蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型：
●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。
免疫共沉淀实验原理及方法 免疫共沉淀（CoIP）概述及原理 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。 免疫共沉淀的优势： 与其他研究蛋白质相互作用技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相比，免疫共沉淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合，避免了人为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋白可信度更高。 免疫共沉淀的局限性和注意事项： 1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到； 2. 由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种pull-down抗体，无论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来，如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP；
3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋白复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大； 4. 如果使用Western Blot的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白，则需要在试验前进行预测，具有一定的冒险性；当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事，并且成本较高； 5. CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用，进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测； 6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP都会得到其他所有成员[1] 免疫共沉淀的一般操作流程（中英文对照）：
第十六章沉淀反应 Chapter 16 Precipitation 第一部分教学内容和要求 一、目的要求 ·掌握：凝胶内沉淀试验、免疫浊度分析、免疫电泳法的原理；熟悉：凝胶内沉淀试验、免疫浊度分析、免疫电泳的应用；了解：液相沉淀试验的原理，各种沉淀反应方法的技术要点和影响因素。 二、教学内容 1。液相沉淀试验：絮状沉淀试验，环状沉淀试验。 2。凝胶内沉淀试验：单向琼脂扩散试验，双向琼脂扩散试验。 3。免疫电泳技术：免疫电泳，火箭免疫电泳，对流免疫电泳，免疫固定电泳。 4。免疫浊度分析技术：透射免疫比浊法，散射免疫比浊法，速率抑制免疫比浊法，免疫胶乳浊度测定法，免疫浊度分析的影响因素和免疫浊度测定法的应用。 第二部分测试题 一、选择题 （一）单项选择题（A型题） 1.Fahey曲线适用于 A.小分子抗原，长时间扩散(48小时) B.小分子抗原，短时间扩散(24小时) C.大分子抗原，长时间扩散(48小时) D.大分子抗原，短时间扩散(24小时) E.不论分子大小 2.Mancini曲线适用于 A.小分子抗原，长时间扩散(48小时) B.小分子抗原，短时间扩散(24小时) C.大分子抗原，长时间扩散(48小时) D.大分子抗原，短时间扩散(24小时) E.不论分子大小 3.Mancini曲线 A.适用于小分子抗原，扩散时间大于48h B.适用于小分子抗原，扩散时间小于24h C.适用于大分子抗原，扩散时间小于24h D.抗原浓度与沉淀环直径的平方呈线性关系 E.使用半对数坐标纸作图 4.Fahey曲线 A.适用于大分子抗原，扩散时间大于48h B.适用于小分子抗原，扩散时间大于48h C.适用于大分子抗原，扩散时间小于24h D.抗原浓度的对数与沉淀环直径呈线性关系 E.使用普通坐标纸作图 5.单向琼脂扩散试验，抗体与融化琼脂混合的温度 A.约37℃ B.约45℃ C.约50℃ D.约60℃ E.室温 6.单向琼脂扩散法可用于 A.抗体定性 B.抗体定量 C.抗原定性 D.抗原定量 E.抗体效价滴定 7.双向琼脂扩散试验出现多条沉淀线的原因 A.抗原抗体过剩 B.抗原抗体相等 C.抗原抗体缺乏 D.抗原抗体不纯 E.抗原抗体分子量不等 8.双向琼脂扩散试验测量两种有相关成分的抗原时，沉淀线出现 A.二条直线相交叉 B.二条弧线完全融合 C.二条弧线部分融合 D.二条弧线不连接 E.二条相交弧线靠近抗体孔 9.双向琼脂扩散试验中，抗原含量较大，反应沉淀线应 A.靠近抗原孔 B.靠近抗体孔 C.在两孔之间 D.沉淀线弯向抗原孔 E.呈多条沉淀线 10.速率散射比浊法测定的散射信号值产生于 A.单位时间内最大量的免疫复合物 B.单位时间内免疫复合物形成的最快时间段 C.单位时间内免疫复合物形成的最稳定期 D.抗体过剩期形成的免疫复合物 E.小分子不溶性免疫复合物颗粒 11.三角孔型模式双向琼脂扩散试验，若沉淀线为二条直线交叉，说明两种受检抗原性质 A..完全相同，抗体系双价 B.完全不同，抗体系双价 C.完全相同，抗体单价 D.完全不同，抗体单价 E.部分相同，抗体双价 12三角孔型模式双向琼脂扩散试验，若二条沉淀线部分相融，说明两种受检抗原性质 A..完全相同，抗体系双价 B.完全不同，抗体系双价 C.完全相同，抗体单价 D.部分相同，抗体单价 E.部分相同，抗体双价 13.三角孔型模式双向琼脂扩散试验，若二条沉淀线完全相融，说明两种受检抗原性质 A..完全相同，抗体系双价 B.完全不同，抗体系双价 C.完全相同，抗体单价
