流式细胞仪（Flow Cytometry）
1 流式细胞仪的概念及其发展历史
1．1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪（flow cytonletry，FCM）是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。
1．2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。
宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人。由于这本书是13年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说，这本书太复杂太深奥。谢小梅主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用。杨蕊概括了流式细胞仪的工作原理，简单提及了流式细胞仪的应用。本文在分析这三篇论著或文章的优缺点后，用比较通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解的一些原理，并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括。
2 流式细胞仪的工作原理和技术指标
2．1 流式细胞仪工作原理除电源外，流式细胞仪主要由四部分组成：流动室和液流系统：激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统，其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同完成了信号的产生、转换和传输的任务。
流动室和液流系统
流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。
激光源和光学系统
经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配和氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。汞灯是最常用的弧光灯，其发射光谱大部分集中于300～400nm，很适合需要用紫外光激发的场合。氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine6G水溶液的染料激光器,则可得到550～650nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半。为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。光斑直径d可由下式确定：d=4λf/πD。λ为激光波长；f为透镜焦距；D为激光束直径。色散棱镜用来选择激光的波长，调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长λ。为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使用525nm带通滤片只允许FITC（Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素）发射的525nm绿光通过。长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。
光电管和检测系统
经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管（PMT）最为常用。PMT的响应时间短，仅为ns数量级；光谱响应特性好，在200～900nm的光谱区，光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从10到10可连续调节，因此对弱光测
量十分有利。光电管运行时特别要注意稳定性问题，工作电压要十分稳定，工作电流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；最大阳极电流在几个毫安。此外要注意对光电管进行暗适应处理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中还要注意安装位置不同的PMT，因为光谱响应特性不同，不宜互换。也有用硅光电二极管的，它在强光下稳定性比PMT好。
从PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞计中一般备有两类放大器。一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系，称为线性放大器。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例DNA测量等。另一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，它们的荧光强度相差1～2个数量级；而且在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。此外还有调节便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。
计算机和分析系统
经放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的，也是和光信号的强弱相关的。对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道分析器出来的信号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件，或存贮于计算机的硬盘和软盘上，或存于仪器内以备调用。计算机的存贮容量较大，可存贮同一细胞的6～8个参数。存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，进行数据处理和分析，最后给出结果。除上述四个主要部分外，还备有电源及压缩气体等附加装置。
