志贺氏菌属
志贺氏菌属（Shigella）的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌。临床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。
一、生物学性状
志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3μm ,宽0.5-0.7μm 。不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。DNA的G+C 为49-53克分子%（Tm法）。
需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37℃，最适pH为6.4-7.8。37℃培养18-24小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，宋内氏菌菌落一般较大，较不透明，并常出现扁平的粗糙型菌落。在液体培养基中呈均匀浑浊生长，无菌膜形成。
本菌属都能分解葡萄糖，产酸不产气。大多不发酵乳糖，仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。靛基质产生不定，甲基红阳性，VP试验阴性，不分解尿素，不产生H
S。根据生化反应可进行初步分类。
2
志贺氏菌属的细菌对甘露醇分解能力不同，可分为二大组。
A、不分解甘露醇组：主要为志贺氏菌。又根据能否产生靛基质，进一步分靛基质阳性（1、3、4、5、6、9、10型）和靛基质阴性（2、7、8型）的志贺氏痢疾菌。
B、分解甘露醇组：包括福氏、鲍氏、宋内氏菌。再按乳糖分解情况，分为迟缓分解乳糖的宋内氏和不分解乳糖的福氏和鲍氏菌。后者进一步再根据靛基质产生与否，分靛基质阳性（福氏菌1、2、3、4、5型和鲍氏菌5、7、9、11、13、15型）和靛基质阴性（福氏菌6型和鲍氏菌1、2、3、4、6、8、10、12、14）二类（见表一）
表一志贺氏菌属生化反应的分类
葡萄糖（+）
甘露醇（-）甘露醇（+）
志贺氏菌志贺氏菌乳糖（-）乳糖（+）（1、3、4、（2、7、8型）
5、6、9、10型）靛基质（-）靛基质（+）靛基质（-）
福氏菌6型福氏菌（1、2、宋内氏菌
鲍氏菌（1、2、 3、4、5型），
3、4、6、8 鲍氏菌（5、7、9、
10、12、14型） 11、13、15型）
抗原构造与分型：志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原（O）及表面抗原（K）组成。主要抗原有三种。
型特异性抗原：型多糖抗原为菌体抗原的一种，是光滑型菌株所含有的重要
抗原。当菌株变为粗糙型时，此抗原也常随之消失，各菌型所含的型抗原不同，可用于区别菌种的型别。
群特异性抗原：为光滑型菌株的次要抗原，也是菌体抗原的一种。特异性较低，常在数种近似的菌内出现。在福氏菌株中，由于所含群抗原不同，可将某些菌型分为多种亚型，如福氏菌2型，根据群抗原不同，可分成2a、2b两个亚型。
表面抗原（K抗原）：在新分离的某些菌株菌体表面含有此种抗原。不耐热，加热100℃1小时即被破坏。具有此种抗原的菌株，可阻止菌体抗原与相应免疫血清发生凝集。
根据抗原构造的不同，按最新国际分类法，将本属细菌分为四个群、39个血清型（包括亚型）（见表二）
表二志贺氏菌属抗原的分类
A群：也称志贺氏菌群，有10个血清型。不发酵甘露醇，无鸟氨酸脱羧酶，与其他各群细菌无血清学联系。
B群：也称福氏菌群，已有13个血清型（包括亚型和变种）。最近又发现3个亚型（1c、4c、5b）。发酵甘露醇，无鸟氨酸脱羧酶。抗原结构较复杂，各型间有交叉凝集。每一福氏菌型具有二种抗原，即型特异性抗原和群抗原，前者只存在于同型菌株中，后者有许多种，存在于福氏各菌型中。例如福氏1b型除含有1型特异性抗原外，尚含有4、6群抗原。
C群：也称鲍氏菌群，有15个血清型，分解甘露醇，无鸟氨酸脱羧酶。各型内无交叉凝集。
D群：也称宋内氏菌群，仅有一个血清型。分解甘露醇，有鸟氨酸脱羧酶，迟缓发酵乳糖。有Ⅰ、Ⅱ相之分。
抵抗力：志贺氏菌属在外界环境中的生存力，以宋内氏最强，福氏菌次之，志贺氏菌最弱。一般在潮湿土壤中能存活34天，37℃水中存活20天，在冰块中可存活96天，在粪便内（室温）存活11天。日光直接照射30分钟，56-60℃10分即被杀死，对高温和化学消毒剂很敏感，1%石炭酸中15-30分钟即被杀死，对氯霉素、磺胺类、链霉素敏感，但易产生耐药性。
变异性：
S-R型变异：菌落可由光滑型变为粗糙型，同时常伴有生化反应、抗原构造和致病性的变异。在机体内，尤其在慢性患者和恢复期患者，志贺氏菌可发生变异而失去原来的生化和抗原特性，成为不典型菌株。但其中部分不典型菌株，可通过10%胆汁肉汤等返祖为典型菌株。故在慢性患者或带菌者粪便检查时，对这
类菌株要特别注意，必须多次反复检查。因这对传染源的发现及控制有重要意义。
耐药性变异：自从广泛使用抗菌素以来，志贺氏菌的耐药菌株不断增加，给防治工作带来许多困难。国内部分地区报道（1972-1974），志贺氏菌对四环素的耐药率达74%、氯霉素73.6-97%、链霉素84-98%、合霉素75-100%、磺胺类97-100%，可见国内对常用几种抗菌素的耐药率相当高。
毒力变异与其他变异：1963年南斯拉夫Mel氏首先创用依赖链霉素的志贺氏菌株（依链Sd株，口服预防痢疾。Sd株是一株必须有链霉素存在下才能生长的菌株，其毒力减弱但仍保持免疫原性。美国以天然变异无毒株与大肠杆菌杂交而获得的MH株制成疫苗，其免疫效果和稳定性均较Sd株差。我国正大力利用变异方法通过动物和药物处理等寻找安全有效可供口服的痢疾杆菌活菌苗，并已取得初步成效。
与E.coli的鉴别：志贺氏菌与E.coli的区别，的确是很困难的，这也反映了这二者在DNA—DNA杂交显示密切相关性，实质是“同一种”。A.培养物常常是不运动的，赖氨酸是阴性。B.除了福氏志贺氏6、鲍氏志贺氏13和14、痢疾志贺氏3少数菌株外，在糖发酵时不产气。C.发酵粘液酸或乙酸盐洋菜上或Chiristensen柠檬酸洋菜。如呈碱反应的菌株则类似与E.coli。D.鲍氏志贺氏菌和痢疾志贺氏菌在美国很少见。
二、流行病学：
人和灵长类是志贺氏菌的适宜宿主，营养不良的幼儿、老人及免疫缺陷者更为易感。据报道，每年约有14000例志贺氏菌病，但估计发病人数为30万。
据FDA统计，1997年美国加州等5个州食源性疾病共为8051例，其中志贺氏菌引起的为1263例。
志贺氏菌病常为食物爆发型或经水传播。和志贺氏菌病相关的食品包括色拉（土豆、金枪鱼、虾、通心粉、鸡），生的蔬菜，奶和奶制品，禽，水果，面包制品，汉堡包，和有鳍鱼类。志贺氏菌在拥挤和不卫生条件下能迅速传播，经常发现于人员大量集中的地方如餐厅、食堂。食源性志贺氏菌流行的最主要原因是从事食品加工行业人员患菌痢或带菌者污染食品，食品接触人员个人卫生差，存放已污染的食品温度不适当等。
三、致病性：
志贺氏菌引起的细菌性痢疾，主要通过消化道途径传播。根据宿主的健康状况和年龄，只需少量病菌（至少为10个细胞）进入，就有可能致病。
致病因素：志贺氏菌的致病作用，主要是侵袭力、菌体内毒素个别菌株能产生外毒素。
侵袭力：志贺氏菌进入大肠后，由于菌毛的作用粘附于大肠粘膜的上皮细胞上，继而进入上皮细胞并在内繁殖，扩散至邻近细胞及上皮下层。由于毒素的作用，上皮细胞死亡，粘膜下发炎，并有毛细吸管血栓形成以至坏死、脱落，形成溃疡。志贺氏菌一般不侵犯其他组织，偶尔可引起败血症。目前认为不论是产生外毒素的还是只有内毒素的志贺氏菌，必须侵入肠壁才能致病。因此，对粘膜组织的侵袭力是决定致病力的主要因素。
