论著
【收稿日期】2004-10-12;【修回日期】2004-12-03
【作者简介】李卫华(1971-),男,籍贯河北,硕士,主治医师,主要研究方向为瘢痕的形成机理。
增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞生长差异比较
李卫华1,李德水2,刘洪琪2
(武警医学院:11整形美容中心;21烧伤整形科;天津300162)
摘 要: 【目的】探讨增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞基因表现型的差异以及EGF 、PD GF 和
bF GF 对其的影响。【方法】测定细胞生长曲线;应用液闪计数测定成纤维细胞胶原蛋白的合成。【结果】增生性
瘢痕成纤维细胞增殖速度比正常皮肤成纤维细胞慢;胶原蛋白的合成高于正常皮肤成纤维细胞。EGF 、PD GF 和
bF GF 均对两种成纤维细胞的增殖具有强烈的刺激作用。EGF 和bF GF 可减少增生性瘢痕成纤维细胞的胶原蛋白
合成,PD GF 可以使两种成纤维细胞的胶原蛋白合成增加。【结论】增生性瘢痕成纤维细胞是一种特殊基因表现型的成纤维细胞,它具有自己特殊的生物学特性。EGF 、PD GF 和bF GF 在增生性瘢痕的形成过程中可能具有重要作用。
关键词:增生性瘢痕;成纤维细胞;胶原蛋白;表皮细胞生长因子;血小板衍生生长因子;碱性成纤维细胞生长因子
【文章编号】 100825041(2005)022******* 【中图分类号】 R32912 【文献标识码】 A
The study of the phenotypic differences of hypertrophic scar f ibroblasts versus normal dermal f ibroblasts by cytokine stimulation
L I Wei 2hu a ,L I De 2shui ,L IU H ong 2qi (Department of Plastic and Esthetic Surgery ,The A ff iliated H ospital of Medical College of Chinese People ′s Armed Police Force ,Tianjin 300162,China)
Abstract :【Objective 】To study the phenotypic differences between the hypertrophic scar fibroblasts and normal dermal fibroblasts by determining their responsiveness to EGF 、PD GF and bF GF 【Methods 】Hypertrophic scar fibroblasts and normal dermal fibroblasts were propagated in culture.Their proliferative behaviors were studied.The collagen synthetic rates were determinedwith liquid scintillation technology.【R esults 】Hypertrophic scar fibroblasts grew at a lower rate than that of normal dermal fibrob1asts.The collagen synthetic rate of the hypertrophic scar fibroblasts was higher than that of the normal dermal fibroblasts.EGF 、PD GF and bF GF stimulated the proliferation of both cells violently.The col1agen synthesis of hypertrophic scar fibroblasts was inhibited by EGF and bF GF whereas PD GF increased both cells ′collagen synthesis.【Conclusion 】The hypertrophic scar fibroblast is a different phenotype from the normal dermal fibrob 2last.EGF 、PD GF and bF GF may play important roles in the formation of hypertrophic scars.K ey Words :Hypertrophic scar ;Fibroblasts ;Collagen ;EGF ;PD GF ;bF GF
增生性瘢痕一直是限制患者正常愈合的一个主要问题,其病因尚未完全明了。Worrall 1的研究结果显示将正常皮肤成纤维细胞长期暴露于可溶性单核细胞提取物的环境中可使成纤维细胞发生红斑
狼疮样基因表现型改变。G arner 2的研究结果揭示增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞可能具有不同的基因表现型。为了进一步明确增生性瘢痕成纤维细胞基因表现型,我们应用体外细胞培养技术研究了增生性瘢痕及正常皮肤成纤维细胞的形态、生长曲线以及胶原蛋白的合成,并就表皮细胞生长因子(EGF )、血小板衍生生长因于(PD GF )和碱性成纤维细胞生长因子(bF GF )对增生性瘢
痕成纤维细胞的作用进行了研究。
1 材料与方法
111 材 料
11111 主要试剂:DM EM低糖型培养基由美国GIBCO公司生产,胎牛血清由中国医学科学院血液学研究所生产,EGF、PD GF、bF GF、粗制Ⅰ型胶原酶、离解蛋白DispaseⅡ、胰酶、N EM、Ⅶ型胶原酶、POP、POPOP、TritonX2100均由美国Sigma公司生产。β2氨基丙腈由上海生化公司生产,3H2脯氨酸(1mCi/ml)由北京原子能所生产。11112 实验器材:超净工作台由北京半导体设备一厂生产,CO2培养箱由日本Sanyo公司生产,倒置相差显微镜由日本Olympus公司生产,液闪计数仪由美国Bickman公司生产。
