中国畜牧兽医 ２０１７，４４（４）：１１７５－
１１８１Ｃｈｉｎａ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ＆Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅｄｏｉ：１０．１６４３１／ｊ
．ｃｎｋｉ．１６７１－７２３６．２０１７．０４．０３３猪伪狂犬病病毒ｇＢ蛋白表达及免疫原性分析
贾 刚１，
樊梅娜２＊，谷 巍１（１．
山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院，泰安２７１０００；２．泰安大凡神农制药有限公司研究院，泰安２７１０００）摘 要：本试验旨在研究猪伪狂犬病病毒（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ＰＲＶ）ｇＢ蛋白的表达并分析其免疫原性，以ＰＲＶ病毒液为模板，设计特异性引物，扩增大小为６１２ｂｐ的保守片段并测序，将其克隆到表达载体ｐＥＴ－２８ａ中，转化表达菌ＢＬ２１（ＤＥ３），经诱导表达、纯化得到目的蛋白，进行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析验证并分析免疫原性。结果表明，表达的ｇＢ蛋白大小为３０ｋｕ，主要以包涵体形式存在，复性后浓度为１０６μｇ／ｍＬ，且具有良好的反应原性。应用市售试剂盒检测到样品中含１３份ＰＲＶ阳性血清和１６份阴性血清，利用检出的阳性血清，初步可建立以ＰＲＶ ｇＢ蛋白为包被抗原的ＰＲＶ抗体ＥＬＩＳＡ检测方法。
关键词：猪伪狂犬病病毒；ｇ
Ｂ蛋白；原核表达；免疫原性中图分类号：Ｓ８５２．６５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７１－７２３６（２０１７）０４－１１７５－
０７收稿日期：２０１６－０７－
０６基金项目：国家８６３计划专项基金（新型抗感染功能型微生态制剂的研制与应用）（２０１３ＡＡ１０２８０６）作者简介：贾 刚（１９８８－），男，山东泰安人，硕士，研究方向：动物微生态学，Ｅ－ｍａｉｌ：ｇａｎｇ
０７１２＠１６３．ｃｏｍ＊通信作者：
樊梅娜（１９８７－），女，河南南阳人，硕士，研究方向：动物微生态学，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｕｅｍｅｉ４１２．ｃｏｍ＠１６３．ｃｏｍＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ Ｖｉｒｕｓ ｇＢ ＰｒｏｔｅｉｎＪＩＡ Ｇａｎｇ１，
ＦＡＮ Ｍｅｉ－ｎａ２＊，ＧＵ Ｗｅｉ １
（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｂａｏｌａｉ－ｌｅｅｌａｉ Ｂｉｏ－ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｔ
ａｉ’ａｎ２７１０００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔａｉａｎ ＤａＦａｎＳｈｅｎＮｏｎｇ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔａｉ’ａｎ２７１０００，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ
ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ（ＰＲＶ）ｇＢ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｏｆ ＰＲＶ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ６１２ｂｐ
ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ，ｔｈｅｎ ｉｔ ｗａｓｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＴ－２８ａａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３），ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ
ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏａｎａｌｙｓｅ ｉｔｓ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｇＢ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ３０ｋｕ，ｗｈｉｃｈ ｍａｉｎｌｙ ｅｘ－ｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍ ｏｆ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ １０６μｇ／ｍＬ，ｗｉｔｈｗｅｌｌ ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．１３ＰＲＶ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ １６ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｐ
ｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄｕｓｉｎｇ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ ｏｎ ｓａｌｅ，ｕｓｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ，ｔｈｅ ＰＲＶ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｉｎｉｔｉａｌｌｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＰＲＶ ｇＢ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｐａｃｋａｇ
ｅ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐｏｒｃｉｎｅ ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ；ｇＢ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ 伪狂犬病，又称Ａｕｊｅｓｚｋｙ’
ｓ病，是一类由疱疹病毒科α疱疹病毒亚科伪狂犬病病毒（ｐ
ｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ，ＰＲＶ）
引起的危害家畜及多种野生动物的急性传染病［１］
，主要感染猪等动物，可造成怀孕母猪流
产或死胎，新生仔猪发热，出现神经症状等，极大地
影响了中国养殖业的健康发展［２－
４］。该病传播快、传
播范围广、传播途径多、死亡率高，已成为危害养猪
业最为严重的疾病之一，需要加以重视［
５］
。ＰＲＶ作为一种猪疱疹病毒，
基因组为双链线性ＤＮＡ，其病毒粒子脂质囊膜由多达１６种糖蛋白组成［６］
。其中，ｇＢ蛋白是ＰＲＶ最主要的保护性抗原蛋白，是ＰＲＶ复制、感染必不可少的囊膜组分，不仅能够诱导宿主产生免疫应答，而且也是病毒入侵
增殖和在细胞间传播的必需组分［７－
９］。ｇＢ基因位于
中 国 畜 牧 兽 医４４卷
ＰＲＶ基因组的ＵＬ区，开放阅读框（ＯＲＦ）约为２．８ｋｂ，共编码９１５个氨基酸，由于ＰＲＶ基因组中ＧＣ含量过高，扩增全长较困难［１０］，因此通常截取含有ｇＢ蛋白抗原表位的一段基因片段进行表达［１１］。
研究证实，ＰＲＶ ｇＢ蛋白是抗体的主要靶子，虽然在猪体内存在着ｇＢ、ｇＣ、ｇＥ、核衣壳蛋白等抗体，但在行使免疫性和诱导免疫应答方面所起到的作用，不同的ＰＲＶ蛋白相差极大［１２－１３］。对猪注射抗ｇＢ、ｇＣ、ｇＥ单克隆抗体或利用免疫接种方式，均能起到抵抗ＰＲＶ致死性攻击的作用，但其中ｇＣ、ｇＥ的单克隆抗体会呈现抗原漂移，从而使ＰＲＶ能够逃避宿主的免疫防御，而ｇＢ免疫原性相对较好，没有发现抗原变异的情况［１４－１５］。
本试验旨在利用特异性引物将猪ＰＲＶ ｇＢ基因片段进行克隆并连接至表达载体中，诱导蛋白表达并进行免疫原性分析，同时，以复性后的蛋白作为抗原，初步建立起以之为包被抗原的ＰＲＶ抗体ＥＬＩＳＡ检测方法，为今后猪伪狂犬病的检测和诊断奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 菌种、质粒和病毒株 大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞、ｐＺｅｒｏ－ｂｌｕｎｔ Ｓｉｍｐｌｅ载体、ｐＥＴ－２８ａ表达载体、ＰＲＶ病毒液由宝来利来生物制品研究室保存；ＢＬ２１（ＤＥ３）购自Ｔｒａｎｓｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ公司。１．１．２ 主要试剂 Ｔ４ＤＮＡ聚合酶、限制性内切酶和ＩＰＴＧ均购自ＴａＫａＲａ公司；Ｎｉ－ＮＴＡ·Ｈｉｓ树脂购自Ｎｏｖａｇｅｎ公司；辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的羊抗猪ＩｇＧ（ＨＲＰ－ＩｇＧ）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；猪伪狂犬病毒抗体检测ＥＬＩＳＡ试剂盒购自深圳芬德生物技术有限公司。