2．1．1 信号的产生、转换和传输在压力作用下，鞘液管中的鞘液被持续不断地压入流动室，形成一股稳定地连续的液流，保证了样本液稳定地处于鞘液液流的轴线上，并以单个细胞形式直线通过激光照射区。激光照射区又称测量区，是指液流与激光束垂直相交的点。当细胞携带荧光素标记物（每种物质携带的标记物不同吗?）通过激光照射区时，产生代表细胞内部不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360°立体角发射，产生散射光和荧光信号。散射光不依赖任何细胞样品的制备技术，因此被称为细胞的物理参数或固有参数。散射光又包括前向角散射和测向角散射。前向角散射与被测细胞直径的平方密切相关，测向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。荧光信号也有二种；一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光信号，另一种是经过特异荧光素标记后的细胞受激发照射后得到的荧光信号。在免疫分析中常要同时探测两种以上波长的荧光信
号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。
经荧光染色的细胞受到适合的光激发后产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。最常用的光电转换器是光电倍增管（PMT）。从PMT输出的电信号需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞仪中一般备有两类放大器。一类是线性放大器，其输出信号与输入信号成线性关系。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，如DNA测量等。另一类是对数放大器，其输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。放大后的电信号被传送到计算机，再经模一数转换器传输到微机处理器形成数据文件，保存在计算机上。保存在计算机上的数据可在脱机后再进行数据处理和分析。
参数（例如：细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构）测量原理
流式细胞仪可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量是在测量区进行的，所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2π（360°）的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号当然不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。
在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量：①前向角（即0角）散射（FSC）；
②侧向散射（SSC），又称90角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系；对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大，尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。
在实际使用中，仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞。光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。
荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波
长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。
减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料；②选用适宜的激光和滤片光学系统；③采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。
2．1．2 流式细胞仪分选原理并不是所有的流式细胞仪都具有分选功能。流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。由喷嘴射出的液流柱在电信号作用下发生振动，断裂形成均匀的小液滴。根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中。使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选效果。从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，可根据具体要求进行适当调整。
2．1．3 数据的显示和分析数据处理主要包括数据的显示和分析。单参数直方图是使用最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析。单参数直方图是由X、Y二方向组成的二维平面图。横座标X是所测的荧光或散射光的强度，用“道数”（Channel No．）来表示。选择的放大器类型不同，标度不同。纵座标Y通常表示被测细胞的绝对数目。正常情况下，数据分析得到的图形为具有一个或若干个峰的曲线图。对曲线图的解释应该具体问题具体分析。