11113 标本的采集:本组10例标本取自住院患者手术时切除的增生性瘢痕(经病理组织学检查确诊),同时在植皮时获取患者剩余的正常皮肤。患者无结缔组织疾病或可能影响结缔组织代谢的疾病,无心、肺、肝、肾等慢性疾病,3m内未使用过类固醇激素、青霉胺、抗肿瘤药物等,且未接受过放射线治疗。本组男7例,女3例,年龄6～42岁,瘢痕为烧伤后8m～3年,瘢痕凸出于皮肤表面,发红,痒、痛症状明显,因此可以确定瘢痕处于增生活跃期。
112 方 法
11211 成纤维细胞培养:我们采用消化法来进行成纤维细胞的原代培养。所得标本切除皮下脂肪组织,置于含青霉素和链霉素各100Iu/ml的DM EM 培养基中。2h后将组织标本浸于25%DispaseⅡ中,置于37℃条件下作用2h,完整撕下表皮层。真皮组织用PBS缓冲液反复冲洗后,剪切成1～2 mm的小块,加入30～50倍体积1mg/ml粗制Ⅰ型胶原酶,于37℃条件下继续消化2～4h。边消化边振荡,随时在显微镜下观察消化结果。当成纤维细胞大部分从包裹的胶原纤维中分离出来时,用100目不锈钢网过滤,去除大的组织块残渣,滤液离心,去除上清液,细胞计数后以(1～2)×105细胞/25ml培养瓶接种,以后每隔3d换1次培养液。待细胞融合后,用胰酶消化后传代。实验所用细胞为体外培养3～5代细胞。
11212 细胞生长动力学研究:实验分为正常对照组、EGF组、PD GF组和bF GF组。以104细胞/孔接种细胞于96孔培养板上,每组24孔,对照组加入含014%FCS的DM EM培养基。实验组每组分别加入8ng/ml EGF、4ng/ml PD GF和4ng/ml bF GF的含014%FCS DM EM培养基,分别于细胞接种后第3、6、9、12d进行细胞记数。每次每组选取6孔细胞进行记数。最后绘制细胞生长曲线。
11213 胶原蛋白合成的测定:实验分为空白对照组、正常对照组、EGF组、PD GF组和bF GF组,每组8孔。以105细胞/孔分别接种增生性瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞于24孔培养板上,每孔加入1ml含8%FCS的DM EM培养液。分别于72、96h后去掉原培养液,加入014%FCS的DM EM培养基。120h后实验组每孔加入含有设定浓度的EGF、PD GF、bF GF和50μg/ml抗坏血酸钠的DM EM培养基。168h后加入3H标记的脯氨酸和β2氨基丙腈,使其最终浓度分别为5μCi/ml 和80μg/ml。192h后,根据Postlethwaite3的方法分别收集两份上清液,每份均为015ml。
一份上清液用于总蛋白含量的测定:在收集到的上清液中加入70μl012M Tris/013MCaCl2缓冲液(p H715),25μl FCS,30μl50mM N EM,75μl50%三氯乙酸/0175%鞣酸混合液,在4℃条件下静置30min,将析出的蛋白过滤到玻璃纤维滤膜上,25℃条件下隔夜烘干,置于闪烁液中进行液闪计数。另一份上清液中加入20μl纯化的细菌胶原酶(用Sephadex G2200凝胶柱过滤去除蛋白酶4),37℃孵育90min以去除胶原蛋白,剩余的蛋白进行液闪计数即为非胶原蛋白的量。最后用总蛋白的量减去非胶原蛋白的量,即为胶原蛋白的含量。最后结果以液闪计数cpm/105细胞表示。11214 统计学处理:每组标本均数间的比较用t 检验进行统计学处理。
2 结 果
211 细胞生长动力学测定结果
通过细胞生长动力学测定,发现增生性瘢痕成纤维细胞倍增时间约为6d,而正常皮肤成纤维细胞倍增时间为3d,细胞发生融合时前者的细胞数
为(114±015)×105,远远少于后者的细胞数(215±018)×105,仅为后者的56%,两者之间具
有明显的差异(P <01001)。而EGF 、PD GF 、bF GF 对两种成纤维细胞均具有明显的促进增殖作
用。在这三种生长因子的作用下,细胞的倍增时间缩短,细胞融合后细胞数明显增多(图1)
。
图1 增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞生长曲线
212 细胞胶原蛋白合成测定结果
增生性瘢痕成纤维细胞胶原蛋白合成的量为(614±113)×103cpm/105细胞,正常皮肤成纤维
细胞胶原蛋白合成的量为(311±019)×103cpm/105细胞,增生性瘢痕成纤维细胞胶原蛋白合成的
量明显高于正常皮肤成纤维细胞(P <01001)。EGF 和bF GF 对增生性瘢痕成纤维细胞胶原蛋白
的合成具有明显的抑制作用,对正常皮肤成纤维细胞胶原蛋白的合成无明显作用。而PD GF 对两种成纤维细胞胶原蛋白的合成均具有明显的刺激作用,PD GF 对增生性瘢痕成纤维细胞胶原蛋白合成的促进作用更明显(图2)
。
图2 生长因子对成纤维细胞胶原蛋白合成的影响
3 讨 论
增生性瘢痕成纤维细胞的来源目前尚未有明确的结论。从我们的实验结果来看,增生性瘢痕成纤
维细胞与正常皮肤成纤维细胞具有不同的基因表现型,它们具有不同的生物学特性,无论细胞的增殖速度还是胶原蛋白的合成,两者都具有明显的差异。
瘢痕的形成是创伤愈合的结果,如果在创伤愈合过程中周围环境发生了改变,那么处于这种环境中的成纤维细胞也有可能发生某些改变。有实验表明,某些生长因子长期存在确实可以使成纤维细胞生物学特性发生改变1。目前已知TGF 2β在增生性瘢痕形成过程中扮演了重要角色,它可以促进增生性瘢痕成纤维细胞的胶原蛋白合成5。我们的实验证明EGF 、PD GF 、bF GF 可以使成纤维细胞的生物学特性发生明显的改变。它们均具有促进细胞增殖作用。EGF 和bF GF 可以使增生性瘢痕成纤维细胞的胶原蛋白合成明显降低,而PD GF 则使增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞的胶原蛋白合成均增加。已知bF GF 可以稳定细胞的基因表现型6。从我们的实验中发现,EGF 也具有稳定细胞基因表现型的作用,它们可以使增生性瘢痕成纤维细胞的生物学特性趋于正常皮肤成纤维细胞。
有实验表明7,8,在增生性瘢痕组织中,TGF 2β和PD GF 的含量均明显高于正常皮肤标本,同时增生性瘢痕成纤维细胞比正常皮肤成纤维细胞可分泌更多的TGF 2
β和PD GF 。经过放射线或激光治疗后的增生性瘢痕,TGF 2
β和PD GF 的含量均明显降低,成纤维细胞分泌TGF 2
β和PD GF 的量也减少。但目前还没有EGF 和bF GF 在增生性瘢痕组织中含量的报道。也许在创伤愈合过程中成纤维细胞周围环境中TGF 2
β和PD GF 的增加以及EGF 和bF GF 的减少使细胞的基因表现型发生了改变。临
床上早期创面应用EGF 和bF GF 可以促进创面愈合并减少增生性瘢痕的形成。
