MACS磁珠分选
免疫磁珠法分离细胞原理
免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。
一、磁性细胞标记方式
应用MACS技术进行磁性细胞分选最重要的一点是高质量的标记。要尽可能地增强阳性细胞的标记，并减弱背景染色。有两种基本的磁性标记方式：直接标记和间接标记。
1、直接磁性细胞标记（Direct magnetic cell labeling）
（磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞）直接标记是最快速、最特异的磁性标记方法。目前有多种分选人、小鼠、大鼠以及非人类灵长类细胞的MACS直标微珠可供选用。
2、间接磁性细胞标记（Indirect magnetic cell labeling）
（磁珠结合不需要的细胞，游离于磁场的细胞为所需细胞）间接磁性细胞标记需要联合使用单克隆或者多克隆抗体和MACS间标微珠。未结合抗体、生物素化抗体或者荧光素标记抗体均可作为一抗标记细胞，再使用抗免疫球蛋白微珠、抗生物素或链霉亲和素微珠、抗荧光素微珠作为二抗磁性标记细胞。
几乎针对任何种系任何细胞的任何一种单抗或多抗，均可用于间接标记。间接标记主要在如下情况时选用：当没有直标磁珠时；需要用几种抗体的混合物同时分选或去除多种类型的细胞；间接标记有放大作用，因此可在磁性分选抗原表达弱的目的细胞时使用；使用自备抗体或者配体的磁珠分选中。（一般而言，阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大，阳性分离法用行更多。）
二、MACS分选策略
有两种基本的分选策略
阳性分选和去除分选。复合分选策略是将两种基本分选策略相结合或者联合使用多选微珠，从而实现细胞亚群的分选。
1、阳性分选策略（Positive selection strategy）
阳性分选中，目的细胞被磁性标记后，作为阳性标记组分直接分选出来。分选后的细胞不必去除MACS微珠，可立即用于培养
2、去除分选策略（Depletion strategy）
去除分选是把非目的细胞磁性标记后从细胞混合物中去除的方法，即未磁性标记的细胞为目的细胞。MACS分选柱技术加上强磁性标记可以去除高达4个对数级的细胞。去除分选策略适用范围：去除不需要的细胞；缺乏针对目的细胞的特异性抗体（如肿瘤细胞）；不需要抗体和目的细胞结合，即细胞不被激惹（如T细胞、B细胞、NK细胞功能分析）；复合分选的一部分。
3、复合分选策略
联合使用两种以上分选策略，主要用于细胞亚群的分选或者得到高纯度非常稀有的细胞。
（1）去除后再阳性分选（Depletion followed by positive selection）
细胞亚群的分选，可以先磁性标记非目的细胞，去除分选后对阴性组分再行磁性标记和阳性分选。适用范围：在细胞悬液中，
去除非目的细胞，在富集细胞的基础上，进行阳性分选，可获得高纯度目的细胞。
（2）多重分选策略（MultiSort Strategy）
MACS多重分选是一种根据多种表面标志磁性分选细胞的技术。多重分选中，首先用MACS多选微珠标记目的细胞，进行第一参数阳性分选。然后细胞与多选解离试剂共同孵育，后者可以将微珠从抗体上酶性解离下来。接着使用针对另一细胞表面标志的抗体－微珠复合物磁性标记阳性分选细胞。二次标记的细胞可以再次进行阳性分选或者去除分选。
三、磁分离细胞的重要指标
纯度和得率，这取决于磁珠所连接单抗的特异性和磁珠大小（磁性），然而太大的磁珠会影响细胞活性，也无法直接上流式。
四、目前市场上有2种磁性细胞分离系统
1、Small particles (≈50 nm) －MACS
2、Large particles (1200~4500 nm) －others（如Dynal）
五、小磁珠
（2）可直接上流式检测，不影响散射光。
2、缺点
（1）需要很强的磁场来分离细胞。
（2）分离速度很慢，得率不高。
（3）一次性的分离柱，不能在普通试管进行。
（4）成本昂贵。
六、大磁珠
1、优点
（1）技术简单，分离可在试管中完成。
（2）易于增减细胞用量。
（3）速度快，得率高
（4）成本低
2、缺点
（1）对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不利于分离后培养。（2）纯度低。
（3）容易阻塞FCM的喷嘴。
磁珠分选细胞注意事项
磁珠分选细胞注意事项
1、待分选细胞中如有贴壁细胞，建议在分选前先贴壁培养去除，或者提高EDTA浓度。
2、抗体包被磁珠对死细胞常有非特异性结合。因而分选前去除死细胞。
3、新鲜分离骨髓细胞，先用胶原酶、DNA酶、胰酶联合消化，可使细胞团块解聚，从而提高分离效率。
4、上分离柱前，充分振荡，混悬细胞，打散细胞团块。
5、用分离柱分选，应用真空抽滤水，减少水中气泡，使分离柱不被气泡阻滞。
6、细胞悬液加入分离柱中时，应将滴管伸至底壁后加入，避免将细悬液沿管壁流入，使管壁残流末分选细胞，以致后继洗柱过程中，因疏忽末被洗下，最后导致纯度不高。洗柱时，应在前次液体充分流尽后，再加洗液。
7、分选细胞量应根据说明书控制，不超量。
8、孵育时间和温度应按说明书进行，延长孵育时间、提高温度会增加非特异结合。
9、先用抗体阻断Fc受体，可降低非特异性结合。
免疫磁珠分离法用的分离柱
不同的厂家生产的磁珠的大小，性能有可能不同。比如MACS的磁珠小，用分离柱分离。而BD产的磁珠是中号的，磁力大，不用分离柱，普通小试管加上分离器就可以分离细胞。如果都是用分离柱，厂商不同的话，最好看看说明，磁珠大小，磁力等性状如何，是否相似。当然，最好还是试一下就知道了。（除了美天旎的是小磁珠，别的几乎都是大磁珠）
我曾经清洗后重复利用的分离柱，感觉死的细胞会增加。看实验需要了，最好用新的。
MACS 的根Dynal的不一样，MACS 是一個磁性column，而Dynal 只是外面依個磁性的eppendorf 座而已。
Miltenyi的柱子回收方法
准备使用回收的柱子时，抗体孵育始，即将柱子置于新鲜的75%酒精中，柱的容器内盛满酒精，自动流下，既消毒，又de-gas，去除气泡十分关键。洗抗体时，即开始洗柱子，将回收柱架于消毒过的长试管口上。换新的酒精自然滴下，换PBS+0.1%FBS冲洗之，最后用MACS Buffer冲洗。柱子准备完毕，准备上柱的细胞也就同时准备好了。