内毒素：志贺氏菌属中各菌株都有强烈的内毒素，作用于肠壁，使通透性增高，从而促进毒素的吸收。继而作用于中枢神经系统及心血管系统，引起临床上一系列毒血症症状，如发热、神志障碍，甚至中毒性休克。毒素破坏粘膜，形成炎症、溃疡，呈现典型的痢疾脓血便。毒素作用于肠壁植物神经，使肠道功能紊乱，肠蠕动共济失调和痉挛，尤其直肠括约肌最明显，因而发生腹痛、里急后重
等症状。
外毒素：志贺氏菌1型及部分2型（斯密兹痢疾杆菌）菌株能产生强烈的外毒素。为蛋白质，不耐热，75-80℃1小时即可破坏。其作用是使肠粘膜通透性增加，并导致血管内皮细胞损害。外毒素经甲醛或紫外线处理可脱毒成类毒素，能刺激机体产生相应的抗毒素。一般认为具有外毒素的志贺氏菌引起的痢疾比较严重。
所致疾病：志贺氏菌引起的细菌性痢疾可分为两类6型。
A、急性细菌性痢疾：又分急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢三型。急性典型菌痢症状典型，有腹痛腹泻、脓血粘便、里急后重、发热等症状。各型菌都可引起，以志贺氏菌引起的较重，宋内氏菌引起的较轻。经治疗，预后良好。如治疗不彻底，可转为慢性。急性非典型菌痢症状不典型，易诊断错误延误治疗，常导致带菌或慢性发展。急性中毒性菌痢小儿多见，各型菌都可发生。中毒性菌痢一系列的病理生理变化，主要是内毒素造成机体微循环障碍的结果。导致内脏淤血、周围循环衰竭（休克），主要功能器官灌注不足，发生心力衰竭、脑水肿，急性肾功能衰竭。严重微循环障碍，再加上内毒素损伤血管内皮细胞、激活凝血因子等，而发生弥漫性血管内凝血（DIC）。
B、慢性细菌性痢疾：又分慢性迁延型、慢性隐伏型、急性发作型三型。慢性迁延型，通常由急性菌痢治疗不彻底等引起。病程超过2个月，时愈时发，大便培养阳性率低。在有临床症状时为急性发作型，该型往往在半年内有急性菌痢病史。慢性隐伏型菌痢，是在一年内有过菌痢病史，临床症状早已消失，但直肠镜可发现病变或大便培养阳性。
志贺氏菌带菌者有三种类型。A.健康带菌者，是指临床上无肠道症状而又能排出痢疾杆菌者。这种带菌者是主要传染源，特别是饮食业、炊事员、和保育员中的带菌者，潜在的危险性更大。B.恢复期带菌者，是指临床症状已治愈的病人，仍继续排菌达2周之久者。C.慢性带菌者，是指临床症状已治愈，但长期排菌者。
免疫性：病后有一定的免疫力，但免疫期短，也不稳定。可能因本菌属菌型众多，相互间无交叉免疫性之故。免疫性与血中抗体似乎无关，而与肠道粘膜细胞吞噬能力加强和机体对痢疾杆菌内毒素耐受性提高有关。肠道分泌型抗体即粪抗体亦有一定作用。粪抗体出现早、消失快，在脓血粘便中，粪抗体检出率高达90%。这为志贺氏疫苗经口免疫的可能性，提供了理论依据。
四、检验步骤：(国家标准 GB4789.5-94）
4.1 增菌
称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8 000～10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃培养6～8h。培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。
4.2 分离和初步生化试验
4.2.1 取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平极或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板1个，于36℃培养18～24h，志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。
4.2.2 挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培养18～24h，分别观察结果。
4.2.3 下述培养物可以弃去：
a. 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；
b. 在18～24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物；
c. 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；
d. 产气的培养物；
e. 有动力的培养物；
f. 产生硫化氢的培养物。
4.2.4 凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。
4.3 血清学分型和进一步的生化试验
4.3.1 血清学分型
挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。
4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1～15各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3～12型多价血清及各型因子血清检查。
表1 福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原
4.3.2 进一步的生化试验
在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即：葡萄糖铵，西蒙氏柠檬酸盐，赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶，pH7.2尿素，KCN生长，以及水杨昔和七叶昔的分解。除宋内氏菌和鲍氏13型为乌氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。必要时还应做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。
已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做5%乳糖发酵，甘露醇、棉子糖和甘油的发酵和靛基质试验。志贺氏菌属4个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏6型的生化特性与A群或C群相似，见表2。
4.4 结果报告：综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告。
志贺氏菌的危害程度评估报告 一、生物学特性 志贺氏菌属（Shigella）的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。 志贺氏菌和大肠杆菌都属于肠杆菌科，根据DNA杂交研究结果表明，志贺氏菌属的四个种和大肠杆菌属在生化上是难以区分的，因为有产气的志贺氏菌，也有乳糖阴性、不产气、不运动的大肠杆菌，有些大肠杆菌也能引起痢疾状的腹泻。 志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3μm ,宽0.5-0.7μm 。不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，不运动，有菌毛。 志贺氏菌需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37℃，最适pH为6.4-7.8。37℃培养18-24小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，宋内氏菌菌落一般较大，较不透明，并常出现扁平的粗糙型菌落。在液体培养基中呈均匀浑浊生长，无菌膜形成。根据抗原构造的不同，按最新国际分类法，将本属细菌分为四个群、39个血清型。 二、危害程度分类 根据中华人民共和国卫生部制定《人间传染的病原微生物名录》该菌危害程度为第三类。 三、致病性和感染剂量 志贺氏菌引起的细菌性痢疾，主要通过消化道途径传播。根据宿主的健康状况和年龄，只需少量病菌（至少为10～100个细胞）进入，就有可能致病。致病因素：志贺氏菌的致病作用，主要是侵袭力、菌体内毒素个别菌株能产生外毒素。志贺氏菌引起的细菌性痢疾可分为两类一类是急性细菌性痢疾：又分急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢三型；二类是慢性细菌性痢疾：又分慢性迁延型、慢性隐伏型、慢性急性发作型三型。病后有一定的免疫力，但免疫期短，也不稳定。 四、暴露的潜在后果 暴露后可能引起感染，菌量大时可使实验人员显性感染，菌量很少时常呈暂时的带菌状态。被感不染后，成为传染源，可能对周围及环境造成污染，应及时得到控制。
