TEF-1δ基因真核细胞稳定表达系统的构建与鉴定
佚名
【期刊名称】《癌变·畸变·突变》
【年(卷),期】2002(014)003
【摘要】目的: 构建TEF-1δ (mouse translation elongation factor-1δ) 的稳定表达系统.方法: 采用磷酸钙介导转染技术和G418细胞筛选法,以pcDNA3.1/V5-His-TOPO为表达载体,构建了TEF-1δ转基因CHO和COS7细胞系,Western Blot分析与鉴定表达蛋白.结果: 在10株转染和经G418反复筛选的CHO细胞系中,有3株(编码为COH-pcDNA3.1-TEF-1δ#3,#6,#14)具有高效稳定表达的TEF-1δ编码蛋白质(Mr约31×103),其余CHO细胞株的TEF-1δ蛋白质表达相对较弱或无表达.在4株转染和经G418反复筛选的COS7细胞系中,4株细胞(编码为COS7-pcCDNA3.1-TEF-1δ #4,#8,#14和#17)均有高效稳定的TEF-1δ编码蛋白表达,相应的无转染组及载体对照组的CHO和COS7细胞均无TEF-1δ蛋白质表达.结论: 这两类TEF-1δ转基因哺乳动物细胞稳定表达系统已成功构建与鉴定,该表达系统的建立对于TEF-1δ这一新基因的生物学功能研究,尤其是镉的致癌作用与致癌机制的研究有重要应用价值.
【总页数】4页(P171-174)
【正文语种】中文
【中图分类】R730.2
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真核细胞常见表达载体 1. pCMVp-NEO-BAN载体 特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1。 Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507 图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域： Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+ Nhe1 Age1 3. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507 图示为启动子和多克隆位点区域：
真核细胞表达系统 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现,其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段. 在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统,这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体（一般为质粒)转化细菌（通常选用的是大肠杆菌）,通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白.其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需的成本相对比较低廉.但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点:如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域,其优点是: ①根据原核生物蛋白与靶DＮＡ间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异
性激活或抑制；...文档交流仅供参考... ②能诱导基因高效表达,可达105倍，为其他系统所不及； ③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关"，还可人为地调控基因表达量。 因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前,基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统....文档交流仅供参考... 1、酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母,后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Ｃandiｄa Bodｉni，Pichia Pasｔris3种。以Pichia Ｐastoriｓ应用最多。...文档交流仅供参考... 甲醇酵母的表达载体为整合型质粒,载体中含有与酵母染色体中同源的序列,因而比较容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一１（A0x１），在该基因的启动子（PAXOI）作用下，外源基因得以表达.PＡXO Ｉ是一个强启动子,在以葡萄糖或甘油为碳源时。甲醇酵母中ＡOx1基因的表达受到抑制,而在以甲醇为唯一碳源时PAＸＯI可被诱导激活,因而外源基因可在其控制下表达，将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。此外甲醇酵母的表达载体都为Ｅ．coli/Piｃhia Pastoris的穿梭载体，