除直方图外，数据显示方式还包括二维点图、二维等高图、假三维图和列表模式等。二维点图也是比较常用的数据显示类型。它显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系，也是二维平面图，横纵坐标可以根据自己选定的被测参数自行决定，点的位置表明了细胞和颗粒具有的二个被测参数的数值。二维点图所提供的信息量要大于单参数直方图。
数据分析的方法大体可分为参数法和非参数法两大类。当被检测的生物学系统能够用某种数学模型时则多使用参数方法。非参数分析法不用对显示的图像做任何假设，也不采用数学模型，分析程序可以很简单，也可能很复杂。临床医学较常使用非参数分析法。
2．2 流式细胞仪性能的技术指标流式细胞仪性能的技术指标主要有荧光分辨率、荧光灵敏度、适用样品浓度、分选纯度等。荧光分辨率是指分辨两个相邻峰的最小距离，通常用变异系数（CV值）来表示。现在市场上主流型号出厂时的荧光分辨率应该小于2.0%。荧光灵敏度反映了仪器探测最小荧光光强的能力。一般用荧光微球上可测出的FITC的最少分子数来表示。目前仪器均可达到1000左右。仪器工作时样品浓度一般在105～107细胞/ml。分析速度/分选速度是指流式细胞仪每秒种可分析或分选的颗粒数目。一般分析速度为5000～10000，分选速度控制在1000以下。
流式细胞仪测量的数据是相对值，因此需要在使用前对系统进行校准或标定。流式细胞仪的校准有二个目的，即仪器的准直调整和定量标度。通常使用标准微球作为非生物学标准样品，鸡血红细胞做为生物学标准样品。
3 主流流式细胞仪型号及其特性介绍
目前拥有市场较大份额的公司是美国的BD（Becton-Dickinson）公司、Beckman-Coulter公司（原名称Coulter）和德国的Partec公司。
3．1 BD公司流式细胞仪介绍BD公司生产的流式细胞仪都冠以FACs（fluorescence activated cell sorter），即荧光激活细胞分选器。其型号种类比较齐全，如早期的FACSort、FACS Canto、FACSean。现在市场上供应的型号有五种：FACSCount（小型流式细胞仪）、FACS CAlibur（流式细胞仪）、FACSA ria（流式细胞分选仪）、FACSV antage SETM（多色分析和高速分选流式细胞仪）、LSR II（数字化分析型流式细胞仪）。
FACSCount为精确计数淋巴细胞CD3，CD4，CD8绝对数而设计的。FACSCalibur是全自动多色流式系统，偏重于临床，其整体设计帮助临床医生快速实现常规免疫表型、CD4T细胞计数、DNA、网织红细胞、血小板等临床分析，兼具分选功能。配备有二根激光管，可同时检测4个荧光参数。可识别粘联细胞。
BD FACSA ria流式细胞分选仪为台式高速细胞分选仪，获取速度达70，000细胞/s，分析速度达50，000/s。使用石英杯流动检测池固定光路校准技术。使用三种激光，多色分析，分析参数可达15色。两管或四管分选，可以使用多种规格的收集管。液流监测系统白动监测液流断点，检查堵塞，实现了细胞分选的无人操作。配件BDACDU装置，可以在微孔板或载波片上定量分选细胞。
FACSV antage SETM是在FACSV antage的细胞分选功能基础上推出的分选增强型流式细胞仪。六色荧光分析系统，点对点分选，配置FACS Diva数字化系统，提供全面的配套试剂。速度和功能优于FACSV antage。BD LSR II是LSR的数字化升级版，其性能介于FACSV antage SE和FACS Calibur之间，是专为生命科学研究设计的台式机。配备固定校准的紫外激光，四种激光立体空间激发、十色荧光同时分析、电子系统数字化、比较易学易用。
3．2 Beckman-Coulter公司流式细胞仪介绍Beckman- Coulter公司生产的流式细胞仪以Profile（早期，现已停产）和EPICS系列为代表，近年又推出了Cytomics FC500系列。EPICS系列是大型流式细胞仪，目前市场上有XL、XL-MCL和ALTRA三种型号，其中ALTRA具有分选功能，适用于免疫学、细胞生理、分子生物学、遗传学、微生物学、水质分析和植物细胞分析。Cytomics FC500系列流式细胞仪体积小，可自动进行5种颜色的分析，适用于免疫学检测，如人类HIV诊断。特别是FC500MPL的独特设计可以在同一系统上使用12×75mm的离心管和24或96孔的平板。特别适合工作量大的实验室。
这二个公司主要针对医学研究和临床工作进行设计和生产，其产品可应用于生物医学基础研究以及临床检
测的许多领域，如遗传、肿瘤、血液、免疫等诸多研究中红细胞、T细胞、淋巴细胞亚群测定、检测早期细胞凋亡、肿瘤细胞免疫测定等。这二个公司的流式细胞仪价格昂贵，我国主要购买、使用的单位基本上都是一些医疗机构。
3．3 Partec公司流式细胞仪介绍与BD和Becman-Coutler公司的产品相比，德国Partec公司生产的流式细胞仪的共同特点是体积小，造价低，易操作，便于携带，适合植物学研究，适合边远地区和发展中国家。德国Partec公司的产品分为三类：CCA家族、PAS家族和CyFlow家族（Galaxy为早期产品，已停产）。CCA家族包括细胞计数分析仪CCA和倍性分析仪PA-I。它是单或双参数的台式小型机，可以进行一些常规分析，如核DNA测定（检测倍性或细胞周期）、细胞计数、细胞凋亡。它的特点是体积小，易操作，价格低，检测范围广，可以检测多种荧光素（如PI、DAPI、Fluorescein）发出的荧光。PAS家族包括粒子分析系统PAS、粒子分析系统III（PAS-III）和倍性分析仪PA-II。提供三种激光器的三种组合，可检测十余种荧光染料。最多可检测和记录八个独立荧光参数。倍性分析仪PA能够在2分钟内自动测量植物的倍性水平，检测异倍体。可以对叶片、幼苗、种子、果皮、根、花等植物材料进行分析。在大多数植物中，异倍体染色体的检测分辨率为±1条染色体。PA-I使用HBO-100汞灯，属于弧光灯，可产生紫外激发光和蓝光。PA-II 中增加了488nm氩离子激光器，能够检测几乎所有的荧光染料，如DAPI，Hoeehst，PI，EB，MMC，FITC，FDA等。汞灯发光是电流经过气体时，气体电离产生的。它能提供最佳的激发波长。