从业人员健康体检沙门氏菌、志贺氏菌检测操作程序 一、目的 本程序用于对从业人员健康体检进行沙门氏菌、志贺氏菌检测等致病菌检测的方法，以规范操作程序，保证检测数据的有效性。 二、适用范围： 本方法适用于从人体粪便中沙沙门氏菌、志贺氏菌的分离、鉴定及保存的梯相关操作。 三、生物安全要求 标本及相应的致病菌操作必须在BSL-2生物安全实验室的生物安全柜中进行。 四、试剂及仪器设备 试剂 采便盒、Cary-Blair运送培养基、亚硒酸增菌液（SF）、改良亚硒酸盐磺绿增菌肉汤（SBG）、沙门志贺培养液、木糖-赖氨酸-脱氧胆酸琼脂（XLD）、麦康凯琼脂、沙门显色培养基、结晶紫沙门培养基（YS）、三糖铁（TSI）、动力-吲哚-尿素培养基（MIU）、沙门氏菌属诊断血清、志贺氏菌属诊断血清、API20E生化试剂条、磁珠菌种保存管 仪器设备 恒温培养箱、微生物鉴定仪 五、采样方法 标本应为新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子，最优标本是转移到Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是
最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。 粪便标本：应采集自然排出的新鲜粪便，取稀水样、粘血样、脓血样，黏液样部分。盛于清洁、干燥、无吸水性的无菌容器，避免混入尿液、水和其他物质。 肛拭标本：若无法获得粪便（如排便困难或婴幼儿），也可以采用肛拭子，即无菌棉拭子用生理盐水湿润后，插入肛门内4-5cm处〈儿童约2-3cm），同一方向轻轻旋转2-3周。以目测能见到粪便为准。插入Cary-Blair运送培养基。 标本采集后立即送至实验室进行检测，若室温保存，不能超过1h；如不能立即送检，应放入Cary-Blair运送培养基中冷藏条件下24小时内送检。 六、检验程序 七、操作步骤
志贺氏菌属 志贺氏菌属（Shigella）的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌。临床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。 一、生物学性状 志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3μm ,宽 m 。不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。DNA的G+C为49-53克分子%（Tm法）。 需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37℃，最适pH为。37℃培养18-24小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，宋内氏菌菌落一般较大，较不透明，并常出现扁平的粗糙型菌落。在液体培养基中呈均匀浑浊生长，无菌膜形成。 本菌属都能分解葡萄糖，产酸不产气。大多不发酵乳糖，仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。靛基质产生不定，甲基红阳性，VP试验阴性，不分解尿素，不产生H S。根据生化反应可进行初步分类。 2 志贺氏菌属的细菌对甘露醇分解能力不同，可分为二大组。 A、不分解甘露醇组：主要为志贺氏菌。又根据能否产生靛基质，进一步分靛基质阳性（1、3、4、5、6、9、10型）和靛基质阴性（2、7、8型）的志贺氏痢疾菌。 B、分解甘露醇组：包括福氏、鲍氏、宋内氏菌。再按乳糖分解情况，分为迟缓分解乳糖的宋内氏和不分解乳糖的福氏和鲍氏菌。后者进一步再根据靛基质产生与否，分靛基质阳性（福氏菌1、2、3、4、5型和鲍氏菌5、7、9、11、13、15型）和靛基质阴性（福氏菌6型和鲍氏菌1、2、3、4、6、8、10、12、14）二类（见表一） 表一志贺氏菌属生化反应的分类 葡萄糖（+） 甘露醇（-）甘露醇（+） 志贺氏菌志贺氏菌乳糖（-）乳糖（+）（1、3、4、（2、7、8型） 5、6、9、10型）靛基质（-）靛基质（+）靛基质（-） 福氏菌6型福氏菌（1、2、宋内氏菌 鲍氏菌（1、2、 3、4、5型）， 3、4、6、8 鲍氏菌（5、7、9、 10、12、14型） 11、13、15型） 抗原构造与分型：志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原（O）及表面抗原（K）组成。主要抗原有三种。 型特异性抗原：型多糖抗原为菌体抗原的一种，是光滑型菌株所含有的重要
志贺氏菌检测
3.12 西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录中12。 3.13 粘液酸盐培养基：见附录中13。 3.14 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录中14。 3.15 志贺氏菌属诊断血清。 3.16 生化鉴定试剂盒。 4 操作步骤 4.1 增菌 以无菌操作取检样25g（ml），加入装有灭菌225ml志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均质器以8000r/min～10000r/min均质；或加入装有225ml 志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质器连续均质1min～2min，液体样品振荡混匀即可。于41.5℃±１℃，厌氧培养16h～20h。 4.2 分离 取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36℃±1℃培养20h～24h，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h再进行观察。志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表1。 表1 志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼 脂平板 志贺氏菌的菌落特征 MAC琼脂无色至浅粉红色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐 XLD琼脂粉红色至无色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐 4.3 初步生化试验 4.3.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种TSI、半固体和营养琼脂斜面各一管，置36℃±1℃培养20h～24h，分别观察结果。
