介绍
核蛋白抽提试剂可以从哺乳动物培养的细胞或组织中逐步分离和制备细胞质和细胞核提取物。不变性的活性蛋白在不到两小时内纯化。在细胞颗粒中加入前两种试剂会导致细胞膜破裂和细胞质内容的释放。用离心法从细胞质提取液中提取完整细胞核后，用第三试剂从细胞核中提取蛋白质。用这种产品提取的核和细胞质组分提取物一般污染率不到10%，这对于大多数涉及核提取物的实验来说是足够的纯度
核抽提物比起全细胞裂解物通常更适合于进行基因调控研究。全细胞裂解液中的细胞成分对核蛋白的相互作用和稳定性有不利影响，核蛋白更集中于核提取物，而非全细胞裂解物。核提取物/试剂与多种下游应用兼容（包括Western blotting，BCA蛋白定量分析（产品编号23225），凝胶移位（产品编号20148），报告基因和酶活性的测定）
重要产品信息
●此试剂盒适用于新鲜（未冷冻）的细胞或组织样品。使用蛋白酶抑制剂维持提取物的完
整性和功能。使用前，将蛋白酶抑制剂加入CRE I和NER浓缩物中以减少试剂稀释（浓缩蛋白酶抑制剂eg.100x）。不需要添加蛋白酶抑制剂到CER II。
●如果在随后应用中需要大量的核提取物或出现问题，透析前用核提取物清除多余的盐。
试剂盒中的洗涤剂是不可透析的，但它主要是在细胞质中。使用Thermo Scientific?Slide-A-Lyzer?小型透析装置进行透析。另外，无回收蛋白或条块分割的不利影响下，NER 用于提取液的体积可以减小2倍可以得到更集中的核提取物。
●在4°C条件下执行所有离心步骤，保持细胞样本和提取物在冰上。
额外所需材料
●蛋白酶抑制剂
●磷酸盐缓冲盐水(PBS)
细胞培养制备
●贴壁细胞，用胰蛋白酶-EDTA消化，然后在500g离心5分钟。对于悬浮细胞，通过离
心在500G 5分钟收获。
●用PBS重悬细胞颗粒冲洗细胞
●1-10×106细胞转移至1.5ml离心管，并在500G 离心2-3分钟
●使用吸管小心地去除和丢弃上清液，使细胞颗粒尽可能干燥。
●在细胞中加入冷的CRE I（表1）。使用表1所示的试剂体积进行细胞质和核蛋白提取
不同细胞体积对应的试剂体积
红细胞压积(μL) CER I (μL) CER II (μL) NER (μL)
10 100 5.5 50
20 200 11 100
50 500 27.5 250
100 1000 55 500
*Hela细胞2×106细胞相当于20μL红细胞体积.
组织制备
●把20-100mg组织剪成小块并在放在微量离心管
●用PBS清洗组织。5分钟，500g离心组织
●使用吸管，小心地去除和丢弃上清液，使细胞颗粒尽可能干燥。
●利用Dounce匀浆器或组织研磨机使组织在适当体积的CRE I中研磨（表2）进行细胞
质和核蛋白提取，使用表2所示的试剂体积。
不同组织量对应的试剂体积.
