转基因技术在动物遗传育种上的研究与应用
崔志峰（B2010087）
摘要：转基因动物是现代生物技术中一个极其重要的研究领域，目前已经有转基因小鼠、兔、绵羊、山羊、猪、牛、鸡和鱼等多种转基因动物问世。本文综述了转基因动物的制作方法、转基因动物的应用研究以及所取得的重要成就，转基因技术的研究展望。
关键词：转基因技术；显微注射；基因打靶；乳腺生物发生器
在动物遗传育种中，传统的动物品种改良方法是通过纯系繁育和配套杂交，该方法带来了明显的经济效益，有力地促进了动物产业的发展，提高了人们的生活水平。但品种改良周期比较长，也会产生负面的影响。转基因技术是在上世纪80年代初发展起来的一项生物技术。如今，转基因技术正在对动物育种产生一场新的革命。转基因技术是将外源基因通过载体导入受体生物体内，让其获得新特性的一门复杂技术。由于这一技术能够实现基因的种间转移，用于动物育种将大大提高育种的目的性，加快育种进程。自Palmiter等1982年将大白鼠生长激素基因显微注射到小白鼠受精卵，获得比正常小鼠大一倍的“超级巨鼠”以来，世界各国科学家竞相开展转基因技术研究，并通过多种转基因方法在猪、牛、鸡、兔、羊等动物上获得成功。转基因技术在定向改造生物体中有着无法可比的优越性。转基因技术在动物品种改良的过程中，有着确定的目标、周密的设计、精确的操作，是目前最先进的技术。
1 动物转基因技术
所谓转基因就是将目的基因导入到受体细胞的过程。1997年，克隆羊Dolly 的诞生，开创了哺乳动物体细胞核移植技术的先河，随后，乳腺中表达人凝血因子IX的转基因克隆羊Polly培育成功。2005年，抗乳房炎转基因牛的诞生，2006年，多不饱和脂肪酸转基因克隆猪的培育成功，标志着转基因动物育种进入了新的发展历程。随着基因工程技术的不断发展，转基因动物技术将会不断得到改善，从而在未来的动物育种中发挥巨大的作用。目前转基因动物育种技术主要有一下几种方法。
1.1 逆转录病毒载体导入法
逆转录病毒法是最早用于生产转基因动物的方法，由于转染过程中不能准确控制整合时间，得到的转基因动物大都是嵌合体，所以没有得到更深入的发展。1974年，Jaenisch和Mintz将SV40 DNA注入小鼠囊胚腔中，发现获得的小鼠肝、肾组织中有SV40 DNA整合。此后，Jaenisch等成功地用逆转录病毒法获得了转基因小鼠。随后，转基因鸡和牛也相继产生。
1.2 显微注射法
显微注射法(Microinjection) 是指通过显微操作仪把外源基因注入受体动物的受精卵，外源基因整合到受体细胞染色体组上，发育成转基因动物的技术。这是发展最早、目前使用最为广泛，也是最有效的方法，已经生产出了转基因小鼠及兔、绵羊、猪、牛、鱼和鸡等各种转基因动物。
显微注射法的优点是外源基因的转移率和整合效率都较高，小鼠为6%~40%，猪和羊分别为0.98%和0.1%，鱼类可达10%~75%，外源基因的长度不受限制，可向动物原核胚导入250kb左右的DNA片断。但该方法操作技术复杂，设备昂贵，导入外源基因的拷贝数无法控制，外源基因随机整合到基因组内，常导致宿主DNA染色体序列丢失或重排，造成严重的生理缺陷。
1.3 精子载体法
精子载体法是用精子作为基因转移的载体(Vector) 生产转基因动物。大多数物种的精子都有一定的摄取外源DNA的能力，可以通过受精过程把外源基因导入到受精卵中。精子介导载体法获得转基因动物的效率能达到30%左右。1989年，意大利的Lavitrano等通过精子介导成功获得转氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)的转基因小鼠。