4.3.2 凡是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸（发酵葡萄糖，不发酵乳糖，蔗糖）、不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体）、不产硫化氢、半固体管中无动力的菌株，挑取其4.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验和血清学分型。 4.4 生化试验及附加生化试验 4.4.1 生化试验 用4.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验，即β-半乳糖苷酶、尿素、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分解试验。除宋内氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌13型的鸟氨酸阳性；宋内氏菌和痢疾志贺氏菌1型，鲍氏志贺氏菌13型的β-半乳糖苷酶为阳性以外，其余生化试验志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。另外由于福氏志贺氏菌6型的生化特性和痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌相似，必要时还需加做靛基质、甘露醇、棉子糖、甘油试验，也可做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属。志贺氏菌属生化特性见表2。 表2 志贺氏菌属四个群的生化特征 生化反应A群：痢疾 志贺氏菌 B群：福氏 志贺氏菌 C群：鲍氏 志贺氏菌 D群：宋内 氏志贺氏 菌 β-半乳 糖苷酶 －a－－a+ 尿素－－－－赖氨酸 脱羧酶 －－－－鸟氨酸 脱羧酶 －－－b+
微生物对污染物的降解和转化 ?有机污染物生物净化（天然物质、人工合成物质） ?无机污染物生物净化 第一节有机污染物的生物净化机理 ?净化本质——微生物转化有机物为无机物 ?依靠——好氧分解与厌氧分解 一、好氧分解 ?细菌是其中的主力军 ?原理：好氧有机物呼吸 ? C → CO2 + 碳酸盐和重碳酸盐 ? H → H2O ? N → NH3→ HNO2→ HNO3 ? S → H2SO4 ? P → H3PO4 ?二、厌氧分解?厌氧细菌 ?原理：发酵、厌氧无机盐呼吸C → RCOOH（有机酸）→CH4 + CO2 ?N → RCHNH2COOH → NH3（臭味） + 有机酸（臭味） ?S → H2S（臭味） ?P → PO 3- 4 ?水体自净的天然过程中 厌氧分解（开始）→好氧分解（后续）第二节各类有机污染物的转化 一、碳源污染物的转化
?包括糖类、蛋白质、脂类、石油和人工合成的有机化合物等。 1．纤维素的转化 ?β葡萄糖高聚物，每个纤维素分子含1400~10000个葡萄糖基（β1-4糖苷键）。 ?来源：棉纺印染废水、造纸废水、人造纤维废水及城市垃圾等，其中均含有大量纤维素。 A．微生物分解途径 B．分解纤维素的微生物 ?好氧细菌——粘细菌、镰状纤维菌和纤维弧菌 ?厌氧细菌——产纤维二糖芽孢梭菌、无芽孢厌氧分解菌及嗜热纤维芽孢梭菌。?放线菌——链霉菌属。 ?真菌——青霉菌、曲霉、镰刀霉、木霉及毛霉。 ?需要时可以向有菌种库的研究机构购买或自行筛选。 2．半纤维素的转化 ?存在于植物细胞壁的杂多糖。造纸废水和人造纤维废水中含半纤维素。 ?分解过程 ?分解纤维素的微生物大多数能分解半纤维素。 ?许多芽孢杆菌、假单胞菌、节细菌及放线菌能分解半纤维素。霉菌有根霉、曲霉、小克银汉霉、青霉及镰刀霉。 3．木质素的转化自然界中哪些微生物能够进行木质素的降解呢？?确证的只有真菌中的黄孢原毛平革菌，疑似的有软腐菌。 黄孢原平毛革菌(Phanerochaete chrysosprium)是白腐真菌的一种，隶属于担子菌纲、同担子菌亚纲、非褶菌目、丝核菌科。 白腐—树皮上木质素被该菌分解后漏出白色的纤维素部分。*木质素降解的意义何在呢？（二）油脂的转化
从业人员健康体检沙门氏菌、志贺氏菌检测操作程序(讨论稿)
从业人员健康体检沙门氏菌、志贺氏菌检测操作程序一、目的 本程序用于对从业人员健康体检进行沙门氏菌、志贺氏菌检测等致病菌检测的方法，以规范操作程序，保证检测数据的有效性。 二、适用范围： 本方法适用于从人体粪便中沙沙门氏菌、志贺氏菌的分离、鉴定及保存的梯相关操作。 三、生物安全要求 标本及相应的致病菌操作必须在BSL-2生物安全实验室的生物安全柜中进行。 四、试剂及仪器设备 4.1试剂 采便盒、Cary-Blair运送培养基、亚硒酸增菌液（SF）、改良亚硒酸盐磺绿增菌肉汤（SBG）、沙门志贺培养液、木糖-赖氨酸-脱氧胆酸琼脂（XLD）、麦康凯琼脂、沙门显色培养基、结晶紫沙门培养基（YS）、三糖铁（TSI）、动力-吲哚-尿素培养基（MIU）、沙门氏菌属诊断血清、志贺氏菌属诊断血清、API20E生化试剂条、磁珠菌种保存管 4.2 仪器设备 恒温培养箱、微生物鉴定仪 五、采样方法
5.1 标本应为新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子，最优标本是转移到Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。 5.2 粪便标本：应采集自然排出的新鲜粪便，取稀水样、粘血样、脓血样，黏液样部分。盛于清洁、干燥、无吸水性的无菌容器，避免混入尿液、水和其他物质。 5.3肛拭标本：若无法获得粪便（如排便困难或婴幼儿），也可以采用肛拭子，即无菌棉拭子用生理盐水湿润后，插入肛门内4-5cm 处〈儿童约2-3cm），同一方向轻轻旋转2-3周。以目测能见到粪便为准。插入Cary-Blair运送培养基。 5.4 标本采集后立即送至实验室进行检测，若室温保存，不能超过 1h；如不能立即送检，应放入Cary-Blair运送培养基中冷藏条件下24小时内送检。 六、检验程序
埃希菌属、沙门菌属、志贺氏菌属鉴定 一、目的对某一细菌的鉴定水平，可提供以下几方面的价值：（1）决定治病方法；（2）作流行病学研究；（3）了解细菌与感染的关系；（4）进行学术交流。 二、原理 根据肠杆菌科的形态染色、培养特性、生化反应、抗原构造等 将肠杆菌科由属鉴定到具体种类。 三、标本 不同病种及不同检查目的而定，可为脓汁、渗透液、咽拭子、 血、脑脊液、食物、呕吐物、粪便等，置于无菌瓶内送检。四、试剂及器材 革兰氏染液、培养皿、培养瓶、生化鉴定管、标准血清、玻片、接种针（环）、酒精灯等。 五、鉴定程序 埃希菌属、沙门菌属、志贺氏菌属鉴定 标本增菌培养 分离培养（SS、麦康凯）
观察生长情况，挑可疑菌落 革兰氏染色镜检：G—杆菌，氧化酶（—）纯培养（转种克氏双糖铁培养基）及做动力、靛基 质、尿素、MIU 肠杆菌生化编码管 据结果初步报告 血清学凝集试验（多价、单价进一步定属、分型） 确定报告 六、临床意义 1、大肠埃希氏菌在肠道可分为致病性与非致病性，非致病性菌作为正常菌群存在，致病菌引起腹泻。肠道作为致病菌外引起其他感染。 2、沙门菌可引起伤寒和副伤寒、败血症、食物中毒、肠炎等。 3、志贺氏菌多侵犯肠道引起菌痢。 七、全防护措施 在操作过程中，要穿好工作衣，戴好口罩、手套，必要时戴眼 罩，严格按操作规程，结束后，用次氯酸溶液（0.2%）擦拭实
验台、显微镜手柄、载物台，浸泡手，然后紫外线消毒30分钟。 八、标本处理 废弃标本，培养基等统一由专门人员高压消毒处理。 九、参考文献 诊断细菌学，李仲兴等主编、第一版、香港、黄河文化出版社，1992。
