公共场所环境样品中嗜肺军团菌定量检验方法
1范围青岛精诚仪器仪表有限公司
本标准规定了公共场所空气、水、土等不同类别环境样品中嗜肺军团菌的定量检测方法。
本标准适用于公共场所环境样品中嗜肺军团菌的定量检测，其他环境样品中嗜肺军团菌的定量检测可参照执行。
2规范性引用文件
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GB/T18204.3公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物
GB/T18204.5公共场所卫生检验方法第5部分：集中空调通风系统
3空气中嗜肺军团菌定量检测
3.1原理
采用液体冲击法采样、叠氮溴乙锭（EMA）前处理结合定量聚合酶链反应(qPCR)方法定量检测室内空气和集中空调送风中存活的嗜肺军团菌。
3.2仪器和设备
3.2.1微生物气溶胶浓缩器：采样流量≥100L/min，3.0μm以上粒子的捕集效率≥80%（或浓缩比≥8）。
3.2.2液体冲击式微生物气溶胶采样器：采样流量7L/min～15L/min，0.5μm以上粒子的捕集效率≥90%。
3.2.3便携式冷藏箱。
3.2.4冷冻离心机：温度4?C。
3.2.5恒温水浴锅或金属浴：温度范围50?C～99?C。
3.2.6荧光定量PCR仪：非耦合6色激发光片和6色检测滤光片通道，4°C–100°C温度范围。
3.2.7卤素灯：500W。
3.2.8涡旋震荡器：调速范围0~3000rpm。
3.3材料和试剂
3.3.1酵母浸出粉。
3.3.2蒸馏水。
3.3.3EMA固体粉：5mg/管。
3.3.4无核酸酶去离子水。
3.3.5矿物油，用于减少气溶胶采样时的吸收液蒸发。
3.3.6核酸提取试剂盒：DNA产量15～30μg，A260/A280在1.7～1.9之间。
3.3.7引物：上游引物5’-GAAAATAAAGTAAAAGGGGAAGCC-3’；
下游引物5’-ATCAATCAGACGACCAGTGTATTC-3’。
3.3.8探针：5’-FAM-AGGCGTTGTTGTATTGCCAAGTGGTT-TAMRA-3’。
3.3.9标准品质粒。
3.3.10荧光定量PCR反应体系。
3.3.11离心管：1.5mL透明离心管和1.5mL棕色离心管。
3.3.12离心管：15mL，50mL。
3.4样品的采集
3.4.1采样吸收液成分：
酵母浸出粉12g
蒸馏水1000mL
3.4.2采样吸收液制法：将酵母浸出粉（3.3.1）12g加蒸馏水至1000mL，121℃下高压灭菌15min，每20mL采样吸收液分装于灭菌后的50mL离心管（3.3.12）中备用。
3.4.3采样点：室内空气按GB/T18204.3中6.4.1规定，集中空调送风按GB/T18204.5中9.5.1规定。
3.4.4将装有采样吸收液的离心管置于便携式冷藏箱（3.2.3）中送到现场，开始采样前将采样吸收液（3.4.2）20mL倒入微生物气溶胶采样器（3.2.2）中，然后用吸管加入矿物油（3.3.5）1滴~2滴。
3.4.5将微生物气溶胶浓缩器（3.2.1）与微生物气溶胶采样器（3.2.2）连接，按照微生物气溶胶浓缩器和微生物气溶胶采样器的流量要求调整主流量和浓缩流量。
3.4.6按浓缩器和采样器说明书操作，每个气溶胶样品采集空气量1m3~2m3；并记录环境温度、大气压力和总采气体积或采样流量、采样时间。
3.4.7采集的样品倒入离心管置于便携式冷藏箱中避光保存，4h内送实验室检验。
3.5样品处理方法与条件
3.5.1样品的离心浓缩：将采集的气溶胶样品（3.
4.7）于4℃下8000×g离心20min（3.2.4），小心吸取弃去上清，剩余1mL左右沉淀全部转移至1.5mL的透明离心管中，再次4℃下8000×g离心20min，弃去上清，剩余0.5mL沉淀。
3.5.2EMA母液{ρ[C21H18BrN5]=10mg/mL}的制备：取1管5mg EMA固体粉（3.3.3），短暂离心后加入0.5mL灭菌无核酸酶去离子水（3.3.4）。颠倒混匀，短暂离心收集管壁液体，每100μl分装于1.5ml棕色离心管（3.3.11）中，-20℃避光保存。
3.5.3EMA工作液{ρ[C21H18BrN5]=100μg/mL}的制备：取10μlEMA母液(3.5.2)加990μl灭菌无核酸酶去离子水（3.3.4）。颠倒混匀，短暂离心收集管壁液体，置于1.5ml
棕色离心管中。每1000μl的EMA工作液可处理70份左右样品，EMA工作液现用现配，使用前计算好所需EMA工作液量。
3.5.4样品避光孵育：取0.5mL经过离心浓缩的气溶胶样品（3.5.1）置于1.5mL透明离心管中，铝箔包裹以便避光。加入13μLEMA工作液（3.5.3），反复颠倒，混合均匀，短暂离心收集管壁液体，4℃避光孵育5min。
3.5.5样品光照活化：去掉包裹离心管的铝箔，将离心管水平放置在碎冰上，调整样品与卤素灯（3.2.7）的距离，使其垂直距离为15cm，光照5min。光照阶段需混匀样品1次~2次，使光照均匀，防止样品过热。
3.5.6样品存放：光照结束后，4℃保存样品，24h内提取核酸。
3.6样品核酸提取
由于样品核酸提取的条件与操作步骤因使用试剂盒的不同而有差异，所以应根据所使用的核酸提取试剂盒的操作手册进行操作。附录A所列的空气中嗜肺军团菌核酸提取操作步骤是一个实例。
3.7荧光定量PCR条件与扩增步骤
3.7.1标准品系列制备：将标准品母液（3.3.8）以十倍梯度依次稀释，在107copies/mL～102copies/mL浓度范围内制备十倍梯度稀释的标准品系列。稀释方式举例如下：取10μL浓度为X×107copies/mL的标准品母液，编号为①，加入90μL无核酸酶去离子水轻柔混匀，浓度为X×106copies/mL，编号为②；取10μL浓度为②的标准品，加入90μL无核酸酶去离子水轻柔混匀，浓度为X×105copies/mL编号为③；以此类推。
3.7.2扩增体系：每次检测包括至少5个连续浓度标准品，每标准品至少进行3个复孔检测。每次检测包括阳性和空白对照各一个。样品进行3个复孔检测。
荧光定量PCR扩增体系（25μL）：其中2×RealMasterMix10μL，上下游引物(10μmol/L)各1.25μL，探针(10μmol/L)0.625μL，20×Probe Enhance Solution1.25μL，模板2μL，ddH2O
8.625μL。
3.7.3扩增条件：94℃预变性4min；然后94℃变性20s，60℃退火延伸60s，61s检测荧光信号，进行40个循环。
3.7.4数据处理：标准曲线相关系数R2>0.99，标准曲线斜率在-3~-3.5之间，扩增效率E 在0.9~1.2之间。根据标准曲线和样品Ct值计算样品核酸中嗜肺军团菌浓度(copies/mL)。3.8结果报告
3.8.1采气体积换算：按式（1）换算成标准状态下采气体积。
000273P P t T V V t ?+?
