实验3 细胞核的分离与核酸的鉴定 【实验目的】 1.掌握细胞核及细胞质的分离和纯化的一般原理和操作方法。 2.了解DNA在细胞中的分布和核酸鉴定的原理。 3.进一步掌握离心机的工作原理及正确使用方法。 【实验原理】 1.DNA主要存在于细胞核， RNA主要存在于细胞质。 2.细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各组分分级分离出来。 肝组织破碎后，柠檬酸能抑制脱氧核糖核酸酶的活性，维持染色质的正常结构和活性。如将此种细胞核保存在等渗（0.25M）蔗糖溶液中（内含微量钙离子，防止核聚集和脆性），可以比较好地保存其完整的正常结构。 在此条件下离心分离得到的是细胞核的粗制品，如离心时通过0.88M蔗糖的高渗溶液。适当调整离心力，可得到纯化的细胞核沉淀。
3.脱氧核糖核酸的鉴定： 【操作步骤】 1、0.5g肝组织＋5ml的1.5%柠檬酸溶液，研磨 2、肝匀浆，倾入离心管，离心：3000r/min；15′ 3、离心结束后，上清液移入另外一个试管中备用（此为细胞质液） 4、沉淀中加入1ml的0.25mol/L 蔗糖-柠檬酸溶液，玻棒搅匀后， 为核悬液。 5、另外取离心管一只，加9ml 的0.88mol/L蔗糖-柠檬酸液。用滴 管吸取核悬液。沿管壁缓慢铺于液面上。 6、离心：2000r/min；10′.上层液，弃去；沉淀为初步纯化的细 胞核。 7、核洗液5ml洗涤沉淀，离心：2000r/min，10 ′白色沉淀为纯
化的细胞核。 8、加10ml 0.02mol/L NaOH溶解细胞核，即为待测的核液。 9、脱氧核糖核酸的鉴定 （1）水解：取离心管二支，编号，按下表操作 混合各管 沸水浴(10’) 离心 3000r/min;5′ 上清液 (2)鉴定：取试管三支，编号，按下表操作: 混合各管 沸水浴(15’) 冷却 比较各管颜色(595nm) 编号 1 2 细胞质（ml） 2.0 - 核液（ml）- 2.0 1M过氯酸(ml） 2.0 2.0
酶的分离纯化方法介绍 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。 关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀 生物细胞产生的酶有两类： 一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到； 另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。 因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。 由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。 酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍： 一、预处理及固液分离技术 1.细胞破碎（cell disruption） 高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。
第6讲细胞质与细胞核测试题 1．（2008广东理科基础）细胞内各细胞具有一定的结构和功能，对图8中结构①的叙述，正确的是A．在不同植物细胞内其数量基本相同 B．是植物合成蛋白质的主要细胞器 C．是植物进行光合作用产生有机物的细胞器 D．含有DNA和RNA，是决定植物遗传的基本单位 2、（06江苏）下列有关细胞结构和功能的叙述，错误 ．．的是 A、水稻主动吸收Si需要根细胞膜上的载体协助 B、甲状腺细胞能够接受促甲状腺激素的调节与其细胞膜上的糖蛋 白有关 C、核糖体是细胞内蛋白质的“装配机器”，由蛋白质和mRNA组 成 D、核孔是细胞核和细胞质之间进行物质交换的通道 3、（06江苏）（多选）右图为某高等植物叶肉细胞结构模式图，相关叙述正确的是 A、图中能产生ATP的结构有1、2、5 B、1中产生的一分子C02扩散出来进入2中被利用，穿过的磷脂双分子层的 层数为4层 C、2与4中都含有叶绿素和类胡萝卜素等色素 D、3是遗传物质储存和复制的主要场所，是细胞遗传特性和 细胞代谢活动的控制中心 4、（06广东）不．在内质网上合成或加工的生物分子是 A、抗体 B、胆固醇 C、维生素D D、核酸 5、下图表示真核生物细胞的结构与功能，下列与此相关的叙述，不正确的一项是 A、图中物质A表示蛋白质，物质B表示磷脂 B、E的结构特点是具有一定的流动性 C、图中①的场所是叶绿体，②的场所是线粒体 D、完成③、④、⑤、⑥功能的结构均具有单层膜结构 6. （2008高考广东生物）用高倍显微镜观察黑藻叶绿体时，可见叶绿体 A.具有双层膜 B.呈绿色带状 C.内部有许多基粒 D.呈绿色椭球形 7．（2008上海高考生物巻）（8分）下面是两类细胞的亚显微结构模式图，请据图回答：
蛋白质和酶的分离与 纯化