组织质量(mg) CER I (μL) CER II (μL) NER (μL)
20 200 11 100
40 400 22 200
80 800 44 400
100 1000 55 500
不同类型的组织可能需要更多或更少的试剂
最佳提取细胞质和核蛋白的重量。
细胞质和核蛋白提取
根据细胞体积（表1和表2）确定试剂比例。保持CER CER II：NER试剂比在200:11:100μL。
1.设置最高涡流速度震荡试管15秒，使细胞颗粒完全悬浮。在冰上培养管10分钟。
2.在试管中加入冰的CER II
3.设置最高涡流速度震荡试管5秒，在冰上培养管1分钟
4.设置高涡流速度震荡试管5秒，最大转速离心5min（~16000g）
5.立即将上清液（细胞质提取物）转移到干净的预冷管中。把管子放在冰上直到使用或储
存（见步骤10）。
6.将含有核的第4步中产生的不溶性成分（颗粒）悬浮在冰的NER中。
7.设置最高涡流速度震荡试管15秒。将样品放在冰上，每10分钟震荡15秒，，总共40
分钟
8.离心机在最大速度（~16000g）离心10分钟
9.立即将上清液（核提取物）转移到干净的预冷管中。把管子放在冰上直到使用或储存
10.储存提取物- 80°C，直到使用。
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 （二）蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化
实验3 细胞核的分离与核酸的鉴定 【实验目的】 1.掌握细胞核及细胞质的分离和纯化的一般原理和操作方法。 2.了解DNA在细胞中的分布和核酸鉴定的原理。 3.进一步掌握离心机的工作原理及正确使用方法。 【实验原理】 1.DNA主要存在于细胞核， RNA主要存在于细胞质。 2.细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各组分分级分离出来。 肝组织破碎后，柠檬酸能抑制脱氧核糖核酸酶的活性，维持染色质的正常结构和活性。如将此种细胞核保存在等渗（0.25M）蔗糖溶液中（内含微量钙离子，防止核聚集和脆性），可以比较好地保存其完整的正常结构。 在此条件下离心分离得到的是细胞核的粗制品，如离心时通过0.88M蔗糖的高渗溶液。适当调整离心力，可得到纯化的细胞核沉淀。
3.脱氧核糖核酸的鉴定： 【操作步骤】 1、0.5g肝组织＋5ml的1.5%柠檬酸溶液，研磨 2、肝匀浆，倾入离心管，离心：3000r/min；15′ 3、离心结束后，上清液移入另外一个试管中备用（此为细胞质液） 4、沉淀中加入1ml的0.25mol/L 蔗糖-柠檬酸溶液，玻棒搅匀后， 为核悬液。 5、另外取离心管一只，加9ml 的0.88mol/L蔗糖-柠檬酸液。用滴 管吸取核悬液。沿管壁缓慢铺于液面上。 6、离心：2000r/min；10′.上层液，弃去；沉淀为初步纯化的细 胞核。 7、核洗液5ml洗涤沉淀，离心：2000r/min，10 ′白色沉淀为纯
化的细胞核。 8、加10ml 0.02mol/L NaOH溶解细胞核，即为待测的核液。 9、脱氧核糖核酸的鉴定 （1）水解：取离心管二支，编号，按下表操作 混合各管 沸水浴(10’) 离心 3000r/min;5′ 上清液 (2)鉴定：取试管三支，编号，按下表操作: 混合各管 沸水浴(15’) 冷却 比较各管颜色(595nm) 编号 1 2 细胞质（ml） 2.0 - 核液（ml）- 2.0 1M过氯酸(ml） 2.0 2.0
蛋白质的分离纯化和表征 第一节蛋白质的酸碱性质 各个解离基团的pK 值与游离氨基酸的不完全相同。等电点要用等电聚焦等方法测定。 第二节蛋白质分子的大小与形状
一、根据化学组成测定最低相对分子质量 假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式算出最低相对分子质量。 若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。 例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr 131）1.65%，含异亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。 解：按照Leu 的百分含量计算，最低Mr X1： X1=(100′ 131)/1.65=7939.4。 