回收方法
将长试管注满PBS，回抽柱子的活塞，倒出回抽液。倒入新的PBS，打出之；重复两次---此时基本上将柱子内的杂细胞除尽。再抽、打两三次无水酒精或95%酒精，然后置于50-60度烘箱，过夜，即能防止生锈。
此法回收的柱子可用2-5次。
本人用回收的柱子分离血CD4细胞，纯度>90%。
1. 目的 为规范磁珠分选T淋巴细胞，获取高纯度和高质量的T淋巴细胞。 2. 范围 适用于T细胞分选生产的操作过程。 3. 职责 3.1 生产部负责操作和清场。 3.2 质量管理部QA负责监督。 4. 仪器、试剂和耗材 4.1 仪器：生物安全柜；移液枪；离心机；细胞计数仪；QuadroMACS Starting kit(LS) 4.2 试剂：Pan T Cell Isolation Kit（Miltenyi）；PBS；RPMI1640；台盼蓝；AB血清； 4.3 耗材：15/50mL离心管；25mL移液管；10mL移液管； 5. 标准操作程序 5.1 打开生物安全柜，紫外灯照射灭菌30min，通风10min后待用。 5.2 缓冲液配制：PBS加0.5%人AB血清和2mM EDTA，用前去气泡；缓冲液放4度冰箱预冷。全程保持低温。 5.3安装：将支撑架和分离器用酒精消毒后，放入生物安全柜。将分离器平行贴到支撑架的垂直面上，移动分离器调整高度。取出LS柱，安装到分离器的磁力槽中。 5.4 用细胞计数仪计数，计算细胞数目。 5.5 离心1000rpm，8min收集细胞，完全去掉上清。 5.6 按照每107细胞加40ul buffer的量加缓冲液重悬细胞。 5.7 每107细胞加10ul Pan T Cell Biotin-Antibody Cocktail。 5.8 混匀，4℃冰箱孵育5min。 5.9 每107细胞加30ul 缓冲液。
5.10每107细胞加20ul Pan T Cell Microbead。 5.11 混匀，4℃冰箱孵育10min。 5.12 加400 ul 缓冲液，混匀（至少500ul上柱）。 5.13 用3ml缓冲液润洗柱子。 5.14 把细胞悬液加入到柱子中。收集流出的T细胞。 5.15 用3ml缓冲液洗涤柱子，收集流出的T细胞。与5.14的合并。 5.16 从分离器上取下柱子，安放到合适的收集管中。 5.17 加入5ml 缓冲液到柱子中，立即将活塞插入柱子，用力将液体压出，即为非T细胞。 5.18 取样，台盼蓝染色后在细胞计数仪上计数。 5.19 关闭生物安全柜，进行清场操作。 5.20 填写相关记录文件。 6. 相关文件 无 7. 相关记录 7.1《T细胞分选生产记录》 8. 附件清单 无
磁珠纯化DNA原理 1、DNA与磁珠作用原理 分选磁珠的作用原理就是基于一种固相载体可逆化固定(SPRI)的分离纯化 方法。磁珠体系中一般包含:磁珠、DNA、聚乙二醇(PEG)、以及盐离子等,在一定浓度的PEG与盐离子环境中,DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面(即固相载体),该过程就是可逆的,在适当条件下,结合的DNA分子可以被洗脱回收。 纳米级别的磁珠表面性质不同,分离原理也不尽相同,但基本上固态的球状 材料组成并无太大差异,基础结构一般分为3层,最内层的核心就是聚苯乙烯、第二层包裹磁性物质——四氧化三铁(Fe3O4),最外层表面就是羧基(-COOH)修饰 的高分子材料所构成,其中羧基行使与核酸结合的工作。 在整个体系中,PEG就是影响DNA回收的决定性因素(其她因素还包括DNA 大小与浓度、盐离子浓度、孵育时间等等)。DNA在一定浓度的PEG存在条件下,NaCl或MgCl2促进条件下,使DNA发生脱水反应,分子构象会发生急剧变化,由线状被压缩形成卷曲球状,继而聚集沉淀,同时随PEG分子量、浓度以及盐浓度的不同,不同长度的DNA可以被选择性的沉淀出来。在磁珠体系中,特定分子量的PEG的功能主要就是与盐离子共同作用,改变不同长度DNA的分子构象,同时增加体系的粘稠程度,使磁珠存在其中处于悬浮状态,不易沉降,增加磁珠在空间位置的碰撞与排斥,从而增加核酸与磁珠的聚集效率与效果,除此之外,PEG与蛋白质具有相容性,也可去除样品中的蛋白质。 当处于PEG与盐离子环境中的DNA,因脱水作用而发生分子构象改变后,会暴露出磷酸骨架上大量的带负电荷的磷酸基团,与表面带负电荷的羧基磁珠结合,但如何解释负负电荷之间的作用,目前还不得而知。但普遍认为,这就是由于带正
美天旎公司磁珠分选产 品 标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]
美天旎公司MACS(磁珠分选)相关产品 一、MACS微珠（MicroBeads） MACS微珠是一种与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒，用于目的细胞或者去除细胞的磁性标记。微珠直径约有50nm，比细胞小200多倍，体积为细胞的百万分之一，光学显微镜下不可见。微珠由多聚糖和氧化铁组成，无毒性，对细胞无损伤，可以生物降解。MACS微珠与流式细胞仪兼容，不会影响细胞的光散射特性；磁性标记只占用2 0－30％的结合位点，不影响细胞的荧光抗体标记。此外，MACS微珠可以最大限度地避免细胞活化；无需解离磁珠，可以直接进行后续实验：如流式细胞仪分析或分选、细胞培养、分子生物学研究、回输给人或者动物。 MACS微珠主要有三种：直标微珠、间标微珠、多选微珠。其中间标微珠有抗免疫球蛋白微珠、抗生物素微珠或链霉亲和素微珠、抗荧光素微珠。多选微珠是专门为分选细胞亚群而研制的一种微珠。这种微珠通过特殊的方式与抗体偶联，在第一次阳性分选完成后，与细胞结合的多选微珠可以被解离试剂剪切下来，阳性分选的细胞可以进行再次阳性分选或者去除分选。 MACS技术分选的CD8阳性T细胞（箭头所示为磁性结合在细胞表面的微珠） 二、MACS分选柱（Separation Column） MACS分选柱是一类填充有不同规格铁珠的塑料容器，铁珠表面有亲水包被，因此不会损伤细胞。在磁场外MACS分选柱不带有磁性，但是当置于一个永久性磁场—MACS分选器中时，分选柱内的铁珠可以使分选器的磁场增强1000倍，足以滞留仅标记有极少量微珠的目的细胞；磁性标记细胞从分选柱中通过时可以受到均匀的磁力作用，从而提高分选纯度和回收率。手动操作在30分钟内可完成，自动分选仅需分钟，得到的细胞可立即用于后续实验。此外，大多数MACS分选柱都是无菌包装，一次性使用，可以满足细胞培养所需的无菌条件。 三、MACS分选器（MACS Separators） MACS分选器由永久性磁铁和支架构成。与分选柱一起组成高强度的梯度磁场。根据应用范围分为研究用和临床应用的MACS分选器，根据操作方式分为手动和自动分选器。
