宏基因组学的研究状况及其发展 摘要：宏基因组学是近年来发展起来的一门新兴学科，主要技术包括从环境样品中提取微生物混合基因组DNA、利用可培养的宿主菌建立宏基因组文库及筛 选目的基因。该技术可以克服传统培养技术的不足，是研究未培养微生物、寻找新功能基因和开发获得新资源的重要新途径。目前宏基因组学已广泛应用于各个领域，并在医药、农业、能源开发、环境修复、生物技术、生物防御等方面有了较深入的研究。 关键词：宏基因组学、宏基因组、基因组文库构建、文库筛选、未培养微生物、研究进展 随着微生物学的发展，微生物基因组全序列测定计划正在全球被快速地推行，但现有技术条件下，自然界存在的可培养微生物不到总数的1％，阻碍了该计划 的发展，使得绝大多数的微生物资源不能被开发和利用。21世纪初，随着测序能力的提高和基因组学的发展，科学家提出了一种研究不可培养微生物基因组的新思路——直接对含有各种不可培养的微生物的群体进行基因组序列的测定。这类研究称为Metagenomics，前缀“Meta”源于希腊语。意思是“超越”。科学家选择它来表示这种基因组研究超越了传统意义上分析单一物种的基因组学，将研究对象定为由种类众多的微生物组成的整个菌落。国内的研究者也据此将该术语翻译为“宏基因组学”。 1 宏基因组的概念 宏基因组 (也称微生物环境基因组、宏基因组学、元基因组学、生态基因组学) 是由Handelsman等1998年提出的新名词, 其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature”，即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因, 目前主要指环境样品中的细菌 和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象, 以功能基因筛选和测序分析为研究手段, 以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 克隆DNA到合适 的载体,导入宿主菌体,筛选目的转化子等工作。宏基因组文库既包含了可培养的又包含了不能培养的微生物基因，避开了微生物分离培养的问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间，增加了获得新的生物活性物质的机会，为新的医药产业和发现新的生物技术提供丰富的基因文库，并利于环境微生物有机群体的分布和功能的研究。 2 宏基因组学的研究过程 2．1 宏基因组文库的构建 宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方法，并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和策略。一般包括样品总DNA的 提取、与载体连接和克隆到宿主中。 2．1．1样品总DNA的提取 宏基因组文库构建的关键之一是获得高质量的目的样品的总DNA。目的样品 的采集是第一步，除了需严格遵循取样规则外，取样中应尽量避免对样品的干扰，缩短保存和运输的时间，使样品能更好地代表自然状态下的微生物原貌。 根据提取样品总DNA前是否分离细胞，提取方法可以分为原位裂解法和异位 裂解法。原位裂解法主要是通过去污剂处理(如SDS)、酶解法(如蛋白酶K)、机械
宏基因组实验计划
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宏基因组学方法研究明永冰川的初步实验计划 起草人：李浩宇 宏基因组学研究方向及意义 研究：环境胁迫对集体遗传变异的过程和机理。 发掘:环境应激和应答基因的多态性。 探究：多态性基因的功能。 实验大体步骤:
I.环境样品的采集: 1）避免人源污染,采样的器具都要高温灭菌,采样过程中要戴手套。 2) 样品的迅速处理保存。有条件最好用液氮冷冻运输,没有条件可以将装有样品的容器至于干冰泡沫箱中。带回实验室之后要尽快处理，特别是固体样品,迅速用预冷缓冲液（多为PBＳ)重悬，离心收集沉淀。分装成小份,冻存于液氮或者‐80 ℃冰箱中，避免反复冻融。 3）如果后续用间接法提取总ＤＮA 的话,此处需要收集菌体，采取的策略是稀释之后的差速离心，一般适用于水样。 IＩ.DNA提取方法的选择： 总ＤNＡ的提取按照处理样品方式的不同划分为直接提取法和间接提取法。 直接提取法就是直接对样品进行裂解，释放其中的DNA。 间接提取法则是先分离样品中的微生物，后对微生物进行裂解。两种方法的适用范围不同，各自都有优缺点。 直接提取法的优缺点:直接提取法多用在提取固体样品(如土壤、污泥、湖泊沉积物等）总DNA 的试验中。其最大的优点在于得率高,在某些环境样品总DNA 提取实例中,比间接提取法高数倍至数百倍。造成这种情况的最主要原因一是环境样品中存在丰富的胞外DＮA;二是许多微生物与基质形成复杂的结构,间接提取法不易对其进行分离。在样品较珍贵时多采用此法。其缺点同样明显,所得DＮA的纯度远不及间接提取法所得，基质中含的腐殖质一并被保留下来，使得所得ＤNＡ呈现黄褐色甚至黑色。 可以考虑MoBiｏ和Ｅpicenｔre的DＮＡ提取的商业试剂盒（主要用于提取土壤样品）。 间接提取法的优缺点:间接提取法则既可以用来提取固相样品总ＤNA也可以用来提取液体样品总DNＡ。在提取液体样品(如海水、河流等样品)总DNA 时，需要用抽滤的方式浓缩。与直接提取法刚好相反,其最大的优点在于提取ＤNA 纯度高，既使在提取固体样品微生物总DＮA 时，也可以用缓冲液对收集的菌体进行反复冲洗以去除表面所带杂质。其缺点是DＮA 得率低。? 土壤ＤNA 直接提取法：