真核表达系统 原核表达系统因其工艺简单、速度快而为人类带来许多便利，eg制药业由原先的脏器提取→发酵制备(IFN)，降低了本钱，扩大了来源，也缩短了生产周期。可是由于原核细胞中没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子，因此很多真核基因就无法在原核细胞中表达；另外，原核细胞缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工。因此许多糖蛋白在原核细胞中表达后，尽管一样形成蛋白质具有抗原性，却因为不能糖基化，而不产生功能。例如，C1INH是一种高度糖基化的单链蛋白(49%分子量为糖基)，因其不可逆结合C1q而阻断补体活化途径，是一种极好的补体抑制剂，若是C1INH缺点可致使遗传性血管神经性水肿(HANE)，表现为全身水肿，尤其是喉头水肿，能够输血，以正常人血中的C1INH来补充医治，但长期输血价钱高，易引发副反映，故可用基因工程产品来医治HANE，但因C1INH为高度糖基化蛋白，在中表达没有活性，现已有人利用CHO表达C1INH，拟用于医治。 一、优势 1.具转录后加工系统； 2.具翻译后修饰系统； 3.可实现真正的分泌表达，分泌至细胞外简化了纯化工艺。 二、真核基因结构及表达调控特点： (一)、基因结构特点： 1.DNA极为丰硕，具全能性——mRNA丰度(选材)
克隆真核基因的经常使用方式是提取细胞mRNA，反转录合成为cDNA。尽管真核生物各类细胞中基因含量、种类相同，但却不是选择任一细胞提取其mRNA就可反转录合成出目的基因cDNA,因不同细胞间存在mRNA的丰度问题，基因在不同细胞中转录情形不一样，产生不同的功能蛋白，才表现出各类细胞的丰硕多样性。故应选择mRNA丰度高的细胞为材料，eg. TNFα基因的克隆是以前髓细胞或早幼粒细胞为材料来源(Alice,1985)。 2.结构复杂，DNA与组蛋白结合，并在其外有核膜——真核生 物转录、翻译不可能持续进行。 3.不持续性：内含子、外显子。 内含子可能参与基因调控，不同剪切方式产生不同蛋白质。 4.具大量非编码序列：占90%以上的DNA序列。 因真核生物(多细胞)中血液循环为细胞提供了一个较稳固的生长环境，即生长调控较简单，而分化的调控那么极复杂，高度分化的组织细胞中只有10%的基因不同程度地表达，其它被关闭，这一调剂机制极复杂，而原核生物生存的唯一目的即无穷生长，其基因调控即生长调控，其细胞中约有40~50%的基因活化。 5.真核mRNA 5’端具帽子结构，3’端具Poly A尾——真 核mRNA半衰期较长，有可能用来制备cDNA。
真核细胞罕见表达载体之迟辟智美创作 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球卵白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在年夜大都真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因.更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株. 拔出外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点.注意在此载体中有二个EcoR1位点存在. 2、pEGFP, 增强型绦色荧光卵白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光卵白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株.另外，载体中的pUC origin 能保证该载体在年夜肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗
性基因在年夜肠杆菌中的表达. 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因. 借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位. 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1). 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光卵白/人肌动卵白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光卵白和人胞浆β-肌动卵白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株.另外，载体中的pUC origin 能保证该载体在年夜肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在年夜肠杆菌中的表达. 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合卵白，该卵白能整合到胞内正在生的肌动卵白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动卵白的亚细胞结构. 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目
