伪狂犬病活疫苗
（Bartha-K61株）生产工艺规程编制人：年月日
审核人：年月日
批准人：年月日
目录
一、目的：伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）生产工艺规程的方法和程序。
二、适用范围：适用于伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的生产的全过程
三、依据：《伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及检验试行
规程》
四、责任者：生产车间、质管部。
五、正文：
Ⅰ工艺流程及质量控制要点
Ⅱ操作细则
1、制苗材料的制备
2、生产用种毒的制备
3、半成品的配制
4、配苗
5、疫苗的分装
6、疫苗的冻干
7、轧盖贴标
8、包装
Ⅲ成品检验
Ⅳ工艺卫生与人员卫生
Ⅴ生产设备一览表
Ⅵ包装机检查方法
Ⅶ物料平衡
Ⅷ劳动定员及劳动保护
吉林和元生物工程有限公司GMP管理文件
一、目的：规定制造伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的方法和程序。
二、适用范围：适用于伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的生产的全过程
三、依据：《伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及检验试行规程》
四、责任者：生产车间、质管部。
五、正文：
I 工艺流程及质量控制要点
伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）质量控制要点
II 操作细则
本品系用伪狂犬病病毒弱毒株接种于鸡胚成纤维细胞收获感染病毒液，加适宜稳定剂，经冷冻干燥制成，用于预防猪、牛及绵羊伪狂犬病。
1 制苗材料的制备
条件准备
根据细胞制备所需物品及设备条件，进行全面准备。
按使用时间，提前做好灭菌工作后将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。
在工作开始前30～40min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。
操作规则
细胞的制备
发育良好的9～10日龄SPF鸡胚。
选择9～10日龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酒棉消毒蛋壳气室部位，无菌取出鸡胚，去头、四肢和内脏，放入灭菌的玻璃器皿中，用汉克氏液洗涤胚体，用灭菌剪刀剪成米粒大小的组织块，再用汉克氏液洗涤2～3次，然后加%胰酶溶液（每胚4ml），～℃消化20～30分钟，吸出胰酶溶液，用汉克氏液洗涤2～3次再加入适量的营养液（用含5%～10%犊牛血清乳汉液，加适宜的抗生素适量）吹打，用4～6层纱布过滤，制成每1ml 含活细胞数约100～150万的细胞悬液，分装于培养瓶中进行培养，形成单层后备用。
细胞培养物应无细菌、霉菌（见《无菌（纯粹）检验标准操作规程》）和支原体（见《支原体检验标准操作规程》）污染，无特异性病变。
将细胞冻融液接种Marc-145细胞，应不出现任何病变（见《外源病毒检测标准操作规程》）。
清场和记录
工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。
全面填写《生产工序记录》。
2 生产用毒种的制备
条件准备
根据毒种制备所需物料及设备条件，进行全面准备。
按使用时间，将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。
在工作开始前30～40min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。
操作规则
制苗用病毒液的制备
细胞单层培养将扩大培养的种子细胞接种到转瓶中培养，控制转速9~12转/小时。
接种取所需数量的、细胞覆盖率达到80%以上的细胞转瓶，弃去生长液，按2％（V/V）接种病毒，加入含2%胎牛血清的细胞培养液，37°C旋转（9~12转/小时）培养。
收获在显微镜下观察由病毒引起的细胞病变（CPE），直至CPE达到70%以上收获细胞培养物，反复冻融1次，经离心或过滤除去细胞碎片，冻存于-40°C以下。
毒种鉴定
毒标准
病毒含量将毒种用无血清培养基做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-74个稀释度，分别接种于96孔细胞板，每个稀释度接种6孔，每孔，设置正常的细胞对找孔，放置5%CO
，
2 37℃下培养观察3~5日，根据Reed-Muench法计算TCID
。病毒含量应≥。
50
鉴别检验
/mL，取与等量呼吸综合征病毒中和试验：将毒种用无血清培养基稀释成103TCID
50
特异性阳性血清混合，同时设病毒对照组和正常细胞对照组，37℃作用1小时后，接种Marc-145细胞培养板，观察5日。应不产生细胞病变（CPE）。
病毒基因鉴定应用下列引物进行RT-PCR检测，毒种可扩增出581bp的特异性条带，以而猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1-R株为代表的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒以及其他猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸为阴性（猪繁殖与呼吸综合征病毒 JXA1-R株RT-PCR检测方法见附注3）。
U1 ATTTGAATGTTCGCACGGTCTC
D2 CGGAACCATCAAGCACAACTCT
毒力
对仔猪的毒力用JXA1-R-R株毒种（≥mL）接种4~6周龄抗原猪繁殖与呼吸综合征病毒、抗体阴性仔猪（阴性猪标准见附注1）5头，每头颈部肌肉注射2mL，同时设5头阴性猪作对照，隔离饲养。接种猪逐日测量体温，观察临床症状，均不发病（发病猪判定标准见附注2）。
对妊娠母猪的毒力用JXA1-R-R株毒种（≥mL）接种怀孕80~90天的母猪3头，每头颈部肌肉注射2mL，同时设同期怀孕母猪3头做对照，隔离饲养，观察母猪临床症状和分娩产仔状况。怀孕母猪应不发生流产，所产仔猪的存活率与未接种对照组无统计学差异。
免疫原性取4~6周龄猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、抗体阴性猪（阴性猪标准见附注1）10头，其中5头肌肉注射JXA1-R-R株毒种2mL（mL），另5头作为对照，同条件下隔离饲养。28日后，所有猪肌肉注射检验用强毒NVDC -JXA1株病毒培养液（病毒含量≥mL）3mL，每天测温并观察21日。对照猪均应发病，且至少2头死亡，免疫猪应至少4头保护（发病猪判定标准见附注）。
纯净按现行《中国兽药典》进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。
基础种子代数82~90代。
种毒保存 -70℃下，保存期暂定为12个月。
强毒标准
病毒含量将毒种用无血清培养基做10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-64个稀释度，分别接种于96孔细胞板，每个稀释度接种6孔，每孔，在37℃下培养观察5~7日，
。病毒含量应≥mL。
根据Reed-Muench法计算TCID
50