α-淀粉酶综述 佚名2013-10-06 摘要：α-淀粉酶分布十分广泛，遍及微生物至高等植物。α-淀粉酶是一种十分重要的酶制剂，大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业等，是应用最为广泛的酶制剂之一。本文概述了α-淀粉酶的发现和应用发展史、分离纯化及结构的研究史、催化机制及其研究史、工业化生产和应用现状与发展趋势等。 关键词：α-淀粉酶发现应用分离纯化结构催化机制研究史发展趋势 α- 淀粉酶( α- 1,4- D- 葡萄糖- 葡萄糖苷水解酶) 普遍分布在动物、植物和微生物中, 是一种重要的淀粉水解酶。其作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开α-1，4糖苷键，生成糊精和还原糖。由于产物的末端残基碳原子构型为α构型，故称α-淀粉酶。现在α-淀粉酶泛指能够从淀粉分子内部随机切开α-1，4糖苷键，起液化作用的一类酶。 1 α-淀粉酶的发现和应用史 1.1 α-淀粉酶的发现 啤酒是最古老的酒精饮料，发酵是其关键步骤，其中所包含的糖化过程就是把淀粉转化为糖。这个转化过程的机理一直都没有被弄清楚，直到淀粉的发现。 在19世纪早期，许多科学家都在研究谷物提取物中淀粉的消化机理。Nasse（1811年）发现，从生物体中提取的淀粉能过被转化为糖，而从被沸水杀死的植物细胞中提取的淀粉不能被转化为糖。Kirchhoff（1815年）做了一个巧妙的实验。他将4份的冷水加入到2份的淀粉中，并边加边搅拌。之后加入20份的沸水使其形成一层厚厚的淀粉糊。在淀粉糊还是余温的时候，加入被粉碎的麸质（或麦芽），然后在40－60°列式温度下水浴。1－2小时后发现，淀粉糊开始缓慢液化。8－10小时后，淀粉糊被转化为一种甜的溶液。之后，他将其通过过滤和蒸发浓缩得到了糖浆，品尝后发现，其和发酵液一样甜。在操作的过程中，他注明了实验过程中仅添加了非常少的麸质，并且得到的糖浆与淀粉的量成正比。此外，如果在加入麸质前加入几滴高浓度的硫磺酸，最终就没有糖生成。从这个实验中他得到结论1）麸质是一种能够使温水中的淀粉粉末转化为糖的物质。2）作为种子发芽的结果，相比种子内的物质而言，麸质能过将更多的淀粉转化为糖。至此,Kirchhoff奠定了发现谷物中一种能够将淀粉转化为糖的蛋白质的基础。
宏基因组学概述
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宏基因组学概述 王莹，马伊鸣 （北京交通大学土木建筑工程学院环境140２班） 摘要:随着分子生物学技术的快速发展及其在微生物生态学和环境微生物学研究中的广泛应用，促进了以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科——微生物环境基因组学(又叫宏基因组学、元基因组学，英文名Mｅｔａｇenomics)的产生和快速发展。宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNＡ,构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能．在短短几年内,宏基因组学研究已渗透到各个领域，包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等,并在医药、替代能源、环境修复、生物技术，农业、生物防御及伦理学等各方面显示了重要的价值。本文对宏基因组学的主要研究方法、热点内容及发展趋势进行了综述 关键词:宏基因组宏基因组学环境基因组学基因文库的构建 Mａcｒo summary of Ｍetagenｏｍｉcs WanｇＹｉng，Ma Ｙi-Mｉｎｇ (BeｉjinｇＪiaoｔｏngUniｖeｒsiｔy, Inｓtitute of civiｌ enｇｉneerｉｎｇ,）Key ｗords:Metａgenｏmｅ; Ｍetagenoｍiｃs;The eｎviｒｏｎｍental genｏmics 宏基因组学（Meｔａgeｎomｉｃｓ)又叫微生物环境基因组学、元基因组学。它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNＡ,构建宏基因组文库,利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。它是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种研究微生物多样性、开发新的生理活性物质（或获得新基因）的新理念和新方法。其主要含义是:对特定环境中全部微生物的总DNA(也称宏基因组，metａgeｎomｉc)进行克隆,并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据ｒDNA数据库设计引物,通过系统学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息。 1.起源 宏基因组学这一概念最早是在19９８年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Haｎｄelsman等提出的,是源于将来自环境中基因集可以在某种程度上当成一个单个基因组研究分析的想法，而宏的英文是"meta－"，具有更高层组织结构和动态变化的含义。后来伯克利分校的研究人员Kevin Chen和LｉoｒPaｃｈｔer将宏基因组定义为"应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落,而不需要在实验室中分离单一的菌株"的科学。 2 研究对象 宏基因组学(Ｍeｔagenｏｍics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体自上而下地研究微生物与自然环境或生物体之间的关系。宏基因组学不仅克服了微生物难以培养的困难, 而且还可以结合生物信息学的方法, 揭示微生物之间、微生物与环境之间相互作用的规律, 大大拓展了微生物学的研究思路与方法, 为从群落结构水平上全面认识微生物的生态特征和功能开辟了新的途径。目前, 微生物宏基因组学已经成为微生物研究的热点和前沿, 广泛应用于气候变化、水处理工程系统、极端环境、人体肠道、石油污染、生物冶金等领域, 取得了一系列引人瞩目的重要成果。 3 研究方法
