反应次数目录号反应次数
04 379 012 001
50次，包括10次对照反应
04 896 866 001
100次
04 897 030 001
200次
试剂盒包装与含量小瓶/瓶盖标签适用于a) 04 379 012 001 b) 04 896 866 001 c) 04 897 030 001
1
红色
Transcriptor
Reverse
Transcriptase（逆转录酶）
a) 1瓶，25 μl (20 U/μl)
b) 1瓶，50 μl (20 U/μl)
c) 2瓶，各50 μl (20 U/ μl)
储存缓冲液：200 mM 磷酸钾，2 mM 二硫苏糖醇，0.2% Triton X-100(v/v)，50% 甘油(v/v)，pH 约为7.2?
2
无色
Transcriptor RT
Reaction Buffer(5×)
（逆转录缓冲液）
a) 1瓶，1 ml
b) 1瓶，1 ml
c) 2瓶，各1 ml
5×浓度：250 mM Tris/HCl，150 mM KCl，40 mM MgCl2，pH约为8.5(25°C)?
3
无色
Protector
RNase Inhibitor
（RNase抑制剂）
a) 1瓶，50 μl(40 U/μl)
b) 1瓶，100 μl(40 U/μl)
c) 2瓶，各100 μl(40 U/μl)
储存缓冲液：20 mM Hepes-KOH，50 mM KCl，8 mM 二硫苏糖醇，50 % 甘油(v/v)，pH 约为7.6 (4°C)?
4
黄色/ 紫色
Deoxynuc-leo-tide
Mix
（dNTP）
a) 1瓶，100 μl(黄色瓶盖)
b) 1瓶，200 μl(紫色瓶盖)
c) 2瓶，各200 μl(紫色瓶盖)
dATP, dCTP, dGTP, dTTP各10 mM?5
蓝色
Anchored-oligo(dT)18
Primer
（锚定oligo(dT)18引物）
a) 1瓶，100 μl(50 μM)
b) 1瓶，200 μl(50 μM)
c) 2瓶，各200 μl(50 μM)
6
Random Hexamer
a) 1瓶，100 μl(600 μM)
蓝色
Primer（随机引物）
b) 1瓶，200 μl(600 μM)
c) 2瓶，各200 μl(600 μM)
7
绿色
Control RNA
（对照RNA）
a) 1瓶，20 μl(50 ng/μl)
包含提取于永生细胞系(K562)的总RNA 片段稳定溶液?
8
绿色
Control Primer Mix PBGD
（对照基因引物）
a) 1瓶，40 μl
5 μM 人类PBGD特异性正向与反向引物?
9(b和c为瓶7)
无色
Water, PCR-grade
a) 1瓶，1 ml
b) 2瓶，各1 ml
c) 3瓶，各1 ml
注意：货号为04 896 866 001和04 897
030 001的产品不含有control试剂(瓶7
和瓶8)，因此瓶7即为Water, PCR-grade。储存条件及其稳定性
请将该产品存放于-15~-25°C条件中，并于产品标签上的有效期之前使用。注意：Control RNA(货号04 379 012 001的瓶7)应储存于-70°C条件。请避免将产品反复冻融！
2 产品使用方法
2.1 实验前准备
样本材料
RNA模板：分离的总RNA，mRNA，病
毒RNA或体外转录的RNA。
注意：想要得到较好的RT结果，使用高质量完整的RNA(不含基因组DNA残留、RNA酶、抑制剂)是必要的。请根据以下
预防措施进行操作，避免使RNA在分离
过程中受到RNA酶的污染(从细胞裂解开始)：
- 使用RNA酶抑制剂(如Protector RNase Inhibitor)或在使RNA酶失活的分离条件下进行操作。
- 如果有必要，用凝胶电泳分析过程中不同步骤(裂解、分离)以确保样本中不含有RNA酶。
- 请记住RNA酶也可能出现在受到污染
的玻璃容器中。
为了准备总RNA或mRNA，我们建议您使用罗氏应用科学部的试剂。为了筛选出能够产生高质量的适用于RT-PCR的完
整RNA模板，请参考第3部分。补充信息：想了解订货信息或查看相关核酸分离纯化指南，请访问
https://www.doczj.com/doc/7717720875.html,/napure.想了解关于使用MagNA Pure LC
System或MagNA Pure Compact System进行核酸自动分离的更多信息，
请访问https://www.doczj.com/doc/7717720875.html,.
引物
六聚物随机引物?
在常规的RT反应中，使用5μg的总RNA 模板，可采用60μM的随机引物终浓度。使用5μg总RNA并增加随机引物浓度，将增加短片段PCR产物（的产率，但是相应地，长片段PCR产物及全长转录子
的产率会降低。在非特异引物的反转录方法中，随机引物法是最多使用的一种方法，其特异性的扩增产物只能通过后续的
PCR反应中使用特异的PCR引物获得。锚定oligo(dT)18引物?
锚定oligo(dT)18引物特异性地结合在带
有poly(A)+的RNA片段上，这类片段通
常只占总RNA的1-2%，因此用锚定
oligo(dT)18引物进行反转录所获得的cDNA产率大大低于随机引物方法。如果实验是为了获得新mRNA的RT-PCR产物，则推荐使用锚定oligo(dT)18引物。
使用该方法获得的RT-PCR产物具有较
强的一致性。
特异性序列引物?
使用特异性序列引物，其终浓度推荐为
2μM。但是请注意，即使这些引物在以DNA作为模板的PCR反应中成功获得扩增产物，相同的引物序列却可能难以定位在cDNA片段上。如果遇到此类情况，请使用锚定oligo(dT)18引物重新进行第一
链合成反应。
2.2 实验流程
标准RT-PCR流程
在此提供两种不同的操作流程：
A：反转录使用锚定oligo(dT)18引物或
六聚物随机引物或特异性序列引物。在大多数情况下，只选择其中的一种引物进行cDNA合成。?