MACS 磁珠分选 免疫磁珠法分离细胞原理免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。 一、磁性细胞标记方式 应用MACS 技术进行磁性细胞分选最重要的一点是高质量的标记。要尽可能地增强阳性细胞的标记，并减弱背景染色。有两种基本的磁性标记方式：直接标记和间接标记。 1 、直接磁性细胞标记( Direct magnetic cell labeling ) ( 磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞) 直接标记是最快速、最特异的磁性标记方法。目前有多种分选人、小鼠、大鼠以及非人类灵长类细胞的MACS 直标微珠可供选用。 2 、间接磁性细胞标记( Indirect magnetic cell labeling ) ( 磁珠结合不需要的细胞，游离于磁场的细胞为所需细胞) 间接磁性细胞标记需要联合使用单克隆或者多克隆抗体和MACS 间标微珠。未结合抗体、生物素化抗体或者荧光素标记抗体均可作为一抗标记细胞，再使用抗免疫球蛋白微珠、抗生物素或链霉亲和素微珠、抗荧光素微珠作为二抗磁性标记细胞。 几乎针对任何种系任何细胞的任何一种单抗或多抗，均可用于间接标记。间接标记主要在如下情况时选用：当没有直标磁珠时；需要用几种抗体的混合物同时分选或去除多种类型的细胞；间接标记有放大作用，因此可在磁性分选抗原表达弱的目的细胞时使用；使用自备抗体或者配体的磁珠分选中。( 般而言，阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大，阳性分离法用行更多。) 二、MACS 分选策略 有两种基本的分选策略阳性分选和去除分选。复合分选策略是将两种基本分选策略相结合或者联合使用多选微珠，从而实现细胞亚群的分选。 1 、阳性分选策略( Positive selection strategy ) 阳性分选中，目的细胞被磁性标记后，作为阳性标记组分直接分选出来。分选后的细胞不必去除 MACS 微珠，可立即用于培养
磁性标记和分选步骤： 1.制备无菌Buffers,冰上放置。 细胞染色缓冲液（cell-staining buffer）：含3%热灭活胎牛血清和0.1%叠氮化钠的PBS。 1×BD IMag? buffer：按1:10稀释(10X)BD IMag? Buffer ，用无菌蒸馏水或加有 0.5% BSA，2 mM EDTA和0.1% 叠氮化钠的PBS稀释。2.无菌操作，从外周淋巴组织内制备单细胞悬浮液。然后用70μm的尼龙细胞过滤器滤除 细胞簇和组织碎片。用cell-staining buffer制备细胞悬浮液。 3.细胞计数：如果细胞浓度在10 x 106和20 x 106/ml之间进行第3步，如果浓度低于10 x 106如，离心细胞，并用cell-staining buffer重悬细胞至终浓度20 x 106/ml。 4.可选：在细胞悬液内添加BD Mouse Fc Block纯化的抗小鼠CD16/CD32单克隆抗体 2.4G2（BD Mouse Fc Block? purified anti-mouse CD16/CD32 mAb 2.4G2），每1 x 106个细胞 添加0.25μg，然后冰浴15min. 5.添加生物素标记的小鼠树突状细胞富集混合物（Bioinylated Mouse Dendritic Cell Enrichment Cocktail），每1 x 106个细胞添加5μl ,冰浴15min. 6.用10x过量体积的1X BD IMag? buffer洗涤标记细胞，300 ? g离心7分钟并小心吸去 所有上清液。 7.彻底涡旋BD IMag? Streptavidin Particles Plus – DM后，每1 x 106个细胞添加5μl。 8.混匀，然后6?C - 12?C冷藏30min. 9.用1X BD IMag?buffer将标签量提高到20到80 x 106/ml。 10.把标记细胞转移到12 x 75 mm的圆底试管，添加的最大体积不超过1.0ml。把这个 positive-fraction 管放到BD IMagnet?(水平位置)8min。 对于较大体积，可把细胞转移到17 x 100 mm圆底试管，添加的最大的体积不超过 3.0ml。把这个positive-fraction 管放到BD IMagnet?(垂直位置)8min。 11.当管在BD IMagnet?上时，用无菌巴斯德吸管轻轻的吸取上清至一个新的无菌管内。 12.从BD IMagnet?取出positive-fraction 管，添加1X BD IMag? buffer到与步骤8相同的 体积。 上下吹打10-15次，重悬positive fraction well，并重置于BD IMagnet?上6-8min. 对17 x 100 mm 管，重置于BD IMagnet?上8min。 13.用一个新的巴斯德吸管轻轻吸上清和步骤10中的enriched fraction。混合。 14.把含有结合enriched fraction的管再置于BD IMagnet?6-8min。 对17 x 100 mm 管，重置于BD IMagnet?上8min。 15.轻轻吸出上清并置于一个新的无菌管内。两次enriched fraction不含有bound antibodies 和磁性粒子。细胞可用后续应用。 16.留在原管内的正选细胞可用适当的缓冲液或培养基重悬以备后续应用，包括流式细胞系 检测。 17.未分离的细胞悬浮液样品和正选富集positive and enriched fractions的样品，应用流式细 胞仪评估细胞分离效率。