小麦中的淀粉酶及其研究进展 摘要：从各个方面来研究了小麦中淀粉酶的功能作用以及它的作用机理，通过研究可知，小麦中的а-淀粉酶和β-淀粉酶对食品的品质的影响起着重要的作用。并通过国内外的研究进展来进一步说明小麦中淀粉酶的研究是很有必要的。最后提到了淀粉酶的添加来弥补某些淀粉酶不足以满足食品加工的小麦。本文主要从小麦中的淀粉酶研究意义，国内外小麦中的淀粉酶的研究近况以及未来的发展方向进行了较为全面的综述。 关键词：小麦；淀粉酶；研究进展 在活细胞中进行着大量的化学反应的特点是速度很快，且能有秩序的进行，从而使得细胞同时能进行各种降解代谢及合成代谢，以满足生命活动的需要。生物细胞之所以能够在常温常压下以极高的速度和很大的专一性进行化学反应是由于其中存在一种称为“酶”的生物催化剂。而在小麦的生长，储存，加工等环节中，其中存在的酶就具有非常重要的作用，小麦中的酶会影响着小麦的储存，加工等品质。小麦粉中的淀粉酶主要有3类，即а-淀粉酶，β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。其中与面包烘焙有关的主要是а-淀粉酶和β-淀粉酶，而且а-淀粉酶与小麦的储藏品质也有着极其密切的关系。所以对小麦中的淀粉酶进行研究是十分有必要的。 1.研究小麦中的淀粉酶的意义 小麦中的淀粉酶主要有а-淀粉酶，β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶这三类。面粉有很多用途，可以制成各种不同的成品食品。而面粉大多数都是小麦面粉，可见要研究面粉就的研究小麦，并且小麦中的а-淀粉酶，β-淀粉酶与面包烘焙有关，而且а-淀粉酶与小麦的储藏品质也有着极其密切的关系。所以研究小麦中的淀粉酶是非常有意义的。通过研究可以更好地把握不同小麦品种的淀粉酶的性质，来改善淀粉酶，从而来改进食品品质。 1.1小麦中的а-淀粉酶对面包品质的影响 大量的研究已证实，由于淀粉酶在发酵过程中对淀粉分子进行了有益的修饰，进而改善了面包的质地、体积、颜色、货架寿命等方面的性质,具体影响如下[1,2]： 1.1.1 а-淀粉酶对面包品质的影响 ○1а-淀粉酶能增大面包体积。а-淀粉酶是通过适当阻止面筋的形成来使面包体积增加的，
淀粉酶活性研究 宁加彬1，王文移2 （青岛科技大学） 摘要：淀粉酶主要用作果汁加工中的淀粉分解和提高过滤速度以及蔬菜加工、糖浆制造、葡萄糖等加工制造。淀粉酶活性的研究在淀粉催化分解工程中占有 重要地位。文中综述了淀粉酶活性及其热稳定性，电场对淀粉酶活性的影响。 pH值、温度、淀粉浓度和钙的添加量以及瞬时高压处理对α-淀粉酶的热稳定 性和活性的影响 关键词：淀粉酶酶活性热稳定性 淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通常通过淀粉酶催化水解织物上的 淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、碱法更柔软，且不损伤纤维。对淀粉酶的研究，有利于我们 更好的理解其催化机理。淀粉是植物种子的主要贮存物质，淀粉酶的主要作用是催化淀粉的水解，淀粉被水解成简单有机化合物并提供细胞生长所需的能量。 1、淀粉酶的研究概况 淀粉酶研究经历了一个较长的奠定和发展时期。在中国知网依据主题—— 淀粉酶进行检索，结果显示在1979-2013年共涉及15840篇文献。其中，2005 年以前的总计5256篇，2005-2010年5256篇，也就是说2005年之前的研究篇 数仅占目前土壤酶研究总数的1／3。而从2005年开始我国对土壤酶活性研究 的论文以超百篇的速度增加，且增加趋势较为明显，仅2012年就有724篇。 针对我国淀粉酶活性研究的快速发展，该文就我国淀粉酶研究种类及研究 方法的资料进行归纳总结，旨在进一步扩宽我国淀粉酶活性研究的范围，为今 后淀粉酶的研究提供一些新的思路，同时也可促进我国淀粉酶研究方法的发展。 2、淀粉酶的分类 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的统称。按水解淀粉方式不同，把淀粉酶分 为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶四类。目前淀粉酶已广泛 地应用于食品、发酵、畜牧业生产、谷物加工、纺织、造纸、轻化工业、医药 和临床分析等领域 (Ashok et al．，2000；Lili，2000；柳辉等，2007；张剑等，2009)。其中，中温淀粉酶主要应用于饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精以及抗生素等行业，也可以用于高质量的丝绸人造棉、化学纤维的退浆。淀粉 酶广泛存在于微生物、植物和动物体中。现已有大量有关土壤微生物产淀粉酶 及酶学性质的文献报道(卢涛等，2002，四川大学学报(自然科学版)，39(6)：1131—1133；张应玖等。2002)。