另外有文献报道9,10皮肤组织中成纤维细胞本身就具有不同的基因表现型,处于皮肤浅层的成纤维细胞增殖能力较强,但胶原蛋白合成能力较
弱;而处于皮肤深层的成纤维细胞增殖能力较弱,胶原蛋白合成能力较强。临床上较深的创伤更易引起增生性瘢痕也许与此有关。
另一方面增生性瘢痕组织中具有一种特殊功能的细胞2肌成纤维细胞,它同时具有平滑肌细胞和
成纤维细胞超微结构的特性,但它与成纤维细胞具有完全不同的生物学特性,我们所用的成纤维细胞系中是否含有肌成纤维细胞尚不清楚,还需要进一步的实验来证实。
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(责任编辑:李宏伟)
(上接第103页)
CDE与CDFI在移植肾血流显像中优缺点的比较:(1)血流信号的强弱方面:CDE的确优于CDFI,更易显示低速的血流信号;(2)CDFI从色彩上可根据红迎蓝离原理,结合肾动脉、静脉走向,即可直观判断为动脉或静脉,CDE则无法判断血流方向,无法判断动脉、静脉;(3)CDFI可根据血流信号的亮度,大致估计血流速度高低,而CDE无法判断血流速度高低;(4)CDE的高敏感性,有时可夸大血流信号,更易溢出,因而,CD2 FI及CDE各有优势,不能相互取代,而应结合使用,相互弥补不足,提高超声诊断水平。
【参考文献】
1周永昌,郭万学.超声医学M.第3版.北京:科学技术文献出版社,1998.1031.
2廖明松,李树森,赵金英,等.彩色多普勒能量图在移植肾排异反应诊断和治疗中的应用研究J.中国超声医学杂志, 2000,16(8):612-615.
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(责任编辑:李宏伟)
关于图表的要求
图表力求简明,内容避免与正文重复,正文与图表中数据须认真核对,做到准确无误,互相一致。表一律采用三线表格式,并置于文内相应处。线条图放文内相应处,并在图下列出图序、图题和图注,图内还应注明应有的全部文字和符号。照片图必须图像清晰,层次分明,并在背后用铅笔轻轻注明图序、上下方向和作者姓名,供制版用。文内置照片图处,应给出照片图的复印件或绘出草图,并在其下标明图的序号、图题及图注。
(编辑部)
老化皮肤成纤维细胞的研究进展 丛敬1，2，指导：吴景东1 <1 辽宁中医药大学，沈阳110032；2 沈阳医学院，沈阳110034 ） 【摘要】延缓皮肤老化，永葆青春是人类从未放弃的梦想。成纤维细胞作为真皮中主要细胞成分，已广泛应用于皮肤老化模型的建立和研究中。较系统的介绍了成纤维细胞的组织学结构与功能，其在细胞和分子水平影响皮肤老化的机制，对深入研究皮肤老化的机制、预防和治疗具有重要意义。 【关键词】成纤维细胞；皮肤老化；机制；中药研究 成纤维细胞是皮肤真皮中最主要的细胞成分，在合成分泌纤维和细胞外基质中扮演着重要的角色，在组织创伤修复中发挥着重要的作用。随着年龄的增长，皮肤老化突显，可以表现为皮肤干燥粗糙，皱纹增多、加深，皮肤松弛，弹性下降等。这些临床表现都与成纤维细胞数量减少，合成功能下降或异常有关。因此，在皮肤老化的研究中，人们越来越关注成纤维细胞的结构和功能的改变及其对皮肤老化产生的影响。 1 成纤维细胞的组织学结构与功能 光镜下观察[1]，成纤维细胞胞体较大，常呈多突起的扁平星状。细胞核较大，扁卵圆形，着色浅，核仁明显。细胞质较丰富，呈弱嗜碱性。胞质内有较多的核糖核酸，碱性磷酸酶的活性很强。电镜下，细胞表面有一些微绒毛和粗短的突起，胞质内富于粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体。 成纤维细胞的超微结构表明，细胞合成蛋白质功能旺盛。成纤维细胞既合成和分泌胶原蛋白，弹性蛋白，生成胶原纤维、网状纤维和弹性纤维，也合成和分泌糖胺多糖和糖蛋白等基质成分[1]。在婴儿和青年人皮肤中，Ⅰ型胶原蛋白的含量约占70％，Ⅲ型胶原蛋白占30％。在衰老过程中，成纤维细胞合成Ⅲ型胶原蛋白增加，Ⅰ型胶原蛋白减少。成纤维细胞受损，还可以产生大量异常弹性蛋白，导致皮肤弹性下降，皱纹增多，且难以平复。 2 成纤维细胞致皮肤老化的作用机理 皮肤老化包括自然老化和外源性老化两种形式，其发生、发展的机制十分复杂。成纤维细胞在致皮肤老化的过程中发挥着十分重要的作用。 2.1基因调控异常 紫外线照射可导致成纤维细胞急性DNA 光损伤和突变，形成环丁烷嘧啶二聚体和6- 4 嘧啶- 嘧啶酮光产物，光老化的成纤维细胞对其修复能力下降，表达参与细胞核外切修复的蛋白及其mRNA水平亦下降[2-3]。而光老化成纤维细胞DNA修复能力的下降是由于修复合成相关因子表达下降导致核苷酸切除修复后期功能障碍造成的[4]。 人类线粒体DNA Ist. Nazionale Neurologico Carlo Besta Laboratory Procedures for Human Cell Culture August 2004 _______________________________________________________________ PRIMARY FIBROBLAST CULTURE FROM HUMAN SKIN BIOPSY This protocol describes the steps for obtaining a primary fibroblast cell line from human skin biopsies. Fibroblasts are derived directly from excised skin as explants; enzyme digestion by collagenase may help obtain cells in a shorter time. This protocol describes the different steps for obtaining a primary cell line from a skin biopsy. Equipment and materials ?Laminar flow hood ?CO2 incubator ?Inverted microscope ?Sterile surgical Instruments for microdissection ?BME fibroblast medium +2 or Mg+2 ?PBS 10x without Ca ?Collagenase type II (4mg/ml) ?Petri dishes 100 