磁珠起源 磁珠目前广泛应用于NGS实验中，DNA、RNA的纯化，片段筛选……今天，我们就聊一聊磁珠。 首先说一下磁珠的起源： 磁珠的发明构想最初来自于挪威科技大学的化学家John Ugelstad，他在1976年以聚苯乙烯(Polystyrene)为主要材料，制造出均匀磁化的球体粒子。1979年Vogelstein等报道在高浓度碘化钠存在下玻璃粉末作为吸附剂用于从琼脂糖凝胶中提取DNA片段，而后基于硅胶和其他具有亲水性表面的载体的固相核酸纯化技术广泛发展起来（Vogelstein B,Gillespiet D. Proc https://www.doczj.com/doc/788282755.html,A，1979,76(2):615～619）。基于磁性微粒的核酸纯化方法就是其中的一种 现代分子生物学和医学对高通量，高灵敏度，自动化操作的需求也是与日俱增，于是20世纪90年代，磁珠法DNA提取技术由此得到了大力发展。硅质膜磁珠是一类最早出现基于硅介质与核酸特异结合的原理而发展起来的的产品，它广泛应用于DNA、RNA的纯化。与离心柱法原理相同，离心柱法所采用的硅胶膜实际上就是玻璃纤维，而磁珠之所以能够结合核酸也是因为其表面包被了玻璃纤维。硅质膜二氧化硅磁珠具有超顺磁性内核和二氧化硅外壳，表面修饰大量的硅羟基。磁珠表面的硅羟基能够与溶液中的核酸通过氢键和静电作用发生特异性结合，在高盐条件下与核酸结合，而在低盐环境下被洗脱，这样就可以直接从复杂的生物体系中迅速分离核酸。 到现在纳米级别的磁珠发展已经各式各样了，表面性质各不相同，分离原理也不尽相同。 但基本上固态的球状材料组成并无太大差异，基础结构一般分为3层，最内层的核心是聚苯 乙烯、第二层包裹磁性物质——四氧化三铁（Fe3O4），最外层表面是官能基团修饰的高分 子材料所构成，其中官能基团行使与核酸结合的工作，提取、生物素捕获、片段筛选功能的 不同，表面官能基团不同。当然不仅磁珠应用在核酸制备上，在化学发光、细胞分选、蛋白 纯化等应用磁珠依然是大显身手，是因为不同的官能基团，或者偶联其它，如蛋白抗体等。 毋庸置疑，NGS上用的最多还是我们的老熟人——贝克曼的XP磁珠。这种羧化磁珠比 羟基磁珠产量更高，非特异性结合更少。XP磁珠采用SPRI（固相可逆固定化）技术：在较 高浓度的PEG和NaCl导致DNA分子水化层脱去，DNA胶体热力学稳定性破坏，构象也随之 改变，带负电荷的磷酸基团大量暴露在外面；带负电荷的磷酸基团通过Na+与羧基形成“电
MACS CD4+ cells purification Kits: 1.Centrifuge cells at 300G×10min, Pipette off supernatant completely 2.Resuspend cell pellet in 40ul of buffer per 107 cells 3.Add 10ul of Biotin-Antibody Cocktail per 107 cells 4.Mix well and incubate for 10min at 40C 5.Add 30ul buffer per 107 cells 6.Add 20ul Anti-Biotin MicroBeads per 107 cells 7.Mix well and incubate for 15min at 40C 8.Wash the cells with buffer by adding 10-20×labeling volume and centrifuge at 300G×10min 9.Resuspend up to 108 cells in 500ul buffer. 10. Magnetic separation with LS columns 11. Place column in the magnetic field of LS MACS Saparator 12.Rinsing the column with buffer (LS: 3ML) 13.Apply cell suspension onto the column, collect effluent in a tube 14.Wash the column with 3ml buffer, 3 times,collect effluent in the same tube. 15.Count cells
MACS磁珠分选 免疫磁珠法分离细胞原理 免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。 一、磁性细胞标记方式 应用MACS技术进行磁性细胞分选最重要的一点是高质量的标记。要尽可能地增强阳性细胞的标记，并减弱背景染色。有两种基本的磁性标记方式：直接标记和间接标记。 1、直接磁性细胞标记（Direct magnetic cell labeling） （磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞）直接标记是最快速、最特异的磁性标记方法。目前有多种分选人、小鼠、大鼠以及非人类灵长类细胞的MACS直标微珠可供选用。 2、间接磁性细胞标记（Indirect magnetic cell labeling） （磁珠结合不需要的细胞，游离于磁场的细胞为所需细胞）间接磁性细胞标记需要联合使用单克隆或者多克隆抗体和MACS间标微珠。未结合抗体、生物素化抗体或者荧光素标记抗体均可作为一抗标记细胞，再使用抗免疫球蛋白微珠、抗生物素或链霉亲和素微珠、抗荧光素微珠作为二抗磁性标记细胞。 几乎针对任何种系任何细胞的任何一种单抗或多抗，均可用于间接标记。间接标记主要在如下情况时选用：当没有直标磁珠时；需要用几种抗体的混合物同时分选或去除多种类型的细胞；间接标记有放大作用，因此可在磁性分选抗原表达弱的目的细胞时使用；使用自备抗体或者配体的磁珠分选中。（一般而言，阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大，阳性分离法用行更多。） 二、MACS分选策略 有两种基本的分选策略 阳性分选和去除分选。复合分选策略是将两种基本分选策略相结合或者联合使用多选微珠，从而实现细胞亚群的分选。 1、阳性分选策略（Positive selection strategy） 阳性分选中，目的细胞被磁性标记后，作为阳性标记组分直接分选出来。分选后的细胞不必去除MACS微珠，可立即用于培养