１．２ 方法
１．２．１ 引物设计与合成 参考ＧｅｎＢａｎｋ中公布的ＰＲＶｇＢ基因序列（登录号：ＪＦ７９７２１９．１），采用ＤＮＡ－ＭＡＮ软件设计扩增ｇＢ基因的引物，引物序列为：上游引物：５′－ＧＣＧＡＡＴＴＴＣＡＧＴＡＣＴＣＧＣＡＧＧＧＧＣＧ－ＣＡＡＣＴ－３′；下游引物：５′－ＧＣＧＴＣＧＡＣＣＧＣＣＧＡＴＣＴ－ＴＧＧＴＧＴＡＧＧＴＧＴ－３′。引物由博尚生物合成。ＰＣＲ反应体系５０μＬ：５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ，ｄＮＴＰＭｉｘ ４μＬ，上、下游引物各１μＬ，ＰＲＶ细胞培养液２μＬ，ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ聚合酶０．５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ３１．５μＬ。ＰＣＲ反应条件：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５５℃退火１５ｓ，７２℃延伸４５ｓ，３０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经１．０％琼脂糖凝胶电泳检测。１．２．２ 重组ｇＢ蛋白表达载体的构建 以ＰＲＶ病毒液为模板，利用合成的引物进行ＰＣＲ扩增，目的片段胶回收之后由Ｔ４ＤＮＡ连接酶于１６℃水浴过夜连接到ｐＺｅｒｏ－ｂｌｕｎｔ Ｓｉｍｐｌｅ载体，转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，酶切鉴定后，将阳性克隆命名为ｐＺｅｒｏ－ＰＲＶ，并进行测序。对ｐＺｅｒｏ－ＰＲＶ进行ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ双酶切后，将目的片段连接到原核表达载体ｐＥＴ－２８ａ上，转化感受态细胞ＢＬ２１（ＤＥ３），重组质粒经酶切鉴定，阳性载体命名为ｐＥＴ２８ａ－ＰＲＶ ｇＢ。
１．２．３ 重组ｇＢ蛋白的表达、纯化和鉴定 挑取单个阳性菌落，２８℃条件下摇床培养至菌液Ｄ６００ｎｍ在０．６～０．８之间，加入１ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ诱导４ｈ；收集菌液，超声破碎处理，离心后经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳确定蛋白以包涵体形式存在，利用Ｎｉ－ＮＴＡ·Ｈｉｓ树脂进行纯化，纯化后的蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定，并进行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析重组蛋白抗原性。１．２．４ 重组ｇＢ蛋白的复性及浓度测定 利用透析法对包涵体蛋白进行复性，将包涵体蛋白放入透析袋中，利用尿素梯度进行复性处理，制作标准曲线，利用Ｂｒａｄｆｏｒｄ蛋白浓度测定试剂盒测定复性后的重组ｇＢ蛋白浓度。
１．２．５ 重组ｇＢ蛋白的活性分析 利用猪伪狂犬病毒抗体检测ＥＬＩＳＡ试剂盒对收集到的血清进行检测，筛选阳性和阴性血清。利用间接ＥＬＩＳＡ鉴定重组ｇＢ蛋白的活性，取纯化后的重组ｇＢ蛋白，以０．２μｇ／孔包被ＥＬＩＳＡ反应板，以稀释４０倍的ＰＲＶ感染的猪的阳性血清为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗猪ＩｇＧ为二抗，将检测结果与市售试剂盒的结果进行比较，判断重组ｇＢ蛋白作为抗原包被建立的ＥＬＩＳＡ检测方法的可行性。
２ 结 果
２．１ 重组ｇＢ蛋白原核表达载体的构建
利用特异性引物，从ＰＲＶ病毒液中扩增到了大小为６１２ｂｐ的目的片段（图１），连入克隆载体ｐＺｅｒｏ－ｂｌｕｎｔ Ｓｉｍｐｌｅ载体，酶切后构建到原核表达载体ｐＥＴ－２８ａ。重组表达载体经ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ双酶切，获得了预期目的基因片段（图２）。
６７１１
４期贾 刚等：猪伪狂犬病病毒ｇＢ
蛋白表达及免疫原性分析
Ｍ，ＤＬ２０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１、２，ｇＢ基因的ＰＣＲ扩增产物Ｍ，ＤＬ２０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１ａｎｄ ２，ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｇ
Ｂｇｅｎｅ图１ ＰＲＶ ｇ
Ｂ基因ＰＣＲ扩增产物Ｆｉｇ．１ ＰＣＲ ｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＰＲＶ ｇＢｇｅｎ
ｅ１，ｐ
ＥＴ－２８ａ载体；２，ｐＥＴ２８ａ－ＰＲＶ ｇＢ双酶切产物；Ｍ，ＤＬ２０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ１，ｐ
ＥＴ－２８ａｖｅｃｔｏｒ；２，Ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｐＥＴ２８ａ－ＰＲＶ ｇＢ；Ｍ，ＤＬ２０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ图２ 重组质粒ｐＥＴ２８ａ－ＰＲＶ ｇ
Ｂ双酶切鉴定Ｆｉｇ．２ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ２８ａ－ＰＲＶ ｇＢ ｂｙ
ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｓ 测序可知，扩增得到的ＰＲＶ ｇ
Ｂ基因大小为６１２ｂｐ，预测表达２０２个氨基酸。对ＰＲＶ ｇ
Ｂ基因进行同源性分析，发现其与ＮＣＢＩ数据库中已公布的３个ＰＲＶ参考序列，欧美毒株Ｂｅｃｋｅｒ株（Ｇｅｎ－
Ｂａｎｋ登录号：ＪＦ７９７２１９．１）、Ｋａｐ
ｌａｎ株（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＪＦ７９７２１８．１）和Ｂａｒｔｈａ株（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＪＦ７９７２１７．１）ｇ
Ｂ基因序列同源性较高，均达到９８％以上（图３
）。７
７１１
中 国 畜 牧 兽 医４４卷
图３ ＰＲＶ ｇ
Ｂ基因序列同源性分析Ｆｉｇ．３ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＰＲＶ ｇＢｇｅｎｅ２．２ 重组ｐＥＴ２８ａ－ＰＲＶ ｇ
Ｂ蛋白表达、纯化将重组ＰＲＶｇＢ基因克隆到原核表达载体上，转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），经ＩＰＴＧ诱导表达，产物过Ｎｉ－ＮＴＡ柱纯化，经ＳＤＳ－
ＰＡＧＥ分析，可见明显的３０ｋｕ的表达蛋白带，主要存在于沉淀中（图４
），利用包涵体纯化试剂盒，成功纯化到目的蛋白（图５
）
。Ｍ，低分子质量蛋白质Ｍａｒｋｅｒ；１，未诱导的ｐＥＴ－
２８ａ载体；２，ＩＰＴＧ诱导０ｈ表达产物；３，ＩＰＴＧ诱导４ｈ时表达产物；４，Ｉ
ＰＴＧ诱导表达４ｈ时超声裂解上清液；５，ＩＰＴＧ诱导表达４ｈ时超声裂解沉淀Ｍ，Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ；１，ｐ
ＥＴ－２８ａｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；２，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｏｒ ０ｈｂｙＩＰＴＧ；３，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｏｒ ４ｈｂｙ
ＩＰＴＧ；４，Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｅｄ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｏｒ ４ｈｂｙ ＩＰＴＧ；５，Ｕｌｔｒａｓｏｎｉ－ｃａｔｅｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｏｒ ４ｈｂｙ
ＩＰＴＧ图４ 重组蛋白ｐＥＴ２８ａ－ＰＲＶ ｇ
Ｂ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析Ｆｉｇ．４ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｎａｌｙ
ｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐＥＴ２８ａ－ＰＲＶ ｇＢ ｐｒｏｔｅｉｎ８７
１１
４期贾 刚等：猪伪狂犬病病毒ｇＢ
蛋白表达及免疫原性分析
Ｍ，
低分子质量蛋白质Ｍａｒｋｅｒ；１，ＩＰＴＧ诱导表达４ｈ时超声裂解上清液；２，ＩＰＴＧ诱导表达４ｈ时超声裂解沉淀；３，蛋白纯化流穿液；４、５，
蛋白纯化产物Ｍ，Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ；１，Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｅｄ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｏｒ ４ｈｂｙ ＩＰＴＧ；２，Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｅｄｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｏｒ ４ｈｂｙ
ＩＰＴＧ；３，Ｔｈｒｏｕｇｈ ｌｉｑｕｉｄ ａｆｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；４ａｎｄ ５，Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔ图５ 重组蛋白ｐＥＴ２８ａ－ＰＲＶ ｇ
Ｂ纯化分析Ｆｉｇ．５ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐＥＴ２８ａ－ＰＲＶ ｇＢ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｆｔｅｒ ｐ
ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ２．３ 重组ｐＥＴ２８ａ－ＰＲＶ ｇ
Ｂ蛋白复性及鉴定利用透析法对重组蛋白进行复性，经检测，复性后蛋白浓度为１０６μｇ／ｍＬ，经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检
测，纯化的蛋白能够与Ｈｉｓ标签特异性识别，
约３
０ｋｕ（图６）
。Ｍ，低分子质量蛋白质Ｍａｒｋｅｒ；１，未纯化的ｐＥＴ２８ａ－ＰＲＶ ｇＢ蛋白；２，纯化后的ｐＥＴ２８ａ－ＰＲＶ ｇ
Ｂ蛋白Ｍ，Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ；１，ｐＥＴ２８ａ－ＰＲＶ ｇＢ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；２，ｐＥＴ２８ａ－ＰＲＶ ｇＢ ｐ
ｒｏ－ｔｅｉｎ ａｆｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ图６ 重组ｐＥＴ２８ａ－ＰＲＶ ｇＢ蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析Ｆｉｇ．６ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐＥＴ２８ａ－ＰＲＶ ｇＢ ｐｒｏｔｅｉｎ２．４ ＰＲＶ阳性血清筛选
利用市售的ＰＲＶ检测试剂盒对采集到的猪Ｐ
ＲＶ血清进行检测，以血清样本中ＰＲＶ抗体浓度＞１．０ｎｇ／ｍＬ为阳性判断依据，共检测到１３份阳性血清和１６份阴性血清。
２．５ 重组ｐＥＴ２８ａ－ＰＲＶ ｇＢ蛋白活性分析以复性后的ＰＲＶ ｇ
Ｂ蛋白作为抗原包被反应板，以感染猪ＰＲＶ的阳性或阴性血清作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗猪ＩｇＧ作为二抗，建立间接ＥＬＩＳＡ方法，与试剂盒测定结果相比较，表明试剂盒检出的阳性血清均可与ｇＢ蛋白发生反应，且两个检测结果数值相近，表明用复性后的ｇＢ蛋白建立间接ＥＬＩＳＡ方法是可行的（
表１）。９
７１１
中 国 畜 牧 兽 医４４卷
表１ 两种ＥＬＩＳＡ检测结果比较
Ｔａｂｌｅ １ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｗｏ ＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄｓ
样本
Ｓａｍｐｌｅｓ
试剂盒检测结果
Ｒｅｓｕｌｔｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｋｉｔ
重组蛋白包被检测结果
Ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ
空白Ｂｌａｎｋ ０．０１４ ０．０９０阳性血清Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ １．６３７ ０．１８２１ ０．５４６ ０．６９６２ ０．７５８ ０．７１６３ ０．５６１ ０．５３７４ ０．５４８ ０．４９７５ ０．７５０ ０．７２９６ ０．５８１ ０．５４３
３ 讨 论
ＰＲＶ作为养猪业的重要疾病，不仅可以引起新生仔猪神经症状和种猪繁殖障碍，更能直接诱发猪繁殖与呼吸系统综合征，而ＰＲＶ与其他病毒在猪群中的混合感染也大大增加了猪病的防控难度。１９９９年，娄高明等［１６］报道伪狂犬病已分布在包括香港和台湾在内的２５个省（市），且暴发形势不断加剧，严重影响和制约着中国养猪行业的健康发展，因此，建立一种有效、可靠的诊断方法对于预防和控制ＰＲＶ具有非常重要的意义。
研究表明，ＰＲＶ ｇＢ蛋白能介导细胞膜与病毒囊膜的融合，促使病毒穿过；能使感染的细胞膜与未感染的细胞膜融合；能诱导免疫学反应抵抗ＰＲＶ感染。通过对ＰＲＶ ｇＢ的基因和蛋白序列进行对比发现，ＰＲＶ不同毒株ｇＢ基因序列同源性均在９８．１％以上，表明ｇＢ蛋白具有高度的保守性［１７］。本试验通过原核表达系统表达的猪ＰＲＶ ｇＢ蛋白建立的间接ＥＬＩＳＡ方法，为今后检测和诊断猪ＰＲＶ建立了先决条件，具有重要的实际意义。
应用ＰＲＶ ｇＢ蛋白建立间接ＥＬＩＳＡ检测方法，国内已有报道，包新奇等［１８］将ＰＲＶｇＢ基因在大肠杆菌中进行分段表达，其中以ｇＢ－４和ｇＢ－５建立的间接ＥＬＩＳＡ方法与ＩＤＥＸＸ公司的市售试剂盒符合率较高；罗飞［１９］以大肠杆菌中高效表达的ＰＲＶ重组ｇＢ蛋白为抗原建立的ＥＬＩＳＡ检测方法，在检测检测猪圆环病毒病、细小病毒病、猪瘟、猪日本脑炎和猪繁殖与呼吸综合征等阳性血清时结果均为阴性，具有高度的特异性，批间、批内重复性试验结果变异系数均小于８％。与ＩＤＥＸＸ试剂盒相比，其敏感性和特异性分别为７５．０％和８０．７％，符合率为７９．０％。
本试验建立的间接ＥＬＩＳＡ方法与市售试剂盒相比，还存在着一些问题，如样本血清Ｄ值整体偏大、阳性血清Ｄ值偏小等，表明用ＰＲＶ ｇＢ蛋白作为抗原包被建立的间接ＥＬＩＳＡ方法条件还有待摸索。相信随着技术的发展，猪ＰＲＶ ＥＬＩＳＡ检测的敏感性和特异性会更好，同时准确性更好，操作更加简便［２０］。
４ 结 论
本试验成功表达并纯化得到ＰＲＶ ｇＢ蛋白，大小为３０ｋｕ，且具有良好的反应原性，可初步建立以ＰＲＶ ｇＢ蛋白为抗原包被的ＰＲＶ抗体ＥＬＩＳＡ检测方法。
参考文献：
［１］ 佘永建．猪伪狂犬病［Ｊ］．畜牧与兽医，１９８７，１：２９－３３．［２］ 刘显煜．猪伪狂犬病的临床症状及控制对策［Ｊ］．中国兽医杂志，２００３，３９（１）：２５－２６．
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ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ’ｓｉｎｇｌｅ ｒｅａｃｔｏｒ’ｐｉｇ［Ｊ］．Ｖｅｔ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９７，５５（１－３）：３７－４７．
［４］ Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ Ｔ Ｃ．Ａｕｊｅｓｚｋｙ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ）ｖｉｒｕｓ：Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ－ｓｔａｔｅ ｏｆ
ｔｈｅ ａｒｔ Ｊｕｎｅ １９９９［Ｊ］．Ｖｅｔ Ｒｅｓ，２０００，３１（１）：９９－１１５．［５］ 王淑杰，蔡雪辉，刘永刚，等．伪狂犬病病毒ｇＥ基因的表达及ｇＥ蛋白单克隆抗体的制备［Ｊ］．中国兽医科
学，２００７，３７（８）：６７９－６８３．
［６］ Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ Ｔ Ｃ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ（Ａｕｊｅｓｚｋｙ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｉ－
ｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，１９９１，１４（２）：１５１－１６３．