1.4 转基因克隆技术
体细胞克隆是将分化的体细胞核导入去核的卵母细胞中，并重新发育成个体的过程。体细胞核移植技术的建立，宣告了动物分化的体细胞可以被逆转为全能型的胚胎，并发育成完整的动物个体。转基因克隆技术是以体细胞核移植技术及细胞转染技术为基础，将外源基因导入到体细胞核内，再以此转基因细胞为核供体进行动物克隆的方法。体细胞核移植技术使得大批量的生产相同遗传背景的动物成为可能，在很大程度上提高了转基因动物生产的效率和稳定性，为培育大规模的有育种价值的群体提供了技术条件。
1.5 基因打靶技术
基因打靶技术包括去除致病或不利基因座位的基因敲除技术，以及将目的基因定点整合到基因组特定位点的基因敲入技术。2000年，Mcgreath等首次应用基因打靶技术，用人的基因替换了羊的基因，生产了转基因克隆羊，证实了基因打靶技术可用于生产转基因家畜。2002年及2003年，Lai等和Sendai等利用基因敲除的方法分别获得了α-1，3-半乳糖苷转移酶基因灭活的转基因猪和转基因牛。
1.6 慢病毒载体法
慢病毒载体技术是一种高效的转基因动物制备技术，其转染效率可达60%以上。2003年，Clark等利用慢病毒载体制备转基因动物的效率可达80%~100%，生产1只转基因绵羊只需5只受体母羊，而传统的纤维注射法则需70只受体母羊。目前的转基因鸡生产也主要采用慢病毒载体技术。
1.7 胚胎干细胞法
胚胎干细胞（ES cell）是高度未分化的全能干细胞，通过人工培养和定向诱导，可分化为多种组织细胞。将外源基因导入ES细胞后进行必要的筛选，筛选出的细胞转移到原肠时期的胚胎中便会得到带有目的基因的嵌合体动物，再通过杂交的方法得到一个品系。目前这种方法仅用于转基因小鼠的基础研究。
2 转基因技术在动物育种上的研究
自Palmiter等1982年将大白鼠生长激素基因显微注射到小白鼠受精卵，获
得比正常小鼠大一倍的“超级巨鼠”以来。这一实验的成功揭开了转基因动物研究的序幕，此后转基因动物研究发展迅速，短短二十几年间，人们相继获得了转基因兔、猪、羊、牛、鱼和鸡，并成功培育出了一些肉质优良、快速生长、具有抗病性以及生产生物材料的转基因家畜。
转基因育种，即通过转基因技术将外源基因导入动物受精卵内组成一个新的融合基因，使其在动物体内整合与表达，产生具有新遗传特性的动物。转基因技术育种可以避开物种间杂交不育的生殖隔离，在较短时期内培育出常规方法不能育成或难以育成的动物品种，从而加快动物改良进程，使选择效率提高，改良机会增多，因而极具研究价值。
2.1 转基因技术在猪遗传育种上的研究与应用
1985年，Hammer R. E.等人首次利用显微注射法得到了1头转基因猪。与同窝非转基因猪相比，生长速度、饲料利用率均有提高，胴体脂肪率降低。1989年，Pursel等，把牛的生长激素基因转入猪体内，获得2个猪的家系，其生长速度提高11％～14％，饲料转化率提高16％～18％；使用类胰岛素生长因子-I (IGF-1) 构建转基因猪也可以加快猪的生长速度，Pursel等又把IGF-I基因转入猪中，首次获得表达IGF-I的转基因猪。当年，我国研究人员将猪GH基因转入湖北白猪受精卵中获得首批转基因猪。经过几个世代的观察，其生长速度与饲料利用率分别比同窝提高13%和10％。