Enzyme Gene CHR Position BAC/PAC Accession Expression Function Mutant Literature ADGP small sub 1 OsAGPS1 9 ~13cM OJ1381_H04 AK073146 E ADGP small sub 2a OsAGPS2a 8 55.4cM P0410E11, 97kb AK071826 E ADGP small sub 2b OsAGPS2b 8 55.4cM P0410E11, 99kb AK103906 E ADGP large sub 1 OsAGPL1 5 117.9cM OSJNBa0017N18 D50317 E ADGP large sub 2 OsAGPL2 1 ~105cM P0663E10U66041 E ADGP large sub 3 OsAGPL3 3 135.7cM OSJNBa0027J18 AK069296 E ADGP large sub 4 OsAGPL4 7 47cM OJ1341_A08AK121036 E SSI OsSSI 6 12.3cM P0681F10 D16202 E, L 与BE一起参与支链淀粉的合成，负责DP~6-7到DP~8-12的合成 SSIIa (SSII-3) OsSSIIa (OsSSII-3) 6 38cM P0525F01 AF419099 E 使DP~10的短链延 长为DP~13-22的 中长链 alk SSIIb (SSII-2) OsSSIIb (OsSSII-2) 2 132cM OJ1118_G04 AF395537 L, R SSIIc (SSII-1) OsSSIIc (OsSSII-1) 10 36cM ? AF383878 E
宏基因组学研究方法及应用概述彭昌文 (山东省济宁学院生物学系 273155) 颜 梅 (山东省曲阜师范大学生命科学学院 273165) 摘 要 本文简要介绍了宏基因组的概念,概述了其原理及应用。 关键词 宏基因组 宏基因组学 环境基因组学 基因文库的构建 迄今,人们对微生物世界的认识基本都来源于对占细菌总种数不到1%的微生物的单个种群的孤立研究结果。然而微生物是通过其群落而非单一种群来执行在自然界物质与能量循环中的作用的,对微生物群落作为整体的功能认识远远落后于对其个体的认识。这种状况不利于全面认识微生物在自然界所扮演的重要角色。为了获得完整的环境微生物基因表达产物,早在1978年许多学者就提出了直接从环境中提取微生物DNA的思路,1998年,AR I A D phar maceutical公司的科学家Handels man等首次提出宏基因组的概念[1]。宏基因组(the genomes of the total m icrobi ota found in nature)是指生境中全部微生物基因的总和[2]。它包含了可培养的和未培养的微生物的基因总和,微生物主要包括环境样品中的细菌和真菌。而宏基因组学就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系等为研究目的的新的微生物研究方法,也称为微生物环境基因组学、元基因组学或生态基因组学。它主要研究从环境样品获得的基因组中所包含的微生物的遗传组成及其群落功能,为充分认识和开发利用非培养微生物,并从完整的群落水平上认识微生物的活动、最大限度地挖掘微生物资源,提供了可能,已成为国际生命科学技术研究的热点和前沿。 1 宏基因组学的研究方法 宏基因组学的研究过程一般包括从环境样品中提取基因组DNA,克隆DNA到合适的载体,导入宿主菌体,筛选目的转化子等工作,可分为三个步骤。 1.1 宏基因组的提取 在宏基因组筛选过程中,目的基因是整个核苷酸链中的一部分,因此样品前期的富集能够提高筛选命中率。DNA的提取是宏基因文库构建的关键步骤。提取步骤通常需要满足两个条件:既要尽可能提取样品所有微生物的基因,又要保持片段的完整和纯度。目前所开发的DNA提取方法有两种:细胞提取法和直接裂解法。直接裂解法包括物理法(冻融法、超声法、玻璃球珠击打法、液氮碾磨法)、化学法(常用化学试剂有表面活性剂、盐类、有机溶剂等)及酶裂解法。另外,依据提取样品总DNA前是否分离细胞,可以分为原位裂解法和异位裂解法。原位裂解法可以直接破碎样品中的微生物细胞而使DNA 得以释放,由于无需对样品微生物进行复苏,且黏附颗粒上的微生物细胞亦能被裂解,所得DNA能更好地代表样品微生物的多样性。此法操作容易、成本低,DNA 提取率高,但由于机械剪切作用较强,所提取的DNA 片段小(1～50kb),通常适用于构建小片段插入文库(以质粒和λ噬菌体为载体)的DNA提取。异位裂解法则先采用物理方法将微生物从样品中分离出来,然后采用较温和的方法抽提DNA。此法条件温和,可获得大片段DNA(20～500kb),纯度高,但操作繁琐、成本高、得率低,通常适用于构建大片段插入文库(以柯斯质粒或者细菌人工染色体为载体)的DNA提取。1.2 宏基因组文库的构建 宏基因组文库的构建需适宜的克隆载体。通常用于DNA克隆的载体主要包括质粒、黏粒和细菌人工染色体等。质粒一般用于克隆小于10kb的DNA片段,适用于单基因的克隆与表达。黏粒的插入片段可达40kb左右,细菌人工染色体插入片段可达350kb,可用来制备由多基因簇调控的微生物活性物质的完整代谢途径的相关片段文库。1.3 目的基因的筛选 目的基因的筛选方法包括序列分析和功能分析两种。序列分析适用于小片段DNA文库的基因筛选;而功能分析通常适用于大片段DNA文库的筛选。序列分析筛选不依赖于重组基因在外源宿主中的表达,因为所使用的寡聚核苷酸引物是直接通过DNA序列中的保守区域设计的,反映了氨基酸序列的保守性,可获得未知序列的目的基因。该方法对DNA量的要求不高,筛选到新活性物质的可能性较大。序列分析的另一个手段是对宏基因组克隆测序,无论是全部或随机测序都是发现新基因的有效手段。 对于功能分析而言,首先需获得目的克隆,然后通过序列和生化分析对其进行表征。此法能快速鉴定出全新且有开发价值的活性物质,可用于医药、工农业等行业。由于此法检出率较低,工作量较大,且受检测手段的限制,所以常要借助于高通量筛选。 2 宏基因组学的应用 2.1 在生态学方面的应用 当今微生物生态学研究的主要目的之一是将微生物与其所在环境中的代谢过程相联系。应用16s r DNA作为系统发育锚去鉴定属于某种微生物的克隆,然后对基因进行测序,从而获得