mm ?Pasteur pipettes 2 ?Culture flask, 25 cm ?15 ml sterile plastic tube BME Fibroblast medium BME 80 ml Foetal bovine serum 20 ml Penicillin-streptomycin solution 100x 1 ml Filter and store at +4°C, up to 1 month. The skin biopsy sample should be shaped as a diamond and about 5-10 mm in diameter. Collect the tissue sample in sterile BME fibroblast medium. Procedure 1 1.Rapidly wash the skin biopsy in PBS in a Petri dish, cut into small fragments and transfer these to a flask. https://www.doczj.com/doc/7a4592852.html,ing a sterile Pasteur pipette with flame-rounded tip, distribute the small tissue fragments over the bottom surface of the culture flask. 3.Pass the flask rapidly and carefully through the Bunsen flame in order to evaporate the medium so that the minced tissue pieces adhere to the plastic surface, but so as not to heat-damage the minced tissue. Take care not to cook the tissue! 4.Carefully add BME medium for fibroblast growth, firmly close the lid of the flask and place in CO2 incubator. 5.The next day, slightly unscrew the lid of the flask so that the tissue can “breathe.” 6.Replace the culture medium after two days and, from this point on, replace it three times a week. ·基础研究· 以人皮肤成纤维细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞* 杨俊林 刘雄昊喻姣玲冯劢谭杨李卓吴 奔 高 庭 潘 盛 邬玲仟梁德生夏家辉 （中南大学医学遗传学国家重点实验室湖南长沙410078） 摘要目的：比较人皮肤成纤维细胞（human dermal fibroblasts,HDFs ）与小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEFs)的增殖能力及研究人皮肤成纤维细胞作为饲养层支持人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs ）未分化生长的能力。方法：利用组织贴壁法从人皮肤中分离出HDFs ，通过细胞形态的观察和生长曲线的绘制比较HDFs 与MEFs 的体外增殖能力。将HDFs 作为饲养层细胞与hESCs 共培养，传代12代后，检测hESCs 碱性磷酸酶(AKP)、表面特异性标志及胚胎干细胞特异性转录因子。结果：HDFs 可连续传代培养15代以上，10代以下的HDFs 增殖迅速，而MEFs 自第4代起，增殖能力就明显下降；hESCs 在HDFs 饲养层上可传代培养12代以上，克隆边界清晰，细胞排列紧密，碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性，表达了hESCs 特异性转录因子。结论： HDFs 比MEFs 具有更强的增殖能力；HDFs 可作为培养hESCs 的饲养层细胞。关键词：人胚胎干细胞；人皮肤成纤维细胞；饲养层细胞中图分类号： R329.2文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2009） 16-3001-05Culture of human embryonic cells by using human dermal fibroblasts as feeder cells* YANG Jun-lin,LIU Xiong-hao,YU Jiao-ling,FENG Mai,TAN Yang,LI Zhuo,WU Ben,GAO Ting, PAN Sheng,WU Ling-qian,LIANG De-sheng,XIA Jia-hui （State Key Laboratory of Medical Genetics,Central South University,Changsha,410078，China ） ABSTRACT Objective:To compare the proliferative potential of human dermal fibroblasts(HDFs)and mouse embryonic fibroblasts (MEFs),and to explore the feasibility for HDFs as feeder cells to support the growth of human embryonic cells (hESCs).Methods:HDFs were obtained from human skin by using the method of tissue-adherence.The proliferative capacities of HDFs and MEFs were compared by cell morphology and growth curve.HDFs were used as feeder cells to culture hESCs.After growing on HDFs for 