B：反转录使用oligo(dT)18引物和六聚
物随机引物的混合物。这种方法可提高反应敏感度，但与使用单一oligo(dT)18引
物比起来反应特异性会降低。?
注意：根据您使用的引物类型，参考以下给出的流程A与B。
流程A：使用锚定oligo(dT)18引物或六
聚物随机引物或特异性序列引物合成cDNA。
以下描述的条件适用于两步法RT-PCR
的第一链cDNA合成。图1为单一反应和多重反应中cDNA合成流程概述。
单一反应
多重反应
RNA+引物+水
可选：变性
10min 65°C
冰上配置多重RT反应混合液(除RNA模板)并分装到各反应管
添加模板RNA到每个反应管中
置于冰上，添加缓冲液，RNase Inhibitor，dNTPs，Transcriptor RT
锚定oligo(dT)18引物/特异性序列引物30min 55°C或1h 50°C
六聚物随机引物
10min 25°C
30min 55°C或1h 50°C
85°C失活5min
添加1-5 μl至PCR体系或RT-PCR体系准备
cDNA合成
图1：单一反应和多重反应中cDNA合成流程概述
①
使用前先将所有冷冻试剂解冻。?
开始实验前将所有试剂轻度离心。?
实验开始后保持将所有试剂置于冰上。?②
将无菌、无核酸酶、薄管壁的PCR管置于冰上，以20 μl反应体系为例，按照以下组分准备模板-引物混合物。
注意：进行与RNA相关的操作时请保持配戴手套。
模板-引物混合物(1次反应) 成分体积最终浓度
总RNA或
poly(A)+ mRNA
1 μg 总RNA或
10 ng poly(A)+ mRNA
引物- 以下任选其一：
Anchored-oligo(dT)18 Primer, 50
pmol/μl (瓶5)
1 μl
2.5 μM 或Random Hexamer Primer, 600 pmol/μl (瓶6)
2 μl
60 μM
或Sequence-Specific Primer 可变
0.5-2.5 μM
Water, PCR-grade (瓶7或9)
可变
使总体积为13 μl
总体积
13 μl
以上为初实验的建议浓度。为了得到合适的模板浓度，需要使总RNA的量在10 ng 到5 μg之间，使mRNA的量在1 ng到100ng之间。
注意：当RNA样本浓度较低(< 10 μg/ml)时，添加10 μg/ml MS2 RNA*以使RNA 模板稳定。
③
可选步骤：
在65°C条件下加热反应管10min使模板-引物混合物变性。此步骤可确保RNA 二级结构变性。?
立即将反应管置于冰上冷却。?
④
在含有模板-引物混合物的反应管中加入下表中其余的RT反应液组分。成分体积最终浓度
Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer, 5×(瓶2)
4 μl
1×
(8 mM MgCl2)
Protector RNase Inhibitor,
40 U/μl(瓶3)
0.5 μl
20 U
Deoxynucleotide Mix,
每种dNTP各10 mM(瓶4)
2 μl
每种dNTP各1 mM
Transcriptor Reverse Transcriptase,
20 U/μl(瓶1)
0.5 μl
10 U
最终体积
20 μl
⑤
在反应管中将试剂小心混匀。?
注意：不要旋涡！
将反应管轻度离心使样本收集于反应管
底部。?
反应时使用带热盖的加热模块，防止反
应管中的液体挥发。?
⑥
根据您所使用的引物以及目标mRNA的
长度，RT反应孵育时间参考下表：使用的引物目标mRNA的长度RT反应孵育时间
Anchored-oligo(dT)18 Primer, 50
pmol/μl 或Sequence-Specific Primer
不超过4 kb
55°C下30min
超过4 kb
50°C下60min
Random Hexamer Primer, 600 pmol/μl
不超过4 kb
25°C下10min，
之后55°C下30min
超过4 kb
25°C下10min，
之后50°C下60min
⑦
加热至85°C维持5min使Transcriptor Reverse Transcriptase失活。?
将反应管置于冰上以终止反应。?
反应管在+2~+8°C下可保存1-2小时，
在-15~-25°C下可保存更长时间。?
⑧
此cDNA产物无需经过纯化即可用于
PCR反应。
一般来说，使用1-5 μl 第一链cDNA作为模板加入PCR体系中。若是最初的实验，可尝试在50 μl PCR体系中使用2 μl cDNA作为模板。?
如果在LightCycler System上进行PCR，在20 μl 的反应体系中使用2-5 μl cDNA
或cDNA稀释液。?
注意：逆转录反应工作液中MgCl2的最终浓度为8 mM，因此PCR反应混合液中每μl 的cDNA反应液模板带入了8 nmol MgCl2,根据实际需要优化反应液中的MgCl2浓度。
Transcriptor Reverse Transcriptase具有RNaseH活性。在cDNA合成结束后RNaseH可除去RNA模板，这使得PCR 引物更容易与cDNA结合，在某些情况下，这会提高PCR反应的灵敏度。
流程B：使用锚定oligo(dT)18引物和六聚物随机引物合成cDNA。
以下描述的条件适用于两步法RT-PCR
的第一链cDNA合成。
①
使用前先将所有冷冻试剂解冻。?
开始实验前将所有试剂轻度离心。?