按照Ile 的百分含量计算最低Mr X2： X2=(100′ 131)/2.48=5282.3。 由于X1 和X2 数字差异较大，提示这种酶含Leu 和Ile 不止1 个，为了估算Leu 和Ile 的个数，首先计算： X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5。 这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2 个Leu，3 个Ile，其最低相对分子质量为： 7939.4 ′2 =15878.8或5282.3×3=15846.9。 二、渗透压法测定相对分子质量 三、沉降分析法测定相对分子质量
基本原理： （一）离心力(centrifugal force，Fc) 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义： F=m·a=m·ω2 r a—粒子旋转的加速度，m—沉降粒子的有效质量，ω—粒子旋转的角速度，r—粒子的旋转半径(cm)。 （二）相对离心力(relative centrifugal force，RCF) 由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF 值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。 RCF 就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。
第6讲细胞质与细胞核测试题 1．（2008广东理科基础）细胞内各细胞具有一定的结构和功能，对图8中结构①的叙述，正确的是A．在不同植物细胞内其数量基本相同 B．是植物合成蛋白质的主要细胞器 C．是植物进行光合作用产生有机物的细胞器 D．含有DNA和RNA，是决定植物遗传的基本单位 2、（06江苏）下列有关细胞结构和功能的叙述，错误 ．．的是 A、水稻主动吸收Si需要根细胞膜上的载体协助 B、甲状腺细胞能够接受促甲状腺激素的调节与其细胞膜上的糖蛋 白有关 C、核糖体是细胞内蛋白质的“装配机器”，由蛋白质和mRNA组 成 D、核孔是细胞核和细胞质之间进行物质交换的通道 3、（06江苏）（多选）右图为某高等植物叶肉细胞结构模式图，相关叙述正确的是 A、图中能产生ATP的结构有1、2、5 B、1中产生的一分子C02扩散出来进入2中被利用，穿过的磷脂双分子层的 层数为4层 C、2与4中都含有叶绿素和类胡萝卜素等色素 D、3是遗传物质储存和复制的主要场所，是细胞遗传特性和 细胞代谢活动的控制中心 4、（06广东）不．在内质网上合成或加工的生物分子是 A、抗体 B、胆固醇 C、维生素D D、核酸 5、下图表示真核生物细胞的结构与功能，下列与此相关的叙述，不正确的一项是 A、图中物质A表示蛋白质，物质B表示磷脂 B、E的结构特点是具有一定的流动性 C、图中①的场所是叶绿体，②的场所是线粒体 D、完成③、④、⑤、⑥功能的结构均具有单层膜结构 6. （2008高考广东生物）用高倍显微镜观察黑藻叶绿体时，可见叶绿体 A.具有双层膜 B.呈绿色带状 C.内部有许多基粒 D.呈绿色椭球形 7．（2008上海高考生物巻）（8分）下面是两类细胞的亚显微结构模式图，请据图回答：
蛋白质纯化的方法选择 随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2．1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2．2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2．3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活．应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同，与树脂的结合力也不同，随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化，蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值，因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制，所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比，离子交换特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较便宜。值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。