对猪的毒力取8~10周龄的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原抗体阴性猪（阴性猪标准见附注1）5头，每头猪肌肉注射检验用强毒NVDC-JXA1-R（~mL）3mL，每天测温并观察21日。猪均应发病，且至少2头死亡。
毒种代次 5～6代。
毒种保存在-70℃以下，保存期暂定为12个月。
3 细胞系
病毒培养用细胞为Marc-145，由中国动物疫病预防控制中心鉴定、保管和供应。
细胞标准
培养2h即可贴壁，24h 细胞形态用含8％犊牛血清的DMEM细胞培养液，37℃、5％CO
2
内可长成单层。显微镜下，细胞呈三角形、多角形、圆形等多种形态。
外源病毒检验
3取2个细胞单层，每个单层至少6cm2，培养7天，每日观察细胞，应无细胞病变。
血吸附病毒检验按现行《中国兽药典》进行检验，应无红细胞吸附现象。
其它特定病毒的检验采用PCR或RT-PCR方法检测，应无BVDV、PCV、CSFV、PPV、PRV 和JEV污染。
胞核学检查对不同传代水平的细胞，取50个处于有丝分裂中期的细胞进行检查。在基础细胞库细胞中存在的染色体标志，在最高代次细胞中也应存在。与基础细胞库的细胞相比，所有细胞的染色体模式数不得高出15%。核型必须相同。
致瘤性检验用无胸腺小鼠至少10只，各皮下或肌肉注射107个待检细胞，同时用Hela 细胞皮下或肌肉注射无胸腺小鼠，每只106个细胞，作为阳性对照，用鸡胚成纤维细胞作为阴性对照。观察21日，Marc-145细胞应无肿瘤形成，阳性对照组应出现明显的肿瘤，阴性对照组应为阴性。
无菌检验按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。
支原体检验按现行《中国兽药典》进行检验，应无支原体生长。
细胞代次基础细胞应为1~10代，工作细胞代次应为10~25代，生产用细胞应在40代以内。
保存液氮保存。保存期36个月。
4 疫苗制造及半成品检验
生产用毒种制备
毒种繁殖将已长成单层的Marc-145细胞倒去生长液，换以含2％毒种的细胞维持液，置37℃下培养2~3天，当70％以上细胞出现病变时收获，置-40℃冻融1次，离心后分装，然后进行鉴定。
45项进行，应符合规定。符合上述标准的毒种作为生产用毒种。
毒种保存在-70℃下保存，应不超过12个月。
毒种继代应不超过3代。
清场和记录
工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。
全面填写《生产记录》。
5 半成品的制备
条件准备
根据毒液繁殖所需物料及设备条件，进行全面准备。
按使用时间，将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。
在工作开始前30～40min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。
操作规则
接种取所需数量的、细胞覆盖率达到80%以上的细胞转瓶，弃去生长液，按2％（V/V）接种病毒，加入含2%胎牛血清的细胞培养液，37°C旋转（9~12转/小时）培养。
收获在显微镜下观察由病毒引起的细胞病变（CPE），直至CPE达到70%以上收获细胞培养物，反复冻融1次，经离心或过滤除去细胞碎片，冻存于-40°C以下。
半成品检验
检验，病毒含量应≥mL。
无菌检验按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。
清场和记录
工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。
全面填写《生产记录》。
6 配苗
条件准备
根据配苗所需物料及设备条件，进行全面准备。
按使用时间，将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。
在工作开始前30～40min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。
将检验合格的半成品于配苗前取出，融化待用。
操作规则
配制将经检验合格的病毒液按比例添加蔗糖脱脂乳冻干保护剂，充分混合均匀。
清场和记录
工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。
全面填写《生产记录》。
7 疫苗的分装
操作内容见《分装岗位标准操作规程》。
8 疫苗的冻干
操作内容见《冻干标准操作规程》。
7 轧盖、贴标
操作内容见《轧盖标准操作规程》、《贴标标准操作规程》。
8 包装
操作内容见《包装标准操作规程》
III 成品检验
见《伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及检验试行规程》
Ⅳ、工艺卫生与人员卫生
1 定期对洁净室进行消毒，并根据沉降菌测定结果决定消毒周期。
2 操作间的卫生按各自区域的清洁消毒规程进行。
3 生产设备按各自清洁规程进行清洁消毒。
4 原辅料进入生产区按规定程序进行清洁消毒。
5 人员进入洁净区时，必须按规定进行人净。进入洁净区程序：更鞋→脱外衣→穿普通工作服→更鞋→脱普通工作服→洗手→穿洁净服→手消毒→进入十万级洁净区→更鞋→手消毒→套洁净服→手消毒→进入万级洁净区。
6 人员在生产区内按区域个人卫生要求进行管理。
7 一般区工作服每三天清洗一次，十万级区工作服每天清洗一次，万级区工作服每班清洗一次，万级洁净区使用的工作服在清洗后进行灭菌，活毒操作区的工作服须经灭菌后才能进行清洗。
8 洁净室温度控制在18～26℃，相对湿度控制在30-65%。洁净区与非洁净区的静压差应≥10帕。不同级别的相邻洁净区间压差应≥5帕。
9 每批生产完毕，都应按清场管理规程进行清场。更换产品应进行彻底清场。
Ⅴ、生产设备一览表
主要生产设备及生产能力一览表
Ⅵ、包装及检查方法
疫苗瓶贴瓶签后，每10瓶装一小盒，小盒内放说明书1张，盒上贴盒签。每60盒装一疫苗箱，箱上贴箱签。（注：盒签和箱签同）
Ⅶ、物料平衡
Ⅷ、劳动定员及劳动保护
1 劳动定员
车间共35人。安排如下：
2 劳动保护
开启设备时，应保证人员在安全区域。
生产操作时，穿戴好劳保防护服。
电器不允许用水冲洗，以防触电。
不能用湿手开闭电源。
Ⅸ、工艺安全要求
1 活毒操作区的物品经灭活后清洗。
2 活毒操作区域产生的废弃物要经过灭活后才能排放。
3 活毒操作区域的空调净化系统的空气仅限于该区域循环，洁净区要定期监测。
4 毒种专柜加锁保存，双人双锁保管。