=（1）
式中：V 0—标准状态下的采气体积，单位为立方米（m 3）；
V t —实际采气体积，为采样流量与采样时间乘积，单位为立方米（m 3）；
t —采样点的环境温度，单位为摄氏度（℃）；
T 0—标准状态下的绝对温度，273K ；
P —采样点的大气压，单位为千帕（kPa ）；
P 0—标准状态下的大气压，101kPa 。
3.8.2浓度计算：空气中存活的嗜肺军团菌浓度按式（2）计算。
001.0V C C ?=
（2）
式中：C —空气中嗜肺军团菌浓度，单位为拷贝数每立方米（copies/m3）；
C0—样品核酸中嗜肺军团菌浓度，单位为拷贝数每毫升核酸（copies/mL ）；V0—标准状态下采气体积，单位立方米（m3）。
3.9方法性能
本方法最低检出空气中嗜肺军团菌核酸浓度为102copies/mL 。
当采气体积为2m 3时，最低检出空气中嗜肺军团菌浓度为5copies/m 3。
4水样品中嗜肺军团菌定量检测
4.1分离培养法
4.1.1
原理集中空调冷却水、沐浴水、景观水、娱乐用水等水样品经浓缩后，接种于GVPC 琼脂平板生成单个军团菌菌落，并在BCYE 琼脂平板上生长而在L-半胱氨酸缺失的BCYE 琼脂平板上不生长，进一步经血清学实验鉴定确认为嗜肺军团菌，依照样品量、加标回收率等定量计算得出水样品中嗜肺军团菌浓度。
4.1.2仪器和设备
4.1.2.1CO 2培养箱：5%CO 2，35℃~37℃。
4.1.2.2微生物过滤系统。
4.1.2.3
恒温水浴箱：50℃±5℃。
4.1.2.4生物安全柜。
4.1.2.5光学显微镜。
4.1.2.6平板振荡器、涡旋振荡器。
4.1.2.7具塞采样瓶：容积 500mL。
4.1.3材料和试剂
4.1.3.1硫代硫酸钠溶液[c(Na2S2O3)=0.1mol/L]。
4.1.3.2滤膜：孔径0.22μm。
4.1.3.3酸处理液[c(HCL-KCL)=0.2mol/L]：pH2.2±0.2。
4.1.3.4GVPC琼脂平板。
4.1.3.5BCYE琼脂平板。
4.1.3.6BCYE-CYE琼脂平板(L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板)。
4.1.3.7军团菌分型血清。
4.1.3.8氯化钠溶液[ρ(NaCL)=0.85%]。
4.1.3.9具塞试管。
4.1.3.10灭菌水。
4.1.4样品采集
4.1.4.1将贝具采样瓶（4.1.2.7）用前灭菌。
4.1.4.2每瓶中加入硫代硫酸钠溶液（4.1.3.1）0.3mL~0.5mL。
4.1.4.3采样点按GB/T18204.5中3.
5.3规定。
4.1.4.4无菌操作采集水样500mL。
4.1.4.5采集的样品2d内送达实验室，不必冷冻，但要避光和防止受热，室温下贮存不应超过15d，尽快及时进行实验室检测。
4.1.5检验步骤
4.1.
5.1样品预处理：水样品如有杂质可静置去除沉淀，将样品通过0.22μm孔径的微生物过滤系统（4.1.2.2）过滤，取下滤膜剪碎置于10mL原样品中，涡旋振荡器（4.1.2.6）充分振荡洗脱，取洗脱液备用。
4.1.
5.2样品酸处理：取1mL预处理后的样品（4.1.5.1）于无菌具塞试管（4.1.3.9）中，加入适量酸处理液（4.1.3.3），使样品pH值至2.0~2.2，轻轻摇匀，处理时间5min~10min。
4.1.
5.3样品接种：取酸处理的样品0.2mL，划线接种GVPC平板（4.1.3.4），使培养后应形成单个菌落。
4.1.
5.4样品培养：将接种平板静置于5%CO2培养箱（4.1.2.1）中，温度35℃~37℃，孵育3d~10d。
4.1.
5.5菌落观察：军团菌生长缓慢，易被其他菌掩盖，从孵育第3d 开始每天在显微镜上观察。48h 内生长的菌落非军团菌，48~72h 长出的为可疑军团菌，72h 后生长出的菌落进行计数并继续进行观察。军团菌菌落通常呈白色、灰色、蓝色或紫色。菌落整齐，表面湿润，典型菌落呈毛玻璃状，在紫外灯下，部分菌落有荧光。
4.1.
5.6菌落鉴定：孵育72h 后，从GVPC 平板上用接种环挑取可疑菌落，接种BCYE 平板（4.1.3.5）和BCYE-CYS 平板（4.1.3.6）。35℃~37℃培养2d ，凡在BCYE 琼脂平板上生长而在BCYE-CYE 琼脂平板不生长的则为军团菌菌落。
4.1.
5.7嗜肺军团菌鉴定：经血清学凝集实验确定嗜肺军团菌。在洁净玻片（可用灭菌平板替代）上滴加两滴彼此分离的氯化钠溶液（4.1.3.9）约15μL ，挑取适量待检菌落分别加在两滴氯化钠溶液上，混匀。其中一滴上加入15μL LP1型诊断血清（4.1.3.8），另外一滴加入15μL 氯化钠溶液作为阴性对照，分别混匀玻片上的两种混合液。轻轻摇动玻片40s ，观察。于40s 内呈明显凝集者为LP1型嗜肺军团菌，呈均匀浑浊者为非LP1型嗜肺军团菌。重复上述实验过程，分别进行LP2~LP15单价或多价血清凝集实验。
4.1.6结果报告
水样品中嗜肺军团菌浓度按式（3）计算。
100021????=
ηV V D n C （3）
式中：C —水样品中嗜肺军团菌浓度，单位为菌落形成单位每升（CFU/L ）；
n —每个平板上嗜肺军团菌平均菌落数，单位为菌落形成单位每皿CFUu/皿）；
D —洗脱稀释倍数，本方法中为10；
V 1—水样品采集量，单位为毫升（mL ）；
V 2—平板接种量，单位为毫升每皿（mL/皿），本方法中为0.2mL/皿；
η—水样品平均加标回收率，本方法为0.9。
4.1.7方法性能
当水样品体积为500mL 时，最低检出嗜肺军团菌浓度为5CFU/mL 。
当水样品中嗜肺军团菌浓度为50cfu/mL 和500CFU/mL 时，加标回收率为80%～100%。
4.2
EMA+qPCR 法4.2.1原理
采用叠氮溴乙锭（EMA ）前处理结合定量聚合酶链反应(qPCR)方法定量检测集中空调冷却水、洗浴水、景观水、娱乐水等水样品中存活的嗜肺军团菌。
4.2.2仪器和设备
4.2.2.1冷冻离心机：温度4?C 。
4.2.2.2
恒温水浴锅或金属浴：温度范围50?C ～99?C 。
4.2.2.3荧光定量PCR仪：非耦合6色激发光片和6色检测滤光片通道，4°C–100°C 温度范围。
4.2.2.4卤素灯：500W。
4.2.2.5涡旋震荡器：调速范围0~3000rpm。
4.2.2.6微生物过滤系统。
4.2.2.7具塞采样瓶：容积>500mL。
4.2.3材料和试剂
4.2.3.1硫代硫酸钠溶液[c(Na2S2O3)=0.1mol/L]。
4.2.3.2滤膜：孔径0.22μm。
4.2.3.3EMA固体粉：5mg/管。
4.2.3.4无核酸酶去离子水。
4.2.3.5核酸提取试剂盒：DNA产量15～30μg，A260/A280在1.7～1.9之间。
4.2.3.6引物：上游引物5’-GAAAATAAAGTAAAAGGGGAAGCC-3’；
下游引物5’-ATCAATCAGACGACCAGTGTATTC-3’。
4.2.3.7探针：5’-FAM-AGGCGTTGTTGTATTGCCAAGTGGTT-TAMRA-3’。
4.2.3.8标准品质粒。
4.2.3.9荧光定量PCR反应体系。
4.2.3.10EP管。
4.2.3.11离心管。
4.2.4样品的采集
水样品采集见4.1.4。
4.2.5样品处理方法与条件
4.2.