细胞生物学设计性实验：细胞核的分离鉴定 医学细胞生物学设计型实验设计报告 班级10级k-7班 评分 实验项目： 细胞核的分离与鉴定 实验原理：1、细胞内各种结构的比重和大小不同，在同一离心场内其沉降速度也不同。所以，用差速离心法可将细胞内各种细胞器及组分分级分离出来。差速离心法也是用来研究亚细胞成分的化学组成，理化特性及其功能的主要手段。 2、分离细胞核最常用的方法是将组织制成匀浆，在特定的条下进行离心分离，然后分析鉴定。 3、匀浆是指在低温条下，将组织放入匀浆器，加入等渗匀浆介质进行研磨，破碎细胞，使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆液。 实验步骤：1、处死：断头处死小白鼠，手提尾部使其学业尽量流出。 2、取材：迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤，称取湿重约为1g的肝组织放在烧杯中。 3、匀浆：加油8ml预冷的0.25mol/L蔗糖0.003mol/L绿化高永夜于烧杯中，尽量剪碎肝组织，将剪碎的刚组织倒入玻璃匀
浆器，是匀浆器下端侵入盛有冰块的器皿（如冰盘）。左手握持匀浆器，右手将匀浆捣杆垂直插入管中匀浆，直至看不到明显的组织块。 4、过滤： 用8层纱布（先用少量生理盐水或蔗糖液润湿纱布）过滤匀浆液于离心管中。 5、离心：在天平上平衡每对离心管，2500r/min离心 15min，取上清液于另一离心管中。 6、涂片：取上清液制一张涂片（涂片1）。将原离心管中剩余上清液吹打成沉淀成悬液，另制一张涂片（涂片2），自然干燥。 7、染色：分别在涂片1和2上低价甲苯胺蓝染液 ，染色5到7分钟（即滴染）。 8、洗涤：冲去染液，晾干。 9、镜检：结合实验结果的描述，镜下观察分析。 注意事项：1.操作规范，防止试剂污染。 2.细胞悬液的涂片制作要轻柔。 3.使用离心机要注意平衡，转速从低到高。 预期结果：低倍镜下找到标本，再换高倍镜，可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色，圆形，中央有2到4个甚至更多个深蓝色的核仁。 实验用品：材料：小白鼠肝脏。
蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
致力于打造高品质文档研究凋亡素参与正常细胞核蛋白表达差异1．引言凋亡素能够特异引起肿瘤细胞与转化细胞的凋亡，这种细胞凋亡是非 P53 依赖的，而不能够导致正常细胞的凋亡，这与凋亡素的核定位有关。凋亡素 是一种在细胞质与细胞核之间穿梭的蛋白。无论是在肿瘤细胞还是正常细胞内，凋亡素都能够通过核定位信号进入细胞核。然而在肿瘤细胞中，凋亡素被修饰，导致出核信号的失活，定位在细胞核内，引起肿瘤细胞的凋亡；而在正常细胞中，凋亡素又通过出核信号出核，定位在细胞浆内，不引起正常细胞的凋亡。 综上所述，肿瘤细胞与正常细胞之间的蛋白表达一定存在着某种差异，使得凋亡素在肿瘤细胞中被特异地修饰。本实验通过蛋白质组学的方法来寻找肿瘤细胞与正常细胞核内的蛋白表达差异，以期望能够进一步探讨凋亡素诱导肿瘤细胞特异凋亡的机制。 2．材料和方法 2.2 pEGFP-C1-apoptin 载体的提取按照Promega 公司PureyieldTM Plasmid Midiprep System 提取试剂盒进行质粒的提取。 2.7 细胞核蛋白的双向电泳将提好的细胞核蛋白样品分装，送公司进行双向电泳。 3．实验及结果分析 3.2 双向电泳结果我们通过双向电泳进行初步分析，发现HepG2 与L02 细胞核蛋白表达存在差异。 4．讨论凋亡素能够特异引起肿瘤细胞与转化细胞的凋亡，这种细胞凋亡是非P53 依赖的，而不能够导致正常细胞的凋亡。同时我们观察到，凋亡素在细胞内的定位与其凋亡功能密切相关。将凋亡素的基因转染进细胞，24 小时后，我们发现凋亡素无论在肿瘤细胞还是正常细胞，都定位在细胞核内，都不引起细胞的凋亡。48 小时后，凋亡素在肿瘤细胞核内聚集，行使凋亡功能，而凋亡素却从正常细胞的核内出来，在胞质内聚集，不能引起正常细胞的凋亡。