十一、伪狂犬病检测方法 伪狂犬病病毒分离鉴定 1 材料准备 DMEM培养基、BHK-21细胞、新生犊牛血清、青霉素、链霉素溶液、0.22ul 微孔滤膜、细胞培养瓶、CO2培养箱、倒置显微镜。溶液配制见附录A(标准的附录) 2 操作步骤 2.1病料的采集对于刚死亡或活体送检并处死的动物，无菌采取肝、脾、肺、肾及其脑组织，尤其是三叉神经节、嗅球，4℃送实验室检测。 2.2样品处理待检组织在灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃砂研磨，用灭菌生理盐水或DME培养基制成1：5乳剂，—70℃反复冻融后，经3000rpm离心30分钟后，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，加入青链霉素溶液至最终浓度为100U/mL，—70℃保存作为接种材料。 2.3 病料接种将病料滤液接种已长成单层的BHK-21细胞，接种量为培养基量的10%，37℃恒温箱中吸附1小时后，加入含10%新生犊牛血清（经过56℃水浴灭活30分钟，过滤除菌，无支原体）的DMEM培养基，置37℃温箱中培养。 2.4观察结果接种后24—48小时，BHK-21细胞应出现典型的细胞病变效应（Cyto pathogenic effect, CPE），表现为细胞变圆，脱落。如第一次接种不出现CPE，应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无CPE，则判为伪狂犬病病毒阴性。 2.5病毒的鉴定将出现CPE的细胞培养物反复冻融后，用聚合酶链式反应、荧光抗体试验等两种方法中任一方法作进一步鉴定。 伪狂犬病聚合酶链式反应 1 材料准备:待检组织、组织匀浆器、蛋白酶K，十二烷基磺酸钠（SDS），苯酚、氯仿，异戊醇（分析纯）、TEN缓冲液。溶液配制见附录C(标准的附录) 引物：扩增伪狂犬病病毒基因中434—651bp之间217bp基因片段，由上海生物工程公司合成。 序列为，上游引物P1：5’-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3’， 下游引物P2：5’-GTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3 仪器设备有：凝胶电泳紫外线检测仪，PCR扩增仪，电泳仪 2操作步骤： 2．1 样品的采集：对于病死或扑杀动物，取脑组织；对于待检活猪，用已灭菌的棉签，伸入猪鼻腔中，采取鼻粘液，即为鼻拭子，冷藏条件送实验室检测。2.2样品处理所采病料经组织研磨器充分研磨，按1:5用TEN缓冲液悬浮收集于离心管内，-70℃反复冻融3次，7000r/min离心5min，如样品为鼻试子，则加入2ml TEN缓冲液，充分挤压，取出棉签，7000rpm，离心5分钟，取上清液。取上清液472.5μl,加入25μl 10％SDS和2.5μl的20mg/ml 蛋白酶K，50℃水浴摇床上放置2h后加入等量的饱和酚500μl，涡旋20s。离心取上清液，加等量的酚：氯仿：异戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：异戍醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20μl双蒸水溶解，-20℃贮存备用。
实验三伪狂犬病的诊断 一．实验目的： ⒈熟悉伪狂犬病的临诊特点。 ⒉熟悉伪狂犬病的诊断方法。 二．实验原理： 利用分离的伪狂犬病毒注射实验兔，病毒在动物机体繁殖一段时间后，会影响实验动物的神经系统，实验兔会出现强烈的痒觉，根据这些症状来判断是否含有伪狂犬病毒。 三．内容及方法 1. 伪狂犬病的临床特点 本病发生于牛、绵羊，犬、猫、鼠及猪。野生动物亦可发生。牛、绵羊、犬及猫感染本病后症状很特殊而明显。主要表现为某部皮肤的强烈痒觉。常使劲地于墙柱上摩擦，直到皮肤撕碎，仍不断摩擦，病畜像疯狂一样，用力制止亦无效果。体温可达40℃以上。常发病后48小时内死亡。成猪一般为隐性感染，怀孕母猪可发生流产、死胎、木乃伊胎儿。仔猪，尤于新生仔猪病情极严重，常可发生大批死亡。主要侵害神经系统，表现为神经症状。 2. 实验室诊断 2.1 病料的采集与处理 分离病毒的材料于发热期最好采取中脑、桥脑及延脑，或采取病总部之水肿液、侵入部神经干及脊髓。病料用培养液制成1:10组织悬浮液。 2.2 兔体接种试验上述悬液经2000r/min离心1Omin，取上清液1~2ml经腹侧皮下或肌肉接种家兔，通常在36-48h后注射部位出现剧痒，病兔啃咬注射部位皮肤，皮肤脱毛、破皮和出血，继之四肢麻痹，体温下降，卧地不起，最后角弓反张，抽搐死亡。但这种症状只维持几小时，一般常于夜间死亡，可见死兔口内有接种部位咬下的被毛。亦可脑内接种小鼠，症状可维持12小时，但其敏感性不如兔。亦可用细胞培养来分离病毒。许多种哺乳动物细胞均能繁殖本病毒，但最常用的是猪肾传代细胞。 2.3 兔、猪及牛肾原代细胞培养。病料接种细胞后最早经18小时出现病变(病毒量大)，一般经48小时，病毒量很低时要到96小时。其典型的病变是出现巨细
扑伪佳 产品简介： 通用名：猪伪狂犬病活疫苗（Bucharest 株） 商品名：扑伪佳?（PR–Vac Plus?） 英文名：Pseudorabies Vaccine, Modified Live Virus（Bucharest Strain） 汉语拼音：Zhu Weikuangquanbing Houyimiao（Bucharest Zhu） 产品说明书： 【主要成分与含量】疫苗中含有猪伪狂犬病毒（Bucharest 株）至少104TCID50/头份 【性状】本品为微黄色海绵状疏松团块，加稀释液后迅速溶解 【作用与用途】用于预防猪伪狂犬病 【用法与用量】3周龄以上猪，肌肉注射。按瓶签注明头份，用专用稀释液进行稀释，每头猪接种1头份（2ml） 推荐接种程序： -基础接种：在3周龄或3周龄以上时进行。对于免疫母猪所产仔猪，应在母源抗体下降后（约8-12周龄时）进行 -加强接种：对于种猪，每半年加强接种1次。对于怀孕母猪，可在怀孕40日后进行加强接种 【不良反应】接种后可能引起过敏反应，若发生这种情况，可用肾上腺素进行抢救，并采取辅助治疗措施 【注意事项】 1、仅用于接种健康猪 2、疫苗不要冻结 3、疫苗瓶开封后应一次用完 4、使用过的疫苗瓶和未用完的疫苗应焚毁 5、接种时，应执行常规的无菌操作 6、疫苗中含有庆大霉素 7、屠宰前21日禁止使用 8、如果动物处于某些传染性疾病的潜伏期、营养不良、有寄生虫感染、处于运输或环境应激状态下或存在免疫抑制，或者未按说明书进行接种，均可能引起免疫失败 【规格】10 头份（20ml）/瓶、25 头份（50ml）/瓶、50 头份(100ml)/瓶 【包装】10 盒/箱 【贮藏与有效期】在2～8℃保存，有效期为1 年6个月。
详解猪伪狂犬的病理过程及其防治 核心提示：本文详细阐述猪伪狂犬病的临床表现、发病过程及诊断要点。 猪伪狂犬病病（PPV）是由疱疹病毒属的伪狂犬病毒引起的疾病。在猪群中该病毒能够通过妊娠从上一代传递到下一代的垂直传播，还能够通过猪只之间互相接吻以及蚊蝇叮咬而水平传播，属于乙型传播疫病。主要经呼吸道传播，病毒感染后首先在鼻咽部、扁桃体中增殖，再经神经侵袭脑、脊髓的同时，也可由鼻腔粘膜经呼吸道侵入肺泡。这是临床初生仔猪无其他明显症状，但若发生抽搐后迅速死亡的主要原因。 一、临床表现 感染早期体重25kg以上的商品猪，病毒侵袭导致猪的肝脏的胆汁分泌机能亢进，突然增多的大量胆汁刺激十二指肠和幽门壶腹部，病猪表现胃肠痉挛和粪便发黑，阵发性腹痛，频频排粪，采食量下降；体温39-41℃。进入4-10天的感染中期，由于十二指肠和幽门壶腹的持续痉挛，幽门突红肿，溃疡，形成胆汁排泄障碍和向胃部的逆流；同时，由于持续增值的病毒对外周淋巴的侵袭引起的全身发热，水排泄的增强，继发胆汁粘稠，胆囊内壁充血、出血和胆囊壁增厚等炎症变化。与此同时，大量胆汁进入胃部，打破胃内容物的酸碱平衡，使pH值上升，直接引发病猪发生呕吐。pH值偏高的胃液长时间的浸润，一方面使得胃神经反射机能麻痹，呕吐很快停止，病猪出现采食量下降，这是饲养密度过大或观察不及时，个体发病后不易被发现的主要原因；另一方面，贴近胃壁的高pH值胃液直接损伤胃底粘膜，引起胃底充血、出血和穿孔、胃痛，形成病猪有食欲，但采食量下降或呈间断性采食（即添加饲料时猪反映明显，但采食数口后停顿下来，稍后继续采食，并再次发生采食停顿）、粪便发黑的现象。到了10-15天（部分单一性病例可达20天）的感染中后期，由于胃底损伤严重，病猪采食量下降至正常采食量的1/5-1/8，甚至