5.1样品的过滤浓缩：见4.1.5.1。
4.2.
5.2样品的离心浓缩：取5mL洗脱液（4.2.5.1）于15mL离心管，室温下6000×g离心15min，小心吸取弃去上清，剩余1mL左右沉淀全部转移至1.5mL的EP管中，再次室温下6000×g离心15min，弃去上清，剩余0.5mL沉淀。
4.2.
5.3EMA母液{ρ[C21H18BrN5]=10mg/mL}的制备：见3.5.2。
4.2.
5.4EMA工作液{ρ[C21H18BrN5]=100μg/mL}的制备：见3.5.3。
4.2.
5.5样品避光孵育：见3.5.4。
4.2.
5.6样品光照活化：见3.5.5。
4.2.
5.7样品存放：光照结束后，4℃保存样品，24h内提取核酸。
4.2.6样品核酸提取
由于样品核酸提取的条件与操作步骤因使用试剂盒的不同而有差异，所以应根据所使用的核酸提取试剂盒的操作手册进行操作。附录B 所列的水样品中嗜肺军团菌核酸提取操作步骤是一个实例。
4.2.7荧光定量PCR 条件与扩增步骤
见3.7。
4.2.8结果报告
水样品中存活的嗜肺军团菌浓度按式（4）计算。
10001.0???=
V D n C （4）
式中：C —水样品中嗜肺军团菌浓度，单位为拷贝数每升（copies/L ）；
n —样品核酸中嗜肺军团菌浓度，单位为拷贝数每毫升核酸（copies/mL ）；
D —洗脱稀释倍数，本方法中为2；
V —水样品采集体积，单位为毫升（mL ）。
4.2.9方法性能
本方法最低检出水样品中嗜肺军团菌核酸浓度为102copies/mL 。
当水样品采集体积为500mL 时，最低检出水样品中嗜肺军团菌浓度为50copies/L 。5土类样品中嗜肺军团菌定量检测
5.1
原理集中空调风管积尘、花卉土、景观土等土类样品经振荡洗脱后，接种于GVPC 琼脂平板生成单个军团菌菌落，并在BCYE 琼脂平板上生长而在L-半胱氨酸缺失的BCYE 琼脂平板上不生长，进一步经血清学实验鉴定确认为嗜肺军团菌，依照样品量、加标回收率等定量计算得出土样品中嗜肺军团菌浓度。
5.2仪器和设备
见4.1.2。
5.3材料和试剂
见4.1.3。
5.4样品采集
5.4.1样本采集原则：遵循无菌操作原则采集土类样品，样品采集、储存所使用的器材均经灭菌；土类样品去除砖石瓦块、枝叶秸秆等块状物，风管积尘避免采集风管及过滤网上的絮状纤维杂物。
5.4.2景观土、花卉土等采样：取土样时选取1m 2按5点采样方法，去除1cm 左右的土壤表层后，挖取土样；花卉土等去除表面落叶杂物后，在花卉的周围均匀采取土样，土样量不少于20g/份置于灭菌采样容器中。
5.4.3空调风管积尘采样：根据风管积尘量确定采样面积，积尘量多时可选用5点采样方法，积尘量少则可将一定面积内的风管积尘全部收集，积尘样品量不少于1.5g/份。
5.4.4
样品保存：采集的样品在6℃±2℃、避光的条件下保存，2d 内送实验室检验。5.5检验步骤
5.5.1样品预处理：采集的样品（5.4.4）充分混匀后无菌操作称取0.5g 空调风管积尘样品或5g 花卉土、景观土样品，风管积尘样品加入4.5mL 0.01%PBS-Tween80洗脱液，花卉土、景观土样品加入45mL 0.01%PBS-Tween80洗脱液，200-250r/min 振荡20～30min ，室温静置≥20min 至上层液体澄清，取上清液备用。
5.5.2
样品酸处理：见4.1.5.2。5.5.3
样品接种：见4.1.5.3。5.5.4
样品培养：见4.1.5.4。5.5.5
菌落观察：见4.1.5.5。5.5.6
菌落鉴定：见4.1.5.6。5.5.7
嗜肺军团菌鉴定：见4.1.5.7。5.6结果报告
土类样品中嗜肺军团菌浓度按式（5）计算。
γ???=
21G G D n C （5）
式中：C —土类样品中嗜肺军团菌浓度，单位为菌落形成单位每克（CFU/g ）；
n —每个平板上嗜肺军团菌平均菌落数，单位为菌落形成单位每皿（CFU/皿）；
D —洗脱稀释倍数，本方法中风管积尘为5，其他为50；
G 1—土类样品采集量，单位为克（g ），本方法中风管积尘为0.5g ，其他为5g ；
G 2—平板接种量，单位为毫升每皿（mL/皿），本方法中为0.2mL/皿；
γ—土类样品平均加标回收率，本方法为0.5。
5.7方法性能
最低检出土类样品中嗜肺军团菌浓度为102CFU/g 。
当土类样品中嗜肺军团菌浓度为103cfu/g 时，加标回收率为30%～90%。
A A
附录A
（资料性附录）
空气中嗜肺军团菌样品核酸提取操作步骤
注：本附录为空气中嗜肺军团菌样品核酸提取操作步骤的一个实例。
A.1材料和试剂
A.1.1OMEGA公司E.Z.N.A.Bacterial DNA Kit核酸提取试剂盒。
A.1.2TE Buffer。
A.1.3无水乙醇
A.2操作步骤
A.2.1实验前的准备：溶菌酶存储液{ =50mg/mL}保存于-20℃并在使用前解冻，Elution Buffer使用前预热到65℃，无水乙醇稀释DNA Wash Buffer浓缩液。
A.2.2取0.5mL经过EMA处理后的气溶胶样品（3.5.6）8000×g离心20min，弃去上清。加入180μL的TE Buffer（A.1.2）重悬样品，加入20μL溶菌酶存储液（A.2.1）30℃水浴30min。
A.2.3室温条件下5000×g离心5min，沉淀消化后的细菌，弃去上清，加入200μL的buffer BTL涡旋以悬浮细菌。
A.2.4加25mg~40mg的玻璃珠，室温条件下高速涡旋5min。静置让玻璃珠沉淀下来，小心吸取上清致一新的灭菌1.5mL离心管中。
A.2.5加入25μL的蛋白酶K并涡旋均匀，将混合均匀的液体放入55℃流动水浴中1h左右，完全溶解细菌。如果没有流动水浴，可孵育在55℃的水浴锅中，每隔20-30min短暂涡旋离心管。
A.2.6加入5μL的RNA酶A并反复颠倒混匀，在室温条件下孵育30min。
A.2.7室温10000×g离心5min，沉淀不溶解的物质，小心地吸取上清到新的1.5mL离心管中，避免吸到有不溶解的沉淀。
A.2.8加入220μL的Buffer BDL，短暂涡旋混匀，65℃孵育10min。在加入Buffer BDL后，可能会有絮状沉淀出现，并不影响DNA的复性。
A.2.9加入220μL的无水乙醇，高速涡旋20s，有沉淀出现，用枪头反复吹打以破碎沉淀。
A.2.10将所得到的所有液体转至DNA结合柱內，其中包括在步骤A.2.9过程中形成的沉淀，室温10000×g离心1min，丢弃收集管和其中的滤出液。
A.2.11将柱子装入一个新的收集管，加入500μL的Buffer HB，室温10000×g离心1min，丢弃收集管中的滤出液。
A.2.12将柱子装回刚才收集管，加入700μL无水乙醇稀释后的DNA Wash Buffer（A.2.1），室温10000×g离心1min，丢弃收集管中的滤出液。
A.2.13再次加入700μL无水乙醇稀释后的DNA Wash Buffer（A.2.1），室温10000×g离心1 min，丢弃收集管中的滤出液。
A.2.14将柱子装回刚才的收集管中，高速（≥10000×g）离心2min以干燥DNA结合柱，丢弃收集管和滤出液。
A.2.15将柱子置于灭菌的1.5mL离心管上，向DNA结合柱的膜中央加入50μL经65℃预热的Elution Buffer，65℃孵育15min。
A.2.16室温10000×g离心1min，将DNA从柱子上洗脱下来。
A.2.17向DNA结合柱的膜中央再次加入50μL经65℃预热的Elution Buffer，65℃孵育15m in。
A.2.18室温10000×g离心1min，将基因组DNA从柱子上洗脱下来。