浅谈蛋白质质谱分析方法及应用 董义龙 (单位：毕节学院，化学与化学工程学院，2009级化学教育本科三班,学号:06320904031） 摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要的综 述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点，方法及蛋白质质谱分析的原理，方式 和应用，并对其发展前景着出展望。 关键词：蛋白质质谱分析原理与方法 蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上。作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行，调节代谢，抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此，蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。 1 蛋白质组学研究的背景和意义 1．1蛋白质组学的产生 20世纪90年代开始的人类基因组计划(}Iuman Genome Project，HGP)是人类有史以来最伟大的认识自身的世纪工程，旨在阐明人类基因组DNA3×109核苷酸序列，希望在分子水平上破译人类所有的遗传信息。经过各国科学家十几年的努力，HGP已取得了巨大的成绩。在揭示基因组精细结构的同时，也凸现了基因数量有限性和基因结构的相对稳定性，这与生命现象的复杂和多交性之间存在着巨大的反差。这种反差促使人们认识到：基因只是遗传信息的载体。要研究生命现象，阐释生命活动的规律，只了解基因组的结构是远远不够的。对于生命活动的主要体现者——蛋白质进行更全面和深入的研究是目前生命科学研究的迫切需要和重要任务。后因组时代中功能基因组(Functional Genomics)的研究采用一些新的技术，如微阵列，DNA芯片对成千上万的基因表达进行分析比较，并从基因整体水平上对基因的活动规律进行阐述。它摒弃经典分子生物学零敲碎打地研究个别基因的习惯，力求从细胞水平上解决基因组问题以建立对生命现象的整体认识。但是，生命现象的主要体现者是蛋白质，而蛋白质有其自身的特定活规律仅仅从基因的角度来研究是远远不够的l 31。因此，产生了一门在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科——蛋白质组学(Proteomics)。 1．2蛋白质组学的概念 “蛋白质组”是澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams等于1994年在意大利一次学术会议上首次提出的，最早见诸于文献是在1995年7月的(Electrophoresisj)杂志上【41指的是基因组编码的全部蛋白质。』4一义上来讲，蛋白质组(proteome)是指：“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。蛋白质组是一个动态的概念，它是对应于一个基因组的所以蛋白质构成的整体，而不是局限于一个或几个蛋白质。它不仅在同一个机体的不同组织和细胞表 达情况不同，在同一机体的不同发育阶段、直至消亡的全过程中也不断变化；机体处于不同生状态下不同，在不同外界环境下也是不同的。实际上每一种生命运动形式，都是特定蛋白质群体不同时间和空间出现并发挥功能的不同组合的结果。蛋白质组的研究是从整体水平上研究细胞或有机体内蛋白质的组成及其活动规律，包括细胞内所有蛋白质的分离、蛋白质表达模式的识别、蛋白质的鉴定、蛋白质翻译后修饰的分析及蛋白质组数据库的构建。这一术语一经提出，很快得到国际生物学界的广泛关注。第～次国际性的“蛋白质组学”会议于1997年召开，同年出版了第
1.免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)： A.蛋白样品的准备： A1.对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。可以使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)或各种RIPA裂解液(P0013B、P0013C、P0013D或P0013E)等进行细胞的裂解。 A2.对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。 A3.对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。 注：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。 B.去除非特异性结合(可选做)： B1.取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein G Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。 B2.2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。 注：所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和nor mal IgG和Protein G Agarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。 C.免疫沉淀： C1.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。 C2.再加入20微升充分重悬的Protein G Agarose，4℃缓慢摇动1-3个小时。(为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein G Agarose的量调整为40微升。) C3.2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein G Agar ose。 C4.用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤C3。 C5.完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。 C6.100℃或沸水浴处理3-5分钟，取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以-20℃保存。 2.免疫共沉淀： 参考免疫沉淀的方法进行，但免疫共沉淀(co-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品，但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。 免疫共沉淀 一原理： IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。 实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体