实验开始后保持将所有试剂置于冰上。?②
将无菌、无核酸酶、薄管壁的PCR管置于冰上，以20 μl反应体系为例，按照以下组分准备模板-引物混合物。
注意：进行与RNA相关的操作时请保持配戴手套。
模板-引物混合物(1次反应) 成分体积
最终浓度
总RNA或
poly(A)+ mRNA
1 μg 总RNA或
10 ng poly(A)+ mRNA
Anchored-oligo(dT)18 Primer,
50 pmol/μl (瓶5)
1 μl
2.5 μM 和Random Hexamer Primer,
2 μl
60 μM
600 pmol/μl (瓶6)
Water, PCR-grade (瓶7或9)
可变
使总体积为13 μl
总体积
13 μl
以上为初实验的建议浓度。为了得到合适的模板浓度，需要使总RNA的量在10 ng 到5 μg之间，使mRNA的量在1 ng到100ng之间。
注意：当RNA样本浓度较低(< 10 μg/ml)时，添加10 μg/ml MS2 RNA*以使RNA
模板稳定。
③
可选步骤：
在65°C条件下加热反应管10min使模板-引物混合物变性。此步骤可确保RNA 二级结构变性。?
立即将反应管置于冰上冷却。?
④
在含有模板-引物混合物的试管中加入下表中其余的RT反应液组分：成分体积最终浓度
Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer, 5×(瓶2)
4 μl
1×
(8 mM MgCl2)
Protector RNase Inhibitor,
40 U/μl(瓶3)
0.5 μl
20 U
Deoxynucleotide Mix,
每种dNTP各10 mM (瓶4)
2 μl
每种dNTP各1 mM/
Transcriptor Rerverse Transcriptase, 20 U/μl(瓶1)
0.5 μl
10 U
最终体积
20 μl
⑤
在反应管中将试剂小心混匀。?
注意：不要旋涡！
将试管轻度离心使样本收集于反应管底部。?
反应时使用带热盖的加热模块，防止反应管中的液体挥发。?
⑥
根据您所使用的引物以及目标mRNA的长度，RT反应孵育时间参考下表：使用的引物目标mRNA的长度RT反应孵育时间
Anchored-oligo(dT)18 Primer,
50 pmol/μl 和Random Hexamer Primer,600 pmol/μl
不超过4 kb
25°C下10min，
之后55°C下30min
超过4 kb
25°C下10min，
之后50°C下60min
⑦
加热至85°C维持5min使逆转录酶失活。?
将反应?管置于冰上以终止反应。
反应管在+2~+8°C下可保存1-2小时，
在-15~-25°C下可保存更长时间。?
⑧
此cDNA产物无需经过纯化即可加入用于PCR反应。
一般来说，使用1-5 μl 第一链cDNA作为模板加入PCR体系中。若是最初的实验，可尝试在50 μl PCR体系中使用2 μl cDNA作为模板。?
如果在LightCycler System上进行PCR，在20 μl 的反应体系中使用2-5 μl cDNA
或cDNA稀释液。?
注意：逆转录反应工作液中MgCl2的最终浓度为8 mM。因此PCR反应混合液中每μl 的cDNA反应液模板带入了8 nmol MgCl2,根据实际需要优化反应液中的MgCl2浓度。Transcriptor Reverse Transcriptase具有RNaseH活性。在cDNA合成结束后RNaseH可除去RNA
模板，这使得PCR引物更容易与cDNA
结合，在某些情况下，这会提高PCR反
应的灵敏度。
2.3 对照反应
cDNA合成
目录号为04 379 012 001的产品提供的
对照反应包括Control RNA的逆转录，以及后续的在常规热循环仪或LightCycler
仪器上进行的扩增检测151bp的PBGD
片段的PCR反应。
以下为两步法RT-PCR对照实验中第一
链cDNA合成的条件。
注意：实验开始前应将热循环仪预热至
RT反应的温度(步骤4)。
①
使用前先将所有冷冻试剂解冻。?
开始实验前将所有试剂轻度离心。?
实验开始后保持将所有反应剂置于冰上。?
②
将无菌、无核酸酶、薄管壁的PCR管置
于冰上，按照以下成分准备含模板-引物混合物的20 μl反应体系。
注意：进行与RNA相关的操作时请保持
配戴手套。
模板-引物混合物(1次反应) 成分体积
最终浓度
Control RNA
2 μl
100 ng
Anchored-oligo(dT)18 Primer,
50 pmol/μl (瓶5)
1 μl
2.5 μM
Water, PCR-grade
10 μl
使总体积为13 μl
总体积
13 μl
③
添加以下成分成分体积最终浓度Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer, 5×(瓶2)
4 μl
1×
(8 mM MgCl2)
Protector RNase Inhibitor,
40 U/μl(瓶3)
0.5 μl
20 U
Deoxynucleotide Mix,
每种dNTP各10 mM(瓶4)
2 μl
每种dNTP各1 mM
Transcriptor Reverse Transcriptase
20 U/μl(瓶1)
0.5 μl
10 U 最终体积
20 μl
吹打混匀。?
用微量离心机轻度离心。?
④
55°C下孵育30min
⑤
加热至85°C维持5min使逆转录酶失活。?
将反应管置于冰上以终止反应。?
⑥
反应管在+2~+8°C下可储存1-2小时，
在-15~-25°C下可储存更长时间。?
PBGD PCR
实验得到的单链cDNA可利用提供的PBGD特异性引物通过聚合酶链式反应
进行扩增。这个过程可以利用常规热循环仪或LightCycler仪器完成。
在PCR反应体系为50 μl的常规热循环反应(使用FastStart Taq DNA Polymerase*)中加入5 μl cDNA反应液。?
采用LightCycler 1.5 System或LightCycler2.0 System进行的反应总体
积为20 μl的real-time PCR (使用LightCycler FastStart DNA Master
SYBR Green I*)中加入2 μl cDNA反应液。?