A.2.19总共获得100μlLDNA溶液，-20℃保存。
B B
附录B
（资料性附录）
水样品种嗜肺军团菌核酸提取操作步骤
注：本附录为水样品中嗜肺军团菌样品核酸提取操作步骤的一个实例。
B.1材料和试剂
B.1.1OMEGA公司E.Z.N.A.Water DNA Kit核酸提取试剂盒。
B.1.2无水乙醇。
B.2操作步骤
B.2.1实验前准备：DNA Wash Buffer浓缩液按要求添加无水乙醇稀释，Elution Buffer置于65℃预热。
B.2.2取0.5mL经过EMA处理后的水样品（4.2.5.7），转移到15mL离心管中8000×g离心20 min，弃上清保留沉淀。
B.2.3加3mL SLX Buffer、500mg glass beads于上述离心管中，以涡旋机最高速度涡旋3min，或直至样品完全混匀。
B.2.4在70℃水浴锅孵育10min，孵育过程中涡旋样品离心管2-3次。
B.2.5加1mL SP2Buffer，涡旋30s，冰浴30min。
B.2.6在4℃下4000×g离心10min。
B.2.7转移上清液于15mL离心管，加0.7体积异丙醇，翻转倒置30次～50次，-20℃孵育1h.。
B.2.8在4℃下4000×g离心20min沉淀DNA，轻轻的吸取弃去上清，不要碰触下层沉淀DN A。
B.2.9加400μL Elution Buffer，涡旋20s，65℃孵育30min溶解DNA。
B.2.10转移样品到新的1.5mL灭菌离心管中，加100μL HTR Reagent，涡旋10s，室温孵育2min。注意：HTR Reagent用之前，先涡旋混匀。
B.2.11室温14000×g离心3min，吸取上清液(约400μL)于另一个1.5mL离心管中，如果样品呈现暗色重复B.2.10和B.2.11步骤。
B.2.12向上清液中加入等体积的Buffer XP1，涡旋混匀。
B.2.13将DNA结合柱套入收集管中，全部样品转移到DNA结合柱中，室温10000×g离心1 min，弃去离心液，重复使用收集管。
B.2.14加300μL Buffer XP1到DNA结合柱中，10000×g室温离心1min，丢弃离心液和收集管。
B.2.15将DNA结合柱套入新的收集管中，加750μL DNA Wash Buffer（已用乙醇稀释），室温10000×g室温离心30s，弃去离心液，重复使用收集管。
B.2.16将DNA结合柱放回收集管，≥14000×g离心2min，以干燥DNA结合柱。弃去收集管。
B.2.17将DNA结合柱套入到新的1.5mL灭菌EP管中，加100μL Elution Buffer于柱子的膜中央，65℃孵育3min。
B.2.18室温14000×g离心1min，弃去结合柱，100μLDNA溶液，-20℃保存DNA备用。
细胞内抗嗜肺军团菌药物有效浓度测定 【摘要】目的：探讨红霉素。环丙沙星。左氧氟沙星。莫西沙星4种抗菌药物对细胞内嗜肺军团菌的抗菌活性。方法：分别采用E-test法和有限稀释法 测定上述4种药物对嗜肺军团菌ATCC 33152的细胞外抗菌活性,再用噻唑蓝比 色法(MTT法)测定上述药物对嗜肺军团菌ATCC 33152的细胞内抗菌活性。结果：细胞外抗菌活性E-test法:红霉素0.047 μg/mL。环丙沙星0.38 μg/mL。左 氧氟沙星0.125 μg/mL。莫西沙星0.125 μg/mL;有限稀释法:红霉素0.125 μg/mL。环丙沙星0.03 μg/mL。左氧氟沙星0.016 μg/mL。莫西沙星0.016 μg/mL。4种药物的细胞内抗菌活性分别为:红霉素0.25 μg/mL。环丙沙星 0.016 μg/mL。左氧氟沙星0.016 μg/mL。莫西沙星0.004 μg/mL。结论： 氟喹诺酮类药物在U937细胞模型中对嗜肺军团菌ATCC 33152具有很强的细胞 内抗菌活性。其中莫西沙星的细胞内抗菌活性最强。MTT法是一种行之有效的 用于检测药物对细胞内嗜肺军团菌抗菌活性的方法,可同时检测并对比各种药物样本的细胞内抗菌活性。 【关键词】嗜肺军团菌; U937细胞; 抗菌活性 Abstract: Objective： To explore the intracellular antimicrobial activities of erythromycin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin against Legionella pneumophila. Methods： The minimum inhibition concentration (MIC) of each antibiotic was evaluated by E-test method and microdilution method respectively. The minimal extracellular concentration inhibiting intracellular multiplication (MIEC) of each antibiotic was evaluated by the MTT colorimetric assay system. Results： The MIC concentration for each drug by E-test method were: erythromycin, 0.047 μg/mL; ciprofloxacin, 0.38 μg/mL; levofloxacin, 0.125 μg/mL; moxifloxacin, 0.125 μg/mL, the MIC concentrations for each drug by microdilution method were: erythromycin, 0.125 μg/mL; ciprofloxacin, 0.03 μg/mL; levofloxacin, 0.016 μg/mL; moxifloxacin, 0.016 μg/mL. The MIEC concentration for each drug were: erythromycin, 0.25 μg/mL; ciprofloxacin, 0.016 μg/mL; levofloxacin, 0.016 μg/mL; moxifloxacin, 0.004 μg/mL. Conclusions： Fluoroquinolones have superior activity than erythromycin in U937 cells infected with L. pneumophila. Moxifloxacin is the most potent drug among the four tested antimicrobials. Our results indicated that the MTT assay system allows comparative and quantitative evaluations of the intracellular activities of antibiotics against L. pneumophila and efficient processing of a large number of samples. Key words: Legionella pneumophila; U937 cells; antimicrobial activities