［７］ Ｈｏｎｇ Ｗ Ｚ，Ｘｉａｏ Ｓ Ｂ，Ｚｈｏｕ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄｂｙ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｏｆ
０８１１
４期贾 刚等：猪伪狂犬病病毒ｇＢ蛋白表达及免疫原性分析
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（责任编辑 秦 彤）
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详解某猪场猪伪狂犬的病例治疗过程及其预防措施 近几年来，伪狂犬发病已无明显季节性，发病率升高，已成为除蓝耳病以外危害母猪繁殖性能的第二大传染病。该病引起母猪繁殖障碍易被临床诊断忽略，延误治疗，严重影响猪场的经济效益。因此，做好伪狂犬病的诊断与防治对提高猪场母猪生产性能和仔猪成活率来说意义重大。现兽医师根据其临床病例和查阅诸多资料后整理出以下关于猪伪狂犬病的诊断要点和防治措施，希望能为广大养殖户提供参考。 1. 临床诊断要点： 母猪：临床症状不明显。主要引起引起母猪顽固性不发情，母猪流产。伪狂犬病引起的流产在母猪妊娠各期均会发生，但以妊娠前期和妊娠中期最易发，且多为木乃伊胎和死胎。 仔猪：主要危害3-7日龄新生仔猪，可谓“九死一生”。病猪多呈现出体温升高，出现神经症状，如头后仰、口吐沫、四肢泳动。四肢软而无力，多见于后肢，眼睑肿大，拉黄色稀粪（用抗生素类药物无效）。 保育猪：少数发生，死亡率低。主要表现的神经症状，猪歪头。 2. 剖检病变： 发病仔猪的解剖病理变化有：肝、脾出现黄白色针尖大小的坏死点；脑膜出血；肾脏点状出血；扁桃体出血坏死。注意和猪瘟的鉴别诊断：猪瘟表现为新生仔猪肾脏不仅有点状出血，且肾脏凹凸不平；扁桃体大面积的出血坏死。 3 治疗与预防： 根据新联大实施的猪场伪狂犬净化系统方案，结合临床实际应用效果开出以下治疗和预防方案： (1) 2000斤饲料添加： 倍能佳或食达旺 1袋 氟奇康泰 2袋 替妙 6袋连用7天 清热散 1袋 <联毒克 3袋如果采食量下降请酌情添加，如有病毒感染请添加> (2) 使用疫苗对伪狂犬病进行防控： 免疫接种：
●后备猪应在配种前实施至少2次伪狂犬疫苗的免疫接种，2次均可使用基因 缺失弱毒苗。 ●经产母猪应根据本场感染程度在怀孕后期（产前20-40天或配种后75-95天） 实行1-2次免疫。母猪免疫使用灭活苗或基因缺失弱毒苗均可，2次免疫中至少有1次使用基因缺失弱毒苗，产前20-40天实行2次免疫的妊娠母猪，第一次使用基因缺失弱毒苗，第二次使用蜂胶灭活苗较为稳妥。 ●哺乳仔猪免疫根据本场猪群感染情况而定。本场未发生过或周围也未发生过 伪狂犬疫情的猪群，可在30天以后免疫1头份灭活苗；若本场或周围发生过疫情的猪群应在19日龄或23-25日龄接种基因缺失弱毒苗1头份；频繁发生的猪群应在仔猪3日龄用基因缺失弱毒苗滴鼻。 ●疫区或疫情严重的猪场：保育和育肥猪群应在首免3周后加强免疫1次。
实验三伪狂犬病的诊断 一．实验目的： ⒈熟悉伪狂犬病的临诊特点。 ⒉熟悉伪狂犬病的诊断方法。 二．实验原理： 利用分离的伪狂犬病毒注射实验兔，病毒在动物机体繁殖一段时间后，会影响实验动物的神经系统，实验兔会出现强烈的痒觉，根据这些症状来判断是否含有伪狂犬病毒。 三．内容及方法 1. 伪狂犬病的临床特点 本病发生于牛、绵羊，犬、猫、鼠及猪。野生动物亦可发生。牛、绵羊、犬及猫感染本病后症状很特殊而明显。主要表现为某部皮肤的强烈痒觉。常使劲地于墙柱上摩擦，直到皮肤撕碎，仍不断摩擦，病畜像疯狂一样，用力制止亦无效果。体温可达40℃以上。常发病后48小时内死亡。成猪一般为隐性感染，怀孕母猪可发生流产、死胎、木乃伊胎儿。仔猪，尤于新生仔猪病情极严重，常可发生大批死亡。主要侵害神经系统，表现为神经症状。 2. 实验室诊断 2.1 病料的采集与处理 分离病毒的材料于发热期最好采取中脑、桥脑及延脑，或采取病总部之水肿液、侵入部神经干及脊髓。病料用培养液制成1:10组织悬浮液。 2.2 兔体接种试验上述悬液经2000r/min离心1Omin，取上清液1~2ml经腹侧皮下或肌肉接种家兔，通常在36-48h后注射部位出现剧痒，病兔啃咬注射部位皮肤，皮肤脱毛、破皮和出血，继之四肢麻痹，体温下降，卧地不起，最后角弓反张，抽搐死亡。但这种症状只维持几小时，一般常于夜间死亡，可见死兔口内有接种部位咬下的被毛。亦可脑内接种小鼠，症状可维持12小时，但其敏感性不如兔。亦可用细胞培养来分离病毒。许多种哺乳动物细胞均能繁殖本病毒，但最常用的是猪肾传代细胞。 2.3 兔、猪及牛肾原代细胞培养。病料接种细胞后最早经18小时出现病变(病毒量大)，一般经48小时，病毒量很低时要到96小时。其典型的病变是出现巨细
详解猪伪狂犬的病理过程及其防治 核心提示：本文详细阐述猪伪狂犬病的临床表现、发病过程及诊断要点。 猪伪狂犬病病（PPV）是由疱疹病毒属的伪狂犬病毒引起的疾病。在猪群中该病毒能够通过妊娠从上一代传递到下一代的垂直传播，还能够通过猪只之间互相接吻以及蚊蝇叮咬而水平传播，属于乙型传播疫病。主要经呼吸道传播，病毒感染后首先在鼻咽部、扁桃体中增殖，再经神经侵袭脑、脊髓的同时，也可由鼻腔粘膜经呼吸道侵入肺泡。这是临床初生仔猪无其他明显症状，但若发生抽搐后迅速死亡的主要原因。 一、临床表现 感染早期体重25kg以上的商品猪，病毒侵袭导致猪的肝脏的胆汁分泌机能亢进，突然增多的大量胆汁刺激十二指肠和幽门壶腹部，病猪表现胃肠痉挛和粪便发黑，阵发性腹痛，频频排粪，采食量下降；体温39-41℃。进入4-10天的感染中期，由于十二指肠和幽门壶腹的持续痉挛，幽门突红肿，溃疡，形成胆汁排泄障碍和向胃部的逆流；同时，由于持续增值的病毒对外周淋巴的侵袭引起的全身发热，水排泄的增强，继发胆汁粘稠，胆囊内壁充血、出血和胆囊壁增厚等炎症变化。与此同时，大量胆汁进入胃部，打破胃内容物的酸碱平衡，使pH值上升，直接引发病猪发生呕吐。pH值偏高的胃液长时间的浸润，一方面使得胃神经反射机能麻痹，呕吐很快停止，病猪出现采食量下降，这是饲养密度过大或观察不及时，个体发病后不易被发现的主要原因；另一方面，贴近胃壁的高pH值胃液直接损伤胃底粘膜，引起胃底充血、出血和穿孔、胃痛，形成病猪有食欲，但采食量下降或呈间断性采食（即添加饲料时猪反映明显，但采食数口后停顿下来，稍后继续采食，并再次发生采食停顿）、粪便发黑的现象。到了10-15天（部分单一性病例可达20天）的感染中后期，由于胃底损伤严重，病猪采食量下降至正常采食量的1/5-1/8，甚至
猪伪狂犬病的预防与用药 -----本文由深圳安多福整理 最近，河南的一养殖户，使用成都天邦的疫苗，却死了3000多头母猪。是成都天邦的伪狂犬疫苗有问题,还是母猪已经感染了强毒或是母猪在注射后被蓝耳病和其他病致死的？相信不久，真相就会揭晓。 那么猪伪狂犬是怎么样的一种病，发病有哪些症状，怎么样去预防和治疗呢？ （一）综述 猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起家畜和野生动物的一种急性传染病。特征为成年猪呈隐性感染或有上呼吸道卡他性症状；妊娠母猪发生流产死胎；哺乳仔猪出现脑脊髓炎（神经症状）和败血症状（发热），最后死亡。没有明显的季节性，但以寒冷的冬季发病较多。 本病主要通过与病猪和带毒猪接触，经呼吸道、消化道、损伤的皮肤感染，也可通过配种、哺乳感染，妊娠母猪感染后，可感染胎儿。（二）症状 本病潜伏期3～11天。临床症状随猪年龄不同而有很大差异。妊娠母猪常发生流产，产出的弱胎通常在3～4天死亡，流产率可达50%；适龄母猪表现为不育症，返情率高，但屡配不孕。成年猪一般为隐性感染，即使有症状也是轻微的，只表现为一般性发热，精神沉郁，有的有呕吐、咳嗽、一般4～8天恢复；可引起新生仔猪大量死
亡，主要表现为刚生下的仔猪第一天无异常，常从第二天开始发病，3～5天内达到死亡高峰，表现明显的神经症状，病猪昏睡、鸣叫、呕吐、拉稀、流涎、发抖、痉挛，有时不自主地前冲、后退或转圈运动；随着病情的发展，发现四肢麻痹，倒地侧卧，头向后仰，四肢乱动或划水样运动，最后昏迷死亡；可引起断奶仔猪发病死亡，发病率在20%～40%，死亡率在40%～60%，主要症状表现为神经症状，拉稀，呕吐等。 （三）病理变化 剖检主要表现为脑膜充血，水肿、出血，脑脊液增多，淋巴结肿大，胃肠黏膜可见卡他性炎症，胃底部有明显出血区，上呼吸道黏膜及扁桃体出血，水肿，并有纤维素性坏死性伪膜覆盖。有的肾脏布满针尖样出血点，有的出现肺水肿。肝肾有特征性坏死灶，中央灰白色，外周有红色晕圈，具有诊断意义。流产胎儿的肝、脾及胎盘绒毛膜有凝固性坏死。 （四）防治 1、种猪每6个月背颈皮下注射伪狂犬病基因缺失油佐剂苗3毫升，母猪在产前1个月左右加强免疫一次；种用仔猪28～35日龄注射一次1.5毫升，4～6周重复注射一次，育肥仔猪30日龄注射1.5毫升。 2、严格执行消毒措施。猪舍地面、墙壁、设施及用具等每周定期消毒1次，粪便放发酵地或沼气池处理。发生疫情时则2～3天消毒1次，消毒液可用安多福万金水按1：500稀释。