于是我们推测，凋亡素行使凋亡功能与其在肿瘤细胞核内受到某种修饰，而停留在细胞核内有关。而这种修饰在正常细胞的核内是没有的，因此肿瘤细胞与正常细胞之间一定存在着某种蛋白表达的差异。 因此，我们可以推测在肿瘤细胞内存在着特异的磷酸激酶，或者其他某种能使凋亡素特异修饰的蛋白。 目前高通量的蛋白质组学研究方法已经成为了有力的手段，蛋白质质谱鉴定技术和生物信息学迅猛发展。高分辨率、高敏感性和高流通性的分离和分离后鉴定技术，结合准确、全面的数据库技术，使蛋白质组技术用于生物研究卓有成效。我们通过蛋白质组学的方法找到了肿瘤细胞HepG2 细胞和正常细胞L02 细胞核蛋白表达的差异，但是由于时间关系，没有对差异点进行质谱分析，鉴定，这是我们下一步的工作，以期望能够找到这个特异的蛋白，来完善凋亡素的机制研究。
蛋白质分离与纯化教学设计 一、教学背景分析 【教材分析】 “蛋白质的分离与纯化”实验是《高中生物》选修1生物技术实践 5.3血红蛋白的提取与分离中的容。本节课的主要容包括蛋白质的提取、分离纯化等基本知识，主要要求学生掌握凝胶电泳的实验原理以及操作方法。“血红蛋白分离与纯化”实验不仅是学习血红蛋白的提取、分离纯化方法，而且也是进一步掌握蛋白质的组成、结构和功能的基础。 【学情分析】 到目前为止，学生已经学习了蛋白质的相关知识，对蛋白质有了一定的了解，“蛋白质的分离与纯化”实验目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取和纯化生物大分子的基本原理、过程和方法，虽然操作难度较大，但原理清晰，动手机会较多，学习兴趣很高。学生有必修“生命活动的主要承担者——蛋白质”的基础，在一定程度上掌握了蛋白质的组成、结构和功能等基础知识，学生在进行实验前还是能大概了解影响蛋白质分离纯化的因素的，再者经过老师的指导，实验能取得良好的结果的。 二、教学目标 【知识目标】 1.了解从血液中提取蛋白质的原理与方法。 2.说出凝胶电泳的基本原理与方法。 【能力目标】 运用凝胶电泳对蛋白质进行分离纯化。 【情感态度与价值观目标】 1.培养学生科学实验的观点。 2.初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神。 三、教学重难点
【教学重点】 从血液中提取蛋白质；凝胶电泳分离纯化蛋白质。 【教学难点】 样品预处理，色谱柱的装柱，纯化分离操作。 四、实验实施准备 【教师准备】 1.分组。学生按学科能力的强中弱平均分组，各组尽量平衡，各组自行分工，并由实验员统一安排实验过程。 2.实验材料：血液 仪器：试管、胶头滴管、烧杯、玻璃棒、离心机、研磨器、透析袋、电泳仪等。 试剂：20mmol/L磷酸缓冲液（pH为8．6）、蒸馏水、聚丙烯酸铵、生理盐水、5％醋酸水溶液等。 【学生准备】 1.预习实验“蛋白质分离纯化”，了解蛋白质的相关信息。 2.进行分组。 五、教学方法 【教法】分析评价法、任务驱动法、直观演示法 【学法】自主学习法、合作交流法 六、教学媒体 黑板、多媒体 七、课时安排 两个课时（80min） 一个课时用来讲述理论部分知识：样品处理与色谱柱分离纯化蛋白质的原理与方法； 另一课时用来进行实验。
提取细胞核蛋白的步骤： 1.向培养细胞的平皿中加入少量（保证在1.5ml TUBE内能放下）冷PBS(或1*D-Hanks) 2.，用细胞刮刀尽可能多的刮下细胞，收集到1.5ml的离心管中。 在预冷的离心机中，４度，1000rcf，1－3分钟，沉降细胞。 为尽可能多的获得细胞，可将一次离心后的上清再重复刮细胞一次； 2. 将细胞重悬于cell lysis buffer中（加入体积106细胞/200uL，体积估计方法还是没确 定,should be sufficient; 一般就是一个10cm平皿加1ml cell lysis buffer）,添加蛋白酶抑 制剂；先破细胞膜，得到细胞核（没有用B DOUNCE）； 冰上放置（不震荡，可偶尔用枪轻吹）30分钟至1小时（此时核膜没有破，有核染色为证），充分裂解； cell lysis buffer： 5mM PIPES pH 8.0 85mM KCL, 0.5% NP40, 1% protein inhibitor; 3. ４度，1000rcf，20分钟，上清为胞质蛋白（蛋白浓度比较低，如需要检测，建议先 浓缩一下），沉淀为细胞核； 此时可以将沉淀冻存于－70℃； 4. 将沉淀重悬于100-200 ul nucleai lysis buffer（体积视目的蛋白表达丰度而定，一般 50-100ul）中，添加蛋白酶抑制剂，冰上放置30分钟至1小时（每5分钟震荡一次），充分裂解；可以观察到沉淀慢慢消失，溶液变澄清； nucleai lysis buffer：成分同SDS lysis buffer； 50mM Tris-Cl pH 8.1, 10mM EDTA, 1% SDS, 1% protein inhibitor; 5. 四度，最大转速离心，10分钟以上（尽可能沉淀完全），上清即为细胞核蛋白； （此文档部分内容来源于网络，如有侵权请告知删除，文档可自行编辑修改内容， 供参考，感谢您的配合和支持） 编辑版word