蛋白质和酶的分离纯化及鉴定 蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。 目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。 一、质分离纯化的一般原则 1. 原料的选择 原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。 蛋白分布：体液、组织、细胞定位 2. 破碎方法： (1) 机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。 如：捣碎法、研磨、匀桨法 (2) 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。 如：反复冻融、渗透压、超声破碎 (3) 化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法. 如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween） (4) 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等 3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法 4. 先粗后细，分级分离 粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。 精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。 5. 避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等） 二、常用的蛋白质的分离纯化技术
细胞生物学设计性实验：细胞核的分离鉴定 医学细胞生物学设计型实验设计报告 班级10级k-7班 评分 实验项目： 细胞核的分离与鉴定 实验原理：1、细胞内各种结构的比重和大小不同，在同一离心场内其沉降速度也不同。所以，用差速离心法可将细胞内各种细胞器及组分分级分离出来。差速离心法也是用来研究亚细胞成分的化学组成，理化特性及其功能的主要手段。 2、分离细胞核最常用的方法是将组织制成匀浆，在特定的条下进行离心分离，然后分析鉴定。 3、匀浆是指在低温条下，将组织放入匀浆器，加入等渗匀浆介质进行研磨，破碎细胞，使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆液。 实验步骤：1、处死：断头处死小白鼠，手提尾部使其学业尽量流出。 2、取材：迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤，称取湿重约为1g的肝组织放在烧杯中。 3、匀浆：加油8ml预冷的0.25mol/L蔗糖0.003mol/L绿化高永夜于烧杯中，尽量剪碎肝组织，将剪碎的刚组织倒入玻璃匀
浆器，是匀浆器下端侵入盛有冰块的器皿（如冰盘）。左手握持匀浆器，右手将匀浆捣杆垂直插入管中匀浆，直至看不到明显的组织块。 4、过滤： 用8层纱布（先用少量生理盐水或蔗糖液润湿纱布）过滤匀浆液于离心管中。 5、离心：在天平上平衡每对离心管，2500r/min离心 15min，取上清液于另一离心管中。 6、涂片：取上清液制一张涂片（涂片1）。将原离心管中剩余上清液吹打成沉淀成悬液，另制一张涂片（涂片2），自然干燥。 7、染色：分别在涂片1和2上低价甲苯胺蓝染液 ，染色5到7分钟（即滴染）。 8、洗涤：冲去染液，晾干。 9、镜检：结合实验结果的描述，镜下观察分析。 注意事项：1.操作规范，防止试剂污染。 2.细胞悬液的涂片制作要轻柔。 3.使用离心机要注意平衡，转速从低到高。 预期结果：低倍镜下找到标本，再换高倍镜，可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色，圆形，中央有2到4个甚至更多个深蓝色的核仁。 实验用品：材料：小白鼠肝脏。
细胞质包括细胞核外的所有物质，被细胞膜包裹着。在细胞中起着运输的作用，细胞质包含着： 线粒体，很小，有着香肠一般的外形。像小型的能量工厂，通过有氧条件下燃烧营养物质产生能量。这个化学反应，被称为分解代谢，复杂结构的营养物质被分解成结构更加简单的物质。细胞中糖类和脂肪的代谢需要能量。 内质网是细胞中一种网状管道结构，这些管道是一个细胞的运输系统——加工细胞可用蛋白质的地方。这些构造生成复杂物质的过程，比如蛋白质。通过合成代谢，小条的蛋白质通过匹配组合到一起像连成一条链子一样组成更长的蛋白质。 这两个过程，合成和分解，被称为新陈代谢。新陈代谢可概括为细胞中发生的所有化学反应。如果一个人拥有快速的新陈代谢，那么对于营养物质，比如糖类和脂肪，将会很快用光，能量将被释放。如果一个人拥有缓慢的新陈代谢，营养物质将会消耗的很慢，脂肪将储存在细胞中。 细胞间的差异。细胞是不同的，或者说成作用分工不同，自始至终细胞都在分泌他们的特有产物，比如，肌肉细胞是细长的，组成肌肉纤维，帮助（人体）收缩和舒张。神经细胞体型细长有着向四周伸展的神经纤维，帮助他们传递神经冲动。脂肪细胞包含一个用于储脂的大的，空荡的空间。这些仅仅是人体中多种多样的细胞类型中的凤毛麟角。 组织 组织是一群相同的细胞一起聚集在一起进行专项工作，组织学家是一名专门从事组织研究的科学家。组织类型分为： 上皮组织，位于身体各处。如内部器官的内层结构，覆盖身体表面的皮肤，它也联系着内分泌和外分泌腺。这个术语最初用来简称内部器官的表面。 肌肉组织。随意肌——位于手臂，腿部，身体各部位的肌肉处于有意识的运动下。不随意肌——位于心脏和消化系统，以及其他器官，在无意识中运动。心肌是一种特殊的肌肉类型，只存在于胸腔上方的心脏处。Now it describes all tissue that covers the outside of the body and lines the ind can be seen beating in a 6-week-old fetus.（这句真不懂） 结缔组织。比如脂肪，软骨和血液。 神经组织。神经组织控制着人体内各处的神经冲动。