12passages,the hESCs were tested for the expressions of alkaline phosphatase (AKP),the cell surface markers and cell-specific transcription factor of hESCs.Results:HDFs could be subcultured for more than 15passages,and retained strong proliferative potential before 10passages,while it decreased obviously in MEFs after subcultured for 4passages.The hESCs can passaged on HDFs feeder cells for 12passages with tightly packed cells and clear boundaries of clone,showing the positive results of alkaline phosphatase (AKP)and the cell surface markers and the expression of hESCs-specific transcription factor.Conclusion:HDFs showed a stronger proliferation ability than MEFs;HDFs can support the growth of hESCs. Key words:Human embryonic stem cells;Human dermal fibroblasts;Feeder cells Chinese Library Classification:R329.2Document code:A Article ID:1673-6273（2009） 16-3001-05*基金项目：国家重点基础研究发展计划（2004CB518800），国家高技术研究发展计划（2007AA021002和2007AA021206）和国家自然科学基金（30700458和30971298） 作者简介：杨俊林（1977-），男，博士研究生，主要研究方向：基因治疗与干细胞生物学，E-mail ：yangjunlin@https://www.doczj.com/doc/7a4592852.html, 刘雄昊（1975-），男，博士，助理研究员，主要研究方向：基因治疗与干细胞生物学，E-mail ：liuxionghao@https://www.doczj.com/doc/7a4592852.html, 杨俊林、刘雄昊为并列第一作者 △通讯作者：梁德生，E-mail ：liangdesheng@https://www.doczj.com/doc/7a4592852.html, （收稿日期：2009-07-06接受日期：2009-07-30） 前言 自1998年Thomson [1]等人建立第一株人胚胎干细胞（hu-man embryonic stem cells,hESCs ）细胞系以来，hESCs 迅速成为人干细胞领域的研究热点。 hESCs 是具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，可以定向分化成不同的细胞、组织，这使得hESCs 在细胞治疗以及再生医学方面具有巨大的潜力。目前大 多数的人胚胎干细胞系是以小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse em-bryonic fibroblasts,MEFs)作为饲养层细胞维持其生长和未分化状态的， MEF 细胞通过与hESC 直接接触及分泌多种因子维持人胚胎干细胞未分化状态。而鼠源性的饲养层细胞很可能给hESCs 带来动物源性的病原体或生物活性分子的污染，严重阻碍hESCs 的临床应用。早期就在鼠的细胞发现Hantaan 病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV ）、呼肠病毒-3[2]，这些病 成纤维细胞的最新用途 一、自体成纤维细胞除皱整形技术的研究应用进展 1、培养的成纤维细胞去皱技术在整形外科上的应用 2005年Anon道在2002年ChelseWestminster医院用Isoagen治疗85％烧伤病人取得了被称为“接近奇迹”的效果。病人康复后说：“瘢痕的皮肤整个不再正常，但治疗后很多的活力回到了她脸上，朋友们见到她认为又回到了她自己，我不能想象有可能用任何其他的方法。” 2、作用原理： 注射培养的自体成纤维细胞制剂能促进软组织的强化作用和促进组织的再生用于除皱和软组织的缺陷，胶原蛋白的氨基酸组成和结构，具有组织细胞的支持功能，是构成皮肤的支架。胶原分子在成纤维细胞内合成并分泌到细胞外，在细胞内先合成多肽链，继之，3条前α链集聚，生成前胶原，即胶原分子的前体。前胶原分子分泌到细胞外间隙内以后受到限制性蛋白水解作用，消除分子的伸展肽而软化为胶原。在细胞外间隙内消除伸展肽后，胶原分子自发地排到成纤维。胶原交联后，纤维获得了所需的张力强度。注射培养的自体成纤维细胞制剂增加了皮肤成纤维细胞，促进胶原分子的合成、交联，使皮肤恢复弹性，皱纹消失。 二、成纤维细胞成骨作用的研究 1、成纤维细胞在骨折愈合中的成骨作用 成纤维细胞在骨缺损等特殊环境下同成骨细胞一起参与成骨过程。Chai Parrasad]等通过电镜发现成纤维细胞分泌合成胶原纤丝,并在胶原纤丝内沉积钙盐结晶,在纵形排列的胶原纤丝内可以看到64 OA的周期带。软骨细胞合成分泌的是Ⅱ型胶原;而成纤维细胞及成骨细胞合成分泌的是Ⅰ型胶原,两种细胞合成分泌的Ⅰ型胶原,无论在形态上,还是在生化结构上是完全一样的。成纤维细胞形成基质小泡,并引起小泡内的钙盐沉积。钙化的基质小泡形成毛球状钙球,钙球合并融合成为骨组织。金大地在骨缺损修复的超微结构中发现了不同发育阶段的成纤维细胞的成骨现象。 2、作用原理： 在骨折愈合实验及成纤维细胞体外培养实验研究中均已被证实。成纤维细胞在骨折修复中不仅对早期形成的纤维骨痂起到固定作用;在以后阶段中,纤维骨痂中的成纤维细胞两种途径演变为骨组织,成为两种相互联系的细胞。体外培养成纤维细胞证实,成纤维细胞不仅能分泌胶原、软多糖等基质成份,在细胞胞浆内及培养液中, ALP活性检测均为阳性,且能分泌大量骨小结节。成纤维细胞的固有发生性只有在特殊环境特殊需要的条件下才能表现出来;一些成骨因子在成纤维细胞骨化过程中起到诱导作用。