CyFlow（R）SL配备三种激光管，可应用于诸如人类健康、微生物学、工业应用、过程控制、生态学等研究。如HIV扫描中免疫标记细胞计数、食品处理过程中的微生物计数、细胞凋亡等。它使用l2 V直流电，特别适合边远地区和发展中国家。
国际上20世纪80年代开始将流式细胞仪检测应用到植物的研究中（Galbraith，1983），众多学者都认为流式细胞仪是一种准确、快速的检测DNA含量的方法（Michaelson，1991）。应用范围主要是利用流式细胞仪研究属内、属间多种植物的DNA含量（Baird，1994；Jacob，1996；HALL，2000）和倍性水平（Costich，1993；Meng，2002）、检测体细胞杂种（Pfosser，1995；Keller，1996）和游离小孢子培养再生株（Kim，2003）的DNA含量。过去我国应用这一检测技术的植物研究工作者寥寥无几，且大多是在国外实验室完成的。研究内容包括植物生理、程序性死亡、倍性鉴定等。植物研究中使用的流式细胞仪基本上都是Partec 公司的产品，也有少量是BD公司生产的流式细胞仪。BD公司的产品主要定位于医学研究与应用，与Partec 产品相比，不太适合从事植物染色体倍性的鉴定。主要体现在不能提供植物样品制备技术/试剂，数据获取软件可同时检测到的倍性数目少。鉴于目前我国科研院所中使用较多的是BD公司生产的流式细胞仪，在下一篇中将会对利用BD流式细胞仪进行植物倍性检测的技术和技巧做详细报告。
如何选择流式细胞仪
自七十年代出现第一代流式细胞仪以来，随着计算机技术、电子制造技术、激光技术及荧光素合成技术的不断发展，现代流式细胞仪已今非昔比，制造工艺、功能、精确度有了质的飞跃。
流式细胞仪生产厂商推出各种不同型号的流式细胞仪来满足用户的不同需要。现生产流式细胞的厂商全球至少有六家，各厂商产品又有不同的系列，各具特点。如何从众多的型号中挑选出最适合自己的机型，我们还需从分析应用出发，评估自己的需求来决定什么样的流式细胞仪最具性价比、最适合自己。
⑴、DNA倍体分析
DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用最广检测项目。由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同，存在异倍体细胞，所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息，这在细胞生物学中运用很广泛。特别地，它可表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。这些DNA检测还可与细胞表面标志物标记同时进行，这样在细胞混合培养中，可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光，常用的染料为PI，DAPI。
流式细胞仪要求：488nm光源，575nm滤光片。
⑵、细胞生存能力实验
使用Heochest 33342染料与DNA特异性结合，后因细胞活力不同，染料的结合程度也各异，故可评估细胞的活性度。
流式细胞仪要求：360nm光源，455nm滤光片。
⑶、计数外周血中检测网织红细胞
使用TO染料能够特异性地与RNA结合，结合系数高达3000，故具有很好的性价比。
流式细胞仪要求：488nm光源，525nm滤光片，液量绝对计数系统。
⑷、外周血、骨髓采集物中CD34阳性干细胞计数，临床上用于骨髓移植前干细胞数理的测定
使用标准ISHAG方案，需要DNA或其他核染料占用FITC通道，PE标记CD34抗体，PE-CY5标记CD45抗体。流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片，液量绝对计数系统。
⑸、交叉淋巴细胞、粒细胞毒实验
检测识别供体血清中免疫球蛋白与受体粒细胞之间是否存在反应有着重要临床意义，因为这种反应会导致移植后发热、移植后肺损伤及免疫性粒细胞缺乏症。流式细胞仪可检测全血样本与血清孵育后粒细胞上结
合的人免疫球蛋白。FITC标记人免疫球蛋白抗体、PE标记粒细胞表面标志物、PE-CY5标记HLA抗体。
流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。
⑹、血小板自身抗体检测
血小板自身抗体识别人血小板抗原，会引起各种临床相关症状，如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。流式细胞可快速准确地检测血小板自身抗体。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE 标记识别血小板抗体。
流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片。
⑺、移植交叉配型
原细胞毒实验，主要用于避免移植物超急性排拆反应。流式细胞仪用于监测T或B细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击，作为HLA配型前的预实验。流式细胞仪因其高精确性已成为该领域内的金标准。FITC 标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别T细胞CD3或B细胞CD29抗体。
仪器要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片。
⑻、检测细胞经抗原或细胞有丝分裂刺激后活化效应
淋巴细胞早期活化指标CD69可用来检测免疫治疗效果。流式细胞使用三色分析可监测淋巴细胞各亚群活化情况：FITC标记的CD3抗体、PE标记的CD8抗体、PE-CY5标记的CD69抗体。