十一、伪狂犬病检测方法 伪狂犬病病毒分离鉴定 1 材料准备 DMEM培养基、BHK-21细胞、新生犊牛血清、青霉素、链霉素溶液、0.22ul 微孔滤膜、细胞培养瓶、CO2培养箱、倒置显微镜。溶液配制见附录A(标准的附录) 2 操作步骤 2.1病料的采集对于刚死亡或活体送检并处死的动物，无菌采取肝、脾、肺、肾及其脑组织，尤其是三叉神经节、嗅球，4℃送实验室检测。 2.2样品处理待检组织在灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃砂研磨，用灭菌生理盐水或DME培养基制成1：5乳剂，—70℃反复冻融后，经3000rpm离心30分钟后，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，加入青链霉素溶液至最终浓度为100U/mL，—70℃保存作为接种材料。 2.3 病料接种将病料滤液接种已长成单层的BHK-21细胞，接种量为培养基量的10%，37℃恒温箱中吸附1小时后，加入含10%新生犊牛血清（经过56℃水浴灭活30分钟，过滤除菌，无支原体）的DMEM培养基，置37℃温箱中培养。 2.4观察结果接种后24—48小时，BHK-21细胞应出现典型的细胞病变效应（Cyto pathogenic effect, CPE），表现为细胞变圆，脱落。如第一次接种不出现CPE，应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无CPE，则判为伪狂犬病病毒阴性。 2.5病毒的鉴定将出现CPE的细胞培养物反复冻融后，用聚合酶链式反应、荧光抗体试验等两种方法中任一方法作进一步鉴定。 伪狂犬病聚合酶链式反应 1 材料准备:待检组织、组织匀浆器、蛋白酶K，十二烷基磺酸钠（SDS），苯酚、氯仿，异戊醇（分析纯）、TEN缓冲液。溶液配制见附录C(标准的附录) 引物：扩增伪狂犬病病毒基因中434—651bp之间217bp基因片段，由上海生物工程公司合成。 序列为，上游引物P1：5’-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3’， 下游引物P2：5’-GTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3 仪器设备有：凝胶电泳紫外线检测仪，PCR扩增仪，电泳仪 2操作步骤： 2．1 样品的采集：对于病死或扑杀动物，取脑组织；对于待检活猪，用已灭菌的棉签，伸入猪鼻腔中，采取鼻粘液，即为鼻拭子，冷藏条件送实验室检测。2.2样品处理所采病料经组织研磨器充分研磨，按1:5用TEN缓冲液悬浮收集于离心管内，-70℃反复冻融3次，7000r/min离心5min，如样品为鼻试子，则加入2ml TEN缓冲液，充分挤压，取出棉签，7000rpm，离心5分钟，取上清液。取上清液472.5μl,加入25μl 10％SDS和2.5μl的20mg/ml 蛋白酶K，50℃水浴摇床上放置2h后加入等量的饱和酚500μl，涡旋20s。离心取上清液，加等量的酚：氯仿：异戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：异戍醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20μl双蒸水溶解，-20℃贮存备用。
猪伪狂犬病的防控措施 从卫生防疫、PR检疫、PR免疫、生产管理、猪场建设、药物使用等方面制定了“PR 防控措施”。提出:建立健全猪场的生物安全性体系;对不同类型的猪场、不同类型猪定期按比例检疫，引种实行PR检疫隔离;规范PR的免疫制度。当PR阳性率高于10%时，实行密集免疫策略;当PR阳性率少于10%时，实行检疫掏汰策略。落实各项生产管理制度，科学用药，采取综合防控措施。 1 PR的防控措施 1.1 PR防控的总则 1.1.1建立健全猪场的生物安全性体系。做好猪只、人员、栏舍、车辆、环境的卫生消毒工作，建立健康的种群，加强兽医管理，改善猪只生长环境，保证营养充足。 1.1.2强化PR检疫隔离制度。不同类型的猪场根据不同类型的猪，定期按比例抽血检测PR 野毒抗体。引种必须经过隔离检疫。 1.1.3规范PR的免疫制度。当PR阳性率高于10%时，实行密集免疫策略;当PR阳性率少于10%时，实行检疫一淘汰策略。 1.1.4落实各项生产管理制度，采取综合防控措施。 1.1.5科学用药，减少猪群的混合感染、继发感染，降低并发症。 1.2 PR防控的具体措施 1.2.1卫生防疫制度 要求猪场所有工作人员在思想上树立起卫生防疫的观念，把卫生防疫工作放在首要位置，自觉地在生产各个环节认真贯彻执行该制度的各项条例。此项工作由猪场兽医负责执行并检查监督，实施绩效与相关工作人员的酬劳挂钩。 1.2.1.1车辆、人员进出场的消毒制度。猪场大门消毒池、更衣室设消毒池、各猪舍出入门口消毒池，要经常保持有消毒液，每个星期更换一次，换药要有记录，并有专人检查。所有进出车辆一律清洗消毒，进出人员脚踏消毒。 1.2.1.2猪场人员净化制度。在猪场生产区工作的人员，凡休假后上班的前3天为净化期，不能进入猪场生产区，安排在非生产区从事其它工作，满3天后才能消毒进入生产区。 1.2.1.3进入猪场生产区的消毒更衣制度。饲养员、饲料运送员、管理人员，进入生产区前一律要在更衣室淋浴、更换消毒过的衣帽、胶鞋，清洗消毒双手，任何人不得违反，被批准进入生产区的外来人员需要在非生产区净化3天，才能消毒进入生产区。 1.2.1.4猪舍猪体的卫生消毒制度。猪舍地面及渠道每天清扫冲洗2次，天花板不能有蜘蛛网，猪舍周围环境每周清理一次，饲料间每用完一批饲料清理一次。夏天每天冲洗猪身1～2次，每月用复合酚消毒猪身一次(哺乳及妊娠后期的母猪除外)。栏舍每周消毒1～2次，栏舍周围环境每月用生石灰消毒1次。每次消毒都要有记录。 1.2.1.5母猪分娩的卫生及护理制度。密切注意观察母猪的分娩时间，做好接产前的准备工作，接产的工具和器械要经消毒，整个分娩过程要有专人护理。仔猪产后24个小时内一律剪脐、剪牙，并用碘酒消毒。仔猪产后3天内注射含铁补血剂，并编耳号。分娩过程中的胎衣及排泄物及时清理，作无害化外理。 1.2.1.6引种隔离制度。从非疫区引进的种猪实行隔离饲养，观察45天，经检疫合格才准进入生产区，隔离期间负责的专人不准进入生产区。 1.2.1.7疫情紧急应对制度。发现疫情要按“早、快、严、小”的原则、及时扑杀发病猪，对死猪进行无害化处理;在场内建立隔离区，暂时封锁，严格消毒，积极治疗，并有专人负责;对易感猪群紧预防接种;确认最后一头病猪痊愈或不存在后，经14天观察不再出现新病猪时，经彻底消毒，才能解除封锁，隔离区三个月内不准猪只出场。
猪伪狂犬病的防治 猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的一种以发热、脑脊髓炎为主要症状的急性、热性传染病。该病一旦在猪群中出现，会很快经呼吸道、消化道传染给其它猪只和临近猪场，特别是在集约化养猪场。本病主要引起种猪不育、妊娠母猪流产，产死胎或胎儿干尸化，初生仔猪和断奶仔猪大量死亡，育肥猪增重缓慢，该病已成为危害养猪业最严重的传染病之一。 一、病原 伪狂犬病病毒属于疱疹病毒科疱疹病毒亚科的猪疱疹病毒I型，可感染家畜和多种野生动物，除猪以外的其它动物发病后通常呈现发热、奇痒及脑脊髓炎等典型症状，致死率极高。二、传播途径和流行特点 传染源猪是伪狂犬病病毒的贮存宿主和传染源，病猪和带毒猪是本病的传染源。带毒鼠类、猫、狗也是重要传播媒介。病毒主要随病猪的分泌物(鼻汁、唾液、尿和乳汁等)排出，污染饲料、饮水、垫草及栅栏等周围环境，或通过精液而传给健康猪。另外，病毒常存在于胴体中，易通过肉食动物传播。 传播途径健康猪与病猪或带毒猪，均能通过直接或间接接触发生感染，引起带毒种猪疫情扩散蔓延是传播本病的主要原因。空气传播是病毒扩散的最主要途径。其他易感动物主要由吃食病畜尸体及病畜污染的饲料经消化道感染。本病还可以经呼吸道黏膜、皮肤伤口以及配种等而发生感染。 易感动物除猪外，牛、羊、马、犬、猫等多种动物以及许多野生动物外，肉食动物和野生啮齿类动物也易感 流行特点本病无明显季节性，一年四季均可以发病，多发生在寒冷季节。2周龄内仔猪发病率和死亡率几乎达到100%，成年猪和母猪常常继发细菌或病毒感染，加重病程，增加死亡率。 三、症状 本病潜伏期3～11天。临床症状随猪年龄不同而有很大差异。妊娠母猪常发生流产，产出的弱胎通常在3～4天死亡，流产率可达50%；适龄母猪表现为不育症，返情率高，但屡配不孕。成年猪一般为隐性感染，即使有症状也是轻微的，只表现为一般性发热，精神沉郁，有的有呕吐、咳嗽、一般4～8天恢复；可引起新生仔猪大量死亡，主要表现为刚生下的仔猪第一天无异常，常从第二天开始发病，3～5天内达到死亡高峰，表现明显的神经症状，