猪伪狂犬病的免疫及其疫苗正确选用问题的研究 冷和平1，张学煌1，曾俊霞2 （1. 恩平市金津养殖有限公司，广东江门529471，2. 珠海市安富来生物科技有限公司， 广东珠海519080） 近年来，很多猪场通过选取典型间质性肺炎病料制作自家组织苗预防蓝耳病和圆环病毒，分离链球菌制作链球菌自家菌苗预防链球菌，选用进口伪狂犬单基因缺失苗和进口喘气病灭活苗预防伪狂犬和喘气病等措施，生产都取得了突飞猛进的进步。大量猪场经验表明，在目前环境下，只要认真贯彻落实好上述措施，把蓝耳病、II型圆环病毒、链球菌、伪狂犬和喘气病这五大疾病控制好，基本上都可以保证不出现大的疫病流行，长期保持正常生产，一头能繁母猪年生产商品活大猪（PSY）18头以上。 然而，仍有很多猪场因对这五大疾病认识不足，相应措施不到位，生产仍在原地踏步，甚至退步，以致近几年国内猪场的生产水平，两极分化的趋势越来越明显。以2009年为例，虽然猪价下跌，但均价都在11.00元/kg以上，仍属历史上较好的行情。那些生产搞得好的猪场都在闷声赚大钱，而一些生产搞不好的猪场却在大喊亏损！ 客观而言，由于我国养猪业当前正处于产业调整期，农民放弃单家逐户养猪模式所腾出的巨大市场急需弥补，生猪供应将在一个相当长的时期内处于短缺状态。未来的十年，将是规模化养猪大有作为的十年。规模化猪场只要兽医防疫工作到位，基本实现正常生产，获利应当是相当丰厚的。近年来，高盛、艾格菲、网易、复星等大财团之所以大举进军养猪业，正是看到了这一点。这些大财团或科技精英凭借其强大的资金优势，通过大量延揽人才，结合他们原本最擅长的应用科学技术解决生产问题的方法，技术也必将遥遥领先。不出几年，养猪行业恐怕就要任由他们主宰。如果我们现在的业内同行对此仍然无动于衷，对一些新技术和新产品本能地抗拒，一些原本应该控制好的疾病不去认真控制好，恐怕等不了几年，就要面临被淘汰的命运。 图1 疑似伪狂犬病变橡皮样肺图2 橡皮样肺并发链球菌感染 猪的伪狂犬病问题，在进口基因缺失苗已被广泛使用的今天，本不应继续成为困
猪伪狂犬病的预防与用药 -----本文由深圳安多福整理 最近，河南的一养殖户，使用成都天邦的疫苗，却死了3000多头母猪。是成都天邦的伪狂犬疫苗有问题,还是母猪已经感染了强毒或是母猪在注射后被蓝耳病和其他病致死的？相信不久，真相就会揭晓。 那么猪伪狂犬是怎么样的一种病，发病有哪些症状，怎么样去预防和治疗呢？ （一）综述 猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起家畜和野生动物的一种急性传染病。特征为成年猪呈隐性感染或有上呼吸道卡他性症状；妊娠母猪发生流产死胎；哺乳仔猪出现脑脊髓炎（神经症状）和败血症状（发热），最后死亡。没有明显的季节性，但以寒冷的冬季发病较多。 本病主要通过与病猪和带毒猪接触，经呼吸道、消化道、损伤的皮肤感染，也可通过配种、哺乳感染，妊娠母猪感染后，可感染胎儿。（二）症状 本病潜伏期3～11天。临床症状随猪年龄不同而有很大差异。妊娠母猪常发生流产，产出的弱胎通常在3～4天死亡，流产率可达50%；适龄母猪表现为不育症，返情率高，但屡配不孕。成年猪一般为隐性感染，即使有症状也是轻微的，只表现为一般性发热，精神沉郁，有的有呕吐、咳嗽、一般4～8天恢复；可引起新生仔猪大量死
亡，主要表现为刚生下的仔猪第一天无异常，常从第二天开始发病，3～5天内达到死亡高峰，表现明显的神经症状，病猪昏睡、鸣叫、呕吐、拉稀、流涎、发抖、痉挛，有时不自主地前冲、后退或转圈运动；随着病情的发展，发现四肢麻痹，倒地侧卧，头向后仰，四肢乱动或划水样运动，最后昏迷死亡；可引起断奶仔猪发病死亡，发病率在20%～40%，死亡率在40%～60%，主要症状表现为神经症状，拉稀，呕吐等。 （三）病理变化 剖检主要表现为脑膜充血，水肿、出血，脑脊液增多，淋巴结肿大，胃肠黏膜可见卡他性炎症，胃底部有明显出血区，上呼吸道黏膜及扁桃体出血，水肿，并有纤维素性坏死性伪膜覆盖。有的肾脏布满针尖样出血点，有的出现肺水肿。肝肾有特征性坏死灶，中央灰白色，外周有红色晕圈，具有诊断意义。流产胎儿的肝、脾及胎盘绒毛膜有凝固性坏死。 （四）防治 1、种猪每6个月背颈皮下注射伪狂犬病基因缺失油佐剂苗3毫升，母猪在产前1个月左右加强免疫一次；种用仔猪28～35日龄注射一次1.5毫升，4～6周重复注射一次，育肥仔猪30日龄注射1.5毫升。 2、严格执行消毒措施。猪舍地面、墙壁、设施及用具等每周定期消毒1次，粪便放发酵地或沼气池处理。发生疫情时则2～3天消毒1次，消毒液可用安多福万金水按1：500稀释。
伪狂犬病活疫苗 （Bartha-K61株）生产工艺规程编制人：年月日 审核人：年月日 批准人：年月日 目录 一、目的：伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）生产工艺规程的方法和程序。 二、适用范围：适用于伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的生产的全过程 三、依据：《伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及检验试行 规程》 四、责任者：生产车间、质管部。 五、正文： Ⅰ工艺流程及质量控制要点 Ⅱ操作细则 1、制苗材料的制备 2、生产用种毒的制备 3、半成品的配制 4、配苗 5、疫苗的分装 6、疫苗的冻干 7、轧盖贴标 8、包装 Ⅲ成品检验 Ⅳ工艺卫生与人员卫生 Ⅴ生产设备一览表 Ⅵ包装机检查方法 Ⅶ物料平衡 Ⅷ劳动定员及劳动保护 吉林和元生物工程有限公司GMP管理文件
一、目的：规定制造伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的方法和程序。 二、适用范围：适用于伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的生产的全过程 三、依据：《伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及检验试行规程》 四、责任者：生产车间、质管部。 五、正文： I 工艺流程及质量控制要点
伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）质量控制要点 II 操作细则 本品系用伪狂犬病病毒弱毒株接种于鸡胚成纤维细胞收获感染病毒液，加适宜稳定剂，经冷冻干燥制成，用于预防猪、牛及绵羊伪狂犬病。
1 制苗材料的制备 条件准备 根据细胞制备所需物品及设备条件，进行全面准备。 按使用时间，提前做好灭菌工作后将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。 在工作开始前30～40min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。 操作规则 细胞的制备 发育良好的9～10日龄SPF鸡胚。 选择9～10日龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酒棉消毒蛋壳气室部位，无菌取出鸡胚，去头、四肢和内脏，放入灭菌的玻璃器皿中，用汉克氏液洗涤胚体，用灭菌剪刀剪成米粒大小的组织块，再用汉克氏液洗涤2～3次，然后加%胰酶溶液（每胚4ml），～℃消化20～30分钟，吸出胰酶溶液，用汉克氏液洗涤2～3次再加入适量的营养液（用含5%～10%犊牛血清乳汉液，加适宜的抗生素适量）吹打，用4～6层纱布过滤，制成每1ml 含活细胞数约100～150万的细胞悬液，分装于培养瓶中进行培养，形成单层后备用。 细胞培养物应无细菌、霉菌（见《无菌（纯粹）检验标准操作规程》）和支原体（见《支原体检验标准操作规程》）污染，无特异性病变。 将细胞冻融液接种Marc-145细胞，应不出现任何病变（见《外源病毒检测标准操作规程》）。 清场和记录 工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。 全面填写《生产工序记录》。 2 生产用毒种的制备 条件准备 根据毒种制备所需物料及设备条件，进行全面准备。 按使用时间，将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。 在工作开始前30～40min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。 操作规则