人RhoB基因真核表达载体的构建和表达分析 王梅林; 牛精铃; 金若其; 徐莹莹; 蔡晶晶; 陈群力 【期刊名称】《《生物技术通报》》 【年(卷),期】2019(035)010 【总页数】6页(P174-179) 【关键词】RhoB; 真核表达; 免疫荧光 【作者】王梅林; 牛精铃; 金若其; 徐莹莹; 蔡晶晶; 陈群力 【作者单位】河南科技大学医学院洛阳 471023 【正文语种】中文 小G蛋白是一类广泛存在于真核生物中的单体GTP结合蛋白，分子量为20-40 kD。小G蛋白家族成员数目庞大，超过150多个，根据其序列结构特征，可被分为5个主要的亚家族：Ras、Rho、Rab、Arf和Ran［1-2］。RhoB基因属于Rho亚家族，该亚家族蛋白在细胞骨架重组、基因表达及细胞周期等的调控中起到重要作用［3］。 RhoB与其同家族成员RhoA和RhoC的氨基酸序列同源性高达86%，生物学功能也有重合，如RhoA、RhoB和RhoC协同调控细胞骨架运动［4-5］，但更多的证据显示，RhoB具有许多独特于RhoA和RhoC的性质和功能。例如，RhoA 和RhoC在细胞中为组成性表达，而RhoB则表现为诱导型表达［6］。抗癌药物处理（如顺铂、洛伐他汀）、紫外线照射、EGF或PDGF刺激等均可使RhoB的
表达水平迅速上调［7-11］。又如RhoA和RhoC均可促进细胞增殖，而RhoB 具有促进细胞凋亡的功能［12-13］。 RhoB在不同癌症的发生发展过程中表现出截然不同的功能。例如，在恶性胶质瘤、非小细胞肺癌和前列腺癌等肿瘤中的相关研究显示，其具有原癌基因的功能，可以促进肿瘤细胞的生长或迁移［14-16］。而在肾细胞癌和胰腺癌等癌症中，RhoB 表现出抑癌基因的性质，其蛋白表达水平呈下降趋势［17-18］。因此，深入研究RhoB蛋白的生理功能尤其是在癌症发展进程中的功能具有十分重要的意义。本实验旨在扩增人RhoB基因的ORF序列，构建获得真核表达质粒Flag-RhoB，并研究所构建质粒在真核细胞的表达情况和细胞亚定位，旨为进一步研究RhoB蛋白 的功能奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验材料人乳腺癌MCF7细胞、宫颈癌HeLa细胞、结直肠癌HCT116细胞、水貂肺上皮细胞Mv.1.Lu细胞、菌株DH5α为本实验室保存；真核表达载体pCMV5作者实验室保存并改造，在多克隆位点前插入了Flag标签的编码序列。1.1.2 试剂总RNA提取试剂盒、PrimeScrip Ⅱ 1st Strand cDNA合成试剂盒、 质粒抽提试剂盒和胶回收试剂，TaKaRa公司；1 kb plus DNA ladder，天根公司；pfu DNA聚合酶、dNTP、SalⅠ、XbaⅠ、T4 DNA连接酶、标准蛋白marker，Fermentas公司；DMEM培养基、胎牛血清（FBS），Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA）、Flag M2抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔IgG 和Alexa FluorR 488标记的羊抗兔IgG，DAPI，Sigma公司；Lipofectamine 3000，Texas red-phalloidin，Thermo Fisher公司；酵母粉、蛋白胨和ECL显 色液，厦门鹭隆生物科技有限公司；氨苄青霉素、Trypsin以及其他化学试剂均购自上海生工。
LEF1慢病毒表达载体的构建及稳定肺癌细胞株的鉴定 滕宇;李丽莉;马丽;张丽娜;王玥;顾勐;王子宇;岳文涛 【摘要】肺癌作为恶性肿瘤死亡的主要原因,其发生机制涉及诸多肿瘤相关基因的异常表达.淋巴增强子结合因子1(LEFl)是经典Wnt/β-catenin信号通路的关键转录因子,在多种肿瘤的侵袭及转移过程中发挥重要作用.本文通过构建LEF1过表达的慢病毒载体,在293T细胞中包装慢病毒颗粒,感染目的肺癌细胞并筛选获得稳定表达LEF1的A549及H1299肺癌细胞株,为后续鉴定LEF1直接调控的靶基因奠定细胞学基础.功能研究结果显示,过表达LEF1使上皮细胞标志物E-cadherin表达下调,而间充质细胞标志物N-cadherin表达上调,因而对肺癌细胞的上皮-间充质转化过程(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)具有明显的促进作用. 【期刊名称】《生命科学仪器》 【年(卷),期】2016(014)005 【总页数】6页(P33-37,59) 【关键词】淋巴增强子结合因子;慢病毒;肺癌;上皮-间充质转化 【作者】滕宇;李丽莉;马丽;张丽娜;王玥;顾勐;王子宇;岳文涛 【作者单位】首都医科大学附属北京胸科医院,北京市结核病胸部肿瘤研究所,北京101149;中国食品药品检定研究院,北京100050;首都医科大学附属北京胸科医院,北京市结核病胸部肿瘤研究所,北京101149;首都医科大学附属北京胸科医院,北京市结核病胸部肿瘤研究所,北京101149;首都医科大学附属北京胸科医院,北京市结核病胸部肿瘤研究所,北京101149;首都医科大学附属北京胸科医院,北京市结核病胸部肿瘤研究所,北京101149;首都医科大学附属北京胸科医院,北京市结核病胸部