微生物转化在植物类中药研究中的应用 班级：科研一班 学号：2013110039 姓名：杜风丽
微生物转化在植物类中药研究中的应用 摘要:对微生物转化在植物药成分研究中的应用取得的进展进行了综述，利用微生物对植物药成分进行转化是中药高效利用的一条新思路，可显著推动我国的植物药资源的高效开发与利用，有利于在短时间内研制出具有自主知识产权的新药。 关键词:微生物;植物药;生物转化 中药是我国民族医药的瑰宝，长期以来人们一直从现有药材中寻找有效成分。尤其植物药，从现有资源中发现新的具有生理活性作用的化合物越来越难。另外，原有植物药成分存在着的体内代谢途径不清楚、药效不强、毒副作用大、稳定性差等缺点，影响了它们的应用。要解决这些问题，一方面要对现有的植物药成分进行化学结构改造，获得新的化合物，开发新的药理活性;另一方面，要选择合适的手段，对植物药成分的体内药代动力学进行研究，更好地阐明植物药成分的药效，发挥中药在世界医药中的作用。生物转化是近五十年来发展起来的一门科学，微生物转化是生物转化的一部分，而真菌种类繁多、营养要求相对较低、易于培养，是一种有效的生物转化载体。使用真菌作为生物转化体系，以植物药成分研究为出发点，进行植物药成分的转化和体内药物代谢的研究已经初步取得了一些成果。 1.紫杉醇 紫杉醇是从红豆杉属植物的树皮中分离提取到的一种二萜类化合物，亦是继阿霉素和顺铂后备受青睐的抗癌药，但其来源一直缺乏[1]。美国施贵宝公司Patel等利用微生物转化方法进行紫杉醇的半合成，他们分别从白色类诺卡菌、藤黄类诺卡菌、莫拉菌的发酵液中分离得到c-13紫杉醇酶、C-7木糖苷酶和c-10去乙酰酶，分别将红豆杉中的几种紫杉烷如巴卡亭Ⅲ、紫杉醇C、cephalomannie、10一去乙酰基紫杉醇等的7，10，13位进行水解，得到较多而单一的10 去乙酰一巴卡亭3，该产物为紫杉醇合成的重要前体化合物，再利用化学反应，连接上13位的侧链，即可得到紫杉醇[2-3] 。这提示了生物转化技术有利于紫杉醇前体物质的得到，从而为紫杉醇的来源提供了一个新的有效途径。 2.喜树碱 喜树碱是Wall和Wani等从珙桐科乔木、我国特有的植物喜树的树叶和树皮中分离得到的具有较强的抗肿瘤和抗病毒活性的生物碱。微生物转化喜树碱可以获得10，羟基喜树
志贺氏菌属诊断血清学试验操作程序 1.目的 制定标准化的志贺氏菌属诊断血清操作程序，指导对志贺氏菌属的检测2.原理 用志贺氏菌属的代表菌株制成灭活菌抗原分别或混合免疫家兔所得的血清，经吸收出去非特异性凝集素后制成，通过凝集试验原理诊断各型志贺氏菌。3.试剂及实验设备 3.1志贺氏菌属诊断血清：宁波天润生物药业有限公司生产的规格为22种的志 贺氏菌属诊断血清 3.2试剂保存：2~8°C避光保存，防止冻结，在有效期内使用。 3.3实验设备：玻片、吸样枪、接种环、水浴箱、玻璃管、血平板、营养琼脂、 电热高温接种灭菌器。 4.程序步骤 4.1将诊断血清于冰箱取出后平衡至室温。 4.2选择符合志贺氏菌属培养特性，并经初步生化检测符合志贺菌属生物特性的 疑似菌落。 4.3菌群分析 将经18~24h血平板上纯培养的待检菌，分别用志贺氏菌属4种多价血清做玻片凝集试验，凝集阳性时，再分别用群多价血清做玻片凝集试验，群多价血清凝集阳性时，再分别与相应的单价血清做玻片凝集试验，最终确定其血清分型。如果志贺氏菌属4种多价血清做玻片凝集试验均为阴性，可能有以下3种可能性：①K抗原的存在，处理方法：取待检菌的纯菌落于生理盐水中制成浓度约2麦氏单位的菌悬液，置于100°C水浴中煮沸30min，泠却至室温后再用诊断血清进行玻片凝集试验；②非典型菌落，处理方法：通过在营养琼脂平板上的传代让其恢复抗原性，再用诊断血清进行玻片凝集试验；③诊断血清型以外的可送市或省CDC检测。 4.4玻片凝集试验法取18~24h血平板上纯培养的待检菌，用生理盐水制成2麦 氏单位的菌悬液，取诊断血清20μL于洁净玻片上，然后取20μL待检菌悬
实验六食品中志贺氏菌的检验 一、实验目的要求 1、了解食品的质量与志贺氏菌检验的意义。 2、掌握志贺氏菌的生物学特性。 3、掌握志贺氏菌检验的生化试验的操作方法和结果的判断。 4、掌握志贺氏菌属血清学试方法。 5、掌握食品中志贺氏菌检验的方法和技术。 二、原理 志贺氏菌属（Shigella）的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌。临床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。所以在食物和饮用水的卫生检验时，常以是否含有志贺氏作为指标。 志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3μ m ,宽0.5-0.7μ m 。不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，不运动，有菌毛。志贺氏菌属的主要鉴别特征为：无鞭毛，不运动，对各种糖的利用能力较差，并且在含糖的培养基内一般不产生气体。志贺氏菌的进一步分群分型有赖于血清学试验。 三、试剂和仪器 （一）最先准备的器材 规格名称数量用途 1、500ml广口瓶1个稀释样品 2、500ml三角瓶1个制增菌液 3、250ml三角瓶6个制培养基 4、18×180mm试管8支制三糖铁培养基 5、13×100mm试管40支制蛋白胨水等 6、1ml移液管2支 7、10ml移液管 2 支 8、直径为90 mm平皿12套制SS、EMB平板 9、250ml量筒1支 （二）应灭菌的其它器材 剪刀1把不锈钢汤匙1把称量纸适量 （三）应准备的培养基和试剂 培养基总量所用容器 1.GN 增菌液225ml/瓶1瓶500ml三角瓶 2.EMB培养基100ml/瓶1瓶250ml三角瓶 3.SS琼脂100ml/瓶1瓶250ml三角瓶
志贺氏菌检测 1 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱：36℃±1℃； 冰箱：2℃～5℃； 膜过滤系统； 厌氧培养装置：℃±1℃； 电子天平：感量0.1g； 显微镜：10×～100×； 均质器； 振荡器； 无菌吸管：1ml（具刻度）、10ml（具刻度）或微量移液器及吸头；无菌均质杯或无菌均质袋：容量500ml； 无菌培养皿：直径90mm； pH计或pH比色管或精密pH试纸； 全自动微生物生化鉴定系统。 2 培养基和试剂 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见附录中1。 麦康凯（MAC）琼脂：见附录中2。 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂：见附录中3。 三糖铁（TSI）琼脂：见附录中4。 营养琼脂斜面：见附录中5。 半固体琼脂：见附录中6。 葡萄糖铵培养基：见附录中7。 尿素琼脂：见附录中8。 β-半乳糖苷酶培养基：见附录中9。 氨基酸脱羧酶试验培养基：见附录中10。 糖发酵管：见附录中11。 西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录中12。