详解某猪场猪伪狂犬的病例治疗过程及其预防措施 近几年来，伪狂犬发病已无明显季节性，发病率升高，已成为除蓝耳病以外危害母猪繁殖性能的第二大传染病。该病引起母猪繁殖障碍易被临床诊断忽略，延误治疗，严重影响猪场的经济效益。因此，做好伪狂犬病的诊断与防治对提高猪场母猪生产性能和仔猪成活率来说意义重大。现兽医师根据其临床病例和查阅诸多资料后整理出以下关于猪伪狂犬病的诊断要点和防治措施，希望能为广大养殖户提供参考。 1. 临床诊断要点： 母猪：临床症状不明显。主要引起引起母猪顽固性不发情，母猪流产。伪狂犬病引起的流产在母猪妊娠各期均会发生，但以妊娠前期和妊娠中期最易发，且多为木乃伊胎和死胎。 仔猪：主要危害3-7日龄新生仔猪，可谓“九死一生”。病猪多呈现出体温升高，出现神经症状，如头后仰、口吐沫、四肢泳动。四肢软而无力，多见于后肢，眼睑肿大，拉黄色稀粪（用抗生素类药物无效）。 保育猪：少数发生，死亡率低。主要表现的神经症状，猪歪头。 2. 剖检病变： 发病仔猪的解剖病理变化有：肝、脾出现黄白色针尖大小的坏死点；脑膜出血；肾脏点状出血；扁桃体出血坏死。注意和猪瘟的鉴别诊断：猪瘟表现为新生仔猪肾脏不仅有点状出血，且肾脏凹凸不平；扁桃体大面积的出血坏死。 3 治疗与预防： 根据新联大实施的猪场伪狂犬净化系统方案，结合临床实际应用效果开出以下治疗和预防方案： (1) 2000斤饲料添加： 倍能佳或食达旺 1袋 氟奇康泰 2袋 替妙 6袋连用7天 清热散 1袋 <联毒克 3袋如果采食量下降请酌情添加，如有病毒感染请添加> (2) 使用疫苗对伪狂犬病进行防控： 免疫接种：
●后备猪应在配种前实施至少2次伪狂犬疫苗的免疫接种，2次均可使用基因 缺失弱毒苗。 ●经产母猪应根据本场感染程度在怀孕后期（产前20-40天或配种后75-95天） 实行1-2次免疫。母猪免疫使用灭活苗或基因缺失弱毒苗均可，2次免疫中至少有1次使用基因缺失弱毒苗，产前20-40天实行2次免疫的妊娠母猪，第一次使用基因缺失弱毒苗，第二次使用蜂胶灭活苗较为稳妥。 ●哺乳仔猪免疫根据本场猪群感染情况而定。本场未发生过或周围也未发生过 伪狂犬疫情的猪群，可在30天以后免疫1头份灭活苗；若本场或周围发生过疫情的猪群应在19日龄或23-25日龄接种基因缺失弱毒苗1头份；频繁发生的猪群应在仔猪3日龄用基因缺失弱毒苗滴鼻。 ●疫区或疫情严重的猪场：保育和育肥猪群应在首免3周后加强免疫1次。
实践Practice 文 ⊙ 周远成 畜禽生物制品四川省重点实验室 张 冰 四川华神兽用生物制品有限公司 李 碧 四川农业大学动物医学院 2011年至今，全国范围内的猪伪狂犬病暴发后，国内学者分离到大量新毒株，如HeN1及TJ株。基因组分析结果表明，新毒株与以往分离的PRV毒株相比存在转换、插入和缺失变异的特点。实验结果证实SA215对伪狂犬病经典毒株和新流行毒株均具有优异的免疫保护能力，能有效保护猪只免受猪伪狂犬病野毒的感染。 猪伪狂犬病活疫苗（SA215株，扑伪优） 对新流行伪狂犬病病毒具有良好的免疫保护力 2011年底河南、山东等地先后暴发猪伪狂犬病，随后迅速扩散至我国主要生猪养殖区域，给养猪业造成了巨大的经济损失。为了研究猪伪狂犬病活疫苗（SA215株）对新流行猪伪狂犬病病毒的免疫效力，本研究对猪伪狂犬病活疫苗SA215株和新流行伪狂犬病野毒株的主要免疫保护相关基因进行遗传进化分析，使用断奶仔猪模型评价猪伪狂犬病活疫苗SA215株对猪伪狂犬病病毒和新流行毒株的免疫效力。结果显示，猪伪狂犬病病活疫苗SA215株与流行毒株均为基因II型毒株，而我国广泛使用的疫苗毒株Bartha株则为基因I型。使用SA215株免疫仔猪后1周即可检测到gB抗体，免疫后4周分别使用流行毒株SCHS株和经典毒株Fa攻毒，结果显示，未免疫攻毒的对照组全部发病、死亡，而免疫组未观察到伪狂犬病的临床症状。 伪狂犬病病毒（Psudorabies Virus，PRV）为疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科成员，基因组为线状双股DNA，核酸长度约150kb。PRV可感染多种动物（35种以上），以发热、奇痒（猪除外）、繁殖障碍、呼吸道症状和脑脊髓炎为特征。猪是PRV最主要的天然宿主，PRV感染后的临床症状与猪的年龄、免疫状态以及毒株毒力密切相关，通常情况下易感猪群年龄越小感染后发病率和死亡率越高。PRV可以在神经细胞内复制并沿神经通路传导，猪感染恢复后PRV可以潜伏在三叉神经节中而不被机体清除，在猪免疫力下降或环境应激条件下，潜伏的PRV可被激活持续在猪体 内复制并排出病毒。目前欧美发达国家已经成功根除该病，而PRV一直在我国猪群中流行，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。 2011年底，猪伪狂犬病首先在我国北方地区暴发，以繁殖障碍和育肥猪gE抗体快速转阳为主要特征。国内科研院所在疾病暴发后对该病进行了大量的研究，先后分离到多个新毒株，如HNX、ZJ01、HeN1、SMX、TJ、JS、HN1201、XJ、FJ和SCHS株等。进一步研究发现，新毒株可感染Bartha免疫猪群并造成严重的经济损失；新流行毒株传播能力强于经典野毒株，在某些猪场种猪或育肥猪gE抗体阳性率甚至达到100%。遗传进化研究结果显示，新流行毒株均为基因II型毒株，而我国广泛使用的疫苗株Bartha株则为基因Ⅰ型毒株。 疫苗免疫是防控猪伪狂犬病最经济的方法。猪伪狂犬病活疫苗SA215株是我国第一个具有完全自主知识产权的动物病毒基因工程活疫苗，开创了我国动物病毒基因工程疫苗实用化的先例。运用基因工程技术，SA215缺失了亲本毒Fa的主要毒力基因gE、gI、TK。经过生物学特性、免疫原性、遗传稳定性和安全性试验等一系列研究证实，SA215株在防控猪伪狂犬病上具有免疫原性好、安全性高、能阻止强毒入侵中枢神经等优势，可区分疫苗和野毒感染。为评价猪伪狂犬病活疫苗SA215株对新流行毒株的免疫保护效力，本研究通过遗传进化分析和免疫效力测试发现SA215与我国当 防控
伪狂犬病活疫苗质量标准 本品系用伪狂犬病弱毒株接种鸡胚成纤维细胞培养 ,收获细胞培养物 ,加适当稳定剂 ,经冷冻真空干燥制成 ,用于预防猪、牛及绵羊伪狂犬病。 【物理性状】本品为微黄色海绵状疏松团块。加P B S液后迅速溶解呈均匀的混悬液。 【无菌检验】按9 2版兽用生物制品规程附录2页进行 ,应无菌生长。 【支原体检验】按9 2版兽用生物制品规程附录4页进行 ,应无支原体生长。 【外源病毒检验】按9 2版兽用生物制品规程附录6页第2. 2进行 ,应符合规定。 【病毒含量测定】每批疫苗任抽样1瓶 ,按瓶签注明头份稀释测毒价 ,每头份不低于5000个T C I D _ ( 50)(半数细胞感染量 )。 【安全检验】每批疫苗任抽样1瓶 ,按瓶签注明头份稀释 ,肌肉接种6～ 18月龄无伪狂犬病毒中和抗体的绵羊2头,每头5m l (含10头剂 ) ,观察14天 ,应无临床反应。 【效力检验】每批疫苗任抽样1瓶 ,按瓶签注明头份稀释成每毫升含1/50头剂 ,肌肉接种6～ 18月龄绵羊4头,每头1m l , 14天