流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm、575nm滤光片。
⑼、检测细胞内因子（TH1/TH2细胞检测）
未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来，因此在检测前需刺激活化。活化所用的刺激素为PMA 佛波酯+Ionomycin。淋巴细胞在刺激素的作用下，活化分泌细胞因子到细胞外。因流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，如细胞因子分泌到细胞外则检测不到，因此必须阻止细胞因子的分泌。抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A或Monensin。Th1/Th2细胞首先是CD4+T细胞，因此存在着用CD4来设定细胞群的问题。我们知道CD4不但在T 细胞上表达，还在所有的单核细胞上表达，因此单独用CD4设门无法将CD4+T细胞区分开来。那么我们用CD3和CD4双参数设门是否可以呢？回答是否定的。因为在佛波酯的刺激作用下CD4 抗原的表达会迅速下调，甚至完全丧失，所以不适合于设门。用CD3和CD8设门，因CD8不受佛波脂的影响且绝大多数CD3+CD8-的细胞都是CD3+CD4+细胞，因此可用CD3+CD8-细胞群来确定CD4+T细胞群。FITC标记CD8，PE标记IL-4和，PE-CY5标记IFN-r，APC或PE-CY7标记CD3。
流式细胞仪要求：488nm或633nm（仅限APC染料）光源，525nm、575nm、675nm，767nm滤光片。
⑽、细胞增殖状态检测
核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量细胞增殖分裂状况，在评估肿瘤预后有重要意义。为些标志物的检
测一般同细胞表面标志物同时检测。FITC标记PCNA或Ki67或BrdUrd，PE或（并）PE-CY5标记细胞表面标志物。
流式细胞仪要求：488nm或633nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。
⑾、染色体分析
流式细胞仪染色分析运用两种特异性染料：Hoechest33258与核苷酸AT结合；Chromomycin A3与GC相结合。从而在双参数坐标上根据染色体ATCG含量的不同识别各种染色体。平时进行的染色体分析耗时且需要操作者极具经验，而用流式细胞仪时可快速地识别出异常染色体，如加配分选系统可将这些异常染色体分选出来作进一步分析。
流式细胞仪要求：360nm或488nm光源，450nm、580nm滤光片。
⑿、BrdUrd标记追踪细胞分化
通过细胞分化时涉入溴化尿嘧啶，再使用抗BrdUrd抗体及PI核酸染料可精确识别它们。在流式细胞仪上可清楚地识别出处于G1、S、G2、M期的细胞，在肿瘤研究中有着重要作用。
流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm滤光片。
⒀、淋巴细胞亚群分析
外周血CD3、CD4、CD8、CD19、NK等各类淋巴细胞亚群定量分析。
流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm滤光片，液量绝对计数系统。
⒁、白血病免疫分型
CD45设门三色白血病免疫分型。
流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。最少三色荧光，参数越多检测越为灵敏。⒂、血小板分析
血小板活化实验、血小板功能分析。血小板识别抗体及相应活化指标。
流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片，液量绝对计数系统。
⒃、白血病、淋巴瘤微小残留病灶检测
根据初诊免疫分型结果，多参数联合设门检测是否有残留白血病细胞，监测白血病的复发。
T系白血病微小残留病灶检测
流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片，液量绝对计数系统。
B系白血病微小残留病灶检测，液量绝对计数系统
流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。最少三色荧光，参数越多检测越为灵敏。
髓系白血病微小残留病灶检测，液量绝对计数系统
流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。最少三色荧光，参数越多检测越为灵敏。
⒄、细胞凋亡分析
DNA凋亡峰检测、ANNEXIN-V/PI双染法凋亡检测。
流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm滤光片。
⒅、肿瘤耐药分析
P-gp、LRP、MRP、BCRP各类耐药蛋白表达及功能检测。
流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。
⒆、强直性脊柱炎诊断
检测淋巴细胞B27表达强度及百分比，诊断强直性脊柱炎。
流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。
⒇、PNH诊断
外周血或骨髓检测淋巴细胞、粒细胞、红细胞或单核细胞CD55、CD59表达强度或百分比，确诊夜间阵发性血红蛋白尿。
流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。
山西大学研究生学位课程论文（2013 ---- 2014 学年第一学期） 学院（中心、所）：生物技术研究所 专业名称：微生物学 课程名称： 论文题目：流式细胞仪的原理及其应用 授课教师（职称）：崔晓东 研究生姓名：常姣 年级：研一 学号：201323001003 成绩： 评阅日期： 山西大学研究生学院 年月日