广州辉骏生物科技有限公司 蛋白质质谱鉴定 一、技术概述 质谱是将待测物质变为气态离子并将离子按质荷比（m/z）进行分离，检测各种离子谱峰的强度而实现分析的一种方法。 蛋白质定性通常采用质谱分析结合数据库检索的方法，所分析的样本可以是蛋白质溶液、蛋白质胶条或胶点。 简单蛋白样本，例如双向电泳斑点或纯化蛋白，通常采用MALDI-TOF/TOF质谱（MS/MS）进行分析。 混合蛋白样本，例如蛋白溶液，或SDS-PAGE条带，通常采用液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术进行分析。应用领域有：亚细胞组分的全谱分析，IP、co-IP、Pull-down后的互作蛋白鉴定，或其他中等复杂蛋白样本的鉴定。 二、技术原理 串联质谱（MS/MS）检测蛋白的原理是：蛋白先经胰酶消化成肽段，肽段在质谱仪中离子化后，会带上一定量的电荷，通过检测器分析，可得到各肽段的质荷比（m/z），从而得知各肽段的相对分子质量。为获得肽段的序列信息，质谱仪会选取某些肽段进行破碎，再次分析，获得二级质谱。用检索软件选择相应的数据库对质谱数据进行分析，同时以打分的形式评判鉴定结果，当打分大于某个阈值时，即判定质谱鉴定成功，反之则鉴定失败。 LC-MS/MS方法是将蛋白酶切消化为肽段混合物，之后这些肽段先经高效液相色谱分离形成简单的组分，再进行串联质谱（MS/MS）分析；因此适合于混合蛋白样本的鉴定。 三、技术优势 1. 采用高效液相色谱和质谱联用的分析方法，可以一次性鉴定成百上千种蛋白质。 2. 鉴定准确性和灵敏度高。 四、技术流程 蛋白样本制备——蛋白酶解——串联质谱分析（或LC-MS/MS分析）——数据库检索——蛋白质鉴定结果
免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法 一、基本概念 免疫沉淀（immunoprecipitation）是利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。 免疫共沉淀（coimmunoprecipitation）是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。与酵母双杂交技术不同，免疫共沉淀技术所利用的是抗原和抗体间的免疫反应，是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。 不难看出，免疫共沉淀与免疫沉淀技术所使用的原理与方法大致相似，所不同的是，在免疫共沉淀中，对靶蛋白的结合与沉淀由另一个与之发生相互作用的蛋白替代。在免疫共沉淀或免疫沉淀的基础上，通过进一步与其它技术的结合，如聚丙烯酰胺凝胶电泳，还可进一步对靶蛋白的的分子量等特性进行鉴定。 二、抗体的选择 （一）多克隆抗体 多克隆抗体因其制备相对简单，可与靶蛋白分子的多个位点结合，所形成的抗原抗体复合物较稳定因而应用的最为广泛。但多克隆抗体的缺点在于非特异性结合较多，常会导致反映本底（是否是背景）升高和一定的假阳性结果。 （二）单克隆抗体 与多克隆抗体相比，单克隆抗体往往只结合一种抗原表位，具有单一结合特异性，所以发生非特异结合的机会少，可被用于确定靶蛋白上某一部位的特殊结构，甚至可被用于区分相同靶蛋白的不同形式如构象变化和修饰。但反过来，单克隆抗体仅与单一表位结合的特性也会引起具有同一表位的不同靶蛋白间的交叉反应。 三、免疫沉淀方法 免疫沉淀的靶蛋白一般来自细胞裂解液，可以是被同位素标记的也可以是未被标记的。若为前者，免
蛋白质质谱分析研究进展作者：汪福源蛋白质质谱分析研究进展摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要综述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点、方法及蛋白质质谱分析的原理、方式和应用，并对其发展前景作出展望。关键词：蛋白质，质谱分析，应用前言：蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上，作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位[2]。1．质谱分析的特点质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。2．质谱分析的方法近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：1)电喷雾电离质谱；2)基质辅助激光解吸电离质谱；3)快原子轰击质谱；4)离子喷雾电离质谱；5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛[3]。3．蛋白质的质谱分析蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。3.1蛋白质的质谱分析原理以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。3.2蛋白质和肽的序列分析现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又称PTH法)，测序速度较慢(50个氨基酸残基/天)；样品用量较大(nmol级或几十pmol级)；对样品纯度要求很高；对于修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对N末端保护的肽链则无法测序[4]。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋白容易许多，许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱(electrospray ionisation，ESI)及基质辅助激光解吸质谱(matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da，目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI
质谱分析蛋白的原理与方法浅述 摘要：随着质谱技术的不断发展与成熟，利用质谱法进行蛋白质分析愈来愈广泛和深入。本文简要阐述蛋白质质谱分析的原理和方法。 关键字：蛋白质质谱分析原理与方法 概述 质谱技术具有较好的灵敏度、准确度，能准确测定蛋白质。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要的地位。[]质谱有进样器、离子源、质量分析器、离子检测器、控制电脑及数据分析系统等组成。传统的质谱仅用于小分子挥发物质的分析，但随着新的离子化技术的出现，如基质辅助激光解读电离飞行时间质谱（）和电喷雾电离质谱（）等，各种质谱技术的出现为蛋白质分析提供了一种新的且准确快速的途径。目前，酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用已成为鉴定蛋白质的发展趋势。 