后连同条件相同的无伪狂犬病毒中和抗体对照羊3头 ,每头肌肉注射强毒1m l (含1000L D_ ( 50) )观察14天 ,免疫羊应4/4保护 ,对照羊至少2/3发病死亡 ,为合格。 【剩余水分测定】按9 2版曾用生物制品规程附录12页进行 , 应符合规定。 【真空度测定】按9 2版兽用生物制品规程附录13页进行 ,应符合规定。 【作用与用途】用于预防猪、牛和绵羊伪狂犬病。注苗后第6天产生免疫力 ,免疫期为1年。 【作法与用量】按瓶签注明的头剂 ,用PB S稀释 ,每一头剂为1m l ,肌肉注射。 猪 :妊娠母猪及成年猪注2头剂。3月龄以上仔猪及架子猪注1头剂。乳猪每一次注1/2头剂 ,断乳后再注1头剂。 牛1岁以上牛3头剂 5～ 12月龄牛2头剂 2～ 4月龄犊牛第1次1头剂 ,断乳后再注2头剂。 绵羊4月龄以上者1头剂。 【注意事项】 1.本疫苗用于疫区及受到疫病威胁的地区。在疫区点内 ,除已发
伪狂犬病活疫苗 Company number：【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】
伪狂犬病活疫苗 （Bartha-K61株）生产工艺规程编制人：年月日 审核人：年月日 批准人：年月日 目录 一、目的：伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）生产工艺规程的方法和程序。 二、适用范围：适用于伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的生产的全过程 三、依据：《伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及检验试行 规程》 四、责任者：生产车间、质管部。 五、正文： Ⅰ工艺流程及质量控制要点 Ⅱ操作细则 1、制苗材料的制备 2、生产用种毒的制备 3、半成品的配制 4、配苗 5、疫苗的分装 6、疫苗的冻干 7、轧盖贴标
8、包装 Ⅲ成品检验 Ⅳ工艺卫生与人员卫生 Ⅴ生产设备一览表 Ⅵ包装机检查方法 Ⅶ物料平衡 Ⅷ劳动定员及劳动保护 吉林和元生物工程有限公司GMP管理文件 一、目的：规定制造伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的方法和程序。 二、适用范围：适用于伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的生产的全过程 三、依据：《伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及检验试行规程》 四、责任者：生产车间、质管部。 五、正文：
I 工艺流程及质量控制要点
伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）质量控制要点 II 操作细则 本品系用伪狂犬病病毒弱毒株接种于鸡胚成纤维细胞收获感染病毒液，加适宜稳定
剂，经冷冻干燥制成，用于预防猪、牛及绵羊伪狂犬病。 1 制苗材料的制备 条件准备 根据细胞制备所需物品及设备条件，进行全面准备。 按使用时间，提前做好灭菌工作后将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。 在工作开始前30～40min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。 操作规则 细胞的制备 发育良好的9～10日龄SPF鸡胚。 选择9～10日龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酒棉消毒蛋壳气室部位，无菌取出鸡胚，去头、四肢和内脏，放入灭菌的玻璃器皿中，用汉克氏液洗涤胚体，用灭菌剪刀剪成米粒大小的组织块，再用汉克氏液洗涤2～3次，然后加%胰酶溶液（每胚 4ml），～℃消化20～30分钟，吸出胰酶溶液，用汉克氏液洗涤2～3次再加入适量的营养液（用含5%～10%犊牛血清乳汉液，加适宜的抗生素适量）吹打，用4～6层纱布过滤，制成每1ml含活细胞数约100～150万的细胞悬液，分装于培养瓶中进行培养，形成单层后备用。 细胞培养物应无细菌、霉菌（见《无菌（纯粹）检验标准操作规程》）和支原体（见《支原体检验标准操作规程》）污染，无特异性病变。 将细胞冻融液接种Marc-145细胞，应不出现任何病变（见《外源病毒检测标准操作规程》）。 清场和记录 工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。 全面填写《生产工序记录》。 2 生产用毒种的制备 条件准备
猪伪狂犬病的流行现状及防控措施 伪狂犬病（pseudorabies，pr又名aujeszky's disease，ad）是当前我国猪场最常见的传染病之一，给养猪业造成严重的经济损失。伪狂犬病是由猪疱疹病毒i型所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动物的一种以发热、奇痒（猪外除）及脑脊髓炎为主症的一种急性传染病。本病是典型的自然免疫性疾病，猪是该病最主要的储存宿主和传染源。据报道，全世界已有40多个国家和地区发生过该病的流行。 由于伪狂犬病疫苗成熟及其病原本省的特点，曾经许多养猪企业都将猪伪狂犬病的净化列入了短期目标，并实现了这个目标。但2011年以来，猪群的无序流动以及疫苗等多方面的原因，猪场伪狂犬病野毒感染率逐年升高。全国相当部分的阴性猪场一夜之间转阳，严重的甚至出现母猪流产、仔猪神经症状并死亡等典型伪狂犬症状，持续数月不能恢复。本文就伪狂犬病在猪场中的流行现状及防控措施进行简要论述。 1 伪狂犬病的流行情况 1.1 2011年前的流行情况 2011年之前全国不同区域都有伪狂犬病的发生，但是主要以散养户和小型养殖场发病为主，主要原因可能是发病猪场伪狂犬免疫不规范、引种来源复杂等。 1.2 2011年至今的流行发病情况 2011年至今伪狂犬的流行区域不断扩大，暴发不再局限于散养户和小型养殖场，大型养殖场也有发生，且表现典型的临床病症。 1.3临床表现 一是母猪流产，母猪群因为狂犬病流产的比例大约为5%。 二是10日龄内死哺乳仔猪淘率高，达15%或更高，主要表现毛松打堆，高烧，部分猪死亡前有神经症状。而初生3～4 d的仔猪，有时整窝死亡，损失很大。 三是中大猪呼吸道问题严重，临床表现为咳嗽、喘气等。常见并发传染性胸膜肺炎，导致急性死亡。 1.4 共同的病变特征 通过剖检发现，他们共同的病变特征就是扁桃体的白色坏死点。伪狂犬是疱疹病毒，疱疹病毒的特点就是对组织细胞的致死性，它引起的病变主要是脏器（扁桃体、肝、脾、肾等）的白色坏死点为主。 2 伪狂犬流行原因的探讨 2.1 毒力变异 首先免疫原性基因和独立基因的变化，使原有疫苗免疫保护力下降，其次疫苗保护时间缩短，长期超剂量免疫，免疫频繁，免疫压力造成毒株变异。 2.2 腹泻可能是伪狂犬病重新流行的原因之一 首先，腹泻导致整个猪群的免疫抑制，影响了伪狂犬疫苗的正常免疫效果，使其免疫保护周期变短，容易出现免疫空白期。其次，很多猪场因为腹泻做返饲或自家苗，如果过程处理不当，极易导致伪狂犬病毒扩散。 2.3 免疫不合理及疫病关注点下降 有两种常见的情况：一是不停的更换不同毒株的疫苗；二是不免疫仔猪和肉猪，只免疫母猪。这都是免疫不科学、免疫意识松懈、免疫程序不合理所导致的。 2.4猪场中猪群带毒 种猪带毒率偏高是伪狂犬病持续流行的重要原因。引用公猪精液、相互引种，都会传播本病。 3 伪狂犬病的总体防控措施 3.1坚持自繁自养