实验四细胞核的分离 [实验目的] 1. 为了研究细胞核及其组分。 2. 定量分析细胞核的生化组分及其它一些特殊成分。 [实验原理] 1956年由chauveau等人提出，用高密度介质来分离细胞核。由于细胞核的密度较大，在高密度介质中，在高速离心条件下沉降下来，从而达到与细胞质其它成分分开来的目的。chauveau 的方法是将动物肝脏直接在2.2mol/l蔗糖溶液中匀浆，然后高速离心40 000g 1小时，细胞核沉淀到底部，线粒体和完整细胞，包括红血球漂浮在液面，通过一步操作即可分离得到细胞核。其后又有不少研究者对此方法进行了改进，例如加进氯化钙、氯化镁、氯化钾等改变分离介质的渗透压；选择介质的ph以及不同的高密度蔗糖溶液离心方法等。这样减少了细胞核的脆性，防止聚集，维持恒定的ph，就能保持细胞核的精细结构。虽然这一方法比较简单，能得到较高纯度的细胞核，也已被广泛采用，但实验需要高速离心机，这在一般实验室不能进行，此方法要用高浓度的蔗糖，如果要分离大量的细胞核，也很不经济。 目前在一般实验室中更多的是用柠檬酸分离细胞核，在柠檬酸介质中分离细胞核可以显著地除去附着在细胞核膜上的细胞质成分。由于柠檬酸降低了溶液的ph值，这样可以减少细胞核的破碎率，并能分离得到较高分子质量的核酸，可能是由于核糖核酸（一种酸溶性蛋白）被柠檬酸除去，以及二价阳离子被柠檬酸螯合所致。 柠檬酸的浓度对分离细胞核的质量有较大影响。通常在较低的ph值时，可以得到较高的细胞核。但在过酸条件下，可能引起细胞核成分的改变和酶的失活。为了研究细胞内核酸，一般常在ph值为4，甚至在ph值为2.5时分离细胞核。如为了分离细胞核的酶，则需要较温和的条件，此时可以在ph值为6～6.2的极稀柠檬酸溶液中分离细胞核。
实验项目：细胞核的分离与鉴定 实验原理： 分离细胞核的可用方法有吸出法、原生质体破裂法、差速离心法排和排除法。差速离心法是根据细胞内各种细胞结构的比重和大小不同，因而在同一离心场内的沉降速率不同从而将细胞内的结构分级分离出来。本实验就采用差速离心法。 细胞核的鉴定，因为细胞核中主要含DNA，而DNA是碱性蛋白，可用甲苯胺蓝染液可使细胞核内碱性蛋白呈现出来。 实验器材：显微镜，普通离心机，离心管，滴管，玻璃漏斗，纱布，烧杯，解剖剪，镊子，玻璃匀浆器，载玻片/盖玻片，染色盘架，小白鼠肝脏。 实验试剂：甲苯胺蓝染液，蒸馏水，0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，生理盐水 实验步骤： （1）、用颈椎脱臼法处死小白鼠，迅速解开其腹腔取出肝脏，去出结缔组织，剪成小块，尽快置于盛有0.9%NaCl的烧杯中。反复洗涤尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。 （2）、将湿重为1g的肝组织放入烧杯中，用量筒取8ml预冷的0.25mol/L 蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，先加少量溶液于烧杯中，尽量剪碎肝组织后全部加入。 （3）、将剪碎的肝组织导入匀浆管中，使匀浆器下端侵入盛有冰块的器血
中，左手持，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3-5次。用3层纱布过滤于匀浆管中，然后制备一张涂片①，自然干燥。 （4）、将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机以2500r/min离心15min,弃去上清液。 （5）、用6mol 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液悬浮沉淀物，以2500r/min离心15min 弃去上清液，将残留液体用气管吹成悬液，滴一滴于干净的载盖玻片上，制成涂片②，自然干燥。 （6）在①·②上滴加甲苯胺蓝染液，染色5-7min，洗涤干燥后镜检。 ⑺记录观察结果 注意事项： （1）尽可能充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。 （2）将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防止浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。 （3）涂片制作过程中把握好涂片的力度，不可太厚。 （4）染色后的洗涤要注意时间，不可过长，避免将染色洗去，观察不到细胞核。 （5）开腹取出肝后，用生理盐水反复冲洗，避免血细胞对食盐的影响。 预期结果： 在低、高倍镜下，可以观察到经.0.1%碱性固绿染色的小白鼠肝细胞的细胞核体被染成绿色。说明这是碱性蛋白，即细胞核已游离出来。 涂片在高倍镜下可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色、圆形、中央有
（二）利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分
蛋白质的分离纯化方法 根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有 用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
医学细胞生物学设计型实验设计报告 姓名：李飘班级：K—10班学号：1020151004 评分 【实验项目】：动物细胞细胞核的分离与鉴定 【实验原理】：核体的制备核体是指含有少量细胞质并由质膜包裹的 细胞核。因为在实际中我们不可能100%的得到细胞核，因此,我们只能制备含有少量细胞质的核体，核体的制备方法主要有吸出法和原生质体破裂法等。在本实验中我们采用排除法来制备核体。排除法制备核体是通过细胞松弛素和高速离心的作用使细胞核排出，然后从离心管底部沉淀中收集获得核体。 细胞核的鉴定因为细胞核中主要含DNA，是碱性蛋白。因此将分离出的核体经三氯醋酸处理,抽提掉核酸后，用碱性固绿溶液染色，可以使细胞核内的碱性蛋白显示出来。 【实验步骤】： 1．细胞培养：将欲分离微核体和细胞质的动物接种于脱核塑料圆板上，使适宜的培养基中于37 ℃的条件下培养，使细胞固定在脱核塑料圆板上，脱核塑料圆板的直径应稍小于离心管的直径，使用前先用水洗干净再经过乙醇杀菌处理。 2．秋水仙碱处理：细胞培养一段时间以后，加入0.1ug/ml的秋水仙碱，处理细胞48～60h 滤纸，使细胞形成多个大小不同的核体。 3．细胞松弛素处理：在离心管内加入5ml预热至37 ℃的细胞松弛素B溶液将固定有动物细胞的圆板面朝下放入离心管内，固定圆板位置后，再加入10ml37 ℃的CB溶液。 4．离心：在1000～15000r/min核体从细胞排出。 5．收集核体：由于核体的贴附力弱，可以从离心管底部的沉淀中收集。 6．固定：将收集的核体涂于玻片上制成涂片，滴加15%乙醇于涂片上，固定5min，室温晾干。 7．三氯醋酸处理：将已固定的血涂片浸在90 ℃的三氯醋酸溶液中处理20min，细流水反复冲洗玻片上的三氯醋酸直至冲尽。用滤纸吸于玻片上多余水分晾干。 8．染色：将制作好的涂片放入0.1%碱性固绿染液中染色10～15min，细流水冲去多余染液，晾干，镜检。 【注意事项】： 1．在离心管内加入的5ml细胞核松弛素B溶液要预热到37 ℃，因为只有这样才接近动物的最佳体温37 ℃。 2．涂片在用三氯醋酸处理时，时间不宜过长或过短，过长会使核膜裂解，过短使抽提的核酸不够。 3．在染色时，时间一定要足够，否则染色不完全，得不到理想的实验结果。 4．因去掉胞质的核体贴附能力弱，因注意在固定、三氯醋酸处理、染色时、尽量避免胞核的脱落。 【预期结果】：经碱性固绿染色的核体涂片被染成绿色，说明这是碱性 蛋白，即细胞核。