质谱分析蛋白的原理： 质谱法分析蛋白的基本原理是通过电离源将蛋白质分子转化为离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（）的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的值，分析鉴定未知蛋白。通常结合相应的处理及其他技术，能够比较准确、快速地鉴定蛋白质。 基质辅助激光解读电离飞行时间质谱（） 简而言之，基质辅助激光解读电离飞行时间质谱是将多肽成分转换成离子信号，并依据质量电荷之比（）来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。基质辅助激光解吸附质谱技术（）的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。产生的离子常用飞行时间（）检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此质谱很适合对蛋白质、多肽等生物大分子的研究。[] 电喷雾电离质谱（） 电喷雾电离质谱（）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。 电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用，如液质联用（）是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。
实验报告 课程名称：病原生物学与免疫学实验 指导老师：陈玮__ _____成绩：______________ 实验名称：沉淀反应和补体参与的免疫反应 实验类型：___________同组学生姓名：钟一鸣 1.沉淀反应——双向琼脂扩散试验 【实验原理】 双向扩散是将可溶性抗原和抗体分别加到琼脂板相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如果抗体和抗原相对应，则在两者比例适当处形成白色沉淀线。若同时含有若干对抗原抗体系统，因其扩散速度不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。观察沉淀线的位置、形状等可对抗原或抗体作出定性分析。本试验常用于检测抗原抗体的纯度，滴定抗体的效价以及用已知抗体（抗原）检测和分析未知抗体（抗原）。临床上用此法检测患者血清中的甲胎球蛋白AFP ，作为原发性肝癌的重要诊断指标。双向扩散实验所需时间较长（24h ），灵敏度不高。 【实验现象】 沉淀线 Ag 对照 Ag 对照 Ag 待测 Ag 待测 Ag 对照 Ab Ab
1）.六边形排列孔中，六条沉淀线在抗体孔周围衔接成一个完整的圆形 2）.三角形排列孔中，出现两条沉淀线，且二者相交顶端相连 【实验结果】 待测样本AFP阳性，与阳性对照含有浓度基本相同的AFP 【讨论】 1）.六边形排列孔中出现完整的圆形，说明阳性对照抗原和待测样本抗原浓度基本接近，使得六个孔中各沉淀线离中央孔的距离接近，围成完整的圆形 2）.三角形和六边形排列孔的沉淀线均较接近中央孔，说明待测抗原和阳性对照抗原的浓度略大于抗体浓度。 3）.制琼脂板时，不能太薄，且因要打六边形孔，尽量保证边上的孔不能太浅 4）.沉淀线不明显可能和抗原抗体浓度以及放置时间有关，放置时间过短则沉淀线不明显，过长则会使已经形成的沉淀线解离或散开而出现假阴性 2.免疫电泳试验——对流免疫电泳试验 【实验原理】 带电的胶体颗粒可在电场中移动，移动的方向与胶体颗粒所带的电荷有关，蛋白质抗原在PH8.6的缓冲液中带负电荷，故由阴极向阳极移动，抗体球蛋白的等电点为PH6-7，故在PH8.6的缓冲液中带负电荷少，且分子较大，移动缓慢，同时因电渗作用，反向阴极移动，于是形成抗原与抗体相对移动的情况，在二者相遇的最适比例处产生白色沉淀。此种在双向免疫扩散的基础上加电泳的方法称为对流免疫电泳。由于抗原、抗体在电场中做定向移动，限制了琼脂双向扩散时抗原、抗体朝各方向自由扩散，因而提高了实验的敏感度，同时缩短试验时间，故可作快速诊断。 【实验现象】 Ag Ab Ab Ag
·因为你IP的时候用的抗体，为了说明是你的抗体特异性的IP下来的东西，而不是其他抗体IP 下来的，所以要用IgG作为对照。 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整的细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间结合的保持下来。这一事实可被用于检测和确定生理条件下相关的蛋白质-蛋白质之间的相互作用。这种方法叫做免疫共沉淀 IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC 片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。 其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 实验流程为： （1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C，最大转速离心30 min后取上清； （2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜； （3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm 离心3 min； （4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连； （5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl 的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟； （6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。 注意的问题： （1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。 （2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用 （3）使用对照抗体： 单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗 兔多克隆抗体：正常兔IgG 在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点： (1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；