1990年，中国农业大学培育的转基因猪，生长速度显著提高，超过对照组40％。1991年，Wall等将小鼠编码乳清酸蛋白(WAP) 的基因转移给猪，获得了3头转基因猪，对这3头转基因猪的整个泌乳期的乳汁进行检测，发现小鼠的WAP在奶中的浓度为l g/l。相应的mRNA只存在于乳腺中在转基因猪的乳中。WAP占总乳量的3%。1993年，Suetlali等将含有编码小鼠粘病毒抗性蛋白(Mxl 蛋白) 的cDNA的3种基因构件分别整合到猪染色体中，获得抗流感病毒的转基因猪，但基因转移效率很低。1995年，湖北农业科学院与中国农业科学院兰州兽医研究所合作，得到了抗猪瘟病毒的转基因猪。1998年，Vin将猪生长激素因子与MT启动子融合基因注入猪受精卵内，获得1头可表达猪生长激素的转基因猪。1998年，中国农业大学培育的转基因群脂肪减少10％，瘦肉率增加6％～8％。
2004年，日本科学家Saeki将菠菜Δ-12去饱和酶(fad-2) 基因转入猪体内并在脂肪组织特异表达，培育出6头转基因猪，猪体内ω-6型不饱和脂肪酸的含量明显提高，且不饱和脂肪酸含量高于普通猪20％。2006年4月，美国密苏里-哥伦比亚大学的Lai等获得了l0头转有线虫的fat-1基因(ω-3去饱和酶基因) 的体细胞克隆猪，FAT-1蛋白可将猪体内的ω-6型多不饱和脂肪酸转化为ω-3型，转基因克隆猪体内ω-6/ω-3的比值达到1~2，远远低于正常猪的8左右，大大提高了猪肉的营养价值。多不饱和脂肪酸转基因克隆猪的培育成功，标志着转基因动物育种进入了新的发展历程。2006年4月，韩国ParkJK等通过精子微注射猪受精卵获得了整合人重组促红细胞生成素的转基因猪，对Fl代以及F2代泌乳母猪的乳样分析表明，其氨基酸组成与商业化的重组hEPO完全相同。2006年12
月22日，我国首例成体体细胞“克隆”东北民猪的东北农业大学教授刘忠华带领的课题组，又成功培育出国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪，这是世界上继美国、韩国、日本之后第四例绿色荧光蛋白转基因猪。绿色荧光蛋白转基因猪的出生，标志着我国在转基因克隆猪技术研究领域步入世界先进水平行列。这项技术为家猪的目标育种、人类疾病医疗模型猪的建立以及生产为人类器官移植提供器官的特殊家猪提供了可靠技术平台，从而为畜牧业发展和医学研究开辟了新的天地。
2008年8月，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所和军事医学科学院生物工程研究所合作同样获得了转有ω-3脂肪酸去饱和酶基因的转基因克隆猪。2008年9月，吉林大学农学部畜牧兽医学院和军事医学科学院第十一所合作，得到了带有抗猪瘟病毒转基因猪的克隆后代，经检测3只克隆猪均带有抗猪瘟病毒基因。2009年，生产高比例的抗原特异性人源抗体的转染色体牛的出生，是转基因动物生产药用蛋白的又一个里程碑。
2.2 转基因技术在牛遗传育种上的研究与应用
美国Genzyme Transgene公司用酪蛋白启动子与人乳铁蛋白(hLF) 的cDNA 构建了转基因载体，通过显微注射法获得世界上第1头名为“Herman”的转基因公牛，该公牛与非转基因母牛生产转基因后代，1/4后代母牛乳汁中表达了人乳铁蛋白(McEcog等，1990)。Krimpenfort等(2001) 利用显微注射技术向牛体外受精早期胚胎注射外源基因，通过非外科手术法进行胚胎移植，在所生的19头牛中，经Southern-blot检测有2头为转基因牛。荷兰的GenPharm公司用相同的方法也培育出含人乳铁蛋白的转基因牛，牛奶中人乳铁蛋白含量为1000μg/ml (Valander等，1992)。Berkel等(2002) 利用牛的α-s1-酪蛋白启动子与人乳铁蛋白基因组的6.2 kb片段构建转基因载体，通过显微注射获得转基因牛，ELISA结果分析表明，转基因牛奶中人乳铁蛋白的含量为300~2800μg/ml。
