乳酸链球菌素的生产及研究现状
吴江乳酸链球菌素(Nisin) 是从乳酸链球菌发酵产物中提制的一种多肽抗菌素类物质,是一种世界公认的安全的天然生物性食品防腐剂和抗菌剂。1944 年Mattick 和Hirsch 发现血清学N 群中的一些乳酸链球菌能产生蛋白类抑菌物质,命名为N-inhibitory Substance 即N 群抑菌物质,简称为Nisin。1953 年由英国的阿普林和巴雷特公司首次以商品的形式出售了这种新的防腐剂———乳酸链球菌素。1969 年,FAO/ WHO 食品添加剂联合专家委员会批准Nisin作为一种生物型防腐剂应用于食品工业。1988 年美国食品和药物管理局(FDA) 也正式批准将Nisin应用于食品中。我国在GB2760 —86 中批准Nisin可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品、肉制品中。迄今为止,Nisin 已在全世界约60 多个国家和地区被用作防腐剂。
1.乳酸链球菌素的生产
1.1 菌种的筛选和改良
乳酸链球菌广泛存在于天然牛奶及乳酪和酸奶中, 从牛奶场取生牛奶样品, 加以稀释, 然后在含有检测菌及吐温20 为扩散剂的固体检测培养基表面进行涂布, 在30 ℃培养24h 后, 测量抑菌圈直径, 挑取抑菌圈直径与菌落直径比较大
的菌株再进行平板划线分离, 选取单个菌落接至试管斜面保存, 然后, 逐一测定菌株的Nisin 效价。这样便筛选出产Nisin 的乳酸链球菌菌株。若想获取高产菌株, 可对原始菌株再进行诱变处理。
1.2 培养基和培养条件
不同的乳酸链球菌株,其Nisin 的效价也有显著的变化,所适应的发酵条件也各有所不同,国内外这方面的研究较多,综合来看,在C 源上,最适合的主要为蔗糖和可溶性淀粉,其添加量随菌株的不同也各有所不同。最适N 源,主要为酵母膏,添加量1 %左右,另外酵母膏及吐温80对细胞的生长及Nisin 的产生均有利。最适P 源普遍认为KH2PO4最合适,添加量一般≤5 % ,使用KH2PO4主要有两方面优点:即可创造良好的pH 环境;可提高Nisin 的产生。有研究表明,Nisin 的高效价在很大程度上也依赖于S 源的存在,添加无机盐类如硫酸镁、硫代硫酸盐或含硫氨基酸如蛋氨酸、半胱氨酸等,均有较好效果。在近几年所有的报道中,最适发酵温度均为30 ℃左右,最适pH为5.0～5.5或6.5左右。
1.3 分离纯化
目前,采用的方法一般为将NaCl 饱和的乳酸链球菌发酵液经正丙醇提取2次,再用丙酮沉淀可得到乳酸菌肽粗制品, 将粗制品溶于0.05mol/ l HAC -
NaAc(pH3.6) 缓冲液,并用缓冲液透析24h ,离心后经柱层析,可使Nisin 的效价及纯度大大提高,再经喷雾干燥、研细及用NaCl 调整成分,即可制成Nisin 成品。
2.豆粕发酵生产乳酸链球菌的试验
培养条件对Nisin生产的影响
有研究证明豆粕发酵生产试验中，蔗糖为乳酸链球菌发酵的最佳碳源, K2HPO4 对发酵也有促进作用。通过单因素实验、正交实验,优化了豆粕发酵的培养基组成,其最优配方为:每100 g豆粕添加麸皮2g、蔗糖1.8g、酵母膏1.2g、K2HPO41.5g、NaCl0.1g、MgSO40.03g,水100g,其生物量达到0.94IU/g,Nisin最高效价达到
997IU/g。
2. 1 不同培养基对Nisin产生的影响
分别接种乳酸链球菌WX506种子液于MRS、LB、M17、CM四种发酵培养基中, 30℃, 200 r/min摇床培养, 24 h后测定发酵液效价、pH值和生物量(OD 600 nm) 。结果证明，MRS培养基虽然有利于菌体生长,但Nisin效价远不如CM培养基,因此,我们选择以CM培养基作为对照,优化豆粕培养基的组成。
2. 2 添加麸皮对豆粕发酵的影响
由于乳酸链球菌WX506为兼性厌氧微生物,添加麸皮能增加豆粕间隙,有利于菌体生长。结果证明，添加2 g麸皮的Nisin产量最高, 4g麸皮的菌体生长最好。
2. 3 碳源对豆粕发酵的影响
豆粕中虽然含有少量糖分,但是远不能满足微生物生长需要。以豆粕为基础,添加不同的碳源进行发酵(每100g豆粕添加1g) ,以豆粕发酵作为对照。结果可知,补加葡萄糖最有利于菌体生长,补加蔗糖产Nisin效果最好。其原因可能是菌株
WX506和其它产生乳链菌肽的乳酸链球菌一样,编码乳链菌肽前体的结构基因与蔗糖发酵基因紧密连锁在一起,而且有一个有效的磷酸烯醇式丙酮酸依赖型磷酸转移酶系统作为蔗糖的吸收、运输及代谢的途径。
2. 4 蔗糖对豆粕发酵的影响
从图2可以看出,补加1.5g的蔗糖效价较高,补加量再增时,效价降低,同时过高的蔗糖浓度对Nisin产生有抑制作用,所以,100g豆粕补加1.5g的蔗糖比较合适。2. 5 磷源对豆粕发酵的影响
通常认为磷酸盐的主要作用是由于它们具有较强的缓冲能力,能够缓冲在发酵过程中由于乳酸的产生而造成的培养基pH值下降,从而有利于Nisin的产生。以豆粕发酵培养基为基础,在100g豆粕中添加2g麸皮、1.5g蔗糖、1g酵母膏的前提下,
添加1g的不同的磷源进行发酵。结果可知,所选用的几种磷酸盐都较好的促进了Nisin的产生,其中以K2HPO4为最好。