染色质免疫共沉淀（ChIP）实验具体方法及步骤 在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。 IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。 目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。 一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天） 1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。 2. 37℃孵育10 min。 3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5 min即可。 4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。 6. 倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2x106个细胞。这样每100 ul溶液含1x106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5x106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为 4x106个细胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800 ul。 7. 超声破碎：VCX750，25%功率，4.5 s冲击，9 s间隙。共14次。 二、除杂及抗体哺育（第一天） 1. 超声破碎结束后，10 000 g 4℃离心10 min。去除不溶物质。 2. 留取300ul做实验，其余保存于-80℃。 3. 300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M），65℃处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
免疫沉淀技术的原理和抗体选择 随着生物技术的发展，蛋白质与基因之间的互作逐渐成为科研人员的关注热点，染色免疫沉淀技术由此而生，并被应用到各个科研领域当中。本文聚焦染色质免疫沉淀技术的原理、应用和抗体选择等问题，让您对其有更全面的了解和认识。 随着人类基因组测序工作的基本完成，功能基因组学的研究逐渐成为研究的热点。而基因表达的调控又是功能基因组学的一个重要研究领域。研究某个蛋白因子的调控功能，可以通过对蛋白活性(激活或抑制其活性)，蛋白数量(过表达Overexpression或基因缺陷型Knockout), 以及蛋白功能(功能缺陷型蛋白Dominant-negative mutation)的控制，影响下游基因的表达，而下游基因的变化又可以通过基因芯片(cDNA Microarray)，抑制消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization)，差异显示RT-PCR等方法进行研究。然而这些方法都无法提供证据证明这些变化是受某个蛋白因子直接调节的，还是间接的其他变化导致的结果。所以，要想提供蛋白因子直接调控的证据，就要直接检测蛋白质-DNA的相互作用。传统的方法包括转录因子结合实验(Transcription Factor Assay)，电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay)，DNase I 足印法(DNase I footprinting)，酵母单杂交系统等。但这些方法都有一定的局限性，不能充分反映生理情况下DNA与蛋白相互作用的真实情况，而且很难捕捉到在染色质水平上基因表达调控的动态瞬时事件。 染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation，简称ChIP)是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。特别是近年来由于该技术不断的发展和完善，其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用，发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用;从研究一个目的蛋白与DNA 的相互作用，发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用;从研究启动子区域的组蛋白的修饰，发展到研究结合在DNA序列上的蛋白复合物。随着对基因功能研究的不断深入，这项技术正越来越多的被应用于科研的各个领域。 ChIP技术的原理 染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化，以及DNA的鉴定。因为ChIP实验涉及的步骤多，结果的重复性较低，所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照，而且对结果的分析也需要有一定的经验。对于刚刚开始使用ChIP技术的研究人员来说，使用成熟的商品化试剂盒和相关的技术服务会达到事半功倍的效果，比如millipore.html' target='_blank'>Millipore公司的EZ-ChIP试剂盒就是专门为初学者设计的入门产品。下面我们就最基本的实验步骤，实验中的小技巧以及需要注意的问题简单介绍一下。
蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子,存在于所有生物细胞,约占细胞干重质量的50%以上。随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃，最富生命力的前沿研究领域之一。本文简要综述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点，方法及蛋白质质谱分析的原理，方式和应用，并对其发展前景作出展望。 1 质谱分析的特点与方法 1.1 质谱分析具有很高的灵敏度，能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。 1.2 质谱分析的方法质谱分析的软电离技术主要有下列几种：（1）电喷雾电离质谱；（2）基质辅助激光解吸电离质谱；（3）快原子轰击质谱；（4）离子喷雾电离质谱；（5）大气压电离质谱。以前三种近年来研究最多，应用也最广泛。 2 蛋白质的质谱分析 2.1 蛋白质的质谱分析原理原理是通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（M/Z值）的蛋白质离子分开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。 