细胞的结构：细胞质和细胞核 【学习目标】 1、理解几种细胞器的结构和功能 2、理解细胞器之间的协调配合，共同完成生命活动 3、理解细胞核的功能，明确细胞核在控制细胞代谢和遗传中的作用。 4、重点：几种重要细胞器的结构和功能、细胞膜系统、细胞核的结构和功能 5、难点：细胞器之间的协调配合、观察叶绿体和线粒体。 【要点梳理】 要点一、细胞质的结构和功能 1、细胞质（细胞质基质+细胞器） （1）细胞质基质 状态：透明、黏稠、流动的液体 物质：水、无机盐、糖类、氨基酸等 作用：活细胞新陈代谢的主要场所 （2）细胞器：分离细胞中各结构的方法——差速离心法 2、细胞器：线粒体和叶绿体 （1）植物叶片内叶绿体分布不均匀，栅栏组织中含有的叶绿体多，便于接受光照，进行光合作用 （2）线粒体在不同细胞中的数量是不同的，代谢旺盛的细胞，线粒体数量较多。 3、其他几种细胞器 （1）内质网的结构和功能 内质网是由一层膜形成的囊状、泡状和管状结构，并形成一个连续的网膜系统。根据内质网上是否附有核糖体，将内质网分为两类，即粗面内质网和光面内质网。粗面内质网多呈大的扁平膜泡，排列整齐。它是核糖体和内质网共同组成的复合结构，普遍存在于细胞中，特别是合成分泌蛋白的细胞。在结构上，粗面内质网与细胞核的外层膜相连。无核糖体附着的内质网称为光面内质网，通常为小的管状和小的泡状，广泛存在于各种类型的细胞中。光面内质网是脂质合成的重要场所。内质网可通过出芽方式，将合成的蛋白质或脂质转运到高尔基体。（2）高尔基体的结构和功能 高尔基体是普遍存在于真核细胞中的一种细胞器。在电镜下观察到，高尔基体是由一些排列较为整齐的扁平膜囊堆叠在一起，构成了高尔基体的立体结构。扁平膜囊多呈弓形，也有的呈半球形，均由光滑的膜围绕而成。在扁平膜囊外还包括一些小的膜泡。整个高尔基体结构分为形成面和成熟面，来自内质网的蛋白质和脂质从形成面逐渐向成熟面转运。 高尔基体与细胞的分泌功能有关，能够收集和排出内质网所合成的物质，它也是聚集某些酶原的场所，参与糖蛋白和黏多糖的合成。高尔基体还与溶酶体的形成有关，并参与细胞的胞吞和胞吐作用。
实验四细胞核的分离 [实验目的] 1. 为了研究细胞核及其组分。 2. 定量分析细胞核的生化组分及其它一些特殊成分。 [实验原理] 1956年由chauveau等人提出，用高密度介质来分离细胞核。由于细胞核的密度较大，在高密度介质中，在高速离心条件下沉降下来，从而达到与细胞质其它成分分开来的目的。chauveau 的方法是将动物肝脏直接在2.2mol/l蔗糖溶液中匀浆，然后高速离心40 000g 1小时，细胞核沉淀到底部，线粒体和完整细胞，包括红血球漂浮在液面，通过一步操作即可分离得到细胞核。其后又有不少研究者对此方法进行了改进，例如加进氯化钙、氯化镁、氯化钾等改变分离介质的渗透压；选择介质的ph以及不同的高密度蔗糖溶液离心方法等。这样减少了细胞核的脆性，防止聚集，维持恒定的ph，就能保持细胞核的精细结构。虽然这一方法比较简单，能得到较高纯度的细胞核，也已被广泛采用，但实验需要高速离心机，这在一般实验室不能进行，此方法要用高浓度的蔗糖，如果要分离大量的细胞核，也很不经济。 目前在一般实验室中更多的是用柠檬酸分离细胞核，在柠檬酸介质中分离细胞核可以显著地除去附着在细胞核膜上的细胞质成分。由于柠檬酸降低了溶液的ph值，这样可以减少细胞核的破碎率，并能分离得到较高分子质量的核酸，可能是由于核糖核酸（一种酸溶性蛋白）被柠檬酸除去，以及二价阳离子被柠檬酸螯合所致。 柠檬酸的浓度对分离细胞核的质量有较大影响。通常在较低的ph值时，可以得到较高的细胞核。但在过酸条件下，可能引起细胞核成分的改变和酶的失活。为了研究细胞内核酸，一般常在ph值为4，甚至在ph值为2.5时分离细胞核。如为了分离细胞核的酶，则需要较温和的条件，此时可以在ph值为6～6.2的极稀柠檬酸溶液中分离细胞核。
细胞质与细胞核的结构与功能 教学目的: 1,掌握各种细胞器的分布,结构,主要功能 2,掌握细胞核的主要结构与功能 3,掌握线粒体与叶绿体的功能与生物新陈代谢的相互关系 4,理解细胞质的结构与功能 教学重点: 1,线粒体与叶绿体的结构与功能 2,细胞核的结构与功能 教学难点: 1,线粒体与叶绿体结构与功能 2,染色体与染色质的关系 教学准备:多媒体课件 教学过程: 一,内容全解 (一). 细胞质的结构和功能 1, 细胞质 ：______态, ___________________场所 2.无膜结构的细胞器： 细胞质
(二)、真核细胞的细胞核的主要结构和功能1,细胞核的主要结构