2. 6 K2HPO4 对豆粕发酵的影响
以豆粕发酵培养基为基础,在100g豆粕中添加2g麸皮、1.5g蔗糖、1g酵母膏,添加不同浓度的K2HPO4 进行发酵。结果可以看出, K2HPO4添加量在1.5g以下时,对发
酵液效价有较大的影响, 对生长影响不大。K2HPO4为1.5g时,发酵液效价达到最高值;当K2HPO4添加量超过2g或更高时,就会对Nisin合成产生一定的抑制作用,对菌体生长也有影响。
2. 7 酵母膏对豆粕发酵的影响
乳酸链球菌是一类对营养要求较高的菌种,氮源可被利用的难易程度必然影响该菌的初级代谢,从而影响Nisin的产量。另外,Nisin生产需要稀有氨基酸等生长因子,而酵母膏中含有这些生长因子,因此,在培养基中适量添加酵母膏有利于菌体生长,有利于Nisin生产。
2. 8 NaCl对豆粕发酵的影响
在CM培养基中,NaCl也是一种主要的营养成分, NaCl添加量0.2g为最佳,生长量与Nisin产量均为最高,添加量超过0.4g时,效价明显降低,生长量也降低。因此,选择添加0.2g的NaCl。
2. 9 硫酸镁对豆粕发酵的影响
在以上优化的基础上,添加不同量的MgSO4对豆粕发酵菌体的生长没有明显的影响,添加0.02g的MgSO4对Nisin合成有一定的促进作用,但是添加量过高会降低Nisin的产量。这可能是由于Mg2+可通过保护细胞质膜的完整性来增强Nisin对主要肽酶NisP的免疫力,或是降低了Nisin在细胞表面的吸附。
2. 10 吐温80的添加对豆粕发酵的影响
吐温80作为一种表面活性剂,可降低细菌菌体与培养基表面之间的表面张力,能刺激多种胞外酶的产生,它也可以影响某些微生物细胞的膜通透性,促进营养物质进入细胞及代谢产物排出体外。吐温80会促进包括Nisin在内的一些细菌素的生产, Huot等研究表明,吐温80对乳酸乳球菌J46产生的细菌素有明显的促进作用,并使发酵单位有了大幅度提高。但在豆粕发酵试验中,添加吐温80并没有显示出明显的促进作用,相反,当吐温80添加量超过0.5ml时,反而会使生长量降低,Nisin发酵效价降低。
3. 行业发展
浙江银象生物工程有限公司——全国最大的乳酸链球菌素制造商
兰州伟日生物工程有限公司
是一家从事生物工程，集研发、生产、销售为一体的现代高科技企业。与浙江大学合作，主要产品—乳酸链球菌素（Nisin）.目前,世界上唯有我公司采用全物理工艺方法提取，生产过程中不使用任何有机溶剂，是真正的绿色产品.
沈阳红梅企业集团——尼鲜宝（NisiNoble）牌乳酸链球菌素（Nisin）
英国Aplin & Barrett公司——商品名为Nisaplin(尼萨普林)
4.Nisin的应用
4.1 在肉制品中的应用
传统的火腿、熏肉和香肠产生中, Nisin能有效控制肉制品中微生物的生长,降低残留的亚硝酸盐的含量,减少亚硝胺的形成。Nisin 可作为一种有效的替代物,减少火腿中发色剂的用量；可取代山梨酸钾作防腐剂,并能提高产品质量。4.2 在乳制品中的应用
Nisin 可用于巴氏灭菌牛奶,添加量为30～50mg/ kg ,通常在35 ℃下产品货架期可延长一倍; UHT 奶中添加20mg/ kg 的Nisin ,能完全抑制灭菌乳中嗜热细菌芽孢的生长，而且感官质量良好。
4.3 在罐头制品中的应用
Nisin 在酸性条件下易溶、稳定、抑菌活力也高,因此可用于高酸性(pH 4. 6) 罐头的保鲜。如西红柿罐头和低酸性(pH 4. 6) 罐头如马铃薯、蘑菇、水果罐头中,添加适量Nisin ,可以有效地抑制芽孢的生长,保持其新鲜度,并延长保存期。
4.4 在酱菜中的应用
目前,各类酱菜中含盐量偏高,约在10～20 %之间,但高盐食品易诱发高血压等疾病。加入100mg/ kgNisin ,可抑制杂菌生长,并使盐的浓度下降为7～9 %。由于一些国家在食品中不准使用苯甲酸钠,所以Nisin 用于瓶装酱菜出口,具有现实意义。
4.5 在酒精饮料中的应用
腐败乳酸菌对Nisin 敏感,但酵母几乎不受其影响。因此,Nisin 可与酵母一起在生产啤酒、果酒、烈性乙醇等酒精饮料时加入,用来抑制G+ 菌。啤酒常见腐败菌几乎均能被100IU/ ml Nisin 所抑制,并能延长啤酒,尤其是非巴氏灭菌和瓶装啤酒的货架期；把Nisin 应用于白酒酿造中,有效地阻碍了肠膜状明串珠菌,啤酒片球菌和乳酸杆菌的生长,防止了杂菌的污染。