真核细胞常见表达载体 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点：该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在,转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP，增强型绦色荧光蛋白表达载体（Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点：pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达. 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位. 亦可用于检测克隆的启动子活性（取代CMV启动子,Acet1-Nhe1）。 3、pEGFT-Actin，增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP—Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP—Actin载体在真核细胞表达EGFP—Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111.SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株. 5、CMV4 表达载体 特点：该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因,转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明： pBluescript II kS、pUC18 ＆Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等.这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞,并在含有IPTG和X—gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞将为白色菌落，而无外源DNA片段载体的细胞则为兰色菌落,由此易于筛选有无外源DNA片段的载体。此外，这些载体中有便于测序的
真核表达质粒的构建与表达
1. 真核表达质粒的构建 真核表达质粒是一种含有真核基因的质粒，它可以用于在真核细胞中 表达外源基因。真核表达质粒的构建主要包括以下步骤： （1）选择表达载体：首先，需要选择一种合适的表达载体，例如质粒、质杆菌、噬菌体等，以及一种合适的表达系统，例如T7系统、T3系统、SP6系统等。 （2）构建表达质粒：其次，通过合成或克隆技术将外源基因插入到表 达载体中，构建表达质粒。 （3）筛选表达质粒：最后，通过PCR、Southern blotting等技术筛选 出含有外源基因的表达质粒。 2. 真核表达质粒的表达 真核表达质粒的表达是一种细胞内的转录和翻译过程，它可以将外源 基因插入真核细胞中，从而实现基因的表达。表达质粒的表达通常由 以下几个步骤组成：首先，将外源基因与表达质粒的启动子序列结合，以形成表达质粒；其次，将表达质粒转染到真核细胞中，以便在细胞 中表达外源基因；最后，真核细胞将表达质粒中的基因转录成mRNA，然后翻译成蛋白质，从而实现基因的表达。此外，表达质粒的表达过 程还可以通过调节启动子序列的表达水平来调控基因的表达。
真核表达质粒的稳定性是指质粒在不同的环境条件下，表达量不受外 界环境变化的影响，能够保持恒定的表达量。稳定性的提高可以改善 表达质粒的性能，并且能够更好地满足实验要求。为了提高真核表达 质粒的稳定性，一般采用以下几种方法： 一是优化质粒的结构特征。质粒结构特征包括质粒的大小、碱基组成、表达载体的类型等。优化质粒的结构特征可以有效提高质粒的稳定性，从而改善质粒的性能。 二是改变质粒的表达系统。质粒的表达系统包括表达调控因子、载体、表达调控序列等。改变表达系统可以改变质粒的表达量，从而提高质 粒的稳定性。 三是改变质粒的表达条件。质粒的表达条件包括培养基、温度、pH值、溶液浓度等。改变质粒的表达条件可以改变表达量，从而提高质粒的 稳定性。 四是改变质粒的表达调控序列。表达调控序列是控制质粒表达的关键 因素，改变表达调控序列可以改变质粒的表达量，从而提高质粒的稳 定性。 总之，通过优化质粒的结构特征、改变质粒的表达系统、改变质粒的 表达条件以及改变质粒的表达调控序列等方法，可以有效提高真核表 达质粒的稳定性。 4. 真核表达质粒的应用
细胞稳转细胞系构建 1. 引言 细胞系是指从原始组织中获得的、可以无限增殖并保持某种特定功能的细胞群体。细胞系的构建对于生物医学研究、药物开发等领域具有重要意义。然而，由于细胞的特性和环境的变化，细胞系的构建并不容易稳定和持久。本文将介绍一种细胞稳转细胞系构建的方法，旨在提供一种可靠的方法来构建稳定的细胞系。 2. 细胞稳转细胞系构建的原理 细胞稳转细胞系构建的原理是通过引入稳定的转染系统，将目标基因稳定地表达在细胞中。这样一来，细胞系就能够维持目标基因的表达，从而实现稳定的细胞系构建。 具体而言，细胞稳转细胞系构建的步骤如下： 2.1 选择合适的转染系统 选择合适的转染系统是细胞稳转细胞系构建的第一步。常用的转染系统包括病毒载体、质粒转染和基因编辑技术等。根据不同的实验需求和细胞类型，选择适合的转染系统。 2.2 构建稳定的转染载体 构建稳定的转染载体是细胞稳转细胞系构建的关键步骤之一。转染载体应包含目标基因的全长序列，并且能够在细胞中稳定表达。同时，转染载体还应包含选择性标记基因，以便筛选出稳定转染的细胞。 2.3 转染细胞 将构建好的转染载体导入目标细胞中，使其发生转染。转染可以通过多种方法实现，如化学转染、电穿孔法和病毒介导转染等。选择合适的转染方法，确保转染效率和细胞存活率。 2.4 筛选稳定转染细胞 在转染后，使用选择性培养基或药物筛选出稳定转染的细胞。选择性培养基或药物应选择适合目标基因的表达和细胞存活的浓度。筛选出的稳定转染细胞即为构建的细胞系。 3. 实验步骤 为了更好地理解细胞稳转细胞系构建的方法，以下是一种常用的实验步骤：