(1) 核膜： 结构：由两层膜构成，核膜上有核孔，是细胞核和细胞质之间进行物质交换的孔道。核膜上有大量的多种的酶 主要功能：有利于各种化学反应的顺利进行 (2) 核仁： 物理特性：核仁的折光性较强，与细胞的其他结构很容易区分 形态：匀质的球形小体 生理变化：在细胞有丝分裂过程中，核仁周期性的消失和重建 (3) 染色体： 特点：容易被碱性染料染成深色 化学组成：主要由DNA和蛋白质组成 存在形式：丝状的染色质高度螺旋、缩短变粗圆柱状或杆状的染色体 染色质和染色体的关系：细胞中同一种物质在不同时期的两种形态 2、细胞核的主要功能：是遗传物质储存和复制的场所，是细胞遗传特性和细胞代谢活动 的控制中心 (三)小结 (1)具有双层膜的细胞器有_______________，有单层膜的细胞器有____________，无膜结构的细胞器有_________________。 (2) 含有少量遗传物质的细胞器有______________________。 (3) 与能量转换有关的细胞器有________________________。 (4) 代谢过程中有水生成的细胞器有_____________________。 (5) 动、植物细胞都有但功能不同的细胞器有__________________。 (6) 与动物细胞分裂有关的细胞器有________________________________。与植物细胞分裂有关的细胞器有_____________________________________。 二、能力提升技巧 从结构与功能的统一上理解细胞各结构间的关系，以各细胞器的特定功能分析各种类型细胞的特点： 1.细胞要完成一定的功能需要各细胞器的配合。 2.线粒体和叶绿体在能量转化过程中的重要性与其结构有密切关系。 3.内质网、高尔基体与扩大细胞内膜面积、为化学反应提供场所有关。 4.物质出入细胞膜的方式与分子本身的特点及细胞膜上的载体有密切关系，浓度差异并不是判断通过膜方式的唯一标准。 例1, 在适当的条件下，研磨绿色植物的叶肉细胞，放入离心管中离心(如图所示)分别得到上清液S1 、、S2 、、S3、S4和沉淀物P1、P2、P3、P4。根据P1、P2、P3、P4所含有的成分回答下列问题：
实验项目：细胞核的分离与鉴定 实验原理： 分离细胞核的可用方法有吸出法、原生质体破裂法、差速离心法排和排除法。差速离心法是根据细胞内各种细胞结构的比重和大小不同，因而在同一离心场内的沉降速率不同从而将细胞内的结构分级分离出来。本实验就采用差速离心法。 细胞核的鉴定，因为细胞核中主要含DNA，而DNA是碱性蛋白，可用甲苯胺蓝染液可使细胞核内碱性蛋白呈现出来。 实验器材：显微镜，普通离心机，离心管，滴管，玻璃漏斗，纱布，烧杯，解剖剪，镊子，玻璃匀浆器，载玻片/盖玻片，染色盘架，小白鼠肝脏。 实验试剂：甲苯胺蓝染液，蒸馏水，0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，生理盐水 实验步骤： （1）、用颈椎脱臼法处死小白鼠，迅速解开其腹腔取出肝脏，去出结缔组织，剪成小块，尽快置于盛有0.9%NaCl的烧杯中。反复洗涤尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。 （2）、将湿重为1g的肝组织放入烧杯中，用量筒取8ml预冷的0.25mol/L 蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，先加少量溶液于烧杯中，尽量剪碎肝组织后全部加入。 （3）、将剪碎的肝组织导入匀浆管中，使匀浆器下端侵入盛有冰块的器血
中，左手持，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3-5次。用3层纱布过滤于匀浆管中，然后制备一张涂片①，自然干燥。 （4）、将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机以2500r/min离心15min,弃去上清液。 （5）、用6mol 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液悬浮沉淀物，以2500r/min离心15min 弃去上清液，将残留液体用气管吹成悬液，滴一滴于干净的载盖玻片上，制成涂片②，自然干燥。 （6）在①·②上滴加甲苯胺蓝染液，染色5-7min，洗涤干燥后镜检。 ⑺记录观察结果 注意事项： （1）尽可能充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。 （2）将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防止浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。 （3）涂片制作过程中把握好涂片的力度，不可太厚。 （4）染色后的洗涤要注意时间，不可过长，避免将染色洗去，观察不到细胞核。 （5）开腹取出肝后，用生理盐水反复冲洗，避免血细胞对食盐的影响。 预期结果： 在低、高倍镜下，可以观察到经.0.1%碱性固绿染色的小白鼠肝细胞的细胞核体被染成绿色。说明这是碱性蛋白，即细胞核已游离出来。 涂片在高倍镜下可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色、圆形、中央有