采用LightCycler 480 System进行的反
应总体积为20 μl的real-time PCR (使用LightCycler 480 SYBR Green I Master*)
中加入2 μl cDNA反应液。?
想要了解更多PCR或real-time PCR的更多具体信息，请阅读FastStart Taq DNA Polymerase*、LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green*、LightCycler 480 SYBR Green I Master*相关使用说明。
常规热循环仪PCR
根据以下流程准备50 μl标准反应体系。
在做RT对照反应管之余，以水替代cDNA 模板加入反应体系作为阴性对照。
①
使用前先将所有冷冻试剂解冻。?
开始实验前将所有试剂轻度离心。?
实验开始后保持将所有试剂置于冰上。 ②
将薄管壁的PCR管置于冰上，配置50 μl 的PCR反应体系,在同一反应管中依次加入下表中各个组分。
成分体积最终浓度
含20 mM MgCl2 的FastStart
Buffer(10×)
5 μl
1×
PCR Nucleotide Mix*(10 mM)
1 μl
0.2 mM
Control Primer MIX PBGD(5 μM)
2 μl
0.2 μM
cDNA from Control RT Reaction
5 μl
FastStart Taq DNA Polymerase*(5 U/μl) 0.4 μl
2 U
Water, PCR-grade
36.6 μl
总体积
50 μl
③
在带有热盖的热循环系统中进行PCR或在反应体系上覆盖30 μl矿物油（如果热循环系统不带热盖）：
1个循环
预变性
94°C
5min
35个循环
变性
退火
94°C
50°C
10s
20s
延长
72°C
30s
1个循环最终延长
冷却
72°C
4°C
7min
④
取15 μl于3%琼脂糖凝胶上进行电泳。
罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书 注意：Label溶液含有甲次砷酸盐和二氯化钴，严禁吸入和食入。 反应悬浮物收集于密闭、不易碎、有明确标识的容器中，按有毒废物处理。 需要自己配置的其他物品： 除上表所列试剂外，还需准备以下溶液。下表列出每步所需物品概览：
产品概述： 特异性：TUNEL 反应优先标记凋亡产生的DNA 链断裂，从而辨别凋亡与坏死、以及由抑 制细胞生长的药物或放射线产生的primary DNA 链断裂 实验干扰：假阴性：在某些型式的凋亡细胞中DNA 链断裂可能缺失或不完全。空间位阻， 如细胞外元件可能阻止TdT 到达DNA 断裂处。两种情况均能产生假阴性。 假阳性：在坏死晚期，可能产生大量的DNA 片段 DNA 链断裂也可能在具有高增殖和代谢活动的细胞中出现。两种情况均能产生 假阳性。为确认细胞死亡的凋亡型式，应认真进行每种细胞的形态学检查 凋亡过程中产生的形态学改变尤其特征形式，因此，对于可以结果进行解释时， 细胞形态评估是一项重要的参数 样本：细胞离心涂片和细胞涂片 在chamber slides 上培养的黏附细胞 冰冻或福尔马林固定、石蜡包埋样本 分析时间：2-3小时，除外培养、固定和渗透 检测次数：一个试剂盒50T
步骤和所需材料： 1 流程图： 2 样品准备 黏附细胞、细胞涂片和细胞离心涂片 需准备的其他试剂：Washing buffer：磷酸盐缓冲液（PBS） Blocking buffer封闭溶液：甲醇稀释的3% H2O2 Fixation solution固定溶液：PBS配制的4%多聚甲醛，ph ，新鲜配制 Permeabilisation solution 渗透液：%Triton1）X-100溶于%柠檬酸钠溶液 中，新鲜配制 步骤：下表描述了细胞固定、内源性过氧化物酶封闭和细胞渗透过程。 组织部分 福尔马林-包埋组织 福尔马林包埋组织的预处理：可按4种不同的方式预处理。如用蛋白酶K，不含核酸酶，浓 度、孵育时间和温度应按组织类型优化 注意：只用罗氏应用科学的蛋白酶K，因其经检测不含核酸酶， 核酸酶可导致假阳性。 另外3中替代方法在下表中描述（step 2） 需准备的其他试剂：二甲苯和乙醇（浓度：95%，90%，80%，70%，溶于双蒸水中）
罗氏(R o c h e)公司T u n e l试剂盒操作说明书(In situ cell death detection kit-POD法) 一、原理： TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。 二、器材与试剂 器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等； 试剂：试剂盒含： 1号（蓝盖）Enzyme Solution 酶溶液：TdT 10×、 2号（紫盖）Label Solution标记液：荧光素标记的dUTP 1×、 3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；
自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、 Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH ）或细胞通透液（% Triton X-100 溶于% 柠檬酸钠，临用前配制）、 苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml–3 U/ml in 50 mM Tris-HCl， pH ，10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。 三、实验步骤 操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。 具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）： 1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min； 2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min； 注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理 4. 用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C（温度、时间、浓度均需摸索）如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的 Proteinase K（400μg/mL）处理5 分钟。其它替代方法：石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即 蛋白酶K 处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同： 替代方法1: 将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透 液：%TritonX-100 溶于%柠檬酸钠，需新鲜配制） 替代方法2：将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min （胃蛋白酶：%%溶于HCl PH2，胰蛋白酶%%溶于HCl ）
人cDNA第一链合成(M-MLV)酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用。 检测范围：96T 20pg/ml-480pg/ml 使用目的： 本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中cDNA第一链合成(M-MLV)含量。实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人cDNA第一链合成(M-MLV)水平。用纯化的人cDNA第一链合成(M-MLV)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入cDNA第一链合成(M-MLV)，再与HRP标记的cDNA第一链合成(M-MLV)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的cDNA第一链合成(M-MLV)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人cDNA第一链合成(M-MLV)浓度。 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 释。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 10分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 操作程序总结： 计算 以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标