3.1 选择合适的转染系统 根据实验需求和细胞类型，选择合适的转染系统。例如，如果需要稳定表达目标基因的细胞系，可以选择质粒转染系统。 3.2 构建稳定的转染载体 根据目标基因的全长序列，设计合适的转染载体。转染载体应包含目标基因的启动子、终止子和选择性标记基因等。使用分子生物学技术构建稳定的转染载体。 3.3 转染细胞 将构建好的转染载体导入目标细胞中。可以使用质粒转染试剂盒完成转染过程。根据转染试剂的说明书操作，确保转染效率和细胞存活率。 3.4 筛选稳定转染细胞 在转染后，使用选择性培养基或药物筛选出稳定转染的细胞。例如，可以使用抗生素等药物来选择稳定转染的细胞。筛选过程中，应注意控制药物浓度，以保证目标基因的表达和细胞存活。 3.5 验证细胞系的稳定性 筛选出稳定转染细胞后，需要验证细胞系的稳定性。可以通过PCR、Western blot、流式细胞术等方法验证目标基因的表达。同时，还可以进行细胞增殖、分化和药物敏感性等实验，评估细胞系的功能和特性。 4. 结论 细胞稳转细胞系构建是一项重要的实验技术，对于生物医学研究和药物开发具有重要意义。本文介绍了细胞稳转细胞系构建的原理和实验步骤，并强调了选择合适的转染系统和构建稳定的转染载体的重要性。通过合理的实验设计和操作，可以成功构建稳定的细胞系，为后续的研究工作提供可靠的细胞模型。
稳定细胞株构建 稳定细胞株的构建是分子生物学和基因工程学领域中的重要技术之一。它是研究基因 在体内作用和基因功能的实验研究中必不可少的工具。稳定细胞株指细胞在一定条件下能 够长期稳定地表达特定基因的细胞系。本文将从稳定细胞株的定义、构建方法、选择与鉴 定等方面进行介绍。 一、稳定细胞株的定义 稳定细胞株是指在体内、外转染过程中，选用合适的筛选、克隆和鉴定方法后，成功 获得细胞固有基因改变或是外源DNA转移并集成到基因组的一种特殊细胞株。与病毒感染 后获得的短暂性表达不同，这种稳定细胞株能够持续稳定地表达需求的基因，从而称其为 经过稳定转染的细胞株。这种细胞株的构建对于探究生物分子的功能及其相关基因及信号 通路的研究具有非常重要的意义。 1. 选择适当的载体：要构建稳定细胞株首先需要选择合适的载体，常用的载体有质粒、病毒、人工染色体等。选择载体的关键是该载体能否满足待表达基因的大小、结构和 表达水平要求。 2. 转染DNA：将表达目的基因的DNA载体导入到目标细胞内，并带入一个选择性基因，用来区分携带目标DNA的细胞和不携带的细胞。转染方法可以选择化学法、电转法、导出法、生物法等。 3. 筛选细胞：待转染完成后，可以通过添加对应抗生素或药物，选择对基因表达有 利的细胞，最终选择转染成功且能够稳定表达目的基因的细胞。 4. 克隆稳定细胞株：将稳定表达目的基因的单个细胞进行克隆成纯种，常用方法有 限制性酶切，PCR扩增等。 5. 筛选和鉴定：对克隆的细胞进行筛选和鉴定。其中，鉴定的指标需要依据实验需 要进行调整，如基因表达水平、蛋白质水平等。同时，也需要确保稳定细胞株在长期维护 中能够稳定表达目的基因。 选择稳定细胞株时，需要确保细胞具备稳定性、高的表达水平和特异性。同时，还需 要有合理的对照组。常用的鉴定方法有：Western blotting、流式细胞术等。 四、一些常见的问题 1. 容器类型：选择扁平形状且易于吸附细胞的容器，如96孔板、24孔板等。 2. 筛选剂的剂量：大剂量选择要杀死不携带基因的细胞，但是小剂量会减少不必要 的伤害。 3. 培养时间：保持细胞处于良好的生长状态，同时避免细胞过度生长。
重组蛋白真核表达系统构建流程 1.从细菌中提取真核表达所需的重组蛋白的基因序列。 2. Extract the gene sequence of the recombinant protein required for eukaryotic expression from bacteria. 3.将基因序列插入真核表达载体中。 4. Insert the gene sequence into the eukaryotic expression vector. 5.确保基因插入的正确性，通过测序鉴定。 6. Ensure the accuracy of gene insertion through sequencing identification. 7.将载体导入宿主真核细胞中。 8. Import the vector into the host eukaryotic cells. 9.筛选出带有重组基因的真核细胞系。
10. Select eukaryotic cell lines with the recombinant gene. 11.使用适当的诱导剂刺激真核细胞进行重组蛋白合成。 12. Stimulate eukaryotic cells with appropriate inducers to synthesize recombinant proteins. 13.收集真核细胞培养上清液中的重组蛋白。 14. Collect recombinant proteins from the culture supernatant of eukaryotic cells. 15.对纯化的蛋白进行鉴定和检测。 16. Identify and test the purified protein. 17.通过离心等方法将蛋白精制并提纯。 18. Centrifuge and purify the protein by centrifugation and other methods. 19.确定蛋白的浓度和纯度。 20. Determine the concentration and purity of the protein.