美天旎公司磁珠分选产品 This manuscript was revised by the office on December 22, 2012
美天旎公司MACS(磁珠分选)相关产品 一、MACS微珠（MicroBeads） MACS微珠是一种与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒，用于目的细胞或者去除细胞的磁性标记。微珠直径约有50nm，比细胞小200多倍，体积为细胞的百万分之一，光学显微镜下不可见。微珠由多聚糖和氧化铁组成，无毒性，对细胞无损伤，可以生物降解。MACS微珠与流式细胞仪兼容，不会影响细胞的光散射特性；磁性标记只占用2 0－30％的结合位点，不影响细胞的荧光抗体标记。此外，MACS微珠可以最大限度地避免细胞活化；无需解离磁珠，可以直接进行后续实验：如流式细胞仪分析或分选、细胞培养、分子生物学研究、回输给人或者动物。 MACS微珠主要有三种：直标微珠、间标微珠、多选微珠。其中间标微珠有抗免疫球蛋白微珠、抗生物素微珠或链霉亲和素微珠、抗荧光素微珠。多选微珠是专门为分选细胞亚群而研制的一种微珠。这种微珠通过特殊的方式与抗体偶联，在第一次阳性分选完成后，与细胞结合的多选微珠可以被解离试剂剪切下来，阳性分选的细胞可以进行再次阳性分选或者去除分选。 MACS技术分选的CD8阳性T细胞（箭头所示为磁性结合在细胞表面的微珠） 二、MACS分选柱（Separation Column） MACS分选柱是一类填充有不同规格铁珠的塑料容器，铁珠表面有亲水包被，因此不会损伤细胞。在磁场外MACS分选柱不带有磁性，但是当置于一个永久性磁场—MACS分选器中时，分选柱内的铁珠可以使分选器的磁场增强1000倍，足以滞留仅标记有极少量微珠的目的细胞；磁性标记细胞从分选柱中通过时可以受到均匀的磁力作用，从而提高分选纯度和回收率。手动操作在30分钟内可完成，自动分选仅需分钟，得到的细胞可立即用于后续实验。此外，大多数MACS分选柱都是无菌包装，一次性使用，可以满足细胞培养所需的无菌条件。 三、MACS分选器（MACS Separators） MACS分选器由永久性磁铁和支架构成。与分选柱一起组成高强度的梯度磁场。根据应用范围分为研究用和临床应用的MACS分选器，根据操作方式分为手动和自动分选器。
磁珠提取D N A原理 Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】
磁珠纯化DNA原理 与磁珠作用原理 分选磁珠的作用原理是基于一种固相载体可逆化固定（SPRI）的分离纯化方法。磁珠体系中一般包含：磁珠、DNA、聚乙二醇（PEG）、以及盐离子等，在一定浓度的PEG和盐离子环境中，DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面（即固相载体），该过程是可逆的，在适当条件下，结合的DNA分子可以被洗脱回收。 纳米级别的磁珠表面性质不同，分离原理也不尽相同，但基本上固态的球状材料组成并无太大差异，基础结构一般分为3层，最内层的核心是聚苯乙烯、第二层包裹磁性物质——四氧化三铁（Fe3O4），最外层表面是羧基（-COOH）修饰的高分子材料所构成，其中羧基行使与核酸结合的工作。 在整个体系中，PEG是影响DNA回收的决定性因素（其他因素还包括DNA大小和浓度、盐离子浓度、孵育时间等等）。DNA在一定浓度的PEG存在条件下，NaCl或MgCl2促进条件下，使DNA发生脱水反应，分子构象会发生急剧变化，由线状被压缩形成卷曲球状，继而聚集沉淀，同时随PEG分子量、浓度以及盐浓度的不同，不同长度的DNA可以被选择性的沉淀出来。在磁珠体系中，特定分子量的PEG的功能主要是与盐离子共同作用，改变不同长度DNA的分子构象，同时增加体系的粘稠程度，使磁珠存在其中处于悬浮状态，不易沉降，增加磁珠在空间位置的碰撞与排斥，从而增加核酸与磁珠的聚集效率与效果，除此之外，PEG与蛋白质具有相容性，也可去除样品中的蛋白质。 当处于PEG和盐离子环境中的DNA，因脱水作用而发生分子构象改变后，会暴露出磷酸骨架上大量的带负电荷的磷酸基团，与表面带负电荷的羧基磁珠结合，但如何解释负负电荷之间的作用，目前还不得而知。但普遍认为，这是由于带正电荷的盐离子的作用（如Na+）。带负电的磷酸基团借由解离的盐离子（如Na+）与羧基形成离子桥，使DNA被特异性吸附到羧基磁珠表面。当PEG和盐类被去除之后，加入水性分子，会快速充分水化DNA，解除其三者之间的离子相互作用，使得吸附到磁珠的DNA被纯化出来。 磁珠的出现，使得核酸制备的实验可以实现自动化，同时相较于传统的回收方式，还具有3个明显的优势：1）效率更高，以DNA为例，1μL磁珠的承载量可达7μg；2）避免使用有机溶剂，如酚类、氯仿等等，更加安全；3）操作简单，无需离心，也更有利于保留核酸的完整性。
美天旎公司MACS(磁珠分选)相关产品 一、MACS微珠（MicroBeads） MACS微珠是一种与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒，用于目的细胞或者去除细胞的磁性标记。微珠直径约有50nm，比细胞小200多倍，体积为细胞的百万分之一，光学显微镜下不可见。微珠由多聚糖和氧化铁组成，无毒性，对细胞无损伤，可以生物降解。MACS微珠与流式细胞仪兼容，不会影响细胞的光散射特性；磁性标记只占用20－30％的结合位点，不影响细胞的荧光抗体标记。此外，MACS微珠可以最大限度地避免细胞活化；无需解离磁珠，可以直接进行后续实验：如流式细胞仪分析或分选、细胞培养、分子生物学研究、回输给人或者动物。 MACS微珠主要有三种：直标微珠、间标微珠、多选微珠。其中间标微珠有抗免疫球蛋白微珠、抗生物素微珠或链霉亲和素微珠、抗荧光素微珠。多选微珠是专门为分选细胞亚群而研制的一种微珠。这种微珠通过特殊的方式与抗体偶联，在第一次阳性分选完成后，与细胞结合的多选微珠可以被解离试剂剪切下来，阳性分选的细胞可以进行再次阳性分选或者去除分选。 MACS技术分选的CD8阳性T细胞（箭头所示为磁性结合在细胞表面的微珠） 二、MACS分选柱（Separation Column） MACS分选柱是一类填充有不同规格铁珠的塑料容器，铁珠表面有亲水包被，因此不会损伤细胞。在磁场外MACS分选柱不带有磁性，但是当置于一个永久性磁场—MACS分选器中时，分选柱内的铁珠可以使分选器的磁场增强1000倍，足以滞留仅标记有极少量微珠的目的细胞；磁性标记细胞从分选柱中通过时可以受到均匀的磁力作用，从而提高分选纯度和回收率。手动操作在30分钟内可完成，自动分选仅需2.5-10分钟，得到的细胞可立即用于后续实验。此外，大多数MACS分选柱都是无菌包装，一次性使用，可以满足细胞培养所需的无菌条件。 三、MACS分选器（MACS Separators）