细胞膜、细胞质和细胞核的结构和功能 【本章知识框架】 【疑难精讲】 1．细胞膜生理功能 细胞膜是具有许多重要功能的结构，这些功能可以归纳成两大方面：一是具有保护功能，包括保护、支持、识别、免疫；二是具有控制物质进出细胞的功能，包括吸收、分泌、排泄。我们常说的新陈代谢是指生物体与外界进行物质交换和能量交换，以及生物体内的物质和能量的转化。细胞膜控制物质进出细胞就是一种新陈代谢现象，所以，细胞膜的这一功能是其最重要的功能。 细胞膜控制物质进出的方式很多，有自由扩散、协助扩散、主动运输、内吞作用、外排作用等，其中常见的、最重要的方式是自由扩散和主动运输。 自由扩散这种物质运输方式是根据物理扩散作用的原理，从高浓度一侧到低浓度的一侧，按浓度梯度的高低进行，这种运输方式不需要消耗新陈代谢产生的能量。属于自由扩散方式运输的物质有氧气、二氧化碳、甘油、胆固醇、乙醇等物质。 主动运输是细胞运输物质的重要方式，被选择的物质从低浓度一侧转运到高浓度一侧，在转运的过程中，需要消耗细胞新陈代谢产生的能量，同时还需要载体蛋白的协助。载体蛋白是细胞膜上的一种蛋白质，它具有特异性，一种载体蛋白只能协助一种被选择的物质转运。在细胞的生命活动过程中，主动运输起到了重要作用，它使细胞能主动地从外界吸收被选择的物质，供生命活动需要用。例如，海水中碘的含
量比海带细胞中碘的含量要低得多，但海带细胞能不断从海水中吸收碘。同样，细胞也能利用主动运输把新陈代谢产物排出细胞外。总之，只有主动运输才能保证细胞生命活动的需要。摄取、积累物质以及不断排出代谢废物，从而保证细胞内和细胞器组成成分的动态稳定，保证生命活动的正常进行。 2．细胞器悬浮在细胞质基质中，它们具有特定的结构，有一定的生理功能 （1）线粒体是动、植物细胞中都有的一种细胞器，大都呈椭球形。线粒体由两层膜组成，内膜向内腔折叠形成嵴，这样就大大增大了内膜的面积。在嵴的四周是线粒体的基质，在基质、基粒和内膜上含有许多与有氧呼吸有关的酶。因此，线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，生命活动所需的能量，绝大部分是由线粒体产生供给的，如主动运输所需的能量就是由线粒体提供的，人们称线粒体为“动力工厂”。对于线粒体的化学成分，它的内、外膜的结构和细胞膜一样，所以线粒体的结构中有蛋白质分子和磷脂分子，还有酶及少量的DNA 分子。不同的细胞中线粒体的数量不同，在生命活动旺盛的细胞中，线粒体的数量多。例如，人的心肌细胞中线粒体数量比人体腹肌细胞的线粒体多，这是因为心肌细胞不断进行收缩和舒张运动，需消耗较多的能量，故线粒体的数量多。再如，肾小管以主动运输的方式重吸收原尿中的全部葡萄糖和部分无机盐，需线粒体提供较多的能量，所以肾小管管壁细胞中的线粒体比肾小囊囊壁细胞中的线粒体多得多。（2）叶绿体是植物细胞所特有的细胞器，但并不是所有的植物细胞中都有，如茎深层的细胞、植物不见光部位的细胞中就没有叶绿体。叶绿体在细胞内比线粒体稍大，呈球形或扁平椭圆形。叶绿体也具双层膜结构。叶绿体内有几个到几十个由囊状结构垛叠成的基粒，在基粒与基粒之间充满了基质。在基粒和基质中含有进行光合作用所需要的酶。从成分上看，组成叶绿体的化合物有蛋白质、磷脂、酶、色素和少量的DNA。叶绿体是绿色植物光合作用的场所，由于光合作用能产生有机物，所以叶绿体被比喻为“养料制造工厂”。在光合作用过程中，把光能转变成化学能储藏在有机物中，故叶绿体又被称为“能量转换站”。 3．染色质
蛋白质和酶的分离纯化及鉴定 蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。 目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。 一、质分离纯化的一般原则 1. 原料的选择 原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。 蛋白分布：体液、组织、细胞定位 2. 破碎方法： (1) 机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。 如：捣碎法、研磨、匀桨法 (2) 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。 如：反复冻融、渗透压、超声破碎 (3) 化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法. 如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween） (4) 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等 3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法 4. 先粗后细，分级分离 粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。 精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。 5. 避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等） 二、常用的蛋白质的分离纯化技术 可以根据各种蛋白质的结构、理化性质不同设计分离方法。 （一）根据蛋白质的溶解度不同进行分离