２０１０Ｎ０．２ ?９４?ＳｅｒｉａｌＮｏ．２１５ＣｈｉｎａＢｒｅｗｉｎｇＩ衄。ｖａｔｉ。ｎ ａｎｄＫｎ。、Ⅳ１ｅｄｇｅＴｒ嬲ｓ衔 基于易错ＰＣＲ技术的仅一淀粉酶基因的定向进化研究 张建云１，谷立坤协，陈红歌２ （１．河南工程学院资源与环境工程系，河南郑州４５１１９１；２．河南农业大学生命科学学院，河南郑州４５０００２）摘要：采用基因体外定向进化策略巾易错Ｐｃ刚支术，用碱基类似物５挨脱氧尿苷三磷酸（５．ＢｒｄＵＴＰ）部分取代脱氧胸苷三磷酸（ｄ１１限），对野油菜黄单胞菌的Ｏｔ．淀粉酶基因进行了体外诱变。通过鉴别培养基进行筛选，得到５个具有高酶活的诱变基因，利用生物学软件ＤＮＡｓｔａｒＮ出发基因序列进行比较，分析了突变位点和酶功能变化的相应关系。结果显示：基因诱变后酶活的改变主要是由淀粉酶基因空间结构的改变向引起的，而不是由启动了的变化引起的。 关键词：定向进化：碱基类似物；诱变；ａ．淀粉酶基凶 中图分类号：Ｑ５５６文献标识码：Ａ文章编号：０２５４—５０７１（２０１０）０２—００９４＿０３ Ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｎｖ／ｔｒｏｏｆｏｒ－ａｍｙｌａｓｅｇｅｎｅｂｙｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅＰＣＲ ＺＨＡＮＧＪｉａｎｙｕｎｌ，ＧＵＬｉｋｕｎ”，ＣＨＥＮＨｏｎｇｇｅ２ （１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，ＨｅｎａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５１１９１。Ｃｈｉｎａ； ２，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＨｅｎａｎＡｇｒｉｃｕｌａｎａｌＵｎｉｖｅｍｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００２，Ｃｔｍａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｒａｎｄｏｍｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｎｏｔ－ａｍｙｌａｓｅｇｅｎｅｉｎｖｉｔｒｏｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｂａｓｅｄｏｎｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅＰＣＲｓｔｒａｔｅｇｙ．５－ＢｒｄＵＴＰｐａｒｔｌｙｒｅｐｌａｃｅｄｎ限ｗｈｅｎｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｔａｒｔｅｄ．Ｂｙｕｓｉｎｇｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍｅｄｉｕｍ，ｗｅｓｃｒｅｅｎｅｄｆｉｖｅｍｕｔａｔｅｄｇｅｎｅｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＴｈｅｏｂｔａｉｎｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅａｌｉｇｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅｔｈｅｏｒｉｇｉｎａｌｇｅｎｅｂｙｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｏｆｔｗａｒｅＤＮＡｓｔａｒ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙａｆｔｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｍａｉｎｌｙｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａ－ａｍｙｌａｓｅｇｅｎｅ，ｎｏｔｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎ；５－ＢｒｄＵＴＰ；ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；ａ－ａｍｙｌａｓｅ ｄ．淀粉酶（ａｌｐｈａ－Ａｍｙｌａｓｅ）为１，４一仪一Ｄ一葡萄糖苷水解酶，作用淀粉时可从分子内部切开Ｏｔ一１，４键生成小分子糊精和还原糖，产物末端葡萄糖残基Ｃｌ碳原子为仅一构型，故称Ｏｔ．淀粉酶。ｄ一淀粉酶在动物、植物、微生物【１】中均能产生，但大量生产主要还是靠微生物发酵闭。微生物中许多种类均能产生饯．淀粉酶，其中有关的属有：Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｓｐ．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｓｐ．Ｔｈｅｌ＂ｍＯＣＯＣＣＵｓｐ．［３１等，从淀粉酶的发现至今ｄ．淀粉酶的种类已越来越多。ａ一淀粉酶能水解淀粉中的仅一ｌ，４葡萄糖苷键，导致淀粉迅速被液化，可被广泛应用于葡萄糖生产、啤酒酿造、酒精工业、发酵行业问以及纺织行业等。因此有关仅．淀粉酶的研究也是酶类中最活跃的研究领域之一。许多研究者通过筛选和育种工作，改变菌种特性，提高丫ｄ一淀粉酶活力，但由于多次使用同种诱变剂，使负变率加大，并且可能发牛平顶效应。近年来基因一Ｉ：程的飞速发展，为（Ｉｔ一淀粉酶的研究开辟了新的道路［５－６１。 酶分子的定向进化不需要事先Ｊ，解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组、门然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）｝Ｈ所需性质的突变酶１７．８１。