流式细胞仪的原理及其应用 姓名常姣专业微生物学 摘要本文简要论述了流式细胞仪( flowcyt ometry, FCM) 的工作原理, 并对其某些科学领域研究中的应用进行阐述, 包括在生物学、免疫学、临床学中的研究应用。 关键词 FMC；生物学；免疫学；临床学 流式细胞仪( fl o w c y to me tr y, F CM) 研制、发展、革新和应用领域的扩展，都是由生物学、生物技术、计算机科学、电子工程学、流体力学、激光技术、分子生物学、有机化学和物理学等多个学科综合发展和应用而实现的。近代流式细胞仪，由于单克隆抗体技术、定量细胞化学和定量荧光细胞化学的应用，使其在生物学、临床医学等众多研究领域的应用愈来愈广泛和重要，尤其在生物学中对细胞周期的动力学分析、细胞因子、细胞凋亡、信号传导、R N A / D N A 的分析、细胞表面受体及特异性抗原的分析等领域发挥着独特作用，具有操作简单、分析精确、重复性好、费用低廉、分析速度快等优点。 1流式细胞仪的构成及工作原理 流式细胞仪主要由液流系统、光学系统、电子系统、分析系统和细胞分选系统五个部分组成。将待测细胞制成单细胞悬液, 经荧光染料染色后加入样品管, 在一定气体压力下待测样品被压入流动室。待测细胞在鞘液的包裹下单行排列, 依次通过检测区, 被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后, 产生散射光和荧光信号。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管(PMT) 接收。散射光分为前向角散射(forwardscatter, FSC) 和侧向角散射(sidescatter, SSC) 。前者主要反映被测细胞的大小, 后者主要反映被测细胞的胞质、胞膜、核膜的折射等, 以及细胞内颗粒的性状。光信号通过波长选择通透性滤片后, 经光电倍增管接收后转为电信号, 再经数/模转换器转换为可被计算机识别的数学信号, 以一维直方图或二维点阵图及数据表或三维图形显示出来[1,2]。 流式细胞仪还可以对分析中的目的细胞进行分选, 它是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。流动室的喷嘴上安装有超高频的压电晶体, 可以产生高频振荡, 使液流断裂为均匀的液滴, 待测细胞就包含在液滴之中。将这些液滴充上正或负电荷, 当带电液滴通过电场, 便会在电场的作用下发生偏转, 然后落入相应的收集器中, 从而实现细胞分选[2]。 2流式细胞仪的应用 流式细胞术的应用，简单用一句话概括就是，凡能被荧光分子标记的细胞或微粒均能用流式细胞仪检测。其中细胞生物学领域是流式细胞术在基础研究中应用范围最广泛的领域，因为最初这个技术就是为此目的而设计的。 2.1流式细胞仪在生物学中的应用 流式细胞仪在生物学中的应用越来越广泛,如在细胞生物学、细胞遗传学、分子生物学、神经生物学、微生物学、分子免役学、植物学等等许多生物学基础学科的应用和在细胞凋亡、细胞周期调控、细胞因子及细胞分型等研究中的应用[3]。 2.1.1 对凋亡细胞的分析 细胞凋亡是生物体生长发育过程中出现的正常现象, 在生物体形态构成、正常细胞更替以及维持
流式细胞仪（Flow Cytometry） 1 流式细胞仪的概念及其发展历史 1．1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪（flow cytonletry，FCM）是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。 1．2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。 宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人。由于这本书是13年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说，这本书太复杂太深奥。谢小梅主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用。杨蕊概括了流式细胞仪的工作原理，简单提及了流式细胞仪的应用。本文在分析这三篇论著或文章的优缺点后，用比较通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解的一些原理，并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括。 2 流式细胞仪的工作原理和技术指标 2．1 流式细胞仪工作原理除电源外，流式细胞仪主要由四部分组成：流动室和液流系统：激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统，其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同完成了信号的产生、转换和传输的任务。 流动室和液流系统
流式细胞仪工作原理与应用范围 2008-11-01 10:30 流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器，被誉为试验室的“CT”。 流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。 工作原理 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。 这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。 检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。 细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。 应用范围 可用于白血病的分型、肿瘤细胞染色体的异倍性测定，以及免疫学研究，并已开