细胞概述、细胞膜和细胞壁 考点一细胞学说与原核细胞 1.连线细胞学说的建立过程(加试) 2.细胞学说的内容 (1)所有的生物都是由一个或多个细胞组成的。(2)细胞是所有生物的结构和功能的单位。(3)所有的细胞必定是由已存在的细胞产生的。 3.细胞的大小、数目和种类 (1)细胞的大小：最小的细胞是支原体，最大的细胞是鸵鸟蛋的卵黄。一般来说，细胞的大小以微米(单位)计。若细胞的体积越小，其表面积与体积之比相对越大，越有利于细胞与外界进行物质交换和信息交流。 (2)细胞的数目：多细胞生物体的长大，主要是由于细胞数目的增多。 (3)细胞的种类：根据有无由核膜包被的细胞核，将细胞分为真核细胞和原核细胞。 4.原核细胞 (1)下面为模式化的原核细胞，填出标号所指的结构名称。 (2)细菌和蓝细菌的拟核及相关细胞器 与真核细胞相比，细菌和蓝细菌等原核生物没有由核膜包被的细胞核，也没有染色体，但有一环状的DNA分子，位于无明显边界的区域，这个区域叫做拟核，只有核糖体一种细胞器。质膜是好氧细菌进行需氧呼吸的场所，质膜向内折叠成好几层形成光合膜，是蓝细菌中光合色素分布和光合作用进行的场所。 思考讨论 1.细胞学说揭示了怎样的问题？ 提示通过对动植物细胞的研究，揭示了细胞的统一性和生物体结构的统一性。
2.填写生物界的常见生物类群的划分 1.原核细胞与真核细胞的比较 2.原核生物和真核生物的判断技巧 (1)“菌”类的判断：凡“菌”字前面有“杆”“球”“弧”及“螺旋”等字的都是细菌，属于原核生物，而酵母菌、霉菌及食用菌等则为真核生物。 (2)“藻”类的判断：藻类的种类很多，常见的藻类有蓝藻即蓝细菌(如念珠藻、颤藻、螺旋藻、发菜等)，红藻(如紫菜、石花菜等)，褐藻(如海带、裙带菜等)，绿藻(如衣藻、水绵、小球藻、团藻等)。其中蓝藻为原核生物，其他藻类为真核生物。 题型一细胞学说 1.细胞学说与达尔文的进化论及孟德尔的遗传定律被认为是现代生物学的三大基石。下列有关细胞学说的叙述正确的是() A.细胞学说认为细胞分为原核细胞与真核细胞 B.施莱登和施万是细胞的发现者和命名者
医学细胞生物学设计型实验设计报告 姓名：李飘班级：K—10班学号：1020151004 评分 【实验项目】：动物细胞细胞核的分离与鉴定 【实验原理】：核体的制备核体是指含有少量细胞质并由质膜包裹的 细胞核。因为在实际中我们不可能100%的得到细胞核，因此,我们只能制备含有少量细胞质的核体，核体的制备方法主要有吸出法和原生质体破裂法等。在本实验中我们采用排除法来制备核体。排除法制备核体是通过细胞松弛素和高速离心的作用使细胞核排出，然后从离心管底部沉淀中收集获得核体。 细胞核的鉴定因为细胞核中主要含DNA，是碱性蛋白。因此将分离出的核体经三氯醋酸处理,抽提掉核酸后，用碱性固绿溶液染色，可以使细胞核内的碱性蛋白显示出来。 【实验步骤】： 1．细胞培养：将欲分离微核体和细胞质的动物接种于脱核塑料圆板上，使适宜的培养基中于37 ℃的条件下培养，使细胞固定在脱核塑料圆板上，脱核塑料圆板的直径应稍小于离心管的直径，使用前先用水洗干净再经过乙醇杀菌处理。 2．秋水仙碱处理：细胞培养一段时间以后，加入0.1ug/ml的秋水仙碱，处理细胞48～60h 滤纸，使细胞形成多个大小不同的核体。 3．细胞松弛素处理：在离心管内加入5ml预热至37 ℃的细胞松弛素B溶液将固定有动物细胞的圆板面朝下放入离心管内，固定圆板位置后，再加入10ml37 ℃的CB溶液。 4．离心：在1000～15000r/min核体从细胞排出。 5．收集核体：由于核体的贴附力弱，可以从离心管底部的沉淀中收集。 6．固定：将收集的核体涂于玻片上制成涂片，滴加15%乙醇于涂片上，固定5min，室温晾干。 7．三氯醋酸处理：将已固定的血涂片浸在90 ℃的三氯醋酸溶液中处理20min，细流水反复冲洗玻片上的三氯醋酸直至冲尽。用滤纸吸于玻片上多余水分晾干。 8．染色：将制作好的涂片放入0.1%碱性固绿染液中染色10～15min，细流水冲去多余染液，晾干，镜检。 【注意事项】： 1．在离心管内加入的5ml细胞核松弛素B溶液要预热到37 ℃，因为只有这样才接近动物的最佳体温37 ℃。 2．涂片在用三氯醋酸处理时，时间不宜过长或过短，过长会使核膜裂解，过短使抽提的核酸不够。 3．在染色时，时间一定要足够，否则染色不完全，得不到理想的实验结果。 4．因去掉胞质的核体贴附能力弱，因注意在固定、三氯醋酸处理、染色时、尽量避免胞核的脱落。 【预期结果】：经碱性固绿染色的核体涂片被染成绿色，说明这是碱性 蛋白，即细胞核。
酶的分离纯化 提取原则 a. 相似相溶。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。 酶的提取方法 酶的分离方法 1沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。 在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。 有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等 2离心分离离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 蛋白质分子在离心時，其分子量、分子密度、组成、形状等，均会影响其沉降速率，沉降係系数即用來描述此沉降性质；其单位为S (Svedberg unit)。 每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离心法，在密度梯度中作分離。 3、过滤与膜分离 过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。