文章篇号:1007-2764(2003)增刊-0029-096 乳酸链球菌素（Nisin ）及其在食品工业中的应用 幸治梅 刘勤晋 （西南农业大学食品学院 重庆 400716） 摘 要: 介绍了乳酸链球菌素（Nisin）性质，综述了乳酸链球菌素（Nisin）在食品防腐中的应用，以及对微生物防腐剂的发展趋势进行展望。 关键词: Nisin 性质；应用；展望 食品极易受到微生物侵袭而导致腐败，采用防腐剂 延缓腐败是贮存食品的有效手段之一。但人们发现不少化学防腐剂影响着人体健康，因此寻求广谱、高效、低毒（无毒）、纯天然的食品防腐剂已成为当今食品贮存研究的热点。而在天然防腐剂中，微生物素防腐剂成为研究、应用的一个重要方面。其中应用得较广泛的是乳酸菌素（包括乳酸链球菌、乳酸杆菌、啤酒片球菌等产生的抗生素）中的乳酸链球菌素(Nisin)。 1 Nisin 的性质 1.1 Nisin 的结构特点 早在1970年Gross 和Morell 已阐明Nisin 分子的一级结构由34个氨基酸组成，分子式是C 143H 228N 42O 37S 7,平均分子量315Da ，其活性体为二聚体或四聚体，分子量分别为7000和14000。Nisin 含有4种异常氨基酸，分别是脱氢丙氨酸（DHA ）、β-甲基脱氢丙氨酸（DHB ）、羊毛硫氨酸（ALA-S-ALA ）和β-甲基羊毛硫氨酸（ABA-S-ALA ），它们通过硫醚键形成5个环。到目前为止，已发现Nisin 的种类包括A 、B 、C 、D 、E 和Z ，对Nisin A 和Nisin Z 研究较多，区别在于NisinA 的第27位AA 为His ，而Nisin Z 的第27位AA 为Asn ，其抗菌特性几乎无差别[1,2],其分子结构见下图所示。 1.2 Nisin 的理化性质 Nisin 作为一种白色易流动的粉末，其溶解度随pH 值的不同而不同，易溶于酸性溶剂，在0.02mol/L 的盐 酸中具有最大溶解度为118.0mg/L [3]； 随着碱性增强，生物活性也减弱。在pH6.5，85℃经15min 加热，其活性损失15%，而当Nisin 溶于pH3的盐酸中经121℃，15min 加热仍能保持100%的活性。 Nisin 作为一种多肽类物质，添加于食品中不会被其中的微生物分解，对人体无毒害作用，但对蛋白水解酶（胰酶、唾液酶、消化酶等）很敏感，人食后在消化道内很快被水解成氨基酸，并且不改变肠道内的正常菌落，也不会与常用的其他抗生素（如青霉素、链霉素等）产 生交叉抗性，是一种安全的防腐剂。 1.3 Nisin 的抑菌性 Nisin 能抑制大部分G +菌的生长，包括产芽孢杆菌（如肉毒芽孢杆菌），耐热腐败菌（如嗜热脂肪芽孢杆菌），生孢梭菌等，而对酵母菌和霉菌无效，但在一定的条件下（如冷冻、加热、降低pH 值和经EDTA 及其它表面活性剂处理）对部分G -菌也有致死作用。 Nisin 对G +菌营养细胞的作用是在细胞膜上构建依靠膜电位的、短期存在的通道，使膜电位丧失，能量产生停止和细胞质中必需小分子组分流失，最后细胞解体；而对芽孢的作用是在芽孢萌发前期及芽孢膨胀期破坏其膜，以抑制其发芽过程。 2 Nisin 在食品工业中的应用 Nisin 不含任何非天然物质，对人体健康无毒害作用，在食品中添加定量Nisin ，不但对食品的色、香、味、口感等无副作用，而且有助于增进食品营养价值，降低其加工能耗。 2.1 在肉制品中的应用 肉制品的主要污染菌是G +菌， Nisin 作为G +菌抑制剂广泛应用在肉类加工中。Rayman 等(1981)提出[4]，Nisin 可作为腌制肉制品中硝酸盐的替代剂或佐剂，以减少或避免亚硝胺类物质对人体健康的威胁。如在烟熏火腿时，加入3000IU/ml Nisin ，37℃能放56d 不变质，使 96
Ｎｏ．１．２００６ 乳酸链球菌素（Ｎｉｓｉｎ）是世界上公认安全的防腐剂，是一种由微生物代谢所产生的具有很强杀菌作用的天然代谢产物。乳酸链球菌素本身具有许多优良性质：首先，容易被人体消化道中的一些蛋白酶和胰蛋白酶所降解，不会在体内蓄积而引起不良反应，并且对食品的色、香、味等无不良影响［１－２］。使用它还可以降低杀菌温度，减少热处理时间，因此能改进食品的营养价值、风味、结构、颜色等性状，同时还可节省能耗。Ｎｉｓｉｎ本身具有热稳定性，并耐酸、耐低温贮藏，Ｎｉｓｉｎ作为一种理想的天然防腐剂获得越来越广泛的应用。 １乳酸链球菌素的研究现状１．１乳酸链球菌素的分子结构 乳酸链球菌素（Ｎｉｓｉｎ）的分子式为Ｃ１４３Ｈ２２８Ｎ４２Ｏ３７Ｓ７，含有３４个氨基酸残基，分子量为３５１０Ｄａ。Ｎｉｓｉｎ在天然状态下主要有两种形式，分别为ＮｉｓｉｎＡ和ＮｉｓｉｎＺ［３］，它 们之间的差别在于氨基酸顺序中第２７位氨基酸不同，在ＮｉｓｉｎＡ中是组氨酸，在ＮｉｓｉｎＺ中是天冬氨酸，在其基因结构上的第１４８位脱氧核苷酸不同是造成差别的根本原因。一般而言，在同样浓度下，ＮｉｓｉｎＺ的溶解度和抑菌能力比ＮｉｓｉｎＡ要强。１．２乳酸链球菌素的性质１．２．１ 物理和化学性质 Ｎｉｓｉｎ的溶解性、稳定性都 与溶液的ｐＨ值密切相关。Ｎｉｓｉｎ的溶解度随ｐＨ值的下降而提高，ｐＨ值２．５时溶解度为１２％，ｐＨ值为５．０时下降到４％，在中性及碱性条件下几乎不溶解［４］。 实验结果表明，Ｎｉｓｉｎ在酸性条件下极为稳定，ｐＨ２．０条件下可耐受高温处理（１２１℃，１５ｍｉｎ），而无活力损失，而在中性或碱性条件下即发生失活。１．２．２ 生物学特性 当α－胰蛋白酶、胰酶制剂和枯 草杆菌肽作用Ｎｉｓｉｎ后，会使其失去活性，但羧肽酶Ａ、羧肽酶Ｅ、肠肽酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶对Ｎｉｓｉｎ无作用。Ｈｕｒｓｔ报道，Ｎｉｓｉｎ对α－凝乳蛋白酶、胰酶、 李红，赵春燕＊ （沈阳农业大学，沈阳１１０１６１） 摘要：乳酸链球菌素是某些乳链球菌产生的一种多肽物质，是一种高效、无毒副作用的天然生物防腐剂。