猪伪狂犬病的诊断鉴别 根据疾病的临诊症状，结合流行病学，可做出初步诊断，确诊必须进行实验室检查。同时要注意与猪细小病毒、流行性乙型脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、弓形虫及布鲁氏菌等引起的母猪繁殖障碍相区别。 分离 病毒分离鉴定病毒的分离是诊断伪狂犬病的可靠方法。患病动物的多种病料组织如脑、心、肝、脾、肺、肾、扁桃体等均可用于病毒的分离，但以脑组织和扁桃体最为理想，另外，鼻咽分泌物也可用于病毒的分离。病料处理后可直接接种敏感细胞，如猪肾传代细胞(pk一l5和ibrs一2)、仓鼠肾传代细胞(bhk一2l)或鸡胚成纤维细胞(cef)，在接种后24～72小时内可出现典型的细胞病变。若初次接种无细胞病变，可盲传3代。不具备细胞培养条件时，可将处理的病料接种家兔或小鼠，根据家兔或小鼠的临诊表现做出判定，但小鼠不如家兔敏感。分离到病毒后再用标准阳性血清做中和试验以确诊本病。 切片 组织切片荧光抗体检测取患病动物的病料如脑或扁桃体的压片或冰冻切片，用直接免疫荧光检查。其优点是快速，在几小时内即可获得可靠结果，对于新生仔猪，其敏感性与病毒分离相当，但对于育肥猪与成年猪，该法则不如病毒分离敏感。 pcr
pcr检测猪伪狂犬病病毒利用pcr可从患病动物的分泌物如鼻咽拭子或组织病料中扩增猪伪狂犬病病毒的基因，从而对患病动物进行确诊。pcr与病毒分离鉴定相比，具有快速、敏感、特异性强等优点，能同时检测大批量的样品，并且能进行活体检测，适合于临诊诊断。 血清学 血清学诊断多种血清学方法可用于伪狂犬病的诊断，应用最广泛的有中和试验、酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、补体结合试验及间接免疫荧光等。其中血清中和试验的特异性、敏感性都是最好的，并且被世界动物卫生组织(oie)列为法定的诊断方法。但由于中和试验的技术条件要求高、时间长，所以主要是用于实验室研究。酶联免疫吸附试验同样具有特异性强、敏感性高的特点，3～4h内可得出试验结果，并可同时检测大批量样品，广泛用于伪狂犬病的临诊诊断。另外，近几年来，乳胶凝集试验以其独特的优点也在临诊上广泛应用，操作极其简便，几分钟之内便可得出试验结果。 鉴别 鉴别诊断猪伪狂犬病病毒鉴别诊断方法是在使用基因标志疫苗的基础上应用的－类诊断方法。由于prv中存在多个非必需糖蛋白基因，缺失这些基因的病毒突变株不能产生被缺失基因所编码的糖蛋白，但又不影响病毒在细胞上的增殖与免疫原性。将这种基因缺失标志疫苗注射动物后，动物不能产生针对缺失蛋白的抗体。因此，可通过血清学方法将自然感染野毒的血清学阳性猪与注苗猪区分开来。目前，缺失疫苗缺失的糖蛋白基因主要为ge和gg基因，也有缺失gc、gb基
猪伪狂犬病净化方案 （见农业部《伪狂犬病防治技术规范》） 我国种猪场伪狂犬病净化方案内容由6个不同阶段组成，即：调查阶段、强化免疫控制、检疫淘汰、全部或部分清群、监测认证阶段和维持阶段。种猪场根据本场实际情况，分阶段逐步实施。 一、材料准备 疫苗：使用国家批准的基因缺失疫苗。 抗体检测试剂盒：检测伪狂犬病全病毒抗体或gB抗体试剂盒、区分免疫猪和感染猪的抗体鉴别检测试剂盒。试剂盒必须获得国家相关批准文号。 待净化猪群的确定：应选择健康、生产成绩稳定的种猪群开展伪狂犬病的净化。在初次开展本病净化的大型种猪场中，可先选定500-1000头母猪群开展净化，逐步推进。 二、净化方案 1、调查阶段 如果种猪群母猪大于500头，按照种母猪群数量的10%、种公猪全群采血。分离血清，用gE-ELISA检测，根据野毒抗体阳性率高低，确定种猪群（种母猪和种公猪）伪狂犬病野毒感染状态。如果母猪数量小于500头，可一次采集全部种猪的样品，检测gE抗体，根据检测结果，确定进入何种净化阶段。 1.1如果所抽检样品全部为gE抗体阴性，则种猪群全群逐头检测，如所有血清样品均为阴性，可确认种猪群为伪狂犬病野毒抗体阴性，直接进入“监测与认证”阶段； 1.2如果血清样品的gE抗体阳性率低于10%，可进入“检测淘汰”—“监测与认证维持”的净化方案； 1.3如果gE抗体阳性率在10%-20%，可实行“强化免疫控制”—“检测淘汰”—“监测与认证维持”的净化方案； 1.4如果gE抗体阳性率大于30%，则实行“全群或部分清群”措施，暂不考
虑实施净化； 1.5在全部种猪群gE抗体阴性时，可直接进入“监测与认证维持”阶段。 2.强化免疫控制阶段 使用伪狂犬病gE基因缺失疫苗免疫该猪群，同时采取生物安全和灭鼠等综合措施，达到控制的目的。 2.1免疫程序的制定 2.1.1种母猪（种公猪） 每年普免3-4次。或者母猪配种前和产前4周分别免疫一次。普免时，避免在分娩前7天内接种疫苗，以减少接种应激对分娩的影响，但可于母猪分娩后补免。 公猪每年3次免疫，采用集中普免的方式。 2.1.2仔猪 分别测定仔猪在50日龄、60日龄和70日龄时的伪狂犬病抗体（gB抗体或全病毒抗体），每个阶段抽样30份，样品来自10窝猪，每窝3头，确保采样的均衡性。根据抗体水平确定仔猪的免疫日龄。猪场可根据产房小猪和保育猪是否出现伪狂犬病(如腹泻、神经症状等)，使用出生猪滴鼻免疫的方式，克服母源抗体干扰，并以提高局部的黏膜免疫力。 2.2实验室评估 仔猪免疫后3周，检测30份血清gB或全病毒抗体和gE抗体。当gE抗体阴性时，如果85%的样品为gB抗体或全病毒抗体阳性，即可认为群体免疫合格。 2.3 临床评估 主要考察猪群的生长成绩。母猪无繁殖障碍，哺乳仔猪无尖叫、腹泻和转圈，最后死亡等现象；保育猪无神经症状，育肥猪无伪狂犬病病毒引起的呼吸道症状。 2.4配套的生物安全措施 2.4.1如需引种，只能引进伪狂犬病gE抗体阴性的后备种猪； 2.4.2对进出猪场的车辆和外来人员进行消毒； 2.4.3无害化处理病死猪和流产死胎等； 2.4.4定期灭鼠。 3、检测淘汰阶段
7 一例猪伪狂犬C 株活疫苗临床应用报告 娄昆鹏，欧伟业，彭俊平，胡永明，李江（浙江美保龙生物技术有限公司321017） 摘要：为了验证伪狂犬新毒株C 株疫苗临床应用效果，笔者在江苏某伪狂犬发病，继发急性传染性胸膜肺炎猪场诊疗过程中用于紧急接种效果明显，免疫伪狂犬C 株活疫苗对提升中大猪生产指标、减少呼吸道疾病很有帮助。 关键词：伪狂犬；C 株；传染性胸膜肺炎 呼吸道类疾病是养猪场常见多发病，该类疾病成为长期困扰猪场的难题，特别是冬春季节，中大猪呼吸道疾病尤为严重。该类疾病常始发于猪伪狂犬病、猪蓝耳病、猪流感等，进而继发传染性胸膜肺炎等，即：发于病毒、死于细菌。这种混合感染给养猪场造成很大的经济损失。本文就笔者诊治一起猪伪狂犬病、急性传染性胸膜肺炎引起的呼吸道疾病病例做一阐述。 1猪场背景 江苏某生态猪场：700头母猪，设施及环境不佳，单点饲养。种猪常年普免B 株伪狂犬苗，4次/年；仔猪3～5日龄滴鼻，60日龄免疫1头份，105日龄免疫1头份。 2临床症状 育肥猪养至16～18周龄，呼吸道疾病严重，表现为咳嗽、呼吸困难、犬坐姿势、急性死亡病猪口鼻流出血样泡沫液体，怀疑是传染性胸膜肺炎造成。添加替米考星等药物有所好转，但停药后又复发，育肥期药费居高不下。剖检气管充满红色泡沫，肺部间质增宽，可见白色坏死灶，胸腔有黄色胶冻样渗出物。 3实验室检测 取肺部、脑部、淋巴结、扁桃体进行伪狂犬、蓝耳病、圆环病毒2型、猪瘟做PCR 病原检测，取肺部进行细菌分离鉴定。 