公共场所环境样品中嗜肺军团菌定量检验方法 1 范围 本标准规定了公共场所空气、水、土等不同类别环境样品中嗜肺军团菌的定量检测方法。 本标准适用于公共场所环境样品中嗜肺军团菌的定量检测，其他环境样品中嗜肺军团菌的定量检测可参照执行。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 18204.3 公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物 GB/T 18204.5 公共场所卫生检验方法第5部分：集中空调通风系统 3 空气中嗜肺军团菌定量检测 3.1 原理 采用液体冲击法采样、叠氮溴乙锭（EMA）前处理结合定量聚合酶链反应(qPCR)方法定量检测室内空气和集中空调送风中存活的嗜肺军团菌。 3.2 仪器和设备 3.2.1 微生物气溶胶浓缩器：采样流量≥100L/min，3.0μm以上粒子的捕集效率≥80%（或浓缩比≥8）。 3.2.2 液体冲击式微生物气溶胶采样器：采样流量7L/min～15L/min，0.5μm以上粒子的捕集效率≥90%。 3.2.3 便携式冷藏箱。 3.2.4 冷冻离心机：温度4?C。 3.2.5 恒温水浴锅或金属浴：温度范围50?C～99?C。 3.2.6 荧光定量PCR仪：非耦合6色激发光片和6色检测滤光片通道，4°C–100°C温度范围。 3.2.7 卤素灯：500W。 3.2.8 涡旋震荡器：调速范围0~3000 rpm。 3.3 材料和试剂 3.3.1 酵母浸出粉。
3.3.2 蒸馏水。 3.3.3 EMA固体粉：5mg/管。 3.3.4 无核酸酶去离子水。 3.3.5 矿物油，用于减少气溶胶采样时的吸收液蒸发。 3.3.6 核酸提取试剂盒：DNA产量15～30μg，A260/A280在1.7～1.9之间。 3.3.7 引物：上游引物5’-GAAAATAAAGTAAAAGGGGAAGCC-3’； 下游引物5’-ATCAATCAGACGACCAGTGTATTC-3’。 3.3.8 探针：5’-FAM-AGGCGTTGTTGTATTGCCAAGTGGTT-TAMRA-3’。 3.3.9 标准品质粒。 3.3.10 荧光定量PCR反应体系。 3.3.11 离心管：1.5mL透明离心管和1.5mL棕色离心管。 3.3.12 离心管：15mL，50mL。 3.4 样品的采集 3.4.1 采样吸收液成分： 酵母浸出粉12 g 蒸馏水1000 mL 3.4.2 采样吸收液制法：将酵母浸出粉（3.3.1）12g加蒸馏水至1000mL，121 ℃下高压灭菌15 min，每20mL采样吸收液分装于灭菌后的50mL离心管（3.3.12）中备用。 3.4.3 采样点：室内空气按GB/T18204.3中6.4.1规定，集中空调送风按GB/T18204.5 中9.5.1规定。 3.4.4 将装有采样吸收液的离心管置于便携式冷藏箱（3.2.3）中送到现场，开始采样前将采样吸收液（3.4.2）20mL倒入微生物气溶胶采样器（3.2.2）中，然后用吸管加入矿物油（3.3.5）1滴~2滴。 3.4.5 将微生物气溶胶浓缩器（3.2.1）与微生物气溶胶采样器（3.2.2）连接，按照微生物气溶胶浓缩器和微生物气溶胶采样器的流量要求调整主流量和浓缩流量。 3.4.6 按浓缩器和采样器说明书操作，每个气溶胶样品采集空气量1m3~2m3；并记录环境温度、大气压力和总采气体积或采样流量、采样时间。 3.4.7 采集的样品倒入离心管置于便携式冷藏箱中避光保存，4h内送实验室检验。 3.5 样品处理方法与条件 3.5.1 样品的离心浓缩：将采集的气溶胶样品（3. 4.7）于4℃下8000×g离心20min（3.2.4），小心吸取弃去上清，剩余1mL左右沉淀全部转移至1.5mL的透明离心管中，再次4℃下8000×g离心20min，弃去上清，剩余0.5mL沉淀。
深圳市空调冷却塔水军团菌污染状况调查 摘要:目的了解深圳市宾馆、大型写字楼、地铁等各类建筑物的空调冷却塔水军团菌污染状况。方法随机采集中央空调冷却塔水样品并进行细菌培养和鉴定，再以聚合酶链式反应（PCR）等方法加以验证。结果共采集水样28件，分离到1株军团菌，经鉴定为嗜肺军团菌Lp1型。结论深圳市中央空调冷却塔存在军团菌的污染，需引起重视，防止军团菌病发生。 关键词:军团菌;嗜肺军团菌;冷却塔;污染状况 Detection of Legionella pneumophila in cooling tower water of central air conditioning system in Shenzhen City.ZHANG Ran，CHEN Gui-bing，SHI Xiao-lu，et al.（Shenzhen Municipal Center for Disease Control and Prevention，Shenzhen518020，Guangdong，P.R.China） Abstract:Objective To investigate the contamination status of cooling water of central air conditioning syatem with Legionella pneumophila in in hotels，buildings and subways in Shenzhen City. Methods Cooling tower water samples from central air condi-tioning system were randomly taken，cultured and then Legionella pneumophilia was isolated.Pobymerase chain reaction（PCR）was used for confirmation of the differentiation. Results Twenty-eight cooling water samples were collected and a strain of Legionella pneumophilia serovar Lp1was isolated. Conclusion The water in cooling tower of central air conditioning system in Shenzhen City has been contaminated with Legionella pneumophilia and measures be taken for preventing infection with Legionella pneumophilia. Key words:Logionella;Leginella pneumophilia;Cooling tower;Contamination status 军团菌是引起军团菌病的一种急性呼吸道传染病的病原体，于1977年在美国首次发现并证实。现已分离到军团菌属（Legionella）共有42个种，64个血清型，其中与人类关系最为密切的是嗜肺军团菌，由它引起的肺炎，如未及时治疗，病死率很高［1］。空调机的冷却塔水、喷水池水、淋浴池和宾馆的养鱼池水，甚至游泳池水均是军团菌其生存定居的小环境，如果该小环境中的微型生物群落结构能与其构成共生关系，军团菌就可以大量繁殖，