流式细胞术详解 一. 流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术 ,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B- D公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能 ,多用于科学研究。 二.流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。 2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。 4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。 三.流式细胞仪主要构造和工作原理 流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信 号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。 流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。见图12.1流动室示意图。流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、250μm等多种，供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。 图12.1流动室示意图(采自Coulter Training Guide) 四. 流式细胞仪主要构造和工作原理 激光光源及光束形成系统
二代流式技术产品-成像流式细胞分析 邱又彬 Merck&Millipore旗下品牌Amnis于近期推出了新一代高速细胞成像系统ImageStreamX Mark II。这是第三代ImageStream成像流式细胞仪，具有无与伦比的细胞分析能力。 显微镜可提供详细的细胞图像和形态信息，是研究细胞功能的重要工具。然而，显微图像的解释却是主观、定性且费力的。流式细胞仪擅长定量的表型分析，可产生统计学上可靠的结果，不过，流式细胞仪却缺乏成像能力，因此无法了解亚细胞定位。 ImageStream系列开创性地将流式细胞检测与荧光显微成像结合于一体，既能提供细胞群的统计数据，又可以获得单个细胞的图像，从而提供了细胞形态学、细胞结构和亚细胞信号分布的完整信息。 ImageStreamX Mark II能实时捕获每个流动细胞最多12幅高分辨率图像，检测速率可达5000细胞/秒，并具有更强荧光灵敏度。ImageStreamX Mark II的这些功能可以对细胞形态、荧光探针的强度和定位进行检测，进而为科学家提供广泛的图像分析应用，包括细胞间相互作用、吞噬、凋亡和自噬、核易位、形态变化等。 ImageStreamX Mark II的特征如下： ?速度更快：Mark II对进样速度进行了提升，每秒可以分析多达5000个细胞，简单易用的补偿向导可以指导您轻松完成多色补偿运算。 ?操作更简单：全新而直观的用户界面提供了每一个细胞的图像及实时绘图相关的图形化控件。 ?样品适应性更强：Mark II可选配7个激光；样品容量20-200 μl，增加了实验的灵活性，适用于多用户实验室。 ?样品利用率更高：Mark II将样品利用率提高到了95%，更适用于稀有的细胞样品，而且未使用的样品也可回收用于进一步分析。 从2005年开始，Amnis量化成像流式分析仪被广泛应用于各个研究领域。其中超过300篇的文章发表在高水平的同行评议杂志（peer-reviewed journal）上。这些研究领域包括生物化学、药物研发、血液、免疫、微生物、海洋、肿瘤、寄生虫、干细胞、毒理、病毒等等。并且由于Amnis与众不同的实验理念和卓越性能，使得这个名单不断变长。 1.生物化学： 经典的生物化学技术主要用于分子定位和共定位检测，这非常适合使用Amnis量化成像流式分析系统，比如转录因子从细胞质到细胞核的转位、分子在亚细胞器间的运输、蛋白质在细胞内和细胞间的共定位。它可以获取复杂样品每个细胞中探针定位和共定位的统计学结果，这对于传统生物化学研
BD流式细胞仪工作原理 流式细胞仪的工作原理是：将待测细胞经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。 这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。 这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。 计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。 检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。 一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。 细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。 将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。对分选出的细胞可以进行培养或其它处理，做更深的研究。 美国BD C6型流式细胞仪 首先C6流式细胞仪能避免操作新手的一个容易犯的错误;--;调整电压，同步化
流式细胞仪入门 ----- 秦华 译
目录 前言 第1章综述 第2章液流系统 第3章散射光信号及荧光信号 3.1 散射光信号 3.2 荧光信号 第4章光电系统 4.1 光平台 4.2 光学滤片 4.3 信号探测器 4.4 阀值 第5章数据分析 5.1 数据采集及显示 5.2 设门 5.3 细胞亚群的数据分析 5.4 流式细胞仪其它应用的数据分析第6章分选 6.1 分选 第7章激光器及光路校正 7.1 激光器的工作原理 7.2 光路校正 第8章习题答案