人FGFR1的BacMam系统构建、表达、纯化与鉴定 武艺;罗志勇;陈艳霞;孟俊炜;方成 【摘要】目前激酶类蛋白的表达大多由昆虫细胞表达系统实现,采用BacMam系统来表达受体型酪氨酸激酶人FGFR1,旨在获得更接近天然结构与功能的重组蛋白.首先,将pDEST20载体的多角体蛋白启动子替换成CMV enhancer启动子,获得BacMam表达载体pDEST20-CMVe.通过Gateway系统,将FGFR1具有酪氨酸激酶活性的区域克隆至改造后的载体中.利用昆虫细胞Sf9产生病毒,P2代病毒转导哺乳动物细胞FreeStyle 293-F进行表达,经亲和纯化后,成功获得了75 kD的融合蛋白.通过磷酸化底物的反应检测此FGFR1激酶的活性.结果表明,BacMam系统是一个良好的表达重组激酶FGFR1的平台,并且所表达的激酶活性高于昆虫细胞表达的激酶蛋白. 【期刊名称】《生物技术通报》 【年(卷),期】2012(000)010 【总页数】5页(P114-118) 【关键词】BacMam;载体构建;蛋白表达;激酶活性 【作者】武艺;罗志勇;陈艳霞;孟俊炜;方成 【作者单位】同济大学生命科学与技术学院,上海200092;上海睿智化学研究有限公司,上海201203;上海睿智化学研究有限公司,上海201203;上海睿智化学研究有限公司,上海201203;上海睿智化学研究有限公司,上海201203;上海睿智化学研究有限公司,上海201203
【正文语种】中文 BacMam表达系统是对传统杆状病毒表达系统的改良，20世纪90年代，有研究 者发现在昆虫细胞表达载体中加入哺乳动物细胞表达框后，可通过杆状病毒转导哺乳动物细胞实现基因的导入与表达［1］。之后，对于不同类型的细胞和蛋白，均出现了利用这一方法的研究。改良后的该方法既可采用瞬时表达，适合毒性蛋白的生产，简便快捷，同时也能通过筛选获得稳定表达的细胞系［2］。 成纤维细胞生长因子受体1（fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1）是 4大FGF受体之一，属于糖蛋白，由3部分组成：结构类似Ig的胞外域、疏水性很强的跨膜域、含酪氨酸激酶活性的胞内域。FGFR1在不同细胞中表达相当普遍，序列在进化过程中高度保守。当FGF与其结合后，受体形成二聚体，自身磷酸化，继而激活下游的信号传递。FGFR1与许多疾病的发生发展相关，如前列腺癌［3］、乳腺癌［4］、膀胱癌［5］、Pfeiffer综合征、骨髓增殖综合症（EMS）、胰腺癌及星细胞瘤等［6］。它所介导的信号通路在体内发挥多种生物学效应，因此也成为许多药物筛选的重要靶标［7］。目前商业化生产的FGFR1均为传统的昆虫细 胞表达，也有研究采用经典的哺乳动物细胞表达方法［8］。本研究拟构建BacMam表达载体，并对人FGFR1具有酪氨酸激酶活性的胞内域进行重组表达与纯化，比较其与普通昆虫细胞表达的FGFR1的活性差异，旨在为基于FGFR1的 新药筛选等相关研究奠定基础。 质粒pTT和ccdB survival菌株为本室自存；质粒pENTR/D-TOPO、质粒pDEST20、DH10Bac感受态、Sf9昆虫细胞和FreeStyle 293-F细胞为Invitrogen公司产品；pCMV6-XL5-FGFR1购自OriGene公司；TOP10感受态 细胞购自TIANGEN公司。 AccuPrime Pfx DNA Polymerase和Gateway LR ClonaseⅡ Enzyme Mix购于Invitrogen公司；In-Fusion HD Cloning Kit购于Clontech公司；IPTG、Bluo-
tert基因内参基因 内参基因的特性 内参基因是用于归一化基因表达水平的稳定基因，在不同实验 条件下其表达水平保持相对恒定。理想的内参基因应具备以下特性： 表达稳定性：在不同的组织、发育阶段、实验条件和处理下，表达水平始终保持稳定。 物种保守性：在不同物种中具有相似的序列和功能，以确保 跨物种比较的准确性。 检测范围：具有足够的检测范围，以量化不同样品中的基因 表达水平。 扩增效率：与目标基因具有相似的扩增效率，以避免引入偏差。 tert基因作为内参基因
tert基因（端粒酶逆转录酶）编码端粒酶催化亚基，负责维持真核细胞端粒的长度。它被广泛用作内参基因，因为它具有以下优点： 表达稳定性： tert基因在多种细胞类型和实验条件下表现出稳定的表达，使其成为可靠的内参。 物种保守性： tert基因在不同的哺乳动物物种中高度保守，这使其适用于跨物种研究。 检测范围： tert基因的表达水平在不同样品中通常处于中等范围，使其在各种实验中都适用。 扩增效率： tert基因的扩增效率通常与典型目标基因相似，这有助于确保定量分析的准确性。 其他可用内参基因 除了tert基因，还有其他常用内参基因，包括： GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）：一种在糖酵解中起作用的家政基因，具有稳定的表达水平。
ACTB（β-肌动蛋白）：一种参与细胞骨架形成的结构蛋白，在多种细胞类型中具有可靠的表达。 18S rRNA：一种核糖体RNA，其表达在不同组织和条件下通常保持稳定。 内参基因选择 选择合适的内参基因至关重要，以确保基因表达分析的准确性和可靠性。以下准则是内参基因选择的考虑因素： 实验的具体要求和目标基因的特性。 组织类型和实验条件。 文献中已确定的可靠内参基因。 结论 tert基因是常用的内参基因，具有表达稳定性、物种保守性、检测范围和扩增效率等优点。它对于归一化不同实验条件下基因表