胞浆蛋白—核蛋白抽提试剂盒 产品编号产品名称包装 SINP001 胞浆－核蛋白抽提试剂盒50× 产品简介：细胞核和细胞浆目前成为研究细胞组分的两个热点，获得高浓度的细胞核蛋白和细胞浆蛋白成为得到好的研究结果的重要实验过程。本试剂盒主要原理是在低渗透压条 件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，离心得到细胞核沉 淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。本试剂盒是本公司 非放射性EMSA试剂盒（cat; SIDET001, SIDET003, SIDET004,）实验成功的重要部 分，经BCA测定24cm2贴壁细胞(或50ml规格培养瓶养的悬浮细胞)抽提物，核蛋白 浓度约为 2.5ug/ul或更高。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA， footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。本试剂盒可足够您进行 50次抽提操作！ 包装清单： 试剂包装总量 5X Buffer A 1瓶35ml/瓶 2X Buffer B1支 1.5ml/支 Solution I（溶液I）1支 1.75ml/支 Solution II（溶液II）1支 1.75ml/支 Solution III（溶液III）1支 1.5ml/支 PMSF Solution 1支0.85ml/支 User Manual (说明书) 1份1份/Kit 保存温度： 4℃保存。 Ⅰ.准备抽提试剂：按照下列方法制备胞浆－核蛋白抽提液： 1.制备3ml胞浆蛋白裂解液I ： 试剂体积 5X Buffer A0.6ml Solution I（溶液I）30ul Solution II（溶液II）30ul PMSF Solution 15ul dd-H2O 2.325ml 总体积 3.0ml 注：PMSF Solution须在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入。
病毒的分离与鉴定 （一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离… （一）病毒的分离 病毒分离的一般程序是： 检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状 鸡胚→病变或死亡 细胞培养→细胞病变 →鉴定病毒种型(血清学方法) 无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。 1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。 原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。 二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细
分离纯化蛋白质的方法及原理 （一）利用分子大小 1、透析：原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。 方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行 涉及的问题： 如何加快透析过程 （1）加大浓度差，及时更换透析液 （2）利用磁力搅拌器 常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成 2、超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上 3、凝胶过滤层析：原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。 结果：大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来 （二）利用溶解度差别 4、等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析
（三）根据电荷不同 6、SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。 7、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。 氨基酸在树脂上结合的牢固程度取决于氨基酸与树脂之间的亲和力，决定亲和力的因素有：（1）主要是静电吸引力（2）氨基酸侧链同树脂之间的疏水作用氨基酸与阳离子交换树脂间的静电引力大小次序依次是： 碱性氨基酸R2+>中性氨基酸R+>酸性氨基酸R0。 因此洗脱顺序应该是： 酸性氨基酸中性氨基酸碱性氨基酸 为使氨基酸从树脂上洗脱下来采用逐步提高pH和盐浓度的方法