设疑，引导学生猜想，再通过演示和多媒体分析，最后得出结论。学生既实现了从感性知识到理性知识的飞跃，又体会到了“设疑----猜想----实验----分析----结论”的研究方法 六、教学仪器 激光发生器、玻璃棒、半玻璃砖 七、教学教程设计 （一）教学流程图
Olympus Application Note Total internal reflection microscopy(TIRFM)is an optical technique used to observe single molecule fluorescence.Some biophysicists have used the technique for many years,while others are just beginning to explore the boundaries of this versatile mechanism for studying phenomena occurring at interfaces. Today,the technique is gaining popularity with cell biologists and neuroscientists to employ it to observe cell membrane fluorescence,in part because new membrane-specific dyes have been developed.In the past,TIRFM was difficult to perform due to the complexity of the microscope setup and the problem of achieving acceptable image brightness.A recently developed high numerical aperture microscope objective lens that improves TIRFM and makes it widely accessible is discussed in this application note. Background Total internal reflection is an optical phenomenon that can be employed to observe events occuring at boundaries.When light strikes the interface between two optical media of different refractive indices,the light incident at an angle greater than the critical angle undergoes total reflection.