综述了乳酸链球菌素的研究开发与生产应用进展。关键词：乳酸链球菌素；防腐剂；研究进展中图分类号：ＴＳ２０１．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００５－９９８９（２００６）０１－００７５－０４ Ｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｎｉｓｉｎ ＬＩＨｏｎｇ，ＺＨＡＯＣｈｕｎ－ｙａｎ （ＳｈｅｎｙａｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０１６１） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＮｉｓｉｎｉｓａｎａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｍｕｌｔｉｐｅｐｔｉｄｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｃｅｒｔａｉｎｓｔｒａｉｎｏｆＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ．Ｉｔｉｓａｈｉｇｈ－ｅｆｆｉ－ｃｉｅｎｃｙａｎｄｎｏｐｏｉｓｏｎｏｕｓｅｆｆｅｃｔｎａｔｕｒａｌｂｉｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｄｅｓｃｒｉｂｅｄｒｅｓｅａｒｃｈｅｘｐｌｏｉｔａ－ｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓａｂｏｕｔｐｒｏｄｕｃｅａｎｄａｐｐｌｉｅｓｏｆｎｉｓｉｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｎｉｓｉｎ；ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ；ｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓ 乳酸链球菌素的研究进展 收稿日期：２００５－０７－３０ ＊通讯作者 基金项目：沈阳农业大学青年教师科技基金（２００３）项目。 作者简介：李红（１９７９－），女，辽宁铁岭人，硕士研究生，研究方向为微生物资源。 ７５
乳酸链球菌素的研究进展 摘要：本文介绍了乳酸链球菌素（Nisin）的分子结构、性质、抗菌机理和生产的研究进展；综述了乳酸链球菌素在食品工业中的应用现状，并对其应用前景进行展望，以期为乳酸链球菌素的进一步研究提供参考. 关键词：乳酸链球菌素，抗菌机理，食品工业，应用 Abstract：Nisin is an antibacterial multipeptide produced by certain strain of Lactococcus lactis．It is a high efficiency and nopoisonous effect natural biopreservative．This paper comprehensive described research exploitation and progress about produce and applies of nisin．Key words：nisin；preservative；research and progress 乳酸链球菌素(Nisin)是世界上公认安全的防腐剂，是一种由微生物代谢所产生的具有很强杀菌作用的天然代谢产物。乳酸链球菌素本身具有许多优良性质：首先，容易被人体消化道中的一些蛋白酶和胰蛋白酶所降解，不会在体内蓄积而引起不良反应，并且对食品的色、香、味等无不良影响。使用它还可以降低杀菌温度，减少热处理时间，因此能改进食品的营养价值、风味、结构、颜色等性状，同时还可节省能耗。Nisin本身具有热稳定性，并耐酸、耐低温贮藏，Nisin 作为一种理想的天然防腐剂获得越来越广泛的应用 1、乳酸链球菌素的研究现状 1．1乳酸链球菌素的分子结构 Nisin）亦称乳酸链球菌肽或音译为尼辛，是目前最常用的生物防腐剂，它是乳酸链球菌产生的一种多肽物质，由34个氨基酸残基组成。分子式为C143H228N42037S7，分子量为3510。Nisin分子结构中包含5种稀有氨基酸，分别为氨基丁酸 (ABA)、脱氢丙氢酸(DHA),R一甲基脱氢丙氨酸(DHB)、羊毛硫氨酸(ALA-S-ALA)和已一甲基羊毛硫氨酸(ALA-S-ABA)，它们通过硫醚键形成五个内环，其活性体为二聚体或四聚体。到目前为止，已发现Nisin 分子的类型有A,B,C,D,E和Z，其中以Nisin A和Z两种类型的研究较多。NisinA与NisinZ的差异仅在于第27位氨基酸的种类不同。前者为组氨酸(His)，后者为天冬酸胺(Asn)，其抗菌特性几乎无差别。 1．2乳酸链球菌素的性质