猪伪狂犬病病毒主要功能蛋白基因序列分析 摘要：根据Genbank中已发表的猪伪狂犬病病毒（PRV）gE、TK基因的序列各设计了1对引物，对分离得到的PRV毒株的gE、gG、TK基因进行了PCR扩增、回收、克隆、测序，测序结果与预期的PRV gE、gG、TK基因片段相符。遗传进化树分析和氨基酸序列比对结果发现PRV毒株的gE、gG、TK氨基酸序列发生变化的位点与2012年国内分离到的PRV 流行株相同，从而推测该毒株为PRV变异毒株。 关键词：伪狂犬病毒；gE基因；TK基因；序列分析 猪伪狂犬（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病毒（Peudorabies virus，PRV）引起的以家畜和多种野生动物发热、奇痒及脑脊髓炎为特征的急性传染病[1]。该病在我国发生较为严重，是严重危害我国养猪业的疫病之一。我国目前广泛应用的是自然缺失弱毒活疫苗Bartha-k61株，使猪伪狂犬病得到了很好的控制。但是，2011年底至2012年该病在中国东北部分省份流行，甚至在许多使用基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场出现了猪伪狂犬病疫情，给中国的养猪业造成了巨大的经济损失[2-6]。 伪狂犬病病毒(猪疱疹病毒1型)属于双股线性DNA病毒，大小约150kb，DNA基因组中G+C的含量高达73%，可编码100种蛋白质。基因组由独特的长节段(UL)、独特的短节段(US)、内部倒转重复序列(IRs)和末端倒转重复序列(TRs)组成。在病毒的结构蛋白中，gE糖蛋白是主要毒力因子之一，并作为标志基因用来区分疫苗免疫和野毒感染。TK基因不仅是最主要的毒力基因，而且也是决定病毒持续感染的重要因素[7]。一旦TK基因缺失，PＲV变异株对宿主的毒力将丧失或明显降低。 2013年至2014年上海市农业科学院畜牧兽医研究所繁殖障碍研究室从山西某免疫猪伪狂犬病（Bartha）疫苗的规模化猪场成功分离并鉴定出四株PRV，命名为SX1，SX2，SX3，SX4株，为明确该四株分离株是否属于PRV抗原变异毒株，本研究对PRV SX株的gE、gG、TK全基因进行克隆和测序，通过与国内外其他已公布PRV分离株的gE、gG、TK推导的氨基酸序列进行比对，构建核苷酸序列遗传进化树，以期为丰富PRV分子流行病学和开发科学有效的新型猪伪狂犬病疫苗提供重要科学依据。
猪伪狂犬病的治疗方法与防治要点 猪是本病毒最重要的贮存宿主和传染来源，猪感染后的症状因日龄而异，种猪主要表现为繁殖障碍，并且对养猪业的损失最大。下面我们了解一下猪伪狂犬病的治疗方法与诊断要点。 猪伪狂犬病的诊断 (1)初步诊断：新生仔猪及4周龄内仔猪常突然发病，高烧达41℃以上，间有呕吐、腹泻及神经症状，出现运动失调，兴奋不安，身体各部分肌肉痉挛，随后麻痹死亡，病程1-2天，死亡率很高。4周龄左右的猪发病后只有轻微症状，有轻热、呼吸困难，时有出现腹泻和呕吐，几天内可完全康复，但也有部分猪出现神经症状后死亡。妊娠母猪常发生流产、死胎或木乃伊胎，流产发生率约占50%。成年猪一般隐性感染，有时有轻度呼吸系统症状，不吃、呕吐、委顿等。由于猪的病症复杂，若出现以上症状怀疑是伪狂犬病时，应进一步进行实验室诊断。 (2)实验室诊断：采用猪扁桃体、咽喉黏膜、脑、延脑、小脑和海马角等，检查细胞中有无核内包涵体。将病料接种家兔，2-3天后注射的局部出现奇痒及全身症状，常在奇痒出现后1-2天转为麻痹而死亡。 (3)血清学诊断：可用直接免疫荧光法检查脑、扁桃体的压片或冰冻切片，发现核内包涵体出现荧光，有诊断价值。检查血清抗体可采用中和试验、间接血凝抑制试验、琼脂扩散试验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验等，其中血清中和试验较为敏感、准确。
猪伪狂犬病的治疗方法 本病目前无特效治疗药物，对感染发病猪可注射猪伪狂犬病高免血清，对断奶仔猪有明显效果，同时应用黄芪多糖中药制剂配合治疗。发病后对猪舍立即采取封锁、隔离、严格消毒等措施，同时对受威胁猪进行紧急免疫接种。 猪伪狂犬病的预防要点 (1)主要采取综合性防治措施，鉴于猪是本病毒的重要保存者，引进种猪时应注意在当地做好认真的检疫工作，进入猪场前要隔离观察，防止带人病源。 (2)消火饲养场的鼠类对本病的预防有重要意义。 (3)发生本病的猪场，应将病猪隔离扑杀，对场内的易感猪进行紧急预防接种，畜舍及用具每隔5-6天消毒一次，做好粪便的发酵处理工作。 (4)免疫预防是防治本病的主要手段，目前可用于猪伪狂犬病预防的疫苗有3种，灭活苗效果好一些。 (5)在母猪临产前20-30天，免疫母猪后可提高小猪母源抗体水平，使小猪母源抗体持续时间较长，但也可干扰小猪对直接免疫产生免疫抗体。免疫本病的重点加强对小猪的免疫。 (6)免疫程序，使用弱毒苗或灭活苗免疫，一般小猪6-14周龄首免，4-6周后二免，免疫力期可达5-6个月。 (7)对发病严重的猪，因本病没有特效药，只能采取针对性对症治疗，防止继发感染的治疗方法。
猪伪狂犬病净化方案 （见农业部《伪狂犬病防治技术规范》） 我国种猪场伪狂犬病净化方案内容由6个不同阶段组成，即：调查阶段、强化免疫控制、检疫淘汰、全部或部分清群、监测认证阶段和维持阶段。种猪场根据本场实际情况，分阶段逐步实施。 一、材料准备 疫苗：使用国家批准的基因缺失疫苗。 抗体检测试剂盒：检测伪狂犬病全病毒抗体或gB抗体试剂盒、区分免疫猪和感染猪的抗体鉴别检测试剂盒。试剂盒必须获得国家相关批准文号。 待净化猪群的确定：应选择健康、生产成绩稳定的种猪群开展伪狂犬病的净化。在初次开展本病净化的大型种猪场中，可先选定500-1000头母猪群开展净化，逐步推进。 二、净化方案 1、调查阶段 如果种猪群母猪大于500头，按照种母猪群数量的10%、种公猪全群采血。分离血清，用gE-ELISA检测，根据野毒抗体阳性率高低，确定种猪群（种母猪和种公猪）伪狂犬病野毒感染状态。如果母猪数量小于500头，可一次采集全部种猪的样品，检测gE抗体，根据检测结果，确定进入何种净化阶段。 1.1如果所抽检样品全部为gE抗体阴性，则种猪群全群逐头检测，如所有血清样品均为阴性，可确认种猪群为伪狂犬病野毒抗体阴性，直接进入“监测与认证”阶段； 1.2如果血清样品的gE抗体阳性率低于10%，可进入“检测淘汰”—“监测与认证维持”的净化方案； 1.3如果gE抗体阳性率在10%-20%，可实行“强化免疫控制”—“检测淘汰”—“监测与认证维持”的净化方案； 1.4如果gE抗体阳性率大于30%，则实行“全群或部分清群”措施，暂不考
虑实施净化； 1.5在全部种猪群gE抗体阴性时，可直接进入“监测与认证维持”阶段。 2.强化免疫控制阶段 使用伪狂犬病gE基因缺失疫苗免疫该猪群，同时采取生物安全和灭鼠等综合措施，达到控制的目的。 2.1免疫程序的制定 2.1.1种母猪（种公猪） 每年普免3-4次。或者母猪配种前和产前4周分别免疫一次。普免时，避免在分娩前7天内接种疫苗，以减少接种应激对分娩的影响，但可于母猪分娩后补免。 公猪每年3次免疫，采用集中普免的方式。 2.1.2仔猪 分别测定仔猪在50日龄、60日龄和70日龄时的伪狂犬病抗体（gB抗体或全病毒抗体），每个阶段抽样30份，样品来自10窝猪，每窝3头，确保采样的均衡性。根据抗体水平确定仔猪的免疫日龄。猪场可根据产房小猪和保育猪是否出现伪狂犬病(如腹泻、神经症状等)，使用出生猪滴鼻免疫的方式，克服母源抗体干扰，并以提高局部的黏膜免疫力。 2.2实验室评估 仔猪免疫后3周，检测30份血清gB或全病毒抗体和gE抗体。当gE抗体阴性时，如果85%的样品为gB抗体或全病毒抗体阳性，即可认为群体免疫合格。 2.3 临床评估 主要考察猪群的生长成绩。母猪无繁殖障碍，哺乳仔猪无尖叫、腹泻和转圈，最后死亡等现象；保育猪无神经症状，育肥猪无伪狂犬病病毒引起的呼吸道症状。 2.4配套的生物安全措施 2.4.1如需引种，只能引进伪狂犬病gE抗体阴性的后备种猪； 2.4.2对进出猪场的车辆和外来人员进行消毒； 2.4.3无害化处理病死猪和流产死胎等； 2.4.4定期灭鼠。 3、检测淘汰阶段
猪伪狂犬病的流行现状及防控措施 伪狂犬病（pseudorabies，pr又名aujeszky's disease，ad）是当前我国猪场最常见的传染病之一，给养猪业造成严重的经济损失。伪狂犬病是由猪疱疹病毒i型所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动物的一种以发热、奇痒（猪外除）及脑脊髓炎为主症的一种急性传染病。本病是典型的自然免疫性疾病，猪是该病最主要的储存宿主和传染源。据报道，全世界已有40多个国家和地区发生过该病的流行。 由于伪狂犬病疫苗成熟及其病原本省的特点，曾经许多养猪企业都将猪伪狂犬病的净化列入了短期目标，并实现了这个目标。但2011年以来，猪群的无序流动以及疫苗等多方面的原因，猪场伪狂犬病野毒感染率逐年升高。全国相当部分的阴性猪场一夜之间转阳，严重的甚至出现母猪流产、仔猪神经症状并死亡等典型伪狂犬症状，持续数月不能恢复。本文就伪狂犬病在猪场中的流行现状及防控措施进行简要论述。 1 伪狂犬病的流行情况 1.1 2011年前的流行情况 2011年之前全国不同区域都有伪狂犬病的发生，但是主要以散养户和小型养殖场发病为主，主要原因可能是发病猪场伪狂犬免疫不规范、引种来源复杂等。 1.2 2011年至今的流行发病情况 2011年至今伪狂犬的流行区域不断扩大，暴发不再局限于散养户和小型养殖场，大型养殖场也有发生，且表现典型的临床病症。 1.3临床表现 一是母猪流产，母猪群因为狂犬病流产的比例大约为5%。 二是10日龄内死哺乳仔猪淘率高，达15%或更高，主要表现毛松打堆，高烧，部分猪死亡前有神经症状。而初生3～4 d的仔猪，有时整窝死亡，损失很大。 三是中大猪呼吸道问题严重，临床表现为咳嗽、喘气等。常见并发传染性胸膜肺炎，导致急性死亡。 1.4 共同的病变特征 通过剖检发现，他们共同的病变特征就是扁桃体的白色坏死点。伪狂犬是疱疹病毒，疱疹病毒的特点就是对组织细胞的致死性，它引起的病变主要是脏器（扁桃体、肝、脾、肾等）的白色坏死点为主。 2 伪狂犬流行原因的探讨 2.1 毒力变异 首先免疫原性基因和独立基因的变化，使原有疫苗免疫保护力下降，其次疫苗保护时间缩短，长期超剂量免疫，免疫频繁，免疫压力造成毒株变异。 2.2 腹泻可能是伪狂犬病重新流行的原因之一 首先，腹泻导致整个猪群的免疫抑制，影响了伪狂犬疫苗的正常免疫效果，使其免疫保护周期变短，容易出现免疫空白期。其次，很多猪场因为腹泻做返饲或自家苗，如果过程处理不当，极易导致伪狂犬病毒扩散。 2.3 免疫不合理及疫病关注点下降 有两种常见的情况：一是不停的更换不同毒株的疫苗；二是不免疫仔猪和肉猪，只免疫母猪。这都是免疫不科学、免疫意识松懈、免疫程序不合理所导致的。 2.4猪场中猪群带毒 种猪带毒率偏高是伪狂犬病持续流行的重要原因。引用公猪精液、相互引种，都会传播本病。 3 伪狂犬病的总体防控措施 3.1坚持自繁自养