3.1PCR 诊断结果表明：猪瘟、蓝耳病和圆环病毒2型均为 阴性，伪狂犬野毒为阳性。 3.2细菌分离培养鉴定为放线杆菌和巴氏杆菌，放线杆菌 是胸膜肺炎的主要感染细菌。 3.3临床症状结合实验室检测，确认病因为猪伪狂犬感染， 继发传染性胸膜肺炎造成中大猪呼吸道疾病，导致大量死亡。 4处理方案 4.1100日龄以上育肥猪紧急免疫2头份伪狂犬C 株活疫 苗（浙江某厂家生产，商品名：“安为佳”，批号：271803）。 4.2药物治疗：育肥猪全群加药，替米考星160ppm ，氟苯尼 考200ppm ，电解多维适量，连用7d 。 4.3卫生消毒：肥猪舍彻底清粪，消毒，空栏时间不低于7d ， 育肥猪做到全进全出。 4.4免疫程序调整：全群改用伪狂犬C 株活疫苗，程序：母猪 普免，一年4次，每次每头猪免疫1头份；仔猪1日龄滴鼻0.5头份；9周龄、11周龄和15周龄免疫1头份。 5效果 5.1方案执行后7d 左右育肥猪死亡逐步停止，呼吸道疾病 得到控制，逐步好转，育肥期日死亡率由高于2.6‰降至0.3‰以 下。 5.2使用安为佳后，每批育肥猪伪狂犬引起的呼吸道疾病得 到了很好的控制，育肥猪每月用药量减少2/3。 5.3育肥猪提前7～10d 出栏。 5.4全群使用伪狂犬C 株活疫苗后，猪群整体表现平稳，生 产成绩和效益逐步提高。 6讨论 猪传染性胸膜肺炎是集约化猪场常发的呼吸道传染病，急性胸膜肺炎的死亡率很高，如果没有及时发现并治疗，会造成大面积感染，甚至死亡。慢性病反复咳喘，饲料报酬低，药费增加，该病已成集约化猪场的一大困扰。众多病例表明，育肥猪gE 抗体一般在13～16周龄时由阴转阳，育肥后期PRV gE 抗体阳性率快速升高是导致传染性胸膜肺炎暴发的主要诱因。育肥期反反复复的咳嗽、气喘等呼吸道病，连续给予对应抗生素治疗7～10d 仍不见好转，应重点考虑伪狂犬病。 伪狂犬C 株活疫苗是2011年由浙江某伪狂犬发病场分离，由于其采自田间新流行毒株，与目前猪场感染的野毒株匹配度高，免疫原性好。另据报道，伪狂犬C 株自然缺失毒力基因gE 和 gI ，安全性高，抗潜伏感染和减少排毒方面优于传统伪狂犬疫苗， 从本病例可知C 株在伪狂犬发病场用来紧急免疫有不错的效果。 器系数影响不大。3.2食蟹猴脏器系数与猕猴脏器系数比较 食蟹猴脏器系数与猕猴9项脏器系数比较中，有6项脏器系数与猕猴的脏器系数相近似，有2项低于猕猴（详见表3），数据显示食蟹猴的脏器系数与猕猴[2]既有相似性，又有区别[1]，在动物实验中可供参考。 3.3从病理学的角度上分析 当脏器出现细胞肿胀、水肿、充血、出血、积水、增生、肥大、肿大和新生物等病理变化时，该脏器的重量可能增加；当脏器出现脱水、萎缩、萎陷、坏死和腐离等病理变化时，该脏器的重量可能减少。因此，在许多医学研究和药物慢性实验中，测定动物的主要脏器及脏器系数是一项必不可少的重要内容，它是作为判 断药物或某些因素对体内主要器官影响的一个主要参考指标[3]。因此实验动物正常脏器重量及脏器系数是动物实验中常用的重要基础数据。本实验的目的是为食蟹猴在科学研究中提供基础对照参考值。 参考文献 [1]候进怀,李卫国等.太行山猕猴脏器测量报告[J].河南师范 大学学报（自然科学版）.2000,4-8. [2]郝光荣.实验动物学[M].西安:第二军医大学出版社,1998.34-35. [3]袁伯俊.新药评价基础[M].西安:第二军医大学出版社,2002.78-79.
国内伪狂犬病的流行现状和危害 核心提示： 伪狂犬病（Pseudorabies）是当前我国猪场一种非常重要的病毒性疾病，给感染猪场造成严重的经济损失，引起种猪繁殖障碍、新生仔猪神经症状及高 死亡率，同时也是猪呼吸系统疾病综合征（PRDC）的重要原发性病原，伪狂犬 病与蓝耳病和猪瘟等病毒性感染在猪群的持续存在也是猪病复杂的重要原因，同时给我国养猪业造成严重的损失，对种猪场，除了经济损失外，伪狂犬野毒 阳性对于品牌和贸易同样带来较大的负面影响，严重影响猪肉出口和种猪的销售。 伪狂犬病（Pseudorabies）是当前我国猪场一种非常重要的病毒性疾病，给感染猪场造成严重的经济损失，引起种猪繁殖障碍、新生仔猪神经症状及高死亡率，同时也是猪呼吸系统疾病综合征（PRDC）的重要原发性病原，伪狂犬病与蓝耳病和猪瘟等病毒性感染在猪群的持续存在也是猪病复杂的重要原因，同时给我国养猪业造成严重的损失，对种猪场，除了经济损失外，伪狂犬野毒阳性对于品牌和贸易同样带来较大的负面影响，严重影响猪肉出口和种猪的销售。 海博莱实验室近年来对我国规模猪场猪伪狂犬感染现状进行了系统的监测与分析。2006年监测中国部分省市规模化猪场伪狂犬野毒感染率的结果显示（本报告发表于《猪业科学》2007年第11期），约有超过一半的（52%）的规模猪场伪狂犬野毒阳性。样品阳性率为16.9%。全国种猪感染率为18.2%，阳性场种猪的感染率为33%。 在2007年所检测的131个规模化猪场中，81个猪场为伪狂犬野毒阳性，猪场阳性率63.4%，在7445份血清中，总样品阳性率为14.8%。2007年所检测的所有猪场3620份种猪样品中，18.2%的种猪为野毒抗体阳性，伪狂犬阳性场中，阳性种猪比例为27.2%（本报告发表于《猪业科学》2008年第10期）。
猪伪狂犬病病毒gpI抗体检测 自备材料 1. 50、100μl 精确微量移液器或连续移液器。 2. 一次性移液器吸头。 3. 配制洗涤液的500ml 量筒。 4. 96 孔板酶标仪。 5. 稀释样品的玻璃或塑料管。 6. 蒸馏水或去离子水。 7. 滴加和吸去洗涤液的装置。 使用注意事项 1. 处理所有的PRV 材料以免PRV 的传播。抗原包被微孔板虽然经过化学处理，仍可能成为PRV 的传染源。 2. 勿用口移液。 3. 使用样品和试剂盒的场所不要吸烟、喝水和吃东西。 4. TMB 底物和终止液对皮肤有刺激性。 5. 试剂盒的某些成分含有防腐剂叠氮钠。处理时需要用大量的水冲洗以免形成叠氮化铜或叠氮化铅，它们在受压时可以爆炸。注意防止该成分对酶标抗PRV gpI 抗体的污染。 6. TMB 不要暴露于强光和任何氧化剂。使用洁净的玻璃或塑料容器盛装TMB 底物液。 7. 所有的试剂应在2－7℃储存。使用前恢复到室温，使用后放回2－7℃。 8. 所有的废弃液应在丢弃前合理处理以免污染环境。 9. 注意防止试剂盒成分的污染。 10.不要使用超过有效期限的试剂，不同批次试剂盒的成分不要混用。 11.严格遵守这些条款可以获得理想的结果。操作过程中的移液、时间和洗涤必须精确。 样品的制备 用样品稀释液将被检样品稀释2 倍 (1:2)。 取每个样品后都要更换吸头，准确记录每个样品在板上的位置。每个样品应在滴加到PRV 包被板前应混匀。 洗涤液的制备 浓缩洗涤液应在使用前恢复至室温并使沉淀的盐溶解。使用前浓缩洗涤液应用蒸馏水或去离子水10 倍稀释（例如：每块板用30ml 浓缩液加上270ml水）。 操作步骤 使用前所有试剂应恢复至室温。试剂应轻轻旋转或震荡予以混合。 1.取出抗原包被板，在记录表上记录样品的位置。 2.在A1，A2 和A3 孔内加入100μl 两倍稀释(1:2)的阴性对照。 3.在A4，A5 孔内加入100μl 两倍稀释(1:2)的阳性对照。 4.在其余的孔内分别加入100μl 已稀释好的被检样品。 5.室温下孵育1 小时或2－8℃孵育过夜(可以将微量反应板用封条封闭)。 6.用大约300μl 洗涤液洗涤板孔，重复3－5 次。每次洗涤时洗涤液都应吸出丢弃。在洗板和加入标记物之间应避免包被板变干。在最后一次洗涤液吸出后，将板中残留洗涤液扣拍到吸水材料上。 7.每孔加入100μl 辣根过氧化物酶标记抗PRV gpI 抗体。 8.室温下孵育20 分钟。