对于食品防腐剂一些外行人会比较陌生，其中乳酸链球菌素就是一种天然合成的食品防腐剂。它的作用可不小，比如可以延长货架期或抑制细菌生长，因此在众多的食品化工行业中均有使用。 我们通过专业的生产厂家了解到乳酸链球菌素的作用和功效主要有这几点：可被人体内的酶降解、消化,是一种高效、安全、无毒、无副作用的天然食品防腐剂。它能抑制多数革兰氏阳性菌,尤其对产生芽孢的革兰氏阳性菌如枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等有很强的抑制作用,而对革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌一般无效。在一定条件下,如冷冻、加热、降低pH值、EDTA处理等,乳酸链球菌素亦可抑制一些革兰阴性菌,如沙门氏菌、大肠杆菌、假单胞菌等的生长。 目前由乳酸链球菌素制成的防腐剂已广泛应用于食品行业,可缩短灭菌时间,提高食品品质，延长食物的储存时间。给你举一些使用用途来分析一下发挥的作用是什么： 一、在罐头食品中的应用 ①可以降低热处理的强度，减少食品营养成分的损失，改善产品的食用品质。 ②抑制耐热细菌芽孢的生长和繁殖，延长食品的保藏时间。目前，主要在一
些果蔬类罐头中应用，以降低灭菌强度，使果蔬类罐头有较好的组织脆度和食用品质。 二、在植物蛋白食品中的应用 盒装内酯豆腐，在炎热的夏季，保质期不到12个小时。超过12小时，产品就会脱水、变酸、变质。添加Nisin，保质期可以延长到24小时。1天的保质期，安全可以满足这种即食产品在市场上流通的需要。 三、在饮料中的应用 在饮料中添加Nisin可以抑制耐酸、耐热细菌（如酸土芽孢杆菌）的生长和繁殖，防止饮料的酸败，延长产品的保质期。 乳酸链球菌素也是一种十分常见的食品防腐剂，可广泛应用于肉制品、乳制品、海产品、饮料、蛋制品、调味品、酿酒工艺、烘焙食品、方便食品、化妆品等不同领域。
乳酸链球菌素的生产及研究现状 吴江乳酸链球菌素(Nisin) 是从乳酸链球菌发酵产物中提制的一种多肽抗菌素类物质,是一种世界公认的安全的天然生物性食品防腐剂和抗菌剂。1944 年Mattick 和Hirsch 发现血清学N 群中的一些乳酸链球菌能产生蛋白类抑菌物质,命名为N-inhibitory Substance 即N 群抑菌物质,简称为Nisin。1953 年由英国的阿普林和巴雷特公司首次以商品的形式出售了这种新的防腐剂———乳酸链球菌素。1969 年,FAO/ WHO 食品添加剂联合专家委员会批准Nisin作为一种生物型防腐剂应用于食品工业。1988 年美国食品和药物管理局(FDA) 也正式批准将Nisin应用于食品中。我国在GB2760 —86 中批准Nisin可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品、肉制品中。迄今为止,Nisin 已在全世界约60 多个国家和地区被用作防腐剂。 1.乳酸链球菌素的生产 1.1 菌种的筛选和改良 乳酸链球菌广泛存在于天然牛奶及乳酪和酸奶中, 从牛奶场取生牛奶样品, 加以稀释, 然后在含有检测菌及吐温20 为扩散剂的固体检测培养基表面进行涂布, 在30 ℃培养24h 后, 测量抑菌圈直径, 挑取抑菌圈直径与菌落直径比较大 的菌株再进行平板划线分离, 选取单个菌落接至试管斜面保存, 然后, 逐一测定菌株的Nisin 效价。这样便筛选出产Nisin 的乳酸链球菌菌株。若想获取高产菌株, 可对原始菌株再进行诱变处理。 1.2 培养基和培养条件 不同的乳酸链球菌株,其Nisin 的效价也有显著的变化,所适应的发酵条件也各有所不同,国内外这方面的研究较多,综合来看,在C 源上,最适合的主要为蔗糖和可溶性淀粉,其添加量随菌株的不同也各有所不同。最适N 源,主要为酵母膏,添加量1 %左右,另外酵母膏及吐温80对细胞的生长及Nisin 的产生均有利。最适P 源普遍认为KH2PO4最合适,添加量一般≤5 % ,使用KH2PO4主要有两方面优点:即可创造良好的pH 环境;可提高Nisin 的产生。有研究表明,Nisin 的高效价在很大程度上也依赖于S 源的存在,添加无机盐类如硫酸镁、硫代硫酸盐或含硫氨基酸如蛋氨酸、半胱氨酸等,均有较好效果。在近几年所有的报道中,最适发酵温度均为30 ℃左右,最适pH为5.0～5.5或6.5左右。 1.3 分离纯化 目前,采用的方法一般为将NaCl 饱和的乳酸链球菌发酵液经正丙醇提取2次,再用丙酮沉淀可得到乳酸菌肽粗制品, 将粗制品溶于0.05mol/ l HAC - NaAc(pH3.6) 缓冲液,并用缓冲液透析24h ,离心后经柱层析,可使Nisin 的效价及纯度大大提高,再经喷雾干燥、研细及用NaCl 调整成分,即可制成Nisin 成品。