慢病毒载体介导HIF1α稳定表达A549细胞系构建 邹斌;周学亮;詹宇亮;陈紫晴;赖松青;吴霞;刘季春 【摘要】目的利用慢病毒载体系统构建稳定表达HIF1α的A549细胞系.方法以NCBI人HIF1α基因编码序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增HIF1α.酶切回收的HIF1α片段与制备的慢病毒载体HBLV-RFP-Puro重组反应.PCR和基因测序鉴定重组质粒.重组质粒和辅助质粒共转染293T细胞.包装好的病毒经过滤、浓缩后,利用稀释计数法测定病毒滴度.制备好的慢病毒感染A549细胞,采用药物筛选稳定转染细胞系.荧光显微镜及Western blot检测观察转染及筛选效果.结果 PCR扩增HIF1α片段经鉴定成功,重组质粒经PCR、基因测序鉴定构建成功.成功包装获得高滴度LV-H IF1α.LV-HIF1α感染A549细胞后经药物筛选,荧光显微镜下细胞带有红色荧光,Western blot结果显示LV-HIF1α组HIF1α的表达水平明显高于对照组.结论慢病毒载体介导HIF1α稳定表达的A549细胞系构建成功.%Objective To establish the A549 cell line with stable expression of HIF1α by using lentiviral vector system.Methods Primers were designed and synthesized with human HIF1α gene coding sequence by the National Center of Biotechnogical Information(NCBI) as the template.HIF1α was amplified by PCR.The HIF1α fragment recycled by enzyme digestion was recombined with prepared lentiviral vector HBLV-RFP-Puro.The recombinant plasmid was identified by PCR and gene sequencing.The recombinant plasmid and the auxiliary plasmid were co-transfect into 293T cell.After filtration and concentration of packaged virus,the viral titer was detected by using the dilution counting method.The prepared lentivirus was infected A549 cells.The drug screening was adopted to stabilize the transfected cell
HIF-1α基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定 【摘要】目的构建HIF-1α基因RNA干扰慢病毒载体。方法选定HIF-1α基因RNAi靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XhoⅠ和HpaⅠ双酶切后的慢病毒载体pLentilox3.7(pLL3.7)连接,产生pLL3.7 HIF-1α慢病毒载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽取质粒后,用限制性内切酶XbaⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定,将阳性克隆送金斯特公司进行测序鉴定;用PHR、pVSVG和pLL3.7慢病毒载体共转染包装细胞293T细胞(磷酸钙转染法),包装产生慢病毒, 将收集的病毒上清经高速离心浓缩后,按一定比例稀释,然后感染293T细胞,用流式细胞仪检测293T细胞GFP蛋白的表达水平,从而测定病毒滴度。结果酶切和测序证实,构建出HIF-1αshRNA的慢病毒载体pLL3.7 HIF-1α;包装慢病毒,测得离心的浓 缩病毒悬液的滴度为2×108 TU/ml。结论成功构建HIF-1α基因RNAi慢病毒 载体。 