这就提示我们在骨诱导因子的作用下,成纤维细胞不仅参与骨折愈合,在病理状态下,这种具有游走性的成纤维细胞可能发生局部浸润及成为组织病理性钙化和骨化的原因之一。 人皮肤成纤维细胞的获取 一、材料：手术过程中获取的老年人皮肤组织 二、所需试剂：DMEM高糖培养基，胎牛血清，胰蛋白酶，PBS缓冲液，青霉素，链霉素 三、方法： 1.提前准备好含有添加过青霉素和链霉素的PBS缓冲液的15ml离心管低温放置。 2.将得到的皮肤组织置于含有PBS（添加300U/ml青霉素和300μg/ml链霉素）的15ml 离心管中，并以冰盒存放拿至实验室立马进行实验。 3.在生物安全柜中将得到的皮肤组织于培养皿内用（含300U/ml青霉素和300μg/ml链霉 素）的PBS缓冲液反复漂洗3-5次。 4.用无菌手术刀片和镊子轻轻剪除、刮去皮下肌肉和脂肪组织。或在PBS清洗前，用70% 酒精浸泡半分钟。 5.清理干净的皮肤组织转移至新培养皿内，用含抗生素的PBS反复清洗后，取出皮肤组织 转移到新的皿中。 6.用剪刀将皮肤剪成体积约1mm3大小的组织块。 7.将小组织块贴附于一新的培养皿底部，每平方厘米均匀接种10-15块组织。 8.5-10分钟后（以团块贴紧培养皿为准），加入少量含10%FBS的DMEM培养液，使组织 块刚刚接触培养液即可（不能浸没组织，防止组织块飘起来），置于CO2培养箱。 9.2-3h后沿培养皿边缘缓慢加入含10%FBS的DMEM培养液浸没组织块，随后将培养皿 轻轻放置于培养箱内，在移动过程中严禁剧烈晃动培养皿影响组织块的贴壁。 10.间隔2-3天观察组织块贴壁情况，并进行换液。 11.观察细胞爬出情况，当组织块周边细胞生长汇合率达90%以上时进行胰蛋白酶的消化传 代。剩余的组织块加入10%FBS的DMEM培养液继续培养，细胞达到融合后，再消化传代，然后剩余组织块加入10%FBS的DMEM培养液继续培养，反复上面的步骤。 论著 【收稿日期】2004-10-12;【修回日期】2004-12-03 【作者简介】李卫华(1971-),男,籍贯河北,硕士,主治医师,主要研究方向为瘢痕的形成机理。 增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞生长差异比较 李卫华1,李德水2,刘洪琪2 (武警医学院:11整形美容中心;21烧伤整形科;天津300162) 摘 要: 【目的】探讨增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞基因表现型的差异以及EGF 、PD GF 和 bF GF 对其的影响。【方法】测定细胞生长曲线;应用液闪计数测定成纤维细胞胶原蛋白的合成。【结果】增生性 瘢痕成纤维细胞增殖速度比正常皮肤成纤维细胞慢;胶原蛋白的合成高于正常皮肤成纤维细胞。EGF 、PD GF 和 bF GF 均对两种成纤维细胞的增殖具有强烈的刺激作用。EGF 和bF GF 可减少增生性瘢痕成纤维细胞的胶原蛋白 合成,PD GF 可以使两种成纤维细胞的胶原蛋白合成增加。【结论】增生性瘢痕成纤维细胞是一种特殊基因表现型的成纤维细胞,它具有自己特殊的生物学特性。EGF 、PD GF 和bF GF 在增生性瘢痕的形成过程中可能具有重要作用。 关键词:增生性瘢痕;成纤维细胞;胶原蛋白;表皮细胞生长因子;血小板衍生生长因子;碱性成纤维细胞生长因子 【文章编号】 100825041(2005)022******* 【中图分类号】 R32912 【文献标识码】 A The study of the phenotypic differences of hypertrophic scar f ibroblasts versus normal dermal f ibroblasts by cytokine stimulation L I Wei 2hu a ,L I De 2shui ,L IU H ong 2qi (Department of Plastic and Esthetic Surgery ,The A ff iliated H ospital of Medical College of Chinese People ′s Armed Police Force ,Tianjin 300162,China) Abstract :【Objective 】To study the phenotypic differences between the hypertrophic scar fibroblasts and normal dermal fibroblasts by determining their responsiveness to EGF 、PD GF and bF GF 【Methods 】Hypertrophic scar fibroblasts and normal dermal fibroblasts were propagated in culture.Their proliferative behaviors were studied.The collagen synthetic rates were determinedwith liquid scintillation technology.【R esults 】Hypertrophic scar fibroblasts grew at a lower rate than that of normal dermal fibrob1asts.The collagen synthetic rate of the hypertrophic scar fibroblasts was higher than that of the normal dermal fibroblasts.EGF 、PD GF and bF GF stimulated the proliferation of both cells violently.The col1agen synthesis of hypertrophic scar fibroblasts was inhibited by EGF and bF GF whereas PD GF increased both cells ′collagen synthesis.