混合淋巴细胞反应（MLR） 分别于0h , 24h和48h收集BMDCs，与未接触过的受试菌的native小鼠脾脏内的CD4+和CD8+T细胞进行反应，用3H-TdR掺入法检测其活化T细胞的能力。小鼠脾脏CD4+和CD8+细胞的制备 （1）脾脏单细胞悬液的制备：颈椎脱臼处死小鼠，自来水冲洗后浸泡在75%酒精中5min。无菌取脾脏放人平皿，加入5ml四型胶原酶溶液，用1ml针筒给每个脾脏注射500ul四型胶原酶溶液，剪碎脾脏后37℃孵育30min。将上述脾脏细胞悬液转移至200目不锈钢筛网，用注射器针芯研磨，过滤剩余组织。加入6ml PBS混匀，4℃，1500 rpm/min ,离心5min ，弃上清后重复一次，加入6ml PBS 重悬备用。 （2）密度梯度离心法分离脾脏单个核细胞（mononuclear cells,MNCs）:吸取3ml已预热的小鼠淋巴细胞分离液至华氏管，缓慢加入6ml脾脏细胞悬液，20℃，1800 rpm/min ,离心25min。吸出云雾状MNCs层液体，加入6ml PBS混匀，4℃，1500 rpm/min ,离心5min 。弃上清后重复一次，再加入5ml PBS重悬。取少量细胞适当稀释后混匀，显微镜下计数。 （3）抗体标记细胞：每106 MNCs加入1ug anti-CD4或anti-CD8单抗混匀，4℃孵育10min后加入1~2 ml buffer , 4℃，1500 rpm/min ,离心洗涤10min ，弃上清后重复一次。加入90ul buffer和10ul streptavidin microbeads混匀，6~12℃孵育30min，每隔10min晃动均匀一次。用1~2ml buffer洗涤，4℃，1500 rpm/min ,离心10min，弃上清后加入500ul buffer。 （4）磁珠法分离CD4+和CD8+T细胞：将LS column 固定于磁珠细胞分选磁场中，加入3ml buffer润洗柱子。细胞悬液上株，收集阴性细胞再次上柱，3ml buffer洗柱3次。将分离柱从磁场中取出，放置在合适的收集管上，加入5ml buffer，用柱塞轻柔的冲洗出细胞，再加入5ml buffer ，快速冲洗出细胞，取少量细胞适当稀释后，显微镜下计数。调整细胞浓度为2.5 * 106个/ml 备用。以上操作步骤均在冰上进行。
磁珠纯化DNA原理 1.DNA与磁珠作用原理 分选磁珠的作用原理是基于一种固相载体可逆化固定（SPRI）的分离纯化方法。磁珠体系中一般包含：磁珠、DNA、聚乙二醇（PEG）、以及盐离子等，在一定浓度的PEG和盐离子环境中，DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面（即固相载体），该过程是可逆的，在适当条件下，结合的DNA分子可以被洗脱回收。 纳米级别的磁珠表面性质不同，分离原理也不尽相同，但基本上固态的球状材料组成并无太大差异，基础结构一般分为3层，最内层的核心是聚苯乙烯、第二层包裹磁性物质——四氧化三铁（Fe3O4），最外层表面是羧基（-COOH）修饰的高分子材料所构成，其中羧基行使与核酸结合的工作。 在整个体系中，PEG是影响DNA回收的决定性因素（其他因素还包括DNA大小和浓度、盐离子浓度、孵育时间等等）。DNA在一定浓度的PEG存在条件下，NaCl或MgCl2促进条件下，使DNA发生脱水反应，分子构象会发生急剧变化，由线状被压缩形成卷曲球状，继而聚集沉淀，同时随PEG分子量、浓度以及盐浓度的不同，不同长度的DNA可以被选择性的沉淀出来。在磁珠体系中，特定分子量的PEG的功能主要是与盐离子共同作用，改变不同长度DNA的分子构象，同时增加体系的粘稠程度，使磁珠存在其中处于悬浮状态，不易沉降，增加磁珠在空间位置的碰撞与排斥，从而增加核酸与磁珠的聚集效率与效果，除此之外，PEG与蛋白质具有相容性，也可去除样品中的蛋白质。
当处于PEG和盐离子环境中的DNA，因脱水作用而发生分子构象改变后，会暴露出磷酸骨架上大量的带负电荷的磷酸基团，与表面带负电荷的羧基磁珠结合，但如何解释负负电荷之间的作用，目前还不得而知。但普遍认为，这是由于带正电荷的盐离子的作用（如Na+）。带负电的磷酸基团借由解离的盐离子（如Na+）与羧基形成离子桥，使DNA被特异性吸附到羧基磁珠表面。当PEG和盐类被去除之后，加入水性分子，会快速充分水化DNA，解除其三者之间的离 子相互作用，使得吸附到磁珠的DNA被纯化出来。 磁珠的出现，使得核酸制备的实验可以实现自动化，同时相较于传统的回 收方式，还具有3个明显的优势：1）效率更高，以DNA为例，1μL磁珠的承 载量可达7μg；2）避免使用有机溶剂，如酚类、氯仿等等，更加安全；3）操作简单，无需离心，也更有利于保留核酸的完整性。 2.蛋白酶K的作用 蛋白酶K具有降解蛋白的功能，而细胞膜主要是由蛋白质构成的富有弹性的半透性膜，因此蛋白酶K能够裂解细胞，从而DNA能够释放出来。 3. 无水乙醇沉淀DNA 用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。 4.TE缓冲液溶解DNA 采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，并且TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。 5.为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？ 在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。 友情提示：本资料代表个人观点，如有帮助请下载，谢谢您的浏览！