2.2 蛋白质和肽的序列分析现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman 法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋白质容易很多。近年来随着电喷雾电离质谱（ESI）及基质辅助激光解吸质谱（MALDI）等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da,目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI TOP MS）已成为测定生物大分子尤其是蛋白质．多肽分子量和一级结构的有效工具，也是当今生命科学领域中重大课题——蛋白质研究所必不可缺的关键技术之一，目前在欧洲分子生物实验室（EMBL）及美国、瑞士等国的一些高校已建立了MALDI TOP MS 蛋白质一级结构（序列）谱库，能为解析FAST谱图提供极大的帮助，并为确证分析结果提供可靠的依据。 2.3 蛋白质谱分析方式 a.蛋白图谱，即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽分子量，将所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与之相对应的已知蛋白，从而获得待测蛋白序列。将蛋白质绘制“肽图”是一重要测列方法。b.利用待测分于在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相序的氨基酸残基，其中亚稳离子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂。C.与Edman法有相似之处，即用化学探针或酶解使蛋白或肽从N 端或C端逐一解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，名为梯状测序，经质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸。（1）蛋白消化：蛋白的基因越大，质谱检测的准确率越低。因此。在质谱检测之前，须将蛋白消化成小分子的多肽，以提高质谱检测的准确率。一般而言，6-20个氨基酸的多肽最适合质谱仪的检测。现今最常用的酶为胰蛋白酶，它于蛋白的赖氨酸和精氨酸处将其切断。因此，同一蛋白经胰蛋白酶消化后，会产生相同的多肽。 （2）基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法（MALDI TOP MS）：简而言之，基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量仪是将多肽成分转换成离子信号，并依据质量/电荷之比来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质混合，此样品混合物随即滴于一平板或载玻片上进行发挥，样品然后置于激光离子发生器。激光作用于样品混合物，使化学基质洗手光子而被激活。此激活产生的能量作用于多肽，使之由固态样品混合物变成气态。由于多肽分子倾向于吸收单一光子，故多肽离子带单一电荷。这些形成的多肽离子直接进入飞行时间质谱分析仪。最后，由电脑软件将探测器录得的多肽质量/电荷比值数据库中不同蛋白经蛋白酶消化后所形成的特定多肽质量/电荷比值进行比较，以鉴定该多肽源自何种蛋白，此法成为多肽质量
楼上说的准确的叫Co-IP。IP就是免疫沉淀，没有“共”，哈哈。其实楼主的意思是既然有Pyk2 and p-Pyk2的抗体，直接检测western,就可以了，为什么还要用IP以后的样品来检测，这是因为p-Pyk2商业化的抗体特异性不好，可能对p-FAK或其他类似的磷酸化蛋白有交叉，所以我们一般为了准确性，看其磷酸化的变化，就先单独把这个蛋白免疫沉淀出来，在用4G10抗体来检测。而且这个方法看的是Pyk2蛋白全部的磷酸化位点的情况，而p-Pyk2商业化抗体一般都是识别某一格Tyr磷酸化位点的，所以这两种试验是有本质区别的，这种方法还应用于很多Tyrosine kinase receptor磷酸化的检测，因为这些蛋白磷酸化位点都特别多哈：) 免疫沉淀是指用抗体把抗原（包括单体、复合物）沉淀下来，是一种抗原纯化、浓集的方法；免疫共沉淀指用抗体把抗原复合物沉淀下来，常用来研究蛋白质的相互作用 免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP） 免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶联的agaose或Sepharose 珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。 基本实验步骤 （1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清； （2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜； （3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl 的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟； （4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。 一、样品处理： 免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads 孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中，除了要控制所有操作尽量在冰上或者4°完成外，最为关键的是裂解液的成份。 用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的RIPA裂解液为例（主要含有pH7.4左右的离子缓冲液，接近生理浓度下的NaCl,一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等）来说明其各主要成份的用途，进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。 a. 缓冲液：离子缓冲液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。 b. NaCl浓度一般习惯用150 mM,这主要是因为150 mM接近生理浓度，不会破坏蛋白质之间的相互作用。然而细胞部的NaCl浓度并不是均一的，局部NaCl的浓度可以低到50 mM,150 mM的NaCl有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl浓度要