公共场所嗜肺军团菌污染状况调查分析 ［摘要］目的应用PCR技术对奉贤地区部分公共场所空调冷却塔水及其他环境（淋浴设施等）进行军团菌污染状况调查。方法于2010年5月和10月，分别采集中央空调冷却塔水样品及环境样品用聚合酶链（PCR）对其进行嗜肺军团菌检测，同时用常规法进行分型鉴定。结果采集的125份样品中，PCR法检出嗜肺军团菌45份，阳性检出率为36%，水样检出率远高于环境（分别为67.19%和3.28%）。在检出的59株军团菌中共鉴定出6种不同菌型，其中LP1为重点菌型，占50.85%。且在同一样品中检出不同菌型有2株以上的占35.29%。结论奉贤地区中央空调冷却塔及环境中存在军团菌污染，需引起重视，以防止军团菌所致的疾病暴发或流行。 军团菌是一种革兰阴性杆菌，能引起急性呼吸道传染病[1]，军团菌已被发现存在40个种，60多个血清型。经流行病学调查研究，这种细菌存在于各种自然界水源以及空调水管道，供水系统等人工水源中，在引进空调冷却塔做冷却水时，随空调器把细菌散布于室内空气中，被人吸入而引发肺炎。 我国自1982年南京首次证实军团菌病例以来已有多起军团菌爆发流行［2］，上海在近几年内也从患者和环境中分离到军团菌［3］。而上海地区健康人血清抗体水平调查也证明军团菌早已存在，并对人群构成潜在威胁［4］。近年来从军团菌的流行可以看出军团菌对人类健康的威胁已达到不容忽视的程度，因此对该病的研究也越来越受到人们的重视。 目前用于军团菌检测的常规培养约7～10d，不仅花费大量时间和精力，还具有敏感性、特异性差的缺点，且操作复杂，易造成漏检和误检。分子生物学技术的发展为军团菌检测提供了新的契机，该课题应用聚合酶链（PCR）技术，检测环境中的军团菌，以分析奉贤地区军团菌的污染状况。 1．材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验菌株大肠埃希菌（A TCC25922）、肠炎沙门菌（ATCC13076）均购于美国典型微生物菌种中心保藏中心提供标准菌株。米克达德军团菌、杜莫夫军团菌由市疾控中心提供。 1.1.2 样品来源2010年分别在5月和10月以单纯随机抽样方式选取奉贤地区具有集中式中央空调设备的各大型超市，酒店共10家。以无菌方式采集空调冷却塔水于无菌广口瓶中，每件约200 ml（根据《公共场所集中空调通风系统卫生规范》），共采集64件。以沾湿生理盐水的棉签反复涂抹空调出风口以及酒店浴室莲蓬头出水口表面，剪去棉签接触手部位，将棉签置5 ml生理盐水中，共采集61件，采样后即送实验室检验。 1.1.3 培养基GVPC平板由柯玛嘉公司提供，血琼脂平板，各反应试剂由上海市疾病预防控制中心提供，均在有效期内使用。 1.1.4 诊断血清军团菌诊断血清由上海市疾病预防控制中心提供,均在有效期内使用。1.1.5 PCR扩增仪Techne Flexigene；全自动数码凝胶成像系统Tanon GIS-2010。 1.1.6 PCR试剂盒嗜肺军团菌（LP）PCR检测试剂由上海健益生物科技有限公司提供。 1.2 方法 1.2.1 分离培养鉴定样品经负压过滤后,剪碎放入蒸馏水中,混合振荡后吸取1毫升进行酸处理,静置5分钟后同时接种GVPC平板和血平板.36℃，5%CO2培养72 h后进行鉴定[5]。 1.2.2 PCR检测方法样品经负压过滤后,剪碎放入5 ml蒸馏水中，混合后取500 μl,12 000 rpm/min离心5 min,弃上清液，加100 μl DNA提取液入沉淀中，振荡混匀，置100℃水浴加热10 min,12 000 rpm/min离心5 min，保留上清液待用。取4 μl上清液加入26 μl PCR反应液中,同时做阳性对照。振荡混匀，将PCR反应管放入PCR扩增仪中。首先预变性94℃5 m
HKCDC/JL-WJ-040 上海市虹口区疾病预防控制中心检验原始记录 （嗜肺军团菌） 样品编号：第页共页样品名称: 样号标记: 收样日期: 检验完成日期: 检验项目和检验依据： 嗜肺军团菌卫生部《公共场所集中空调通风系统检验卫生规范》2006.3（附录A） 设备：CO2培养箱（仪器编号：S/N 305529-461） 生物安全柜（仪器编号：S/N 102589-95） 环境温度（℃）: 环境湿度（%）: 检测结果及记录： 样品形状： 1 材料：GVPC选择性平板：有效期，BCYE平板：有效期， 血平板：有效期，军团菌分型血清：有效期 （法国生物梅里埃公司提供），血平板（科玛嘉制备）分型血清（SCDC制备） 2 方法与步骤： 2.1无菌方法将500ml水样全部通过μm滤膜，取下滤膜仔细剪碎，置入一 含15ml原水样的大试管中，涡旋震荡充分洗脱后，备用。 2.2酸处理：取5ml洗脱样品，用0.01mol/L HCL调PH至2.2，混匀后静置5分钟。 2.3热处理：取1ml洗脱样品置50℃水浴加热30min。 2.4取2.1洗脱样品，2.2酸处理样品，2.3热处理样品各0.1ml，置入GVPC平 板，用L型玻璃棒将其在琼脂表面推开。 2.5将上述接种好的GVPC平板置入36℃ 2.5% CO2含量的二氧化碳培养箱中（有 湿盘）培养，每日观察GVPC平板上有无可疑菌落生长。 3 培养结果： 3.1三天后GVPC平板若有表面光滑，整齐，灰白，灰蓝或紫色呈典型毛玻璃状， 在紫外光灯下，有荧光的可疑菌落，做革兰氏染色镜检。 3.2结果记录： 3.2.1平板培养每日可疑菌落观察记录（有无可疑菌落分别以“+”，“-”表示 测试人：复核人：审核人： 年月日年月日年月日
２０１３年１月第２０卷第２期 儿童嗜肺军团菌肺炎30例临床分析 黄爱萍 嗜肺军团菌肺炎在临床症状和影像学上的表现与其他 病原体肺炎相比无特异性，很难鉴别［１］。本组儿童嗜肺军团 菌肺炎肺内症状虽无特异性，但咳嗽以刺激性干咳为主，寒战、胸痛、咯血不明显；且肺外症状明显，特别是消化道症状，部分病例肺外表现还于肺炎之前或肺炎成功治愈之后出现，需引起注意；血Ｃ反应蛋白（ＣＲＰ）和血沉升高为明显，重要脏器功能损害不明显；大片高密度阴影为主，两肺下叶特别是右肺下叶为主要病变部位。本文回顾３０例儿童嗜肺军团菌（Ｌｐ）感染肺炎的临床资料，分析儿童嗜肺军团菌肺炎的临床特点、诊断及愈后，以便为临床预防和诊断提供参考。报道如下：1 临床资料 １．１ 一般资料 我院２０１０年１月至２０１１年１２月收治的３０例嗜肺军团菌肺炎患儿，男１８例，女１２例。年龄＜２岁１例（３．３％），２～３岁８例（２６．７％），４～８岁８例（２６．７％），９～１３岁１３例（４３．３％）。３０例均无基础疾病。本地居民子女１８例（６０．０％），外地民工子女１２例（４０．０％）；夏秋季１８例（６０．０％），冬春季１２例（４０．０％）。住院时病程＜７ｄ１例（３．３％），７～１４ｄ １９例（６３．３％），＞１４ｄ １０例（３３．３％）。对照组３０例，选择同期住院支气管肺炎（非Ｌｐ感染），男１７例，女１３例。年龄２～３岁９例（３０．０％），４～８岁９例（３０．０％），９～１２岁１２例（４０．０％）。３０例均无基 础疾病。本地居民子女１５例（５０．０％），外地民工子女１５例（５０．０％）；夏秋季１８例（６０．０％），冬春季１２例（４０．０％）。住院时病程＜７ｄ １例（３．３％），７～１４ｄ ２１例（７０．０％），＞１４ｄ ８例（２６．７％）。 １．２ 儿童嗜肺军团菌肺炎诊断标准 ①发热、咳嗽等呼吸道症状；②胸部Ｘ线有渗出性阴影；③血清酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）抗嗜肺军团菌抗体ＩｇＭ阳性；④阿奇霉素或红霉素治疗有效。 １．３ 实验室检查与辅助检查 所有病例进行血、尿常规，血ＣＲＰ、血沉、血生化、心肌酶谱、痰培养、血气分析，副流感病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体ＩｇＭ抗体。ＥＬＩＳＡ试剂由德国欧蒙医学实验诊断股份公司提供。所有病例治疗前或治疗后１～２周行胸部Ｘ线或胸部ＣＴ检查。１．４ 统计方法 本文资料均为两独立组计数资料。其中非等级资料行卡方检验或精确概率检验。其他等级计数资料行秩和检验。多次比较则适当调整显著性水平。2 结果 ２．１ 临床表现 ３０例（１００．０％）患者均有发热，体温＞３９℃，热型不定；咳嗽３０例（１００．