免疫磁珠细胞分选 免疫磁珠细胞分选方法可以在几分钟内从复杂的细胞混合物中分离出很高纯度的细胞。把细胞用超级顺磁性的 MACS MicroBeads （MACS微型磁珠）特异性地标记，磁性标记完后，把这些细胞通过一个放在强而稳定磁场中的分选柱。分选柱里的基质造成一个高梯度磁场。被磁性标记的细胞滞留在柱里而未被标记的细胞则流出。当分选柱移出磁场后，滞留柱内的磁性标记细胞就可以被洗脱出来，这样就完全可以获得标记和未标记的两个细胞组份。 超顺磁性的MACS MicroBeads 的体积很小，其直径约为50nm，体积约小于真核细胞的一百万份之一，可与病毒的大小相比。标记细胞上的微型磁珠即使在扫描电镜照片上也几乎看不到。磁性抗体和磁性标记物间的反应可在几分钟内完成。 由于微型磁珠的体积极小，所以不会对细胞造成机械性压力，而且使孵育时间短，操作过程快。MicroBeads 形成一个稳定的胶体液，它们在磁场中既不沉淀又不凝聚。微型磁珠的大小和它的组成成份（氧化铁和多糖）使其可被生物降解，且不会激活细胞或影响细胞的功能和活力，细胞的生理功能也不变。磁珠不需要去除，因此，阳性分选出的细胞（即磁性标记细胞）可立即用于分析和随后的实验。 用MACS 细胞分选系统可以分离出非常纯的细胞群体，而且有极好的回收率和存活率。依据细胞频率和标记表达水平的不同，MACS分离细胞的纯度可达95%-99.9%，回收率>90%[1]。 免疫磁珠法分离细胞原理： 免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。 免疫磁珠法分为正选法和负选法： 正选法－磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞 负选法－磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的细胞为所需细胞 一般而言，负选法比正选法的磁珠用量大 磁珠：大小在0.1－0.45mm 包被了生产的高质量单抗磁珠已为白细胞亚群的分选所优化将包被了特异性单抗的BD IMag磁珠加入细胞悬液，磁珠特异性地与有相应抗原的细胞亚群结合，通过分离得到的连有磁珠的细胞可直接用于功能试验和用流式细胞仪检测。 磁分离细胞的重要指标是：
磁珠分离技术 摘要：主要介绍了磁珠分离技术的基本概念，基本原理还有它的特点。磁珠分离技术中应用最广泛的是免疫磁珠分离技术，这里详细说明了免疫磁珠分离技术的结构以及有由它的结构决定的它的一些重要特性，以及免疫磁珠分离技术的制备原理和方法。并且详细说明了免疫磁珠分离技术的重要应用，为帮助同学了解记忆，例举了一些该技术的应用实例。 基本概念：磁珠是一种包被有生物活性基团的功能化载体, 可分散于基液中形成磁性液体材料, 它兼有液体的流动性和固体磁性颗粒材料的双重特点, 从而使固一液相的分离变得十分方便快捷。磁珠法的出现和应用,给生命科学的研究提供了一种新式的手段和武器, 也给大、中学生对的直观认识提供了一个简捷、客观的实验途径。其中最常用的事免疫磁珠技术。 原理：利用人工合成的内含铁成分，可被磁铁磁力所吸引，外有功能基团，可结合活性蛋白质(抗体)的磁珠，作为抗体的载体。当磁珠上的抗体与相应的微生物或特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，这种复合物具有较高的磁响应性，在磁铁磁力的作用下定向移动，使复合物与其他物质分离，而达到分离、浓缩、纯化微生物或特异性抗原物质的目的。 特点:应用于磁分离技术的磁性载体微球应具备以下特点: 粒径比较小, 比表面积较大, 具有较大的吸附容量; 物理和化学性能稳定, 具有较高的机械强度, 使用寿命长; 具有可活化的反应基团, 以用于亲和配基的固定化; 粒径均一, 能形成单分散体系; 悬浮性好, 便于反应的有效进行。载体微球有纳米级、微粒级的, 纳米级的载体微球与微粒级的载体微球相比具有以下优点: 尺寸小, 扩散速度快, 悬浮稳定性好; 比表面积大, 偶联容量大; 超顺磁性, 能快速实现磁性粒子的分散与回收。 免疫磁珠(Immonumagnetic beads，IMB简称磁珠)，由载体微球和免疫配基结合而成。载体微球的核心部分为金属小颗粒(Fe304，Fe203)，是一种磁性高且较稳定的磁性材料，核心外包裹一层高分子材料(如聚氯乙烯，聚苯乙烯，聚乙烯亚胺)，最外层是功能基层，如羟基(．OH)，氨基(．NH2)，醛基(-CHO)，羧基(一COOH)。
磁珠分离技术 摘要:磁珠分离技术是一种分子生物学分离技术, 它利用其表面修饰的磁性颗粒对生物分子或细胞的亲和结合而进行分离, 能对待分离或待检测的靶标进行高 效富集, 是一种方便、快速、回收率高、选择性强的方法。磁珠分离技术在生物学方面的应用始于20世纪70年代后期, 目前已经在分子生物学、细胞学、免疫学、微生物学、生物化学等领域取得一些令人瞩目的研究成果。 基本概念 磁珠磁珠是一种通过一定方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的体积在几纳米到几十微米之间的载体微球。载体微球的核心为金属小颗粒, 常为铁的氧化物或铁的硫化物, 核心外包裹一层高分子材料, 最外层是功能基团, 载体微球表面可根据需要赋予不同的功能基团(如－OH、－COOH、－CHO、－NH2,—SH、—CONO2、—CONH2、—SO3H、—SiH3、—环氧基、—CHCl等)，使其表现具有疏水-亲水、非极性-极性、带正电荷-带负电荷等不同物理性质。同时具有磁响应性，在外磁场作用下具有磁导向性。由于载体微球表现的物理性质不同, 可结合不同的免疫配基, 如抗体、抗原、DNA、RNA 等。 应用于磁分离技术的磁性载体微球应具备以下特点: 粒径比较小, 比表面积较大, 具有较大的吸附容量; 物理和化学性能稳定, 具有较高的机械强度, 使用寿命长; 具有可活化的反应基团, 以用于亲和配基的固定化; 粒径均一, 能形成单分散体系; 悬浮性好, 便于反应的有效进行。载体微球有纳米级、微粒级的, 纳米级的载体微球与微粒级的载体微球相比具有以下优点: 尺寸小, 扩散速度快, 悬浮稳定性好; 比表面积大, 偶联容量大; 超顺磁性, 能快速实现磁性粒子的分散与回收。 磁珠的制备方法：共沉淀法、悬浮聚合法、乳液聚合法、分散聚合法、包埋法及原子转移自由基聚合法等。