产品信息 Thermo Scientific Maxima第一链cDNA合成试剂盒（适用于RT-qPCR）#K1641，#K1642 https://www.doczj.com/doc/7717720875.html,/onebio
分析证书 经验证，在两步法RT-qPCR中，对于不同起始量（5 ng-0.5 fg）的RNA逆转录产物，使用Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR 预混液进行qPCR扩增。其反应效率在90-110％之间，曲线斜率在-3.09和-3.58之间，且相关系数>0.99。 质量授权人：Jurgita Zilinskiene
目录页码 试剂盒组分 (4) 贮存条件 (4) 产品描述 (4) 重要提示 (5) RT-qPCR实验方案 (6) 对照反应 (6) 疑难解答 (7) 参考文献 (8)
试剂盒组分 贮存条件 所有试剂盒成分都应贮存于-20 °C。 产品描述 Thermo Scientific Maxima第一链cDNA合成试剂盒是合成cDNA第一链的方便系统，适用于两步法实时定量RT-PCR（RT-qPCR）中的cDNA合成。试剂盒采用先进的Maxima 反转录酶（RT），该酶源自M-MuL V 逆转录酶的体外进化。这种酶相比M-MuL V逆转录酶热稳定性高，扩增效果强劲且具有更高的cDNA合成效率。Maxima第一链cDNA合成试剂盒能够在较高温度下（55-65℃），在很宽的总RNA量范围内（从1 pg到5 μg）合成cDNA。合成反应能在15-30分钟内完成。 Maxima第一链cDNA合成试剂盒的各组分经预混合，以节约时间和减少移液错误。试剂盒由Maxima Enzyme Mix、5×反应混合液、无核酸酶的水三部分组成。 Maxima Enzyme Mix包含Maxima反转录酶和Thermo Scientific Ribolock RNase抑制剂。重组的Ribolock RNase抑制剂能有效保护RNA模板在高于55℃时不被RNase A、B和C降解。 5×反应混合液包含剩余的反应组分：反应缓冲液、dNTPs、Oligo(dT)18和随机引物。 无核酸酶的水用于反应体系的配制和RNA样本的溶解。已通过相关检验证明其中不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶、核糖核酸酶和磷酸酶。
罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书 (In situ cell death detection kit-POD法) 一、原理： TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。 二、器材与试剂 器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等； 试剂：试剂盒含： 1号（蓝盖）Enzyme Solution 酶溶液：TdT 10×、 2号（紫盖）Label Solution标记液：荧光素标记的dUTP 1×、 3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP； 自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、
cDNA第二链合成试剂盒 产品简介： cDNA第二链合成试剂盒，Second Strand cDNA Synthesis Kit是一种在合成了cDNA第一链的基础上去除RNA-DNA杂合链中的RNA链并合成cDNA第二链，最终形成双链cDNA的试剂盒。本试剂盒包含了进行cDNA第二链合成所需的各种试剂。 本试剂盒采用RNase H使RNA-DNA杂合链中的RNA产生切口，此时DNA Polymerase I可以通过切口平移(nick translation)反应催化形成cDNA第二链。 使用本试剂盒合成的双链cDNA，可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA文库的构建等。 本试剂盒用于体积为20微升的cDNA第一链合成反应的后续反应时，足够进行20个cDNA第二链样品的合成。 保存条件： -20℃保存。 注意事项： 进行第二链合成时，dNTP比较适当的最终浓度约为0.2mM。如果最终浓度过低，在反应体系中需要适当补充dNTP。 如果希望获得平末端的双链cDNA，可以用T4 DNA Polymerase (D7051)或DNA末端平滑试剂盒 (D7012)处理。 酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1.用反转录酶，例如BeyoRT TM II M-MLV反转录酶(RNase H-) (D7160/D7161/D7162)或BeyoRT TM II cDNA第一链合成试剂盒 (RNase H-) (D7167/D7168)合成cDNA第一条链，70℃孵育10分钟终止反应。 2. 3.按上述体系配好之后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 V ortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。 4.15℃孵育2小时。(注意：反应温度不能超过15℃) 5.加入5μl 0.5M EDTA(pH8.0)混匀，以终止反应。 6.后续可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化合成的双链cDNA，也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯 化试剂盒(D0033)可以向碧云天订购。
罗氏 (Roche)公司 Tunel 试剂盒操作说明书 (In situ cell death detection kit-POD法) 一、原理： TUNEL （TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒 是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA 的断裂情况。其 原理是荧光素（ fluorescein）标记的 dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移 酶（ TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂 DNA 的 3’-OH 末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与 HRP 底物二氨基联苯胺（DAB ） 反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的 细胞几乎没有 DNA 断裂，因而没有 3‘-OH 形成，很少能够被染色。本 试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细 胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗 肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。 二、器材与试剂 器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱 布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试 剂：试剂盒含： 1 号（蓝盖） Enzyme Solution 酶溶液： TdT 10×、