伪狂犬病活疫苗 （Bartha-K61株）生产工艺规程编制人：年月日 审核人：年月日 批准人：年月日 目录 一、目的：伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）生产工艺规程的方法和程序。 二、适用范围：适用于伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的生产的全过程 三、依据：《伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及检验试行 规程》 四、责任者：生产车间、质管部。 五、正文： Ⅰ工艺流程及质量控制要点 Ⅱ操作细则 1、制苗材料的制备 2、生产用种毒的制备 3、半成品的配制 4、配苗 5、疫苗的分装 6、疫苗的冻干 7、轧盖贴标 8、包装 Ⅲ成品检验 Ⅳ工艺卫生与人员卫生 Ⅴ生产设备一览表 Ⅵ包装机检查方法 Ⅶ物料平衡 Ⅷ劳动定员及劳动保护 吉林和元生物工程有限公司GMP管理文件
一、目的：规定制造伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的方法和程序。 二、适用范围：适用于伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的生产的全过程 三、依据：《伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及检验试行规程》 四、责任者：生产车间、质管部。 五、正文： I 工艺流程及质量控制要点
伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）质量控制要点 II 操作细则 本品系用伪狂犬病病毒弱毒株接种于鸡胚成纤维细胞收获感染病毒液，加适宜稳定剂，经冷冻干燥制成，用于预防猪、牛及绵羊伪狂犬病。
1 制苗材料的制备 条件准备 根据细胞制备所需物品及设备条件，进行全面准备。 按使用时间，提前做好灭菌工作后将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。 在工作开始前30～40min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。 操作规则 细胞的制备 发育良好的9～10日龄SPF鸡胚。 选择9～10日龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酒棉消毒蛋壳气室部位，无菌取出鸡胚，去头、四肢和内脏，放入灭菌的玻璃器皿中，用汉克氏液洗涤胚体，用灭菌剪刀剪成米粒大小的组织块，再用汉克氏液洗涤2～3次，然后加%胰酶溶液（每胚4ml），～℃消化20～30分钟，吸出胰酶溶液，用汉克氏液洗涤2～3次再加入适量的营养液（用含5%～10%犊牛血清乳汉液，加适宜的抗生素适量）吹打，用4～6层纱布过滤，制成每1ml 含活细胞数约100～150万的细胞悬液，分装于培养瓶中进行培养，形成单层后备用。 细胞培养物应无细菌、霉菌（见《无菌（纯粹）检验标准操作规程》）和支原体（见《支原体检验标准操作规程》）污染，无特异性病变。 将细胞冻融液接种Marc-145细胞，应不出现任何病变（见《外源病毒检测标准操作规程》）。 清场和记录 工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。 全面填写《生产工序记录》。 2 生产用毒种的制备 条件准备 根据毒种制备所需物料及设备条件，进行全面准备。 按使用时间，将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。 在工作开始前30～40min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。 操作规则
国内伪狂犬病的流行现状和危害 核心提示： 伪狂犬病（Pseudorabies）是当前我国猪场一种非常重要的病毒性疾病，给感染猪场造成严重的经济损失，引起种猪繁殖障碍、新生仔猪神经症状及高 死亡率，同时也是猪呼吸系统疾病综合征（PRDC）的重要原发性病原，伪狂犬 病与蓝耳病和猪瘟等病毒性感染在猪群的持续存在也是猪病复杂的重要原因，同时给我国养猪业造成严重的损失，对种猪场，除了经济损失外，伪狂犬野毒 阳性对于品牌和贸易同样带来较大的负面影响，严重影响猪肉出口和种猪的销售。 伪狂犬病（Pseudorabies）是当前我国猪场一种非常重要的病毒性疾病，给感染猪场造成严重的经济损失，引起种猪繁殖障碍、新生仔猪神经症状及高死亡率，同时也是猪呼吸系统疾病综合征（PRDC）的重要原发性病原，伪狂犬病与蓝耳病和猪瘟等病毒性感染在猪群的持续存在也是猪病复杂的重要原因，同时给我国养猪业造成严重的损失，对种猪场，除了经济损失外，伪狂犬野毒阳性对于品牌和贸易同样带来较大的负面影响，严重影响猪肉出口和种猪的销售。 海博莱实验室近年来对我国规模猪场猪伪狂犬感染现状进行了系统的监测与分析。2006年监测中国部分省市规模化猪场伪狂犬野毒感染率的结果显示（本报告发表于《猪业科学》2007年第11期），约有超过一半的（52%）的规模猪场伪狂犬野毒阳性。样品阳性率为16.9%。全国种猪感染率为18.2%，阳性场种猪的感染率为33%。 在2007年所检测的131个规模化猪场中，81个猪场为伪狂犬野毒阳性，猪场阳性率63.4%，在7445份血清中，总样品阳性率为14.8%。2007年所检测的所有猪场3620份种猪样品中，18.2%的种猪为野毒抗体阳性，伪狂犬阳性场中，阳性种猪比例为27.2%（本报告发表于《猪业科学》2008年第10期）。
猪伪狂犬病病毒gpI抗体检测 自备材料 1. 50、100μl 精确微量移液器或连续移液器。 2. 一次性移液器吸头。 3. 配制洗涤液的500ml 量筒。 4. 96 孔板酶标仪。 5. 稀释样品的玻璃或塑料管。 6. 蒸馏水或去离子水。 7. 滴加和吸去洗涤液的装置。 使用注意事项 1. 处理所有的PRV 材料以免PRV 的传播。抗原包被微孔板虽然经过化学处理，仍可能成为PRV 的传染源。 2. 勿用口移液。 3. 使用样品和试剂盒的场所不要吸烟、喝水和吃东西。 4. TMB 底物和终止液对皮肤有刺激性。 5. 试剂盒的某些成分含有防腐剂叠氮钠。处理时需要用大量的水冲洗以免形成叠氮化铜或叠氮化铅，它们在受压时可以爆炸。注意防止该成分对酶标抗PRV gpI 抗体的污染。 6. TMB 不要暴露于强光和任何氧化剂。使用洁净的玻璃或塑料容器盛装TMB 底物液。 7. 所有的试剂应在2－7℃储存。使用前恢复到室温，使用后放回2－7℃。 8. 所有的废弃液应在丢弃前合理处理以免污染环境。 9. 注意防止试剂盒成分的污染。 10.不要使用超过有效期限的试剂，不同批次试剂盒的成分不要混用。 11.严格遵守这些条款可以获得理想的结果。操作过程中的移液、时间和洗涤必须精确。 样品的制备 用样品稀释液将被检样品稀释2 倍 (1:2)。 取每个样品后都要更换吸头，准确记录每个样品在板上的位置。每个样品应在滴加到PRV 包被板前应混匀。 洗涤液的制备 浓缩洗涤液应在使用前恢复至室温并使沉淀的盐溶解。使用前浓缩洗涤液应用蒸馏水或去离子水10 倍稀释（例如：每块板用30ml 浓缩液加上270ml水）。 操作步骤 使用前所有试剂应恢复至室温。试剂应轻轻旋转或震荡予以混合。 1.取出抗原包被板，在记录表上记录样品的位置。 2.在A1，A2 和A3 孔内加入100μl 两倍稀释(1:2)的阴性对照。 3.在A4，A5 孔内加入100μl 两倍稀释(1:2)的阳性对照。 4.在其余的孔内分别加入100μl 已稀释好的被检样品。 5.室温下孵育1 小时或2－8℃孵育过夜(可以将微量反应板用封条封闭)。 6.用大约300μl 洗涤液洗涤板孔，重复3－5 次。每次洗涤时洗涤液都应吸出丢弃。在洗板和加入标记物之间应避免包被板变干。在最后一次洗涤液吸出后，将板中残留洗涤液扣拍到吸水材料上。 7.每孔加入100μl 辣根过氧化物酶标记抗PRV gpI 抗体。 8.室温下孵育20 分钟。
伪狂犬病活疫苗 Company number：【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】