０％），其中刺激性干咳２４例，咳痰６例；呼吸困难１例（３．３％）；抽搐１例（３．３％）；肺部闻及干湿啰音１５例（５０．０％）；肝脾大２例（６．７％）。所有病例无胸痛、寒战、咯血、相对缓脉。两组间比较，除皮疹外，其余多项肺外表现差异均有统计学意义，嗜肺军团菌 组的肺外表现症状明显严重。见表１。 ２．２ 实验室检查结果 外周血白细胞＞１２×１０９ /Ｌ ９例 作者单位：317600 浙江玉环县人民医院儿科通信作者：黄爱萍，Email:hap_huang@https://www.doczj.com/doc/795596443.html, 【摘要】 目的 了解儿童嗜肺军团菌肺炎的临床特点、诊断及预后。方法 回顾分析我院２０１０年１月至２０１１年１２月经酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）检测嗜肺军团菌血清抗体ＩｇＭ诊断明确的３０例儿童嗜肺军团菌肺炎的临床特点、实验室检查、影像学改变及预后。结果 ①临床特点：发热、干咳、恶心、呕吐、腹痛、腹泻、肌肉酸痛。２９例（９６．７％） 血Ｃ反应蛋白（ＣＲＰ）＞８ｍｇ/Ｌ，９例（３０．０％）血白细胞＞１２×１０９ /Ｌ。部分病例有低钠血症。心肌酶谱、肾功能等 均正常。②３０例无重症肺炎。③胸部影像学改变，大片高密度阴影或云雾状阴影；胸腔积液３例；病变以两肺下叶多见。④３０例经阿奇霉素或红霉素治疗痊愈，咳嗽持续时间较长。结论 儿童嗜肺军团菌肺炎无基础疾病，为普通型肺炎，临床症状轻，病死率低。儿童肺炎肺外表现明显时考虑嗜肺军团菌肺炎可能。儿童慢性咳嗽可能与嗜肺军团菌感染有关。 【关键词】 儿童；嗜肺军团菌；肺炎
集中空调通风系统中嗜肺军团菌采集方法 一、概述 为了预防公共场所集中空调通风系统传播传染病，保护公众身体健康，卫生部组织制定了《公共场所集中空调通风系统卫生规范》 WS394-2012，并于2013年4月1日正式实施。规范对中央空调送风中可吸入颗粒物（PM10）浓度及嗜肺军团菌检出量做出了规定，并在检测方法中明确了对检测设备性能和质量要求。由于微生物气溶胶具有传播距离远，对人体危害严重，在浓度很低时便可以造成人群感染，因而检出困难，本文将介绍一种微生物气溶胶浓缩器与标准生物采样器BioSampler联合采样方法，通过提高单位时间内的采气量，经分离浓缩后送入标准生物采样器，可大大缩短采样时间，避免长时间采样对微生物活性的损伤，因而提高低浓度病原微生物气溶胶检出率。可广泛用于空气环境中病原微生物的采样与监测。 二、联合采样系统构成（图1） 1.浓缩采样头 2.KW-1型微生物气溶胶浓缩器主机 3.标准生物采样器BioSampler 4.干燥瓶 5. 外置抽气泵 图1 KW-1型微生物气溶胶浓缩器构成的浓缩采样系统 1.浓缩采样头 3.BioSampler （内装吸收液） 2.KW-1型微生物气溶胶浓缩器主机 4．干燥瓶 （内装干燥剂）
三、联合采样系统的工作原理 KW-1型微生物气溶胶浓缩器的“浓缩采样头”是基于虚拟冲击浓缩法原理设计。带有微生物气溶胶的空气通过总气流进口进入到“浓缩采样头”中，总气流经加速板加速后进入加速板和接收板之间，其中，小于切割粒径的气溶胶粒子随主流量发生偏转，通过主气流出口流出。而大于切割粒径的微生物气溶胶粒子由于惯性大，直接向前运动进入接收喷嘴，形成小气流通过“浓缩采样头”浓缩气流出口流出，从而达到微生物气溶胶的浓缩；总气流流量与浓缩气流流量之比即为浓缩比。浓缩后的气体进入装有吸收液液体冲击式微生物采样器（BioSampler）被采集，采集的样品可以用于后续的微生物检测。总气流与浓缩气流的流量由“KW-1型微生物气溶胶浓缩器”主机控制和显示。 四、KW-1型微生物气溶胶浓缩器的特点及主要技术指标 1.触摸屏控制，汉字显示 2.可设定定时采样、定体积采样、手动控制采样 3.双路采集流量及累计体积实时显示 4.采样时间、平均流量等数据可保存和回放 5.流量可手动校准 6.灵活的采样方式：可利用内置云台采样也可以使用外置云台高位采样。 7.总气路流(110～130) l/min可调，允许误差±5%。 8.接标准生物采样器后浓缩气路流量（7～10.5）l/min可调，允许误差±5%。 9.总气路流量及浓缩气路流量重复性误差±2%。 10.理论浓缩比1:10 11.定时功能:（1～40） min 五、现场安装与使用方法 使用内置云台构成的浓缩采样系统见图2。 当需要在呼吸带采样时，可使用内置云台方式： 1.将三角架调整至1.2m高度左右，调平并锁紧。 2.将KW-1放置到三角架上。 3.打开KW-1后面板上的内置云台，分别放入标准生物采样器BioSampler及干燥瓶。 4.在BioSampler中放入吸收液，干燥瓶中放入干燥剂。
了采样的效率。三是混杂物质和环境的干扰,国外的 研究发现空气中细菌和真菌等混杂物质的干扰会降低撞击法的采样效率,通过添加高效过滤网,可以提高采样效率[12]。此外环境的温湿度对流感病毒的采集效率也有一定的影响[13] 。 本实验证实了使用新型静电场采样装置采集分析流感病毒是可行性的,可以进一步改进目前的采样器,通过延长气溶胶在采样器中的停留时间,提高其采集的效率。 [参考文献] [1] Lesne J ,Bert het S ,Binard S ,et al.Changes in culturability and virulence of Salmonella typhimurium during long 2term starvation under desiccating condition[J ].International Journal of Food Mi 2crobiology ,2000,60(223):1952203. [2] Lipsitch M ,Cohen T ,Cooper B ,et al.Transmission dynamics and cont rol of severe acute respiratory syndrome [J ].Science ,2003,300(5627):196621970. [3] Lee KS ,Bartlett KH ,Brauer M ,et al.A field comparison of four samplers for enumerating fungal aerosols I.Sampling charac 2teristics[J ].Indoor Air ,2004,14(5):3602366. [4] Mainelis G ,Grinshpun SA ,Willeke K ,et al.Collection of air 2 borne microorganisms by electrostatic precipitation [J ].Aerosol Science and Technology ,1999,30(2):1272144. [5] Yao MS ,Mainelis G ,An HR.Inactivation of microorganisms u 2 sing electrostatic fields[J ].Environmental Science and Technolo 2gy ,2005,39(9):333823344. [6] Agranovski I ,Safatov A ,Sergeev A ,et al.Rapid detection of airborne viruses by personal bioaerosol sampler combined with the PCR device [J ].Atm ospheric Environment ,2006,40(21):392423929. [7] Drosten P ,Seifried E ,Rot h W K.TaqMan 5’2nuclease human immunodeficiency virus type IPCR assay wit h phage 2packaged competitive internal control for high 2t hroughput blood donor screening[J ].Clinic Microbiology ,2001,39(12):430224308.