2号（紫盖） Label Solution 标记液：荧光素标记的 dUTP 1×、 3号（棕瓶） Converter-POD:标记荧光素抗体的 HRP； 自备试剂： PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、 70%）、 DAB 工作液（临用前配制， 5 μl 20 ×DAB+1 μL 30%H2O2+94 μl PBS）、 Proteinase K工作液（ 10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl ，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 溶于 0.1% 柠檬酸钠，临用前配制）、 苏木素或甲基绿、 DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl ， pH 7.5， 10 mM MgCl2 ，1 mg/ml BSA ）等。 三、实验步骤 操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL 反 应液→加 converter-POD→与底物 DAB 反应显色→光学显微镜计数并拍照。 具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）： 1.用二甲苯浸洗 2 次，每次 5min； 2.用梯度乙醇（ 100、95、90、80、70%）各浸洗 1 次，每次 3min；注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理 4.用 Proteinase K工作液处理组织 15-30 min 在 21–37°C（温度、时间、浓度均需摸索）如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的
反应次数目录号反应次数 04 379 012 001 50次，包括10次对照反应 04 896 866 001 100次 04 897 030 001 200次 试剂盒包装与含量小瓶/瓶盖标签适用于a) 04 379 012 001 b) 04 896 866 001 c) 04 897 030 001 1 红色 Transcriptor Reverse Transcriptase（逆转录酶） a) 1瓶，25 μl (20 U/μl) b) 1瓶，50 μl (20 U/μl) c) 2瓶，各50 μl (20 U/ μl) 储存缓冲液：200 mM 磷酸钾，2 mM 二硫苏糖醇，0.2% Triton X-100(v/v)，50% 甘油(v/v)，pH 约为7.2? 2 无色 Transcriptor RT Reaction Buffer(5×) （逆转录缓冲液） a) 1瓶，1 ml b) 1瓶，1 ml c) 2瓶，各1 ml 5×浓度：250 mM Tris/HCl，150 mM KCl，40 mM MgCl2，pH约为8.5(25°C)? 3 无色 Protector RNase Inhibitor （RNase抑制剂） a) 1瓶，50 μl(40 U/μl) b) 1瓶，100 μl(40 U/μl) c) 2瓶，各100 μl(40 U/μl) 储存缓冲液：20 mM Hepes-KOH，50 mM KCl，8 mM 二硫苏糖醇，50 % 甘油(v/v)，pH 约为7.6 (4°C)? 4 黄色/ 紫色 Deoxynuc-leo-tide Mix （dNTP） a) 1瓶，100 μl(黄色瓶盖) b) 1瓶，200 μl(紫色瓶盖) c) 2瓶，各200 μl(紫色瓶盖) dATP, dCTP, dGTP, dTTP各10 mM?5 蓝色 Anchored-oligo(dT)18 Primer （锚定oligo(dT)18引物） a) 1瓶，100 μl(50 μM) b) 1瓶，200 μl(50 μM) c) 2瓶，各200 μl(50 μM) 6 Random Hexamer a) 1瓶，100 μl(600 μM) 蓝色 Primer（随机引物） b) 1瓶，200 μl(600 μM) c) 2瓶，各200 μl(600 μM) 7 绿色 Control RNA （对照RNA） a) 1瓶，20 μl(50 ng/μl) 包含提取于永生细胞系(K562)的总RNA 片段稳定溶液? 8 绿色 Control Primer Mix PBGD （对照基因引物） a) 1瓶，40 μl 5 μM 人类PBGD特异性正向与反向引物? 9(b和c为瓶7) 无色 Water, PCR-grade a) 1瓶，1 ml b) 2瓶，各1 ml c) 3瓶，各1 ml 注意：货号为04 896 866 001和04 897
RevertAid?第一链cDNA Synthesis试剂盒 #K1621, #K1622 分析证明书 #K1621 Lot 质量控制 采用100 fg对照GAPDH RNA和对照引物进行RT-PCR反应，通过在1%琼脂糖上进行凝胶电泳和溴化乙锭染色显示得到足够量的496 bp的产物 质量认证人：Jurgita Zilinskiene 目录 页码 试剂盒组成 (2) 存储条件 (2) 产品说明 (2) 注意事项 (3) 操作步骤 (6) RT-PCR (6) 合成cDNA用于克隆 (7) 实验对照 (8) 问题分析与解决 (10)
试剂盒成分 RevertAid?第一链cDNA 合成试剂盒 20 次 #K1621 100 次 #K1622 RevertAid? M-MuLV 反转录酶（200 u*/μl ） 25 μl 120 μl RiboLock? RNA 酶抑制剂 (20 u**/μl) 25 μl 120 μl 5×反应缓冲液 （250 mM Tris-HCl (pH 8.3), 250 mM KCl, 20 mM MgCl 2, 50 mM DTT ）150 μl 500 μl 10mM dNTP 混合物 50 μl 250 μl Oligo(dT)18 引物 100 μM, 0.5 μg/μl (15 A 260 u/ml) 25 μl 120 μl 随机六聚体引物 100 μM, 0.2 μg/μl (6 A260 u/ml) 25 μl 120 μl GAPDH 正向引物, 10 μM 5’ – CAAGGTCATCCATGACAACTTTG – 3’ 20 μl 20 μl GAPDH 反向引物, 10 μM 5’ – GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG - 3’ 20 μl 20 μl 对照GAPDH RNA 1.3 kb 3’-poly(A) tailed RNA transcript, 0.05 μg/μl 20 μl 20 μl 无核酸酶高纯度水 2x1.25 ml 2x1.25 ml * 一个单位的RevertAid?M-MLV 逆转录酶在37℃10 分钟将1 nmol 的dTMP 转化为多核苷酸组分（吸附在DE81上）。 ** 一个单位的RiboLock?RNase 酶抑制剂抑制5ng RNA 酶A 50%的活性。 存储条件 试剂盒中所有组分应存储在-20°C 。对照用RNA 可存储于-70°C 以便长期使用。 产品说明 RevertAid?第一链cDNA 合成试剂盒以mRNA 或者总RNA 为模板，高效合成第一链cDNA 。本试剂盒使用RevertAid? M-MuLV 反转录酶，它的RNA 酶H 的活性与AMV 反转录酶相比较低。该反转录酶可耐受42-50°C 温度，合成的cDNA 片段长度达13kb 。 试剂盒中含有RiboLock? 重组RNA 酶抑制剂，防止RNA 降解，可耐受55°C 高温。 试剂盒同时含有oligo(dT)18和随机六聚体引物。随机六聚体引物与模板非特异性地结合，以总RNA 中任何RNA 为模板合成cDNA 。oligo(dT)18选择性和RNA 3’poly(A)配对结合，只以有poly(A)尾巴的mRNA 为模板合成cDNA 。使用本试剂盒也可采用序列特异性引物。 合成的第一链cDNA 能直接用作PCR 或荧光定量PCR 的模板，第二链cDNA 的合成或线性RNA 扩增，也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA 的实验，比如将标记好的第一链cDNA 作为杂交实验中的探针或者用于微阵列分析。
翻译好的罗氏公司T u n e l 试剂盒操作说明方案 Final approval draft on November 22, 2020