Ｎｉｓｉｎ 乳酸链球菌素 Ｎｉｓｉｎ是从乳酸链球菌发酵产物中提制的一种多肽抗菌素类物质,是一种世界公认的安全的天然生物性食品防腐剂和抗菌剂。早在1928年,Ｒｏｇｅｒｓ和ｗｈｉｔｔｉｅｒ就发现乳酸链球菌的代谢产物能够抑制部分革兰氏阳性菌的生长。1944年Ｍａｔｔｉｃｋ和Ｈｉｒｓｃｈ发现血清学Ｎ群中的一些乳酸链球菌能产生蛋白类抑菌物质,命名为Ｎ＿ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙＳｕｂｓｔａｎｃｅ即Ｎ群抑菌物质,简称为Ｎｉｓｉｎ]。1951年,Ｈｉｒｓｃｈ等人应用Ｎｉｓｉｎ到食品保藏中,成功的抑制了由产气梭状芽孢杆菌引起的奶酪腐败,极大改善了奶酪的品质。1953年由英国的阿普林和巴雷特公司首次以商品的形式出售了这种新的防腐剂———乳酸链球菌素。1969年,ＦＡＯ/ＷＨＯ食品添加剂联合专家委员会批准Ｎｉｓｉｎ作为一种生物型防腐剂应用于食品工业。1988年美国食品和药物管理局(ＦＤＡ)也正式批准将Ｎｉｓｉｎ应用于食品中。我国在ＧＢ2760—86中批准Ｎｉｓｉｎ可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品、肉制品中。迄今为止,Ｎｉｓｉｎ已在全世界约60多个国家和地区被用作防腐剂。 1.Ｎｉｓｉｎ的特性 1.1分子结构 Ｎｉｓｉｎ分子由34个氨基酸残基组成,分子式为Ｃ143Ｈ228Ｎ42Ｏ37Ｓ7,分子量为3510。Ｎｉｓｉｎ分子结构中包含5种稀有氨基酸即ＡＢＡ、ＤＨＡ、ＤＨＢ、ＡＬＡ-Ｓ-ＡＬＡ和ＡＬＡ-Ｓ-ＡＢＡ,它们通过硫醚键形成五个内环,其活性分子常为二聚体或四聚体。二聚体分子量为7000,四聚体分子量为14000。经过几十年的研究,人们已发现Ｎｉｓｉｎ分子有6种类型,它们分别是Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｚ,其中以ＮｉｓｉｎＡ和Ｚ两种类型的研究最为活跃。ＮｉｓｉｎＡ与ＮｉｓｉｎＺ的差异仅在于氨基酸顺序上第27位氨基酸的种类不同。ＮｉｓｉｎＡ是组氨酸(Ｈｉｓ),而ＮｉｓｉｎＺ是天门冬酰胺(Ａｓｎ)。资料表明,同样浓度下ＮｉｓｉｎＺ的溶解度和抗菌能力都比ＮｉｓｉｎＡ强。 1.2溶解性与稳定性 Ｎｉｓｉｎ是一种白色易流动的粉末,使用时需溶于水或液体中。Ｎｉｓｉｎ的溶解度主要取决于溶液的ｐＨ值,在ｐＨ值较低的情况下,溶解性较好。其溶解度随ｐＨ值的降低而升高,ｐＨ5.0时溶解度为4.0%,ｐＨ为2.5时溶解度为12%。Ｎｉｓｉｎ在中性和碱性条件下几乎不溶解,所以在应用时,一般先用0.02Ｍ盐酸溶解,再加入到食品中。Ｎｉｓｉｎ的稳定性主要取决于温度,ｐＨ值,基质等因素。Ｎｉｓｉｎ在酸性条件下呈现最大的稳定性,随着ｐＨ的升高其稳定性大大降低。在ｐＨ为2.0或更低的稀盐酸中,经115.6℃高压灭菌,仍能稳定存在;在ｐＨ为5时,其活力损失40%;在ｐＨ为9.8时其活力损失超过90%。在一定温度范围内,随着温度的升高,它的活性丧失增加。当Ｎｉｓｉｎ加入到食品中,则受到介质的保护,一些大分子食物如牛奶,肉汤等可使其稳定性大大增强。另外,Ｎｉｓｉｎ的稳定性还与热处理时间、食品保藏的温度及时间等有关。 1.3抑菌性 Ｎｉｓｉｎ主要抑制大部分Ｇ+菌,特别是细菌的芽孢。Ｎｉｓｉｎ能抑制葡萄球菌属、链球菌属、小球菌属和乳杆菌属的某些菌种;抑制大部分梭菌属和芽孢杆菌属的芽孢。例如能有效抑制肉毒梭状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等引起的食品腐败。早期的研究认为,Ｎｉｓｉｎ一般对霉菌、酵母菌和Ｇ-菌是无效的,但近期的研究表明,在一定条件下(如冷冻、加热、降低ｐＨ和ＥＤＴＡ处理),一些Ｇ-菌(如沙门氏菌、大肠杆菌、假单胞菌等)对Ｎｉｓｉｎ敏感。Ｎｉｓｉｎ对Ｇ+菌营养细胞和芽孢有不同的抗菌机理。Ｎｉｓｉｎ对营养细胞的抗菌机理有不同的看法。一种观点认为,Ｎｉｓｉｎ吸取于细胞膜上,可以抑制细胞壁中肽聚糖的生物合成,使细胞膜和磷脂化合物的合成受阻,导致细胞内物质外泄,引起细胞裂解[10]。另一观点认为Ｎｉｓｉｎ的抗菌机理与ＤＨＡ和ＤＨＢ密切相,因为Ｎｉｓｉｎ中的ＤＨＡ和ＤＨＢ能够与敏感菌株细胞膜中某些酶的巯基发生作用,释放细胞质,造成敏感细胞裂解。Ｎｉｓｉｎ对芽孢的作用是在其萌发前期及膨胀期破坏其膜,以抑制其发芽过程。 1.4安全性 Ｎｉｓｉｎ对蛋白酶特别敏感,在消化道中很快被α＿胰凝乳蛋白酶分解。它对人体基本无毒性,也不与医用抗生素产生交叉抗药性,能在肠道中无害的降解。对Ｎｉｓｉｎ的毒性、致癌性、存活性、再生性、血液化学、肾功能、应激反应以及动物器官病毒学等生物学研究证明,Ｎｉｓｉｎ是安全的。1994年,ＦＡＯ/ＷＨＯ规定其ＡＤＩ为33000ＩＵ/ｋｇ,ＬＤ50为7ｇ/ｋｇ。 2Ｎｉｓｉｎ在食品工业中的应用 2.1在肉制品中的应用 传统的火腿、熏肉和香肠产生中,普遍使用亚硝酸盐、硝酸盐等发色剂来产生典型的腌制红色和腌制风味,并抑制肉毒梭状芽孢杆菌的生长,但这些添加剂同时对人体具有潜在的致癌危险。Ｎｉｓｉｎ能有效控制肉制品中微生物的生长,尤其是抑制产生毒素的肉毒梭状芽孢杆菌的活性,并且Ｎｉｓｉｎ本身呈酸性,能降低周围介质的ｐＨ值,因而能降低残留的亚硝酸盐的含量,减少亚硝胺的形成。Ｒａｙｍａｎ等(1981)提出,Ｎｉｓｉｎ可作为一种有效的替代物,减少火腿中发色剂的用量。另外,在加工过程中,过分的热处理会明显改变肉制品的质地及外观,加入Ｎｉｓｉｎ后仅需45%的热处理即可延长其贮存期。孙保华等(1997)将Ｎｉｓｉｎ添加于红肠中可显著降低细菌总数,并延长产品保存期。袁秋萍(1998)研究表明,在香肠中Ｎｉｓｉｎ添加量为0.3ｇ/ｋｇ,绝大多数的革兰氏阳性菌受到抑制,而且产品色、香、味不受影响;猪肉丝中添加0.48ｇ/ｋｇＮｉｓｉｎ,可取代山梨酸钾作防