第一章综述 流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术，通常指细胞通过激光束时在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是内部结构，以及相对的荧光强度。通过光电系统记录细胞的散射光信号和荧光信号可得知细胞特性。 流式细胞仪主要由三部分组成：流动室和液流系统；光路系统以及电系统。其作用如下： z液流系统：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。 z光路系统：细胞由激光激发，通过光学滤片产生光信号，并传送到相应的探测器。 z电系统：把光信号转换为电信号。对于有分选装置的仪器，电系统可初始化分选条件。 在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。任何存在于悬液中的直径为0.2-150微米的粒子或细胞都适用于流式分析。在实际工作中，用实体组织进行流式细胞分析往往是不可能的，分析之前必须对其进行分解。被液滴包绕的粒子称为细胞液柱，当粒子经过激光照射区时，通过激光激发产生散射光。含有荧光的粒子就会表现出其荧光特性。散射光和荧光由光路系统（相应的透镜，滤片和探测器）收集。分光器和滤光片引导散射光和荧光至相应的探测器，把光信号转换为电信号。 单个粒子通过其表现出的光散射和荧光属性，通过列表模式（List mode）完成数据采集，并对样本中的细胞亚群进行分析。
流式细胞仪原理及操作步骤 流式细胞仪(FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的 结果。 (一)原理 活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。 (二)操作步骤 制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) (三)试剂和器材 1.各种特异性单克隆抗体。 2.荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3.10％FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4.玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
流式细胞仪检测细胞周期原理和方法 流式细胞仪（FCM）检测细胞周期的原理和方法高考和模拟试题中经常会出现流式细胞仪检测细胞周期图像，那么，什么是流式细胞仪？如何检测细胞周期？ 流式细胞仪是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。 流式细胞仪，又称荧光激活的细胞分选器，作为进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体力学、图像技
术、细胞生物学、免疫学理论于一体，是一种非常先进的检测仪器，被誉为生物医学实验室的“CT”。 流式细胞术已经成为一种用途最广泛和最先进的细胞分析技术，在细胞生物学、血液学、肿瘤学、免疫学等基础和临床医学领域发挥着重要作用。 流式细胞计的基本结构流式细胞计主要由流动室与液流系统、激光源与光学系统、光电管与检测系统、计算机与分析系统四部分组成（如图）。 典例分析
（2015年北京高考试题）流式细胞仪可根据细胞中DNA含量的不同对细胞分别计数。研究者用某抗癌药物处理体外培养的癌细胞，24小时后用流式细胞仪检测，结果如图。对检测结果的分析错误的是 A．b峰中细胞的DNA含量是a峰中的2倍 B．a峰和b峰之间的细胞正进行DNA复制 C．处于分裂期的细胞均被计数在a峰中 D．此抗癌药物抑制了癌细胞DNA的复制 【答案】C 【解析】从题目图中我们不难看出有两个峰值细胞的数目最多，分别对应的DNA含量为40和80。可知40的应该是处于分裂间期的G1期细胞，G1期时间比较长。而80的细胞应该是属于G2期和分裂期的细胞，DNA含量已经加倍。因此A选项中b峰中细胞的DNA含量是a峰中的2倍是正确的。B选项中a峰和b峰之间应该是细胞周期中的S期，正在进行DNA分子复制。C选项中，处于分裂期的细胞DNA含量处于加倍状态，应该计数在b峰中。D选项通过看右侧图可知b峰明显下降，可知应该是抑制了DNA分子的复制，DNA 加倍的细胞明显减少，所以D选项正确。
流式细胞术简介 一、流式细胞术发展简史 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点是：①测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。 概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。 1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。1953年Crosland –Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。 1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数技术的主要历程。 现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发源的，其开拓者是Kamentsky。1965年，Kamentsky在组织化学的基础上提出了两个新设想：(1)细胞的组分是可以用光光度学来定量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学的重要信息。(2)细胞的不同组