罗氏(R o c h e)公司T u n e l试剂盒操作说明书(Insitucelldeathdetectionkit-POD法) 一、原理： TUNEL（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdTEnzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radishperoxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。 二、器材与试剂 器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等； 试剂：试剂盒含： 1号（蓝盖）EnzymeSolution酶溶液：TdT10×、 2号（紫盖）LabelSolution标记液：荧光素标记的dUTP1×、 3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP； 自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、 DAB工作液（临用前配制，5μl20×DAB+1μL30%H2O2+94μlPBS）、
miRNA first-strand cDNA synthesis kit 使 用 说 明 书 包 装 量： 产品组成、储存：－20 ℃ 保存。 制品说明：miRNA 第一链合成试剂盒本试剂盒采用在 miRNA 3’末端加多聚A 尾Poly(A)，再使用Anchored oligo(dT)-universal tag 通用逆转录引物进行逆转录反应，最终生成miRNA 对应的cDNA 第一链。miRNA cDNA 第一链合成试剂盒包含miRNA 3’末端Poly(A)修饰过程和逆转录过程的所有试剂，该试剂盒具有高效的Poly(A)修饰和逆转录效率， 可从20pg-2μg 的total RNA 中有效制备miRNA 对应的cDNA 第一链。一次合成的cDNA 可检测多个microRNA ，节约了样品和成本。 注：该试剂盒须与 miRNA 荧光定量检测试剂盒（154901）配套使用。 操作步骤： 一、 m iRNA 3’末端进行加Poly (A)处理 1. 在冰上预冷RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积20μl (最后加入E.coli Poly(A) Polymerase ）
*在反应中使用的total RNA 必须含有小分子RNA。 *此过程也可以使用小分子RNA（建议加入量为2μl ~4μl。请根据目的miRNA丰度决定加入量）。 2. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在37℃反应30-60 min。所得的Poly(A)反应液可以立即进行第一链合成，也可以放置-20℃短暂保存。如需长期保存建议存放于-80℃。 二、加Poly (A)修饰后的miRNA 进行逆转录反应（第一链合成） 1. 2. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在42℃反应50min。 3. 70℃加热15 min失活TUREscript Hˉ RTase。合成的cDNA反应液可放置于-20℃保存；也可以直接进行下游PCR或者荧光定量PCR检测。 注：按照上述操作步骤得到的cDNA模板用于下游PCR或者荧光定量PCR检测时，可以根据实际情况选择使用量，如果发现有非特异扩增条带，或者融链曲线显示有非特异扩增，往往提示cDNA模板过量，可以将上述cDNA模板稀释几十到几百倍甚至上千倍再使用。 NOT FOR HUMAN OR DRUG USE
1. Superscipt II―RT合成第一链: 1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入 xul mRNA(大约500ng) 1ul Xho I Primer(1.4ug/ul) (5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGT CTCGAG TTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’) 11-x ul RNase-free water （大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.） 2. 混匀后,70℃反应10分钟; 3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min; 4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂: 4ul 5×first strand buffer 2ul 0.1M DTT 1ul 10mM dNTP(自己配制) 5. 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟; 6. 反应完成,趁热加入1 ul S uperscipt II―RT,混匀; 7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶. 2. cDNA第二链的合成 : 1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega): 20ul 10×DNA Polymerase I buffer 6ul 10mM dNTP(自己配制) xul dd H2 O 1ul RNase H(2U/ul) 10ul DNA Polymerase I(10U/ul)
总体系为200ul; 2. 混匀后,16℃反应2.5小时; 3. 70℃灭活10分钟; 4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上; 5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。 注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。 3. 双链cDNA末端补平 : 1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega): 6ul 10mM dNTP 2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul) 2ul BSA(10mg/ml) 2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟; 3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟; 4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟; 5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA; 6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA; 7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟; 8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味. 注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。 PCR纯化试剂盒操作流程： 1．溶液PE使用前应加入适量体积95％－100％的乙醇，混匀。 2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。 3．加入spin column中，13000rpm离心1min。 4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。
For research purposes only. Not for use for in vitro diagnostic procedures for clinical diagnosis. In Situ Cell Death Detection Kit, POD Kit for immunohistochemical detection and quantification of apop-tosis (programmed cell death) at single cell level, based on labeling of DNA strand breaks (TUNEL technology): Analysis by light microscopy. Cat. No. 1 684 817Store at ?15 to ?25°C 1 Kit (50 tests) Instruction Manual Version 3, January 2003