粘液酸盐培养基：见附录中13。 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录中14。 志贺氏菌属诊断血清。 生化鉴定试剂盒。 4 操作步骤 增菌 以无菌操作取检样25g（ml），加入装有灭菌225ml志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均质器以8000r/min～10000r/min均质；或加入装有225ml志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质器连续均质1min～2min，液体样品振荡混匀即可。于℃±１℃，厌氧培养16h～20h。 分离 取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36℃±1℃培养20h～24h，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h再进行观察。志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表1。 表1 志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 初步生化试验 4.3.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种TSI、半固体和营养琼脂斜面各一管，置36℃±1℃培养20h～24h，分别观察结果。 4.3.2 凡是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸（发酵葡萄糖，不发酵乳糖，蔗糖）、不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体）、不产硫化氢、半固体管中无动力的菌株，挑取其中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验和血清学分型。 生化试验及附加生化试验 4.4.1 生化试验
志贺氏菌属的生物危害评估报告 一、细菌的传播与致病 志贺菌属是主要的肠道病原菌之一，也是引起人类细菌性痢疾的病原体。本属细菌分布于全世界,是炎症性痢疾的典型病原菌,很多地区5%~10%的腹泻性疾病是由该菌属所致。弗氏志贺菌和宋内志贺菌比鲍氏志贺菌和毒力特别强的痢疾志贺菌分布更广。美国犹他州所有临床实验室工作者志贺菌病的年发病率为0.7/1 000，而临床微生物学工作者的年发病率为5.4/1 000。在英国临床实验室，沙门菌病和志贺菌病的年发病率分别为0.137/1 000和0.322/1 000，大多数感染者为微生物学工作者。 感染者和恢复期带菌者的排泄物是传染源,经粪-口途径直接传播,经污染的食物或物体可间接传播。苍蝇可作为机械性媒介,水源性传播不常见。卫生条件差的拥挤人群中最易发生流行,流行区的幼儿志贺菌病特别常见,而成人得病较轻。 恢复期和亚临床带菌者是重要传染源,但真正的长期带菌者罕见。感染很少或不诱导产生免疫性,因此同一菌种的再感染是可能的。 志贺菌可穿入低位肠段的粘膜,引起粘液分泌,充血,白细胞浸润,水肿,并常有表浅粘膜溃疡。志贺菌感染相关的水泻由内毒素介导所致,因这种内毒素可引起肠道分泌增多。 由志贺菌感染所导致的症状包括：（1）急性细菌性痢疾经潜伏期1~4日,幼儿的起病突然,表现为发热,烦躁不安,嗜睡,厌食,恶心
或呕吐,腹泻,腹痛和腹胀以及里急后重。3日内大便中出现血液,脓液和粘液.大便次数可增加到≥20次/d,体重下降和失水严重。若不治疗,患儿可在12日内死亡；若患儿存活,则在第2周急性症状消退.成人可表现为无发热的非血性,非粘液性腹泻,很少有或完全没有里 急后重.但其最初的症状可为发作性腹绞痛,急于排便,起初排出成形大便并在排便后可缓解腹 痛.以后反复发作,并且日趋严重和频繁.腹泻变得明显,系软便 或含有粘液,脓及常 有血液的水泻。严重的里急后重可造成直肠脱垂和大便失禁。成人患病常可自愈：轻者4~8日,重者3~6周。伴有循环虚脱的明显脱水和电解质丧失及死亡主要发生于＜2岁的婴儿和衰弱的成人；（2）慢性细菌性痢疾主要是因急性菌痢治疗不彻底，造成反复发作迁延不愈，病程超过两个月以上者；若是有病史、无症状，结肠镜检或粪便培养阳性者称为隐匿型菌痢，在流行病学上亦具有重要的意义；（3）携带者是指恢复期带菌、慢性带菌者和健康带菌者三种类型，尤其是健康带菌者是主要的传染源。 除此以外，还可发生继发性细菌感染,特别是衰弱和脱水的病人。严重的粘膜溃疡可引起明显的急性失血.其他并发症虽不多见,但可 有中毒性神经炎,关节炎,心肌炎和罕见的肠穿孔。小儿志贺菌病可并发溶血性尿毒症综合征。本病不会变成慢性,也不会成为溃疡性结肠炎的病因学因素。但有HLA-B27基因型的病人在志贺菌病后常常比较容易发生关节炎或明显的Reiter综合征。
微生物转化技术在现代医药工业中的应用 生工082 学号：108043051 邵越 摘要：对微生物转化技术在现代医药工业应用上的独特优势，特别是在手性药物或药物中间体制备、借助微生物转化手段实施组合生物催化在新药筛选方面发挥的积极作用进行了阐述分析。 关键词：微生物转化技术；生物催化；关键中间体 1.概述 在过去的30多年中，微生物转化或酶转化技术在有机化学合成领域中的尝试不仅使理论研究获得广泛开展，在实际应用方面也取得了长足的进步。许多化学合成工艺相当复杂的药物、食品添加剂、维生素、化妆品和其它一些精细化工产品合成过程中的某些重要反应，目前已经能够用微生物或酶转化技术得以替代。在许多国外文献中经常能够看到的描述这种技术的名词有：microbial transformation、microbial conversion、biotransformation、biotransconversion和enzymation等［1，2］。微生物转化的本质是某种微生物将一种物质(底物)转化成为另一种物质(产物)的过程，这一过程是由某种微生物产生的一种或几种特殊的胞外或胞内酶作为生物催化剂进行的一种或几种化学反应，简言之，即为一种利用微生物酶或微生物本身的合成技术。这些具有生物催化剂作用的酶大多数对其微生物的生命过程也是必需的，但在微生物转化过程中，这些酶仅作为生物催化剂用于化学反应。由于微生物产生的这些能够被用于化学反应的大多数生物催化剂不仅能够利用自身的底物及其类似物，且有时对外源添加的底物也具有同样的催化作用，即能催化非天然的反应(unnatural reactions)，因而微生物转化可以认为是有机化学反应中的一个特殊的分支。某种特殊的微生物能够将某种特定的底物转化成为某种特定的产物，其本质是酶的作用。因此，对酶转化无需多作解释，它与微生物转化的差别仅在于：前者是一个单一的酶催化的化学反应，而后者为了实现这一酶催化反应，需要为微生物提供一个能够生物合成这些酶的条件，因此，从这一角度来看，这似乎是真正的生物转化。另外，尽管用于生物转化的酶大多来自于微生物，但也可以是来自于动物和植物的酶。而对于一个具体的生物转化来说，究竟是采用微生物转化技术，还是采用酶转化技术，这要综合考虑实现这一过程的诸多因素，如成本、环境、技术装备和质量要求等。在研究一个微生物(或酶)转化过程时，需要仔细地考虑诸多方面的问题如：所用转化底物的选择、所用微生物对不同底物转化能力的考察、转化路线或转化反应的选择等。其中最主要的是寻找适合于所设计转化过程的微生物，以及如何来提高这种微生物的转化能力，即提高这种酶活力。再则是发现一种新的酶或一种新的反应以便为设计一个新的微生物转化过程提供一条线索。为了寻找能够适合作为生物催化剂的微生物酶，除了有必要对原来已知的一些重要的酶或反应进行重新评价外，一种更为有效的方法是筛选新的微生物菌株或酶［3～6］。用于微生物转化的菌株或酶的筛选的范围应该尽可能地广，因为至目前为止已经发现了3000余种能够催化各种化学反应的酶，其中有些酶的催化效果比化学催化剂好；另外，微生物的多样性和其生理生化特性的多样性(它们能够修饰和降解许许多多有机化合物)，使我们有可能找到某种微生物或酶来催化某种特定的和所期望的化学反应。 2.生物转化与药物开发的应用