病毒的分离与鉴定 （一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离… （一）病毒的分离 病毒分离的一般程序是： 检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状 鸡胚→病变或死亡 细胞培养→细胞病变 →鉴定病毒种型(血清学方法) 无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。 1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。 原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。 二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细
实验二细胞核与线粒体的分离与观察 一、实验目的 1．了解差速离心法分离细胞核与线粒体的原理。 2．掌握差速离心法分离动物与植物细胞的细胞核与线粒体的方法。 二、实验原理 细胞核（nucleus）是细胞中重要的细胞器，细胞的控制中心，在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，是遗传物质的主要存在部位。线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的能量转换的重要细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动需要。对细胞核和线粒体结构与功能的研究通常是在离体进行的，因而分离细胞核和线粒体是必须的。 差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心分离细胞核和线粒体。在确定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。 缓冲的蔗糖溶液是常用的悬浮介质，它属于等渗溶液，比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。线粒体的鉴定用詹纳斯绿B（Janus green B）活染法，对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中染料被还原成无色。 从植物细胞分离线粒体除了作线粒体功能测定外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因——线粒体DNA等目的。 分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差速离心。介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二价阳离子，Ca2+除去后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。牛血清白蛋白（BSA）能包在细胞外面，并作为
密度梯度离心后的结果低倍镜下的叶绿体 高倍镜下的叶绿体 实验二利用离心技术分离细胞核和叶绿体 一、实验目的： 1. 了解常用的离心法； 2. 理解差速离?心法和速率区带离心法分离样品组分的原理； 3. 以分离细胞核和叶绿体为例,掌握离心的操作方法。 二、实验原理： ? 离心技术：是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离的实验技术。?离心技术类型: 1.差速离心法 2.密度梯度离心法 ?等密度梯度离心： ①对象：常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。(此法一般应用于分离大小相 近，而密度差异较大的颗粒物质时) ②原理：当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中， 颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相 等的位置，在这里颗粒没有重量，不管离心多长时间，它们再也不移 动了，形成一系列密度区。从而使不同浮力密度的物质得到分离。③等密度梯度离心一般常用CsCl、蔗糖、甘油等做介质。 ?速度梯度离心： ①对象: 纯化分离叶绿体和细胞核(主要用来分离密度相近，大小不同的物质) ②原理:根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带,达到彼此分离的目的。 ②要求：1、样品溶液的密度必须小于悬浮介质层的最小密度； 2、样品颗粒的密度必须高于悬浮介质的最大密度； 3、离心时间十分重要 三、实验结果分析： 实验结果：