骨髓CD138MACS操作步骤 1.抽取2-5mL骨髓，骨髓转移至锥形管（50mL）中，管内含等体积 的细胞培养基（HEPES缓冲液调配） 2.滤膜过滤细胞悬液（孔径大小100μm），去除骨碎片或细胞团块。 滤膜使用前须用分选缓冲液（autoMACSrunning buffer）打湿。 3.20℃，445g离心10min。 4.弃上清，勿激起细胞沉淀，加入分选缓冲液稀释沉淀至初始体积。 5.进行磁珠标记实验，加磁珠。每1mL抗凝全血或骨髓加50μL全 血CD138微磁珠。 6.混匀，臵于冰箱（2-8 ℃）孵育，15min。 7.洗涤细胞。每1mL抗凝全血或骨髓加入2-5mL分选缓冲液，室温 445g离心10min。 8.弃上清，勿激起细胞沉淀，保留一定的上清，避免细胞丢失。分 选缓冲液稀释悬液至1mL。 9.全血分选柱（Whole Blood Column）预处理：从柱顶端加入3mL 分选缓冲液，使缓冲液完全流过分选住，去除流出物。 10.将细胞悬液转移到预处理后的分选柱上，收集流出的未标记细胞。 11.再用3×3mL分选缓冲液清洗，收集未标记的细胞片段，与上步收 集的流出物混合。 12.卸下全血分选柱，臵于收集管上。 13.加入5mL洗脱缓冲液（全血分选柱），向下推挤柱塞，同时收集 洗脱流出物。此流出物即为磁珠标记细胞。
注意： 1.本实验选用直接磁珠标记法，实验操作尽量快速、保证细胞的 低温环境、使用预冷溶液。高温、时间太久导致非特异性细胞被标记，影响实验效果。 2.本实验选用全血分选柱（Whole Blood Column）进行磁珠分选。 3.为了增加磁珠标记成分的纯度，可将洗脱成分通过MS/LS分 选柱，重新富集。
SOP for Magnetic Bead Separations (using “Positive Selection” of White Blood Cell Subsets from PBMCs By Daniel Estes, 2006 Modified: DJE, 2007 General Using magnetic beads that attach to CD8 or CD4 on T-cells, or CD19 on B cells, is an effective way to positively select for and isolate white blood cell subsets with >97% purity from PBMCs. The method employs a magnet to “capture” cells with the magnetic beads, and when the magnet is removed, the cells are released. Note that these instructions are similar to those provided by Miltenyi biotech except for three changes: 1) separations occur at room temperature to avoid any sort of temperature “shock” to cells; 2) we use half the recommended amount of bead solution; and 3) for all buffers, we use the simplified wash buffer below instead of a specific magnetic bead buffer. The buffer below provides a total separation time of 15 minutes (of actually dripping through the columns), is reliable (we never have any clogging of the columns). BE CAREFUL: PBMCs as well as isolated T cells may contain bloodborne pathogens, so always wear appropriate laboratory attire, dispose of cells in appropriate manner, and follow general blood protocols (please see Mayer lab Bloodwork SOP). Materials - Wash buffer (98% dPBS (w/o Ca2+ and Mg2+), 2% FBS) - MicroBeads coated with antibodies to either human CD4 or CD8 (Miltenyi Biotec) - MACS MultiStand - MS Columns - MiniMACS Magnet Procedure General notes: work quickly and wear appropriate protection attire (see bloodwork and cell culture SOPs). NOTE: if sterility is required, first wash all components of setup in 70% ethanol and do separations in laminar flow hood. 1. Starting with PBMCs that have been thoroughly washed (obtained in our case after Histopaque separation) 2. Determine cell count – please note that the amounts of bead solution indicated in step #4 are only good for a maximum of 50 million cells 3. Spin-down cells (I usually use 300g’s for 5 min)