【Conclusion 】The hypertrophic scar fibroblast is a different phenotype from the normal dermal fibrob 2last.EGF 、PD GF and bF GF may play important roles in the formation of hypertrophic scars.K ey Words :Hypertrophic scar ;Fibroblasts ;Collagen ;EGF ;PD GF ;bF GF 增生性瘢痕一直是限制患者正常愈合的一个主要问题,其病因尚未完全明了。Worrall 1的研究结果显示将正常皮肤成纤维细胞长期暴露于可溶性单核细胞提取物的环境中可使成纤维细胞发生红斑 狼疮样基因表现型改变。G arner 2的研究结果揭示增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞可能具有不同的基因表现型。为了进一步明确增生性瘢痕成纤维细胞基因表现型,我们应用体外细胞培养技术研究了增生性瘢痕及正常皮肤成纤维细胞的形态、生长曲线以及胶原蛋白的合成,并就表皮细胞生长因子(EGF )、血小板衍生生长因于(PD GF )和碱性成纤维细胞生长因子(bF GF )对增生性瘢 ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶信号通路在ＴＧＦ－β１诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化中的作用 胡永亮 刘真 焦大凯 马恬 王常勇 贾赤宇 目的 观察ＴＧＦ－［１对人皮肤成纤维细胞表型转化的作用是否受到ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶 信号通路的影响，以探究该通路是否参与了人皮肤成纤维细胞的表型转化。方法 原代培养人皮 肤成纤维细胞，将第４代细胞用ＴＧＦ－β１（ １０ ｎｇ／ｍｌ）刺激后，分不同作用时间（０、３、６、２４ｈ）提取细胞 内总蛋白。ＢＣＡ法测定总蛋白浓度，Ｗｅｓｔｅｒｎ －ｂｌｏｔ检测α－ＳＭＡ的表达水平；并用相同的方法检测不 同浓度ＴＧＦ－β１（０、２、１０、５０ ｎｇ／ｍｌ）刺激人皮肤成纤维细胞后，α－平滑肌肌动蛋白（α－ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ，α－ＳＭＡ）的表达水平。用ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶信号通路阻断剂Ｙ－２７６３２处理后，再用ＴＧＦ－β１刺激， 作为实验组，将未作处理的正常细胞作为空白对照组，Ｙ－２７６３２（１０ μｍｏｌ／Ｌ）组作为阴性对照组，只 用ＴＧＦ－β１（ １０ ｎｇ／ｍｌ）刺激组作为阳性对照组，分别检测α－ＳＭＡ的表达差异。使用ＡＮＯＶＡ对蛋白 表达量进行统计学分析，Ｐ ＜０．０５为差异有统计学意义。结果 １０ ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ－β１按不同作用时间 刺激人皮肤成纤维细胞后，α－ＳＭＡ的表达量分别为：０ｈ为１．０，３ｈ为１．９＋０．２、６ｈ为２．１±０．１， ２４ ｈ为３．１±０．１。２４ ｈ较其他３个时间点α－ＳＭＡ表达量明显上升（ｎ＝４，Ｐ＜０．０５）。不同浓度 ＴＧＦ－β１刺激人皮肤成纤维细胞后，α－ＳＭＡ的表达量分别为：０ ｎｇ／ｍｌ为１．０，２ ｎｇ／ｍｌ为１．４±０．２， １０ ｎｇ／ｍｌ为３．２±０．１，５０ ｎｇ／ｍｌ为３．１±０．２。１０ ｎｇ／ｍｌ表达量明显高于０ ｎｇ／ｍｌ和２ ｎｇ／ｍｌ（ｎ ＝４， Ｐ ＜０． ０５），较５０ ｎｇ／ｍｌ差异无统计学意义（ｎ＝４，Ｐ＞０．０５）。用Ｙ－２７６３２（１０ μｍｏｌ／Ｌ）处理后，再用 ＴＧＦ－β１刺激，细胞的表型转化明显受到抑制，实验组α－ＳＭＡ的表达量（１．２±０．２）较阳性对照组 （２．９±０．１）明显降低（ｎ＝５，Ｐ ＜０．０５），与空白对照组（１．０）和阴性对照组（１．１±０．１）相比差异均 无统计学意义（ｎ＝５，Ｐ＞０． ０５）。结论 ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶信号通路参与了 ＴＧＦ－β１诱导的人皮肤成纤 维细胞表型转化过程。 成纤维细胞； ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ激酶信号通路；转化生长因子β１； α－平滑肌肌动蛋 白 Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｏｎ ＴＧＦ－β１－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ＨＵ Ｙｏｎｇ－ｌｉａｎｇ ＬＩＵ ＺｈｅｎＪＩＡＯ Ｄａ－ｋａｉＭＡ ＴｉａｎＷＡＮＧ Ｃｈａｎｇ－ｙｏｎｇ ＪＩＡ Ｃｈｉ－ｙｕ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ ａｎｄ Ｂｕｒｎ Ｒｅｐａｉｒ， ３０９ ｔｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ ＰＬＡ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９１， Ｃｈｉｎａ １０． ３７６０／ｃｍａ． ｊ． ｉｓｓｎ． １００９－４５９８． ２０１１．０５． ０１５ 国家自然科学基金（３０７７２２５９） 作者单位：１０００９１ 北京，解放军第３０９医院整形美容烧伤修复中心（胡永亮、刘真、马恬、贾赤宇）；军事医学科学院基础医学研究所组织 工程研究室（王常勇）；航空工业中心医院整形外科（焦大凯） Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘａｍｉｎｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｏｎ ＴＧＦ－β１－ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ４ｔｈ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＴＧＦ－β１ （１０ ｎｇ／ｍｌ）． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ α－ＳＭＡ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＴＧＦ－β１ ｆｏｒ ０， ３， ６， ａｎｄ ２４ ｈ． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔ－ＳＭＡ ｗａｓ ａｌｓｏ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＧＦ－β１ （０， ２， １０， ５０ ｎｇ／ｍｌ）． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ （４ｔｈ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ） ｗｅｒｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＴＧＦ－３１ （ １０ ｎｇ／ｍｌ） ａｆｔｅｒ ｂｅｉｎｇ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＲｈｏＡ／Ｒｈｏ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｙ－２７６３２ （ｌ０ｕｍｏｌ／ｍｌ）． Ｔｈｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｎｏｔｈｉｎｇ ａｓ ｓｈａｍ ｃｏｎｔｒｏｌ， ｏｒ ｗｉｔｈ Ｙ－２７６３２ （１０ｕｍｏｌ／Ｌ） ｏｎｌｙ ａｓ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ， ｏｒ ｗｉｔｈ ＴＧＦ－β１ （１０ ｎｇ／ｍｌ） ｏｎｌｙ ａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ α－ＳＭＡ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ａｌｌ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 皮肤成纤维细胞怎么治疗 因为我们并不是专业的医生，对很多的医学名词或者疾病问题，其实大部分人总是存在疑惑和不了解的，就比如说皮肤成纤维细胞，很多人并不了解它到底是什么疾病，所以在生活当中，往往却忽视了它的认识和了解，无意中给身体健康产生威胁，那么下面我们就去分析一下，到底什么是皮肤成纤维细胞。 成纤维细胞（fibroblast）成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起。根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核仁大而明显，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动；纤维细胞（fibrocyte）功能活动不活跃，细胞轮廓不明显，核小着色深，核仁不明显，细胞质少。此二型细胞可互相转化。 成纤维细胞摄取所需的氨基酸，如脯氨酸和赖氨酸等，在粗面内质网的核蛋白体上合成前α多肽链（proalpha polypeptide chain），多肽链输送到高尔基复合体后，组成前胶原分子（procollagen）。前胶原分子由分泌囊泡带到细胞表面，然后通过胞吐作用释放到细胞外。在前胶原肽酶催化下，将每一前α多 肽链的尾段除去，成为原胶原分子（tropocollagen）。许多原胶原分子成行平行排列，结合成具有周期性横纹的胶原原纤维。由胶原原纤维互相结合形成胶原纤维。 事实上任何的疾病，只要我们更多的去认识和了解它，这样在生活当中才可以提醒自己，注重做好预防和保健，帮助自己尽可能的降低这种疾病，产生的影响和威胁，因此大家都应该更加主动去了解这些常识，提高自己对疾病的预防能力。 人真皮成纤维细胞的分离培养及鉴定 作者：马英智张丽红孙梅李玉林 【摘要】目的对人真皮成纤维细胞(hFbs)进行分离培养及鉴定，为组织工程复合皮肤的构建提供种子细胞。方法利用组织块培养法、消化传代纯化培养hFbs，通过细胞形态的观察及免疫细胞化学、流式细胞术等方法对其进行鉴定。结果经组织块培养法获得的细胞可以传代培养，从P1代到P6代细胞形态保持一致，呈纤维细胞样生长;免疫细胞化学检测可见波形蛋白(vimentin)呈阳性反应，通过流式细胞术检测P3及P6代的细胞vimentin阳性表达量均达到95%以上，角蛋白15(cytokeratin 15)呈阴性表达。结论成功建立体外稳定培养hFbs 的方法，为组织工程皮肤的研究提供了理论与实验基础。 【关键词】成纤维细胞;分离;培养;鉴定 【Abstract】Objective To explore a method of the isolation, culture and identification of human fibroblasts (hFbs) in vitro for the provision of seed cells in tissue engineering skin. Methods The cells were cultured and expanded and observed under phase contrast microscope, and they were identified with immunocytochemistry and flow cytometry (anti vimentin, cytokeratin 15). Results With phase contrast microscope, the cells were observed to uniformed population of cells and fibroblast like. Immunocytochemistry and flow cytometry showed all cultural cells were fibroblasts (positive一 人皮肤成纤维细胞培养
以人皮肤成纤维细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞_杨俊林
成纤维细胞的最新用途
人皮肤成纤维细胞的获取-
增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞生长差异比较
%9a%84人皮肤成纤维细胞表型转化中的作用
皮肤成纤维细胞怎么治疗
人真皮成纤维细胞的分离培养及鉴定
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