河南商业高等专科学校 毕业论文 题目乳酸链球菌素及在食品工业中的应用学号09050402021班级09食品02班专业食品加工技术系别食品系 作者姓名吕丹丹完成时间2011-11-05 指导教师邹建职称讲师
乳酸链球菌素及其在食品工业中的应用 摘要 乳酸链球菌素，又称乳球菌肽或乳链菌肽，是目前用于食品中为数较少的生物防腐剂之一。由于乳酸链球菌素对许多革兰氏阳性菌，特别对产孢子的革兰氏阳性菌有很强的活性，加之它对人体安全无毒，展示了乳酸链球菌素在食品工业中的前景。本文介绍了乳酸链球菌素的理化性质：分子结构、溶解性和稳定性、抑菌性以及安全性。本文还介绍了乳酸链球菌素在酒精饮料、肉制品、乳制品、等食品中的应用。 关键词：乳酸链球菌素；天然防腐剂；应用 世界上每年约有20%以上的粮食及食品因腐败变质而造成巨大浪费和经济损失，变质食品还会危及人的身体健康，因食品变质导致食物中毒的事件时有发生，所以，在食品工业中，防腐剂是一个重要的添加剂。食品防腐剂按来源不同可分为三类：天然防腐剂、化学合成防腐剂、生物防腐剂。由于化学防腐剂一般在较低的pH介质中以分子状态存在，并有一定的副作用，在允许的使用量下，对食品风味仍有一定的影响，所以难以满足现代食品加工的需要。20世纪50年代以后，生物防腐剂的出现，以高效、低毒、天然的特征弥补了化学合成防腐剂的不足，具有广阔的发展前景。 乳酸链球菌素，又称乳球菌肽或乳链菌肽，英文名为 Nisin。
是目前用于食品中为数较少的生物防腐剂之一。乳酸链球菌素是Rogers于1982年首次发现的。1914年，Mattick和Hirsch证明该物质可抑制许多革兰氏阳性菌，并将这种活性物质称为Nisin。1969年，FAO/WHO联合食品添加剂专家委员会确认乳酸链球菌素可作为食品防腐剂。由于乳酸链球菌素对许多革兰氏阳性菌，特别对产孢子的革兰氏阳性菌有很强的活性，加之它对人体安全无毒，展示了乳酸链球菌素在食品工业中的前景。 一、理化性质 (一)分子结构 乳酸链球菌素的分子由34个氨基酸残基组成，分子式为C143H228N42037S7，分子量为3510道尔顿。Nisin分子结构中包含5种稀有氨基酸，分别为氨基丁酸 (ABA)、脱氢丙氢酸(DHA),R 一甲基脱氢丙氨酸(DHB)、羊毛硫氨酸(ALA-S-ALA)和已一甲基羊毛硫氨酸(ALA-S-ABA)，它们通过硫醚键形成五个内环，其活性体为二聚体或四聚体，分子量分别为7000和14000121。到目前为止，已发现Nisin 分子的类型有A,B,C,D,E和Z，其中以Nisin A 和Z两种类型的研究较多。NisinA与NisinZ的差异仅在于第27位氨基酸的种类不同。前者为组氨酸(His)，后者为天冬酸胺(Asn)，其抗菌特性几乎无差别 （二）溶解性和稳定性 Nisin作为一种白色或略带黄色的结晶性粉末，其溶解度随pH值的不同而异，易溶于酸性溶剂，在0.02mol/L的盐酸中具有最大溶解度为118. Omg/L;随着碱性增强，生物活性也减弱[7[。当pH为2.5时溶解度为12%;pH为5.0时降低到4%;中性和碱性条件下几乎不溶解 Nisin热稳定性高，常受到不同加工温度、pH, 蛋白质的保护作用、本身的纯度等因素的影响。Nisin在酸性条件下呈现最大的稳定性，随着pH的升高其稳定性大大降低。在pH2.0或更低时，经115.6℃灭菌不失活，但在pH5.0灭菌时40%失活， pH6，8时90%失活[s1在pH6.5，850C经15min加热，其活性损失15%;在pH3的盐酸中经121℃加热15min，仍能保持100%的活性。据研究，Nisin的 (三)抑菌性 Nisin主要抑制大部分Ｇ+菌,特别是细菌的芽孢。Nisin能抑制葡萄球菌属、链球菌属、小球菌属和乳杆菌属的某些菌种;抑制大部分梭菌属和芽孢杆菌属的芽孢。例如能有效抑制肉毒梭状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、枯草芽孢杆菌、嗜热
由于乳酸链球菌素可抑制大多数革兰氏阳性细菌，并对芽孢杆菌的孢子有强烈的抑制作用，因此被作为食品防腐剂广泛应用于食品行业，那具体的使用范围有哪些呢，下边带您了解。 乳酸链球菌素现主要广泛应用于肉制品、乳制品、罐头、海产品、饮料、果汁饮料、液体蛋及蛋制品、调味品、酿酒工艺、烘焙食品、方便食品、香基香料、化妆品领域等中。 1.乳酸链球菌素在肉制品中的应用； 适用范围相当广泛，适合于各类中、西式、高中低档产品。如，烤肉、火腿、三文治、香肠、法兰克福肠、高温火腿肠、鸡肉类产品及酱卤制品。乳酸链球菌素能有效地抑制引起食品腐败的革兰氏阳性细菌，如：李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌及多种腐败微生物等，它的防腐效果是很明显的，能明显延长