1. Preface 1.1Table of contents P reface (2) 1. 1.1Table of contents (2) (3) 1.2 Kit contents (5) 2. Introduction 2.1Product overview (5) (8) 2.2 Background information 3. Procedures and required materials (10) 3.1Flow chart (10) 3.2Preparation of sample material (11) 3.2.1Adherent cells, cell smears and cytospin preparations (11) (12) sections 3.2.2 Tissue 3.2.2.1 Treatment of paraffin-embedded tissue (12) 3.2.2.2Treatment of cryopreserved tissue (14) 3.3Labeling protocol (15) 3.3.1 Before you begin (15) 3.3.2Labeling protocol for adherent cells, cell smears, cytospin preparations, and tissues (16) 3.3.3 Labeling protocol for difficult tissue (17) (18) conversion 3.4 Signal (19) 4. Appendix (19) 4.1 Trouble-shooting (22) 4.2 References (23) 4.3 Related products
-! RevertAid?第一链cDNA Synthesis试剂盒 #K1621, #K1622 分析证明书 #K1621 Lot 质量控制 采用100 fg对照GAPDH RNA和对照引物进行RT-PCR反应，通过在1%琼脂糖上进行凝胶电泳和溴 化乙锭染色显示得到足够量的496 bp的产物 质量认证人：Jurgita Zilinskiene 目录 页码 试剂盒组成 (2) 存储条件 (2) 产品说明 (2) 注意事项 (3) 操作步骤 (6) RT-PCR (6) 合成cDNA用于克隆………..………………………………………7 实 验对照……………………………………………………………….8 问 题分析与解决 (10)
试剂盒成分 ** 一个单位的RiboLock?RNas e酶抑制剂抑制5ng RNA酶A 50%的活性。 存储条件 试剂盒中所有组分应存储在-20°C。对照用RNA可存储于-70°C以便长期使用。 产品说明 RevertAid?第一链cDNA合成试剂盒以mRNA或者总RNA为模板，高效合成第一链cDNA。本试剂盒使用RevertAid? M-MuLV反转录酶，它的RNA酶H的活性与AMV反转录酶相比较低。该反转录酶可耐受42-50°C温度，合成的cDNA片段长度达13kb。 试剂盒中含有RiboLock?重组RNA酶抑制剂，防止RNA降解，可耐受55°C高温。试剂盒同时含有oligo(dT)18和随机六聚体引物。随机六聚体引物与模板非特异性地结合，以总RNA 中任何RNA为模板合成cDNA。oligo(dT)18选择性和RNA 3’po ly(A)配对结合，只以有poly(A)尾巴的mRNA为模板合成cDNA。使用本试剂盒也可采用序列特异性引物。合成的第一链cDNA能直接用作PCR或荧光定量PCR的模板，第二链cDNA的合成或线性RNA扩增， 也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验，比如将标记好的第一链cDNA 作为杂交实验中的探针或者用于微阵列分析。
罗氏公司TUNEL细胞凋亡检测程序 （In situ cell death detection kit-POD法） 一、原理： TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。 二、器材与试剂 器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等； 试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70％）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB＋1μL
30％H2O2＋94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5, 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。 三、实验步骤 操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL 反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。 具体操作步骤： 1.用二甲苯浸洗2次，每次5min； 2.用梯度乙醇（100、95、90、80、70％）各浸洗1次，每次3min； 3.PBS漂洗2次； 4.用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C（温度、时间、浓度均需摸索）或者加细胞通透液8min； 5.PBS漂洗2次； 6.制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT＋450μl 荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP 液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在15～25℃×10min，后面步骤同处理组。 7.玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反
自己翻译的罗氏t u n e l 检测细胞凋亡试剂盒说 明书 公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书 注意：Label溶液含有甲次砷酸盐和二氯化钴，严禁吸入和食入。 反应悬浮物收集于密闭、不易碎、有明确标识的容器中，按有毒废物处理。 需要自己配置的其他物品：
产品概述： 特异性：TUNEL反应优先标记凋亡产生的DNA链断裂，从而辨别凋亡与坏死、以及由抑制细胞生长的药物或放射线产生的primary DNA链断裂 实验干扰：假阴性：在某些型式的凋亡细胞中DNA链断裂可能缺失或不完全。 空间位阻，如细胞外元件可能阻止TdT到达DNA断裂处。两种情况 均能产生假阴性。 假阳性：在坏死晚期，可能产生大量的DNA片段 DNA链断裂也可能在具有高增殖和代谢活动的细胞中出现。两种情况均能产生假阳性。为确认细胞死亡的凋亡型式，应认真进行每种 细胞的形态学检查 凋亡过程中产生的形态学改变尤其特征形式，因此，对于可以结果 进行解释时，细胞形态评估是一项重要的参数 样本：细胞离心涂片和细胞涂片 在chamber slides上培养的黏附细胞 冰冻或福尔马林固定、石蜡包埋样本 分析时间：2-3小时，除外培养、固定和渗透 检测次数：一个试剂盒50T 试剂盒存储/稳定性：未开封试剂盒储存于-15～-25℃可稳定至标签上标明的效 优点：
优点特点 灵敏在单个细胞水平检测细胞凋亡的早期间断 特异对坏死来说，优先标记凋亡 快速分析时间短（2-3h） 简便试剂稳定、优化，没有稀释步骤 灵活适合于固定细胞核组织，允许堆积、贮存和转运样本 双染可以鉴定细胞凋亡的类型和阶段 对于大量的批号来说，每一批号均进行了功能检测Function-tested功 能检查 步骤和所需材料： 1 流程图： 2 样品准备 黏附细胞、细胞涂片和细胞离心涂片 需准备的其他试剂：Washing buffer：磷酸盐缓冲液（PBS） Blocking buffer封闭溶液：甲醇稀释的3% H2O2 Fixation solution固定溶液：PBS配制的4%多聚甲醛，ph ，新鲜配制