易错ＰＣＲ技术是在采）｜ｊＴａｑ酶进行ＰＣＲ扩增同的毖阗时，通过调整反应条件（如提高酶离子浓度，改变体系中４种ｄＮＴＰ的浓度等），改变Ｔａｑ酶的突变频率，从而向目的基因中以一定频率引入突变，构建突变库，然后选择或筛选需要的突变体。ＣＨＥＮＫ等［９１用此策略定向进化枯草杆菌蛋白酶Ｅ获催化活性提高２５６倍的突变体。 本研究使用碱基类似物５．溴脱氧尿营三磷酸为诱变剂，利用热稳定性的Ｔａｑ聚合酶不具备校对功能的特点而引入突变，经多轮诱变后，获得５株酶活性显著提高的诱变株。 碱基类似物掺入诱变简便、快捷，成为基因体外定向进化的又一新策略∞。研究进一步验证了这一方法的可行性，并为研究仅．淀粉酶基因突变位点和酶功能的关系提供了材料，从而为深入研究ｄ．淀粉酶基因的进化和诱变育种打下了基础。 １材料与方法 １．１试验材料 １．１．１质粒和试剂 大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｔｉｃｈｉａｃｏｂ３ＤＨ５０ｔ菌株和ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ质粒（２．９６ｋｂ）均ｒｆｌ本实验室保存；含野油菜黄单胞菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）ｃｔ一淀粉酶基冈的质粒ＰＨＮＨ００３：南术实验室构建（ｄ一淀粉酶基冈人小为１８０８ｂｐ）；限制性内切酶，Ｔ４ＤＮＡ连接酶、ＤＮＡｍａｒｋｅｒｓ：均购ｆＩＴａｋａｒａ公叫：ＴａｑＤＮＡ聚介酶、肤ＲＮＡ酶、ｄＮＴＰ、矿油、ＩＰＴＧ、Ｘ—ｇａｌ、ＳＤＳ、ＴＲＩＳ、ＥＢ：购自上海生工生物工程公司。１．１．２培养基 ＬＢ培养基：在９５０ｍＬ去离子水中加入蛋白胨１０９，酵母 收稿日期：２００９．１１－０８ 基金项目：河南省科技厅科技攻关项目（０９２１０２２１０２１２） 作者简介：张建云（１９７９．），女，河南南召人，讲师，研究方向为应用微生物技术；谷立坤?，讲师，通讯作者。
宏基因组学概述 王莹，马伊鸣 （北京交通大学土木建筑工程学院环境1402班） 摘要：随着分子生物学技术的快速发展及其在微生物生态学和环境微生物学研究中的广泛应用，促进了以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科——微生物环境基因组学(又叫宏基因组学、元基因组学，英文名Metagenomics)的产生和快速发展。宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA，构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能．在短短几年内，宏基因组学研究已渗透到各个领域，包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等，并在医药、替代能源、环境修复、生物技术，农业、生物防御及伦理学等各方面显示了重要的价值。本文对宏基因组学的主要研究方法、热点内容及发展趋势进行了综述 关键词：宏基因组宏基因组学环境基因组学基因文库的构建 Macro summary of Metagenomics Wang Ying, Ma Yi-Ming （BeijingJiaotongUniversity, Institute of civil engineering,） Key words: Metagenome; Metagenomics; The environmental genomics 宏基因组学（Metagenomics）又叫微生物环境基因组学、元基因组学。它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA,构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。它是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种研究微生物多样性、开发新的生理活性物质（或获得新基因）的新理念和新方法。其主要含义是：对特定环境中全部微生物的总DNA （也称宏基因组，metagenomic）进行克隆，并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据rDNA数据库设计引物，通过系统学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息。 1.起源 宏基因组学这一概念最早是在1998年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Handelsman等提出的，是源于将来自环境中基因集可以在某种程度上当成一个单个基因组研究分析的想法，而宏的英文是"met a-"，具有更高层组织结构和动态变化的含义。后来伯克利分校的研究人员Kevin Chen和Lior Pachter 将宏基因组定义为"应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落，而不需要在实验室中分离单一的菌株"的科学。 2 研究对象 宏基因组学(Metagenomics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体自上而下地研究微生 物与自然环境或生物体之间的关系。宏基因组学不仅克服了微生物难以培养的困难, 而且还可以结合生物信息学的方法, 揭示微生物之间、微生物与环境之间相互作用的规律, 大大拓展了微生物学的研究思路与方法, 为从群落结构水平上全面认识微生物的生态特征和功能开辟了新的途径。目前, 微生物宏基因组学已经成为微生物研究的热点和前沿, 广泛应用于气候变化、水处理工程系统、极端环境、人体肠道、石油污染、生物冶金等领域, 取得了一系列引人瞩目的重要成果。 3 研究方法 宏基因组学的研究过程一般包括样品和基因(组)的富集；提取特定环境中的基因组 DNA；构建宏基因组 DNA 文库；筛选目的基因；目的基因活性产物表达(图 1)五个步骤。