伪狂犬病活疫苗 （Bartha-K61株）生产工艺规程编制人：年月日 审核人：年月日 批准人：年月日 目录 一、目的：伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）生产工艺规程的方法和程序。 二、适用范围：适用于伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的生产的全过程 三、依据：《伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及检验试行 规程》 四、责任者：生产车间、质管部。 五、正文： Ⅰ工艺流程及质量控制要点 Ⅱ操作细则 1、制苗材料的制备 2、生产用种毒的制备 3、半成品的配制 4、配苗 5、疫苗的分装 6、疫苗的冻干 7、轧盖贴标
8、包装 Ⅲ成品检验 Ⅳ工艺卫生与人员卫生 Ⅴ生产设备一览表 Ⅵ包装机检查方法 Ⅶ物料平衡 Ⅷ劳动定员及劳动保护 吉林和元生物工程有限公司GMP管理文件 一、目的：规定制造伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的方法和程序。 二、适用范围：适用于伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的生产的全过程 三、依据：《伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及检验试行规程》 四、责任者：生产车间、质管部。 五、正文：
I 工艺流程及质量控制要点
伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）质量控制要点 II 操作细则 本品系用伪狂犬病病毒弱毒株接种于鸡胚成纤维细胞收获感染病毒液，加适宜稳定
剂，经冷冻干燥制成，用于预防猪、牛及绵羊伪狂犬病。 1 制苗材料的制备 条件准备 根据细胞制备所需物品及设备条件，进行全面准备。 按使用时间，提前做好灭菌工作后将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。 在工作开始前30～40min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。 操作规则 细胞的制备 发育良好的9～10日龄SPF鸡胚。 选择9～10日龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酒棉消毒蛋壳气室部位，无菌取出鸡胚，去头、四肢和内脏，放入灭菌的玻璃器皿中，用汉克氏液洗涤胚体，用灭菌剪刀剪成米粒大小的组织块，再用汉克氏液洗涤2～3次，然后加%胰酶溶液（每胚 4ml），～℃消化20～30分钟，吸出胰酶溶液，用汉克氏液洗涤2～3次再加入适量的营养液（用含5%～10%犊牛血清乳汉液，加适宜的抗生素适量）吹打，用4～6层纱布过滤，制成每1ml含活细胞数约100～150万的细胞悬液，分装于培养瓶中进行培养，形成单层后备用。 细胞培养物应无细菌、霉菌（见《无菌（纯粹）检验标准操作规程》）和支原体（见《支原体检验标准操作规程》）污染，无特异性病变。 将细胞冻融液接种Marc-145细胞，应不出现任何病变（见《外源病毒检测标准操作规程》）。 清场和记录 工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。 全面填写《生产工序记录》。 2 生产用毒种的制备 条件准备
猪伪狂犬病的防制 摘要：介绍了几例猪伪狂犬病防制的病例，以 供参 考。 关键词：猪伪狂犬病；防制 中图分类号： S858.3 文献标识码： B 文章编 1007-273X （2014）02-0049-02 猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒（PRV ）引起仔猪 脑脊膜 炎、败血症、母猪流产、产死胎和木乃伊胎等 症状的一种传 染病。近年来，有效的疫苗免疫极大地 减少了典型的伪狂犬 病临床症状，但是国内猪群的野 毒阳性率仍然很高，在免疫 失败（如疫苗质量差、免 疫程序不合理、操作不规范及其它 免疫抑制因素等） 、 饲养管理不好，带毒猪会排毒引起新的 传染，导致伪 狂犬病流行。笔者 2013年接诊了 2例猪伪狂 犬病，现 将情况报告如下。 1 病例 1 1.1 基本情况 该户饲养有母猪 80 余头，从事养猪 8 年，场地建 在远离村庄、 进行伪狂犬疫苗免疫。 1.2 临床 症状 口， 号： 面环山的山坡上，防疫条件较好。
2013年7月初，部分母猪在配种后65?75 d发生流产，产死胎、木乃伊胎，半月内先后出现10来头，且母猪配种返情率高；之后产房小猪出现精神倦怠，发烧（41?42 C）,庆食，不吃奶，口吐白沫，呼吸困难，共济失调，四肢抽搐，出生15 内仔猪死亡率100%，一月内损失哺乳期仔猪180余头。 1.3现场剖检见扁桃体有白色坏死点，肝脏和脾脏有疱 疹样黄 白色坏死点；肺表面有坏死点，脑膜充血。 1.4诊断结合免疫情况、临床症状、病理剖检变化，初 步 诊断为猪伪狂犬病。用病料研磨成混悬液皮下接种兔子，注射部位出现“奇痒”致死现象。 1.5治疗 全部母猪用伪狂犬疫苗紧急免疫注射2 头份/头，间隔一个月相同剂量加强一次，之后每隔3个月一次；初生仔猪伪狂犬疫苗滴鼻一头份/头，同时肌肉注射一头份/头，2 h后再让仔猪吃奶；母猪紧急免疫20 d后, 初生小猪不进行超免，所生仔猪已全部成活。 2 病例2 2.1 基本情况
伪狂犬病及相应的控制措施 19世纪在欧洲和美洲已存在1902年，由匈牙利兽医Aujeszky正式发现.所以也称“Aujeszky”，1910年Schmiedhofer证实病原为病毒，1934年Sabin和Wrght确认为疱疹病毒，1935年Shope发现猪是主要宿主，中国1947年首次报道伪狂犬病，德国、英国、丹麦和美国已基本消灭PRV ?伪狂犬的流行特征 1.只有一个血清型。迄今还没有发现抗原性特不同的伪狂犬毒株，从世 界各地分离的毒株都能呈现一致的血清学反应； 2.免疫性抑制性疾病，由于该病毒能造成扁桃体、肝、脾、肺、淋巴结 等内脏器官的坏死，从而破坏机体的免疫体系，造成免疫抑制，容易 继发感染其他的疾病，如传染性胸膜肺炎等； 3.猪是自然宿主,隐性感染(潜伏感染)。病毒首先在扁桃体、咽部及嗅上 皮细胞内增殖，然后通过嗅神经和舌咽神经等到达脊髓，再进一步增 殖扩散到整个大脑，而生长育肥及成年猪一般不表现明显的临床症状，而胎儿和新生仔猪则会表现临床症状，大量的实验证明，猪既是本病 的原发感染宿主，又是病毒的长期贮存和排出者； 4.难以根治,净化比较困难。正是因为猪是自然宿主，并能潜伏感染，造 成净化很困难，因为一旦野毒感染就终生带毒，所以我们必须阻断猪 感染的最初的一个环节，目前最好的方法就是模拟野毒的感染，通过 伪狂犬病毒的占位效应这一特征进行滴鼻； 5.传播途径多样化，在自然条件下，猪、牛、羊、犬、猫、兔、鼠等多 种动物易感，但猪和鼠是自然界中主要贮存宿主和疫源动物； 6.中国目前大多数猪场母猪野毒阳性率100%,育肥猪50%以上，危害造 成的损失巨大，由于我国没有在伪狂犬爆发的年代进行像欧美一样的 净化计划，而且在疫苗的使用上很不规范，引种比较频繁，再加上对 一个猪场是否存在野毒没有一个很好的诊断方法，造成目前这个野毒 阳性率高的现状；散发性的流产死胎，新生仔猪的大量死亡，而且也 是PRDC的一个重要的原发性病原，给生产带来的损失不可估量。 ?伪狂犬的发病特点 1.母猪流产(通常在怀孕前期)、产木乃伊胎、死胎、返情 2.初生仔猪发病率和死亡率高 3.易继发感染其他疾病，特别是放线杆菌胸膜肺炎
怎么治疗猪伪狂犬病 病猪的年龄不同，其临床症状也有差异。一般呈地方流行性发生，多发生于冬、春两季。临床症状： 新生仔猪感染伪狂犬病毒会引起大量死亡，临诊上新生仔猪第1天表现正常，从第2 天开始发病，3～5天内是死亡高峰期，有的整窝整窝死光。同时，发病仔猪表现出明显的神经症状、昏睡、呜叫、呕吐、拉稀，一旦发病，1～2日内死亡。仔猪突然发病，体温上升达41℃以上，精神极度委顿，发抖，运动不协调，痉挛，呕吐，腹泻，极少康复。 断奶仔猪感染伪狂犬病毒，发病率在20％～40％左右，死亡率在10％～20％左右，主要表现为神经症状、拉稀、呕吐等。成年猪一般为隐性感染，若有症状也很轻微，易于恢复。主要表现为发热、精神沉郁，有些病猪呕吐、咳嗽，一般于4～8天内完全恢复。 怀孕母猪可发生流产、产木乃伊胎儿或死胎，其中以死胎为主无论是头胎母猪还是经产母猪都发病，而且没有严格的季节性，但以寒冷季节即冬末春初多发。据近年来的报道，奇痒症状以往在猪罕见，但目前则常可见到。 伪狂犬病的另一发病特点是表现为种猪不育症。母猪配不上种，返情率高达90%，有反复配种数次都屡配不上的。此外，公猪感染伪狂犬病毒后，表现出睾丸肿胀、萎缩，丧失种用能力。 防治措施： 紧急情况下，用高免血清治疗，可降低死亡率。消灭牧场中的鼠类，对预防本病有重要意义。同时，还要严格控制犬、猫、鸟类和其他禽类进入猪场，严格控制人员来往，并做好消毒工作及血清学监测等，这样对本病的防制也可起到积极的推动作用。此外，对猪群采血做血清中和试验，阳性者隔离，以后淘汰。以3～4周为间隔反复进行，一直到两次试验全部阴性为止。另外一种方式是培育健康猪，母猪产仔断乳后，尽快分开，隔离饲养，每窝小猪均须与其他窝小猪隔离饲养。 治疗方案： 蓝圆风暴+刀豆素一针见效，两针治愈，三针巩固。每套用于治疗200斤体重，预防剂量减半。