[8] Agranovski I ,Safatov A ,Borodulin A ,et al.Inactivation of vi 2 rus in bubbling processes utilized for personal bioaerosol monito 2ring[J ].Applied Environmental Microbiology ,2004,70(12):696326967. [9] Hermann J R ,Hoff S J ,Y oon K J ,et al.Optim ization of a sampling sys 2 tem for recovery and detection of airborne porcine reproduction and re 2spiratory syndrome virus and swine influenza virus[J ].Applied and En 2vironmental Microbiology ,2006,72(7):481124818. [10] K ell DB ,K aprelyants AS ,Weichart D ,et al.Viability and activity in readily culturable bacteria :A review and discussion of the practical is 2sues[J ].Antonie van Leeuwenhoek ,1998,73(2):1692187. [11] 吕阳.动物吸入染毒气溶胶发生系统的研究[J ].中国比较医学 杂志,2003,13(3):1692171. [12] Neumann HD ,Becker G ,Lohmeyer M ,et al.Preventive meas 2 ures to reduce bioaerosol exposure during refuse collection ;re 2sult s of field studies in t he real 2life situations[J ].Science of t he Total Environment ,2005,341(123):1213. [13] Kalogerakis N ,Paschali D ,Lekaditis V ,et al.Indoor air quali 2 ty 2bioaerosol measurement s in domestic and office premises[J ].Aerosol Science ,2005,36(526):7512761. ?专题论著? 嗜肺军团菌荧光定量PCR 检测方法的建立 张琦1,陈晓东1,2,张宝莹3,钱乐4,司朝宗4,张秀珍2,甄世祺2,刘凡3,陈连生2 (1.南京医科大学公共卫生学院, 江苏南京 210029;2.江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 3.中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所, 北京 100050; 4.东南大学公共卫生学院, 江苏南京 210009) DOI :10.3969/j.issn.1006-9070.2010.03.002 基金项目:“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAI19B04)收稿日期:2010-03-22 作者简介:张琦(1984— ),女,内蒙古赤峰人,硕士研究生在读。 【摘 要】 目的:建立嗜肺军团菌mip 基因荧光定量PCR 检测方法。方法:利用Primer Express 软件设计特异性引物和探针,对质粒标准品、嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他菌株进行检测,验证方法的特异性、敏感性和重复性,最后采集环境样本进行检测。结果:该方法特异性好,嗜肺军团菌呈现阳性结果,而非嗜肺军团菌及其他菌株均为阴性结果。检测灵敏度达 293copies/μl ;重复性较好,Ct 值变异系数较小;检测的12份环境样本中5份阳性。结论:该方法快速且具有较好的特异性、 敏感性、重复性,适于外环境嗜肺军团菌污染调查及应急事件的快速检测。 【关键词】 嗜肺军团菌;荧光定量PCR 检测;mip 基因 【中图分类号】 R -331 【文献标识码】 A 【文章编号】 1006-9070(2010)03-0003-04
军团菌 军团杆菌，系需氧革兰氏阴性杆菌，以嗜肺军团菌最易致病。广泛存在于自然环境中，其传染源是水源和空调系统，通过空气传播。根据细胞壁组成、生化反应和DNA杂交研究，军团菌和过去已知的病原菌无关，故构成单独一个科。军团菌科仅有一个属，即军团菌属。 现已提出了超过30种军团杆菌，至少19种是人类肺炎的病原。其中最常见病原体为嗜肺军团菌(占病例的85%~90%),其次是L.micdadei(占5%~10%),再次是L.bozemanii和L.dumoffii.此类细菌形态相似，具有共同的生化特征，引起类似疾病。 发现历史 1976年美国费城退伍军人协会会员中曾爆发急性发热性呼吸道疾病，是已知的首次爆发；221人感染疾病，其中死亡34人。由于大多的死者都是军团成员，因此称为军团病或退伍军人症。 早在1965年7～8月华盛顿特区圣伊丽莎白医院就曾有一次类似流行，81例罹病，14例死亡（17.3%)。1968年7～8月密执安州庞堤阿克市曾发生一次不明原因的疾患，累及144人，特点为发热、头痛、肌痛、腹泻及呕吐，无一例死亡；后称庞堤阿克热。 此后，军团病在全球共发生过50多次，近几年在欧洲、美国、澳大利亚等国家和地区均有流行。 近年来我国也发生了小规模疫情爆发，2000年1月北京市通州区某新兵训练营地发生了一起呼吸道感染疫情，流行病学和血清学检查证实，这是一起由博杰曼军团菌所引起的军团菌暴发流行. 2000年7月某写字楼多名员工出现发热、咽喉痛、肌肉痛，在312名员工中共发病193人。经检查证实,这是一次由空调系统冷凝水导致的上呼吸道感染型军团菌暴发流行。同时国内许多地区均有报道散发的军团病病例和亚临床感染。2000年北京20多所医院的129例肺炎患者，采用一般抗生素治疗无效，难以确诊，经血清学检查，33份为军团菌抗体阳性。可见在肺炎感染病人中,军团菌肺炎占一定的比例。我国1995年12月～1996年1月在驻京某部新兵集训营地新兵战士中发生了6例军团菌病，其中1例死亡。1999年4月份，在某新兵大队中又发生了21例军团菌病的暴发流行。 经研究,发现一种细菌命名为嗜肺军团菌。随后，许多有关细菌暂被列入这一属,且追溯研究发现早在1943年即有军团人员病的病例.现已提出了超过30种军团杆菌,至少19种是人类肺炎的病原。其中最常见病原体为嗜肺军团菌(占病例的85%~90%),其次是 L.micdadei(占5%~10%),再次是L.bozemanii和L.dumoffii.此类细菌形态相似，具有共同的生化特征,引起类似疾病。