宏基因组学的一般研究策略 摘要: 宏基因组学是目前微生物基因工程的一个重要方向与热点。它把微生物的总群体特性与基因组学实验手段结合了起来，包括从环境样品中提取总DNA、再用可培养的宿主微生物建立文库及筛选目的克隆和基因。该法是研究不可培养微生物、寻找新的基因和开发新活性产物的重要新途径。它避开了微生物分离、纯化和培养的步骤,大大扩展了微生物资源的利用范围。本文旨在介绍宏基因组学的一般研究方法并结合我们的实验情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。 关键词: 宏基因组学, 不可培养微生物, 文库构建, 文库筛选，研究策略 Strategies for accessing metagenomics for desired applications Abstract: Metagenomics is a new field of microbial genetic engineering. It has the characteristics of microbial ecology and the methodology of genomics. Metagenomics includes genomic DNA isolation, library construction and screening strategies, and can be used in the discovery of new gene and biocatalysts and in the study of uncultured microorganism. Metagenomics can overcome the advantages of isolation and cultivation procedures in traditional microbial method, and thus greatly broaden the space of microbial resource utilization. In this paper, we mainly reviewed the metagenomic methodology, together with the latest advances and novel strategy in this research field. Keywords：Metagenomics; Uncultured microorganism；Library construction；Library screening Research strategies 大自然中蕴藏着无数具有重要价值的微生物及其活性产物,也是新基因及生物学资源的重要源泉，对其进行研究成为微生物学和分子生物学研究的一个重要方向。然而人们现在能够培养与利用的不到环境中总微生物的1%[1]。宏基因组学(metagenomics)是直接从环境样品中提取全部微生物的总DNA, 避开了分离、纯化和培养微生物的过程来构建宏基因组文库,用基因组学的研究策略来研究环境样品中的总微生物的组成及其在群落中的功能等。现在,宏基因组学技术方法已在微生物多样性,微生物细胞间的相互作用,新基因和新型生物催化剂的开发，新的抗生素的开发及环境生态等方面得到了广泛应用[2]。本文旨在介绍宏基因组学的一般实验方法并结合我们的研究情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。深化了我们对这一学科的认识,促进了该学科的进步。 1 宏基因组学研究策略 1.1宏基因组学概要 宏基因组学是Handelsman等于1998年提出的[3], 可见是一门很新的学科，其随着基因组实验手段，生物信息学和测序技术等的日新月异也迅猛发展了起来，这个新学科是以环境样品的总微生物基因组为实验对象，通过测序分析、文库评价、产活性物质及其基因的克隆的获取和基因功能的鉴别，对微生物种群组成与生物量、生态学关系、生物化学关系与环境关系以及功能活性进行研究[4]。其主要过程包括样品和基因的富集和提取; 宏基因组文库的构建; 目的基因的筛选; 目的基因活性产物的表达(图1)。 1.2 微生物及其基因的富集 在文库筛选过程中由于目的基因比例较小, 对环境中微生物的富集不但可提高基因总量，有利于基因的提取，还可增加目的基因的比例，如Kouker 等用橄榄油富集产脂肪酶的微生物收到了很好的效果[5 ]，橄榄油不仅可作为底物，还可诱导脂肪酶的合成。目前富集技术主要分为细胞水平和基因水平。其中细胞水平主要是用选择培养基来富集某些微生物, 常
固定化酶的研究进展 固定化酶是20世纪60年代发展起来的一项新技术。最初主要是将水溶性酶与不溶性体结合起来，成为不溶于水的酶衍生物，所以曾叫过“水不溶酶”和“固相酶”。但是，后来发现，也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出。在这种情况下，酶本身仍是可溶的，只不过被固定在一个有限的空间内不能再自由流动。因此，用水不溶酶或固相酶的名称就不再恰当。在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”的名称[1]。 一固定化酶的发展历程[1] 酶参与体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变换。作为一种生物催化剂，酶可以在常温常压等温和条件下高效地催化反应，一些难以进行的化学反应在酶的催化作用下也可顺利地进行反应，而且反应底物专一性强、副反应少等优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研究。