2-3倍的货架期。添加5g/100kg—15g/100kg的乳酸链球菌素复合少量其它防腐剂可使低温肉制品保质期在常温条件下达三个月以上。 2.乳酸链球菌素在乳制品中的应用； ◆在pH4 左右的酸奶、果奶中添加0.05g/kg 乳酸链球菌素，经90℃、20分钟灭菌产品的保质期由常温下6天延长到一个月以上。◆经超高温灭菌、无菌灌装奶，添加0.05g/kg乳酸链球菌素产品变败率由0.04%降低0。◆添加0.08g/kg--0.1g/kg乳酸链球菌素于罐装无糖炼乳中可抑制耐热性孢子的生长，减少热处理时间10 分钟。◆添加0.08g/kg 乳酸链球菌素，经121℃、3分钟(F0=3)的热处理能使低脂的牛乳,无盐的奶油,无脂肪的牛乳,调味乳放置于40℃下,仍能保存至六周。◆在干酪中，添加0.05g/kg—0.1g/kg的乳酸链球菌素可解决在干酪加工过程中因耐热性革兰氏阳性菌孢子（如肉毒梭菌和其它厌氧梭菌、保加利亚乳杆菌等）引起的腐败。 3.乳酸链球菌素在罐头食品中的应用； 罐头食品中经常污染一些极为耐热的细菌芽孢，如嗜热脂肪芽孢杆菌和热解糖梭菌的芽孢，一旦条件适宜，它们就会生长，引起产气、产酸腐败. 0.1g/kg
乳酸链球菌素（Nissan）亦称乳链菌肽，是由乳酸链球菌产生的一种多肽物质, 食用后在人体的生理pH条件和α—胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不会改变人体肠道内正常菌群以及产生如其它抗菌素所出现的抗性问题，更不会与其它抗菌素出现交叉抗性, 是一种高效、无毒、安全、性能卓越的天然食品防腐剂。它能有效抑杀嗜热脂肪芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌、肉毒梭菌等各种革兰氏阳性菌的营养细胞和芽孢。加入食品中，可大大地降低食品的灭菌温度、缩短食品灭菌时间，使食品保持原有营养成份、风味、色泽，同时还可大量节能。可广泛应用于肉制品、乳制品、植物蛋白食品、罐装食品、果汁饮料及经热处理密闭包装食品的防腐保鲜，同时也可应用于化妆品和医疗保健品等领域 浙江银象生物工程有限公司 乳酸链球菌素（E234） 产品简介 乳酸链球菌素（Nisin）又称乳链菌肽或尼生素，是从乳酸链球菌发酵产物中提取的一类多肽类化合物。它能有效地抑制致使食品腐败的革兰氏阳性菌的生长和繁殖，特别是对耐热性芽孢杆菌、肉毒梭菌、李斯特菌及其所产生的芽孢有强烈的抑制效果，可用于肉制品、乳制品、植物蛋白食品、罐装食品等的防腐保鲜。由于乳酸链球菌素是一种多肽，进入人体后易被植物蛋白酶分解，因此是一种安全、无毒、高效的天然食品防腐剂。 产品特性： 1、能有效抑制革兰氏阳性菌，如耐热性芽孢杆菌、肉毒梭菌、李斯特菌及其所产生的芽孢，在一定条件下也可抑制部分革兰氏阴性菌； 2、保证食品质量，提高食品品质，延长食品的货架期； 3、降低返货率； 4、热稳定性好，热处理后的活性损失较少； 5、添加量低，一定程度上节约了成本； 6、可以代替部分化学防腐剂，满足客户及消费者对天然防腐剂的需求。 使用方法
乳酸链球菌素（Nisin） 产品简介: 乳酸链球菌素（Nisin）是一种天然、高效、无毒的防腐剂，属多肽，在人体可降解为各种氨基酸。该产品能有效地抑制引起食品腐败的革兰氏阳性细菌，特别是对产芽孢的细菌有很强的抑制作用，但对真菌如酵母和霉菌没有作用。它是由乳酸球菌菌株在受控条件下经发酵，提取等工艺精制而成。 法定编号：CAS No.1414-45-5;INS No.234;EEC No.234 分子式：C143H228N42O37S7 性状:白色粉末，效价≥1000IU/mg,其活度在温室下及在酸性条件下加热时均 稳定，能耐受PH=2.0,121°C加热30min和PH=3.0，121°C加热15min不变;但在较高PH值下会丧失活力的稳定性 项目标准 外观 水份 PH（10%酒精溶液）铅 砷 氯化物 效价 微生物总数 大肠杆菌 沙门氏菌白色粉末 ≤3% 3.10—3.60 ≤10mg/ kg ≤3mg/kg ≥50% ≥1*10IU/g ≤10/g 不得检出/25g 不得检出/25g 限量：GB 2760-90; FAO/WHO,1984; FDA§184.1;EEC 毒性：GRAS(FDA§184.1538,1994 );ADI33000IU/kg(FAO/WHO,1994) 应用： （1）乳和乳制品：在鲜乳中添加0.05g/kg的Nisin,即可控制造成鲜乳和乳制品腐败之耐热性细菌，使产品保存期延长2-3倍。若添加Nisin能使低脂牛乳、无盐奶油在45°C下，能使保存期限延长至6周。 （2）蛋液及含蛋加工制品:添加0.05-0.1g/kg的Nisin蛋制品中，可有效的抑制耐热性产孢子菌Bacillus app等，讲原来保存期限7天的液体延长至一个月。 （3）沙拉酱和调味酱汁:许多研究表明，添加Nisin于沙拉酱中可抑制乳酸菌和孢子成长，使保存期限延长至4倍，建议用量为0.05-0.2g/kg. （4）罐头食品:许多研究表明，添加Nisin于蔬菜罐头中，能有效抑制耐热性细菌产生的腐败，并且能够减少加工时间减少90%，因此能提高产品质量。添加Nisin于豆类罐头中在55°C的条件下保存期限可延长2年。 （5）热加工的头制品/果汁和饮料:添加0.1-0.2g/kg的溶液于肉制品或海产品一起加工或