图书分类号： 密级： 毕业设计(论文) 志贺氏菌的检测方法SHIGELLA DETECTION METHOD 学生姓名冯圣军 学院名称食品生物工程学院 专业名称生物技术及应用 指导教师李文 2010年4月18日
徐州工程学院学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用或参考的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标注。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名：日期：年月日 徐州工程学院学位论文版权协议书 本人完全了解徐州工程学院关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：本校学生在学习期间所完成的学位论文的知识产权归徐州工程学院所拥有。徐州工程学院有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的纸本复印件和电子文档拷贝，允许论文被查阅和借阅。徐州工程学院可以公布学位论文的全部或部分内容，可以将本学位论文的全部或部分内容提交至各类数据库进行发布和检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 论文作者签名：导师签名： 日期：年月日日期：年月日
摘要 志贺氏菌是引起人类肠道疾病常见的病原菌，在我国感染性腹泻病原菌中高居首位。为了能够有效地预防、治疗和控制水或食源性传染病，对水或食品中志贺氏菌的快速检测与鉴定显得十分重要。本文主要介绍了志贺氏菌的各项检测技术及其优缺点，并对志贺氏菌的检验技术进行了展望。 关键词志贺氏菌；检测技术；展望
Abstract Shigella is a common disease caused by human intestinal bacteria, pathogens of infectious diarrhea in China topped the rankings. In order to effectively prevent, treat and control water or food-borne diseases, water or food in Shigella rapid detection and identification is very important. This paper describes the Shigella detection technology and its strengths and weaknesses, and Shigella inspection techniques were reviewed. Keywords Shigella detection methods food safety
志贺氏菌属及检验 志贺氏菌属（Shigella）的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌。临床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。 一、生物学性状 志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3μ m ,宽0.5-0.7μ m 。不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。DNA的G+C为49-53克分子%（Tm法）。 需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37℃，最适pH为6.4-7.8。37℃培养18-24小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，宋内氏菌菌落一般较大，较不透明，并常出现扁平的粗糙型菌落。在液体培养基中呈均匀浑浊生长，无菌膜形成。 本菌属都能分解葡萄糖，产酸不产气。大多不发酵乳糖，仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。靛基质产生不定， S。根据生化反应可进行初步分类。 甲基红阳性，VP试验阴性，不分解尿素，不产生H 2 志贺氏菌属的细菌对甘露醇分解能力不同，可分为二大组。 A、不分解甘露醇组：主要为志贺氏菌。又根据能否产生靛基质，进一步分靛基质阳性（1、3、4、5、 6、9、10型）和靛基质阴性（2、 7、8型）的志贺氏痢疾菌。 B、分解甘露醇组：包括福氏、鲍氏、宋内氏菌。再按乳糖分解情况，分为迟缓分解乳糖的宋内氏和不分解乳糖的福氏和鲍氏菌。后者进一步再根据靛基质产生与否，分靛基质阳性（福氏菌1、2、3、4、5型和鲍氏菌5、7、9、11、13、15型）和靛基质阴性（福氏菌6型和鲍氏菌1、2、3、4、6、8、10、12、14）二类（见表一） 抗原构造与分型：志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原（O）及表面抗原（K）组成。主要抗原有三种。 型特异性抗原：型多糖抗原为菌体抗原的一种，是光滑型菌株所含有的重要抗原。当菌株变为粗糙型时，此抗原也常随之消失，各菌型所含的型抗原不同，可用于区别菌种的型别。 群特异性抗原：为光滑型菌株的次要抗原，也是菌体抗原的一种。特异性较低，常在数种近似的菌内出现。在福氏菌株中，由于所含群抗原不同，可将某些菌型分为多种亚型，如福氏菌2型，根据群抗原不同，
志贺氏菌检测 1 设备与材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其她设备与材料如下： 1、1 恒温培养箱:36℃±1℃； 1、2 冰箱：2℃~５℃; 1、3 膜过滤系统； 1、4 厌氧培养装置：4１、５℃±１℃; 1、5电子天平：感量0。1g； １、6显微镜:１0×~100×; 1、７均质器； １、８振荡器; 1、9 无菌吸管:1ml（具0、０１ml刻度)、10mｌ（具0、1ｍl刻度)或微量移液器及吸头； 1、1０无菌均质杯或无菌均质袋：容量５０0ml； １、11无菌培养皿:直径９0mm； 1、1２ｐＨ计或pＨ比色管或精密pＨ试纸; 1、１3全自动微生物生化鉴定系统。 2培养基与试剂 3、１志贺氏菌增菌肉汤—新生霉素：见附录中１。 3、２麦康凯(MAC）琼脂：见附录中2. 3、3 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐(XLD)琼脂：见附录中3。 3、4 三糖铁（TSI）琼脂:见附录中4。 3、5 营养琼脂斜面：见附录中5。 3、6 半固体琼脂:见附录中6． 3、7 葡萄糖铵培养基：见附录中7。 3、8尿素琼脂：见附录中8。 3、9 β－半乳糖苷酶培养基:见附录中9。 ３、10氨基酸脱羧酶试验培养基:见附录中１０。 ３、11 糖发酵管:见附录中11。