近年来，酶被人们广泛应用于食品生产与检测、生物传感器、医药工程、环保技术、生物技术等领域。 1916年美国科学家NELSON和GRIFFIN最先发现了酶的固定化现象；直到20世纪50年代，酶固定化技术的研究才真正有效地开展；1953年，德国科学家GRUB-HOFER 和SCHLEITH首先将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶等与上述载体结合制备固定化酶；到20世纪60年代，固定化技术迅速发展；1969年日本千畑一郎利用固定化氨基酰胺酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸，是世界上固定化酶大规模应用的首例；在1971年的第一届国际酶工程会议上，正式建议使用固定化酶(mimobilizedenzyme)这个名称。我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是中国科学院微生物所和上海生化所的酶学工作者同时开始了固定化酶的研究工作 二固定化酶的特点[2] [3] 固定化酶具有许多优点：极易将固定化酶与底物、产物分开；可以在较长时间内进行分批反应和装柱连续反应；在大多数情况下，可以提高酶的稳定性；酶反应过程能够加以严格控制；产物溶液中没有酶的残留，简化了提取工艺；较水溶性酶更适合于多酶反应；可以增加产物的收率,提高产物的质量；酶的使用效率提高，成本降低。但是，固定化酶也有其不足之处，如固定化时，酶活力有损失；增加了固定化的成本，工厂开始投资大；只能用于水溶性底物，而且较适用于小分子。 三固定化酶固定化方法[3] [4] 由于所固定的酶或细胞的不同，或者固定的目的及固定用的载体的不同，使固定化方法大相径庭。根据固定的一般机理，可将之分为如下几种方法。酶的固定化方法有：
宏基因组学方法研究明永冰川的初步实验计划 起草人：李浩宇 宏基因组学研究方向及意义 研究：环境胁迫对集体遗传变异的过程和机理。 发掘：环境应激和应答基因的多态性。 探究：多态性基因的功能。 实验大体步骤：
I.环境样品的采集： 1）避免人源污染，采样的器具都要高温灭菌，采样过程中要戴手套。 2）样品的迅速处理保存。有条件最好用液氮冷冻运输，没有条件可以将装有样品的容器至于干冰泡沫箱中。带回实验室之后要尽快处理，特别是固体样品，迅速用预冷缓冲液(多为PBS)重悬，离心收集沉淀。分装成小份，冻存于液氮或者‐80 ℃冰箱中，避免反复冻融。 3）如果后续用间接法提取总DNA 的话，此处需要收集菌体，采取的策略是稀释之后的差速离心，一般适用于水样。 II.DNA提取方法的选择： 总DNA 的提取按照处理样品方式的不同划分为直接提取法和间接提取法。 直接提取法就是直接对样品进行裂解，释放其中的DNA。 间接提取法则是先分离样品中的微生物，后对微生物进行裂解。两种方法的适用范围不同，各自都有优缺点。 直接提取法的优缺点：直接提取法多用在提取固体样品(如土壤、污泥、湖泊沉积物等) 总DNA 的试验中。其最大的优点在于得率高，在某些环境样品总DNA 提取实例中，比间接提取法高数倍至数百倍。造成这种情况的最主要原因一是环境样品中存在丰富的胞外DNA；二是许多微生物与基质形成复杂的结构，间接提取法不易对其进行分离。在样品较珍贵时多采用此法。其缺点同样明显，所得DNA 的纯度远不及间接提取法所得，基质中含的腐殖质一并被保留下来，使得所得DNA 呈现黄褐色甚至黑色。 可以考虑MoBio 和Epicentre的DNA提取的商业试剂盒(主要用于提取土壤样品)。 间接提取法的优缺点：间接提取法则既可以用来提取固相样品总DNA 也可以用来提取液体样品总DNA。在提取液体样品(如海水、河流等样品)总DNA 时，需要用抽滤的方式浓缩。与直接提取法刚好相反，其最大的优点在于提取DNA 纯度高，既使在提取固体样品微生物总DNA 时，也可以用缓冲液对收集的菌体进行反复冲洗以去除表面所带杂质。其缺点是DNA 得率低。
宏基因组测序技术检测标准 简介： 宏基因组测序介绍 宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。下面就是对这两者的具体介绍。 一、16s DNA/18s DNA/ITS测序 16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。 二、宏基因组全测序 在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。 样品处理：
宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。尽量留足备份样品。核酸提取： 宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = ， 260/230 = ，电泳检测DNA 应是完整的一条带。 测序Sequencing 1)16S/18S测序： Sanger测序： 用于低通量的16S/18S DNA测序，提取宏基因组后，首先通过PCR将16S/18S 序列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导入感受态细胞，涂平板做蓝白斑筛选，选出阳性克隆提质粒，对质粒进行测序反应，测序反应后纯化后用ABI 3130或ABI 3730进行毛细管电泳测序。 由于其测序准确率比较高，而通量非常低，现通常用做二代测序结果的验证。454 Platform： 454平台主要包括两种测序系统：454 GS FLX+ System和454 GS Junior System。454 GS FLX+ System测序读长可以达到600-1000bp，通量450-700M，GS Junior System测序读长在400bp左右，通量在35M。