实验结果： 如图所示，叶绿体在混合液的梯度层中，形成一条带，聚集在密度梯度交界处；沉降系数较大的细胞组份则沉到离心管底部。 如图所示，叶绿体镜检为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒为基粒。 实验分析： 此实验最难的一点就是蔗糖溶液梯度的制备。要想制得清晰，平整的界面，需要将离心管放置于稳定的水平界面上；最重要的是，向下层溶液中加入上层溶液时，需要极小心、熟练地控制滴加的力度，并使枪头贴着离心管管壁，让液滴缓慢的流入，防止梯度层被破坏；除此之外，将配置好梯度层的的EP管放入离心机时要用试管架移动，而且离心时一定要两两平衡，之前要称量两个离心管使其相等。 四、思考问答： 本实验使用了哪两种离心方法，它们在分离样品时有何不同？ 答：使用了等密度梯度离心和速率区带离心。速率区带离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始离心速度较低，使较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍悬浮在上清液中。收集沉淀，再改用较高的离心速度离心悬浮液，使较小的颗粒沉降，多次重复此步骤，从而达到分离不同大小颗粒的目的；等密度梯度离心是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。此种分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。
细胞核与线粒体的分级分离 一、原理 细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不 同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。 分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括 组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的 主要手段。 匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即 0.25mol／L 蔗糖一 0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。 分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将 浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大 小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯 的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。 分析 分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。 二、细胞核的分离提取 (一)操作步骤 1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有 0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。 2． 将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙 溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。 3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂 直插入管中， 上下转动研磨3～5次， 用3层纱布过滤匀浆液于离心管中， 然后制备一张涂片①， 做好标记， 自然干燥。 4．将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15分钟；(1)缓缓取上清液，移入 高速离心管中， 保存于有冰块的烧杯中， 待分离线粒体用； (2)同时涂一张上清液片②做好标记， 自然干燥； (3)余下的沉淀物进行下一步骤。 5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟弃上清，将残 留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。 6．将①、②、③涂片用l％甲苯胺兰染色后盖片即可观察。 (二)结果 分别于高倍镜下观察三张涂片，描述镜下所见。 三、高速离心分离提取线粒体 (一)操作步骤 1．将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以 17000rpm 离心 20 分钟，弃上 清，留取沉淀物。 2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化钙液lml，用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20分 钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液混匀成 悬液(可用牙签)。 3．取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④、⑤涂片)，各滴一滴0.02％詹纳斯 绿B染液盖上盖片染20分钟。 (二)结果 油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。