3、１2 西蒙氏柠檬酸盐培养基:见附录中12. 3、1３粘液酸盐培养基:见附录中１3。 ３、14蛋白胨水、靛基质试剂：见附录中14。 3、15 志贺氏菌属诊断血清. 3、１6 生化鉴定试剂盒。 4 操作步骤 4、1 增菌 以无菌操作取检样25g(ml）,加入装有灭菌２25mｌ志贺氏菌增菌肉汤得均质杯,用旋转刀片式均质器以8００0ｒ／mｉn~10000r/ｍin均质;或加入装有225ｍｌ志贺氏菌增菌肉汤得均质袋中，用拍击式均质器连续均质1ｍiｎ~2min，液体样品振荡混匀即可。于４1、５℃±１℃，厌氧培养16h～20h。 ４、２分离 取增菌后得志贺氏增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板与MAＣ琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36℃±1℃培养２０h~24h，观察各个平板上生长得菌落形态。宋内氏志贺氏菌得单个菌落直径大于其她志贺氏菌.若出现得菌落不典型或菌落较小不易观察,则继续培养至48h再进行观察。志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上得菌落特征见表1. 表1 志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上得菌落特征 4、3初步生化试验 4。3.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落,分别接种ＴＳI、半固体与营养琼脂斜面各一管，置36℃±1℃培养２0ｈ～２4h,分别观察结果。４．3。2 凡就是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸(发酵葡萄糖,不发酵乳糖,蔗糖）、不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体）、不产硫化氢、半固体管中无动力得菌株,挑取其４、3、1中已培养得营养琼脂斜面上生长得菌苔，进行生化试验与血清学分型。 4、４生化试验及附加生化试验
志贺氏菌是引起人类肠道疾病常见的病原菌，在我国感染性腹泻病原菌中高居首位。为了能够有效地预防、治疗和控制水或食源性传染病，对水或食品中志贺氏菌的快速检测与鉴定显得十分重要。本文主要介绍了志贺氏菌的各项检测技术及其优缺点，并对志贺氏菌的检验技术进行了展望 志贺氏菌的检测方法 随着生物实验技术的发展，志贺氏菌的检测和鉴定技术也在不断的完善，大致可分为三大类：常规生化鉴定方法、免疫学方法以及分子生物学方法。其中最为常用的是分子生物学上的常规PCR检测。 2.1 常规生化鉴定方法 常规生化检测须经过增殖培养、分离纯化、生化试验、血清学实验等，检验步骤繁琐、耗时长、准确性低，且一次检测完成样品项数较少[5]，不能应对市场需求的快速准确检验方法的要求。但这种方法具有直观、准确、稳定性好且假阳性率低等特点，因此一直被沿用至今。国家标准方法[6]中采用常规生化鉴定方法对志贺氏菌进行检测，整个过程需要4～5d。通过对SS 培养基、Mac 培养基、HE 培养基和MT 培养基进行比较，发现SS 培养基对志贺氏菌的检出率最高。为防止漏检其他菌型，可同时采用Mac 培养基来提高检出率。 2.2 免疫学方法 免疫学的发展为致病菌的快速检测提供了新方法，同时大大提高了致病菌检测的灵敏性和特异性。除了凝集实验、沉淀实验和补体实验等经典的免疫学检测方法，以免疫学方法为基础建立起来的检测技术也已被应用于志贺氏菌的检测。 2.2.1 酶联免疫技术 酶联免疫技术 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术。建立间接 ELISA 方法以检测检测志贺菌纯培养液，其检出限为105～106CFU/ml；建立双抗夹心 ELISA 方法检测含0.1～1CFU/ml 志贺氏菌的样品在增菌13h 后可检出阳性反应，含1～10CFU/ml志贺氏菌的样品在增菌11h 后可检出阳性；用间接 Dot-ELISA 方法检测志贺氏菌的检出限可达106CFU/ml。E L ISA 法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点，适用于志贺氏菌的快速检测，但ELISA 方法影响因素多，假阳性率高且不易确定，还需要其他方法辅助检测。 2.2.2 SPA协同凝集法 金黄色葡萄球菌 A 蛋白(Staphylococcal protein A，SPA)是某些金黄色葡萄球菌细胞壁的一种表面蛋白，具有同人和多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合的能力。SPA 协同凝集法是用已知标准血清吸附到含 A 蛋白的金黄色葡萄球菌表面，使之成为吸附抗体的载体，再以此去诊断相应未知抗原产生的肉眼可见的凝集颗粒。用含 A 蛋白丰富的金黄色葡萄球菌菌体与志贺氏菌抗血清在一定条件下混合致敏，让抗体结合到金黄色葡萄球菌细胞壁的A 蛋白上制成SPA 诊断试剂，样品经增菌后即可用SPA 诊断试剂来检验。SPA 协同凝集法在 24～48h 内即可得到检测结果，且检出率高，可作为一种快速灵敏的检验方法。由于SPA 能结合大量抗体，大大提高了灵敏性，缩短了检验周期。 2.3 分子生物学方法 以分子生物学为基础建立的众多检测技术以其敏感、快速、高特异等特点成为生物技术革命的新产物,已经应用于食源性致病菌的检测。检测志贺氏菌的分子生物学技术主要包括：聚合酶链反应、脉冲场凝胶电泳、基因芯片和探针技术等。 2.3.1 聚合酶链式反应 志贺氏菌的传统检测方法耗时长，操作繁琐，已不能满足食品安全控制的需要。分子生物学尤其是 PCR技术的发展给志贺氏菌的快速检测提供了广阔的空间。在此主要介绍用于志贺
志贺氏菌属 志贺氏菌属（Shigella ）的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌。临床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。 一、生物学性状志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3 μm, 宽0.5-0.7 μm 。不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。DNA的G+C 为49-53 克分子%（Tm法）。 需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37℃，最适pH 为6.4-7.8 。37℃培养18-24 小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，宋内氏菌菌落一般较大，较不透明，并常出现扁平的粗糙型菌落。在液体培养基中呈均匀浑浊生长，无菌膜形成。 本菌属都能分解葡萄糖，产酸不产气。大多不发酵乳糖，仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。靛基质产生不定，甲基红阳性，VP 试验阴性，不分解尿素，不产生H2S。根据生化反应可进行初步分类。 志贺氏菌属的细菌对甘露醇分解能力不同，可分为二大组。A、不分解甘露醇组：主要为志贺氏菌。又根据能否产生靛基质，进一步分靛基质阳性（1、3、4、5、6、9、10型）和靛基质阴性（2、7、8 型）的志贺氏痢疾菌。 B、分解甘露醇组：包括福氏、鲍氏、宋内氏菌。再按乳糖分解情况，分为迟缓分解乳糖的宋内氏和不分解乳糖的福氏和鲍氏菌。后者进一步再根据靛基质产生与否，分靛基质阳性（福氏菌1、2、3、4、5 型和鲍氏菌5、7、9、11、13、15 型）和靛基质阴性（福氏菌6 型和鲍氏菌1、2、3、4、6、8、10、12、14）二类（见表一） 表一志贺氏菌属生化反应的分类 葡萄糖（+） 福氏菌6 型福氏菌（1、2、宋内氏菌 鲍氏菌（1、2、3 、4、5 型）， 3、4、6、8 鲍氏菌（5、7、9、10、12、14 型）11 、13、15型）抗原构造与分型：志贺氏菌属细菌的抗 原结构由菌体抗原（O）及表面抗原K）组成。主要抗原有三种。 型特异性抗原：型多糖抗原为菌体抗原的一种，是光滑型菌株所含有的重要抗原。当菌株变为粗糙型时，此抗原也常随之消失，各菌型所含的型抗