【Abstract】Objective To construct a lentiviral vector of RNA interfered(RNAi)HIF-1αgene. Methods To confirm the targeting sequence of HIF-1α gene that can be effectively silenced by RNA inference. The cDNA containing both sense and antisense Oligo DNA fragments of the targeting sequence was designed, and cloned into the pLentilox3.7(pLL3.7) vector which was digested by XhoI and HpaI. The obtained lentiviral 基金项目:厦门市卫生局资助项目(项目编号:3502Z20077055); 厦门市科技局资助项目(项目编号:3502Z20089001) vector containing HIF-1α shRNA was confirmed by digestion and sequencing. Using lentiviral vector PHR、pVSVG and pLL3.7 HIF-1α to cotransfect 293T cells, then the collected lentivirus. The titer of virus was tested according to the expression level of GFP. Results Digestion and DNA sequencing demonstrated that the constructed lentivirus vector pLL3.7 HIF-1α which can produce HIF-1α shRNA. The titer of concentrated virus was 2×108 TU/ml. Conclusion The lentivirus RNAi vector targeting HIF-1α is constructed successfully. 【Key words】HIF-1α;RNAi;Lentivirus 缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是目前所发现的正常细胞以及肿瘤细胞适应缺氧的最关键的转录因子[1],其基因的功能研究具有非常重要的意义。很多肿瘤存在HIF-lα的高表达,并与肿瘤的侵袭转移,耐药等相关
pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体的构建与鉴定 刘培;曹毅;陈微;刘改荣;杨晓红;陶茂灿;罗宏宾 【摘要】[目的]从人角质形成细胞系HaCaT中克隆NRP1(Neuropilin-1)基因全长cDNA,构建含NRP1基因的重组真核表达载体,为下一步的NRP1基因功能研究奠定基础.[方法]采用RT-PCR法从人角质形成细胞系HaCaT中扩增NRP1基因全长cDNA,扩增产物通过TA克隆连接到pMD18-T载体进行测序鉴定,然后通过双酶切将全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),最后得到pcDNA3.1(+)-NRP1重组质粒.[结果]成功克隆NRP1基因全长cDNA,并成功构建了 pcDNA3.1(+)-NRP1 真核表达载体.[结论]pcDNA3A(+)-NRP1 真核表达载体的成功构建可以为NRP1基因功能的进一步研究及其临床基因治疗奠定实验基础.%[Objective] To clone full-length cDNA of Neuropilin-1(NRP1) gene from Human Keratinocytes Cell line (HaCaT) and construct reco-mbinant cukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-NRP1, and pave the road for deeply research on functions of NRP1. [Methods] The full-length cDNA of NRP1 was amplified from HaCaT cells by RT-PCR and then cloned into pMD18-T vector through TA base pairing. After identification by DNA sequencing, the plasmid pMD18 -T -NRP1 was digested by restriction enzymes and the full -length cDNA of NRP1 was generated and cloned into the eukaryon'c expression vector pcDNA3.1(+), then the recombinant plasmid pcDNA3.1(+)-NRP1 was constructed. [Results] The full- length cDNA of NRP1 was successfully cloned, and the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (+)-NRP1 was successfully contracted. [Conclusion] The eukaryoac expression plasmid pcDNA3.1 (+)-NRPl has been constructed