在国内，上海医学遗传研究所黄淑帧等(2000) 利用向体外受精的早期胚胎中注射外源基因的方法成功培育出了我国第1头转有人血清白蛋白(hALB) 基因的转基因牛，该成果被评为1999年中国十大科技进展。
2.3转基因技术在羊遗传育种上的研究与应用
Nancarrow 等(1991) 把来自于优质羊毛的一种A2蛋白的主要成分(半胱氨酸) 基因导入绵羊原核期胚胎，获得的转基因羊的产毛率明显提高。Powell 等(1994) 将毛角蛋白Ⅱ型中间细丝基因导入绵羊基因组，获得的转基因羊毛光泽亮丽，羊毛中羊毛脂的含量得到明显提高。Damak等(1996) 将小鼠超高硫角蛋白启动子与绵羊的IGF-I cDNA融合基因显微注入绵羊原核期胚胎，得到转基因羊净毛平均产量比非转基因羊提高了6.2%。Bawden 等(1998) 将毛角蛋白Ⅱ型中间细丝基因导入绵羊基因组并使其在皮质中特异表达，结果转基因羊毛光泽亮丽，羊毛中羊毛脂的含量得到明显的提高。Adams 等(2005) 通过对成年的转绵羊生长激素基因的转基因绵羊性能进行测定，发现生长速度和羊毛产量都比对照组显著提高。目前，新西兰、澳大利亚、英国等主要产羊毛国家正致力于开发一
种可以生产彩色羊毛的高产转基因羊。
Clement 等(1994) 将Visna病毒的衣壳蛋白基因转入绵羊，获得了抗病能力明显提高的转基因羊。朊病毒(PrP) 是一种对羊极为致命的病毒粒子，能引起羊的搔痒症(scrapie) 等致命性中枢神经系统机能退化症(Hill 等，1997)。这些疾病已使众多欧洲国家遭受了严重的经济损失。PrP为单拷贝基因，从人们从对PrP敲除小鼠的实验来看，它们都不受朊病毒疾病的感染，且没有发现其它副作用(Bueler 等，1992)。因此如果将羊的PrP基因敲除掉，产生抗PrP种群，这对畜牧业生产和人类健康都有着积极的作用。Denning 等(2001) 从绵羊体细胞剔除PrP基因后，经核移植生产出4只敲除掉PrP基因的羊羔，其中一只存活了12 d。Yu等(2006) 报道利用基因打靶技术获得敲除了一个PrP基因位点的体细胞克隆山羊，经过3个月观察这些基因敲除羊没有异常表现，该中心正在进行PrP基因位点双敲除研究。
3 转基因技术在动物育种中的应用
3.1 促进动物生产，改善畜产品质量
常规育种改良畜禽品种进展较慢，而且有些种畜的生产性能已达到相当高的水平，很难获得较大的进展，利用转基因技术，将所需的优良基因直接转入待改良群体中，从而培育出具有优良品质的转基因品系。生长激素（GH）基因是转基因研究中运用最早的基因，Hammer于1985年，Rexroad于1989年及Pursel 于1993年分别获得转人的生长激素释放因子(hGRF) 的转基因小鼠、转基因母猪和转基因绵羊。提高了猪的生长速度和饲料利用效率，胴体脂肪率也明显下降。1994年，德国成功培育出转入生长素的转基因猪，使世界上出现了壮如小牛的“超级猪”。
3.2 提高抗病能力和适应性
畜禽传染病一直是严重威胁畜牧业的毒瘤，不仅直接影响到畜禽产品生产，同时也降低了产业投入的积极性，转基因家畜在抗病育种方面具有明显的优势。将抗病性基因导入受精卵，发育成的个体就可能表现抗病性。在对各种动物的抗病基因转移研究中，对鸡的抗病效果研究最为显著。美国和日本已用反转录病毒载体法和显微注射法产生了抗马立克和新城疫的新品种鸡。美国农业部以禽白血病病毒(ALV) 为载体，获得了抗ALV的新品系鸡。我国殷震等将猪瘟病毒抗性基因导入猪体内获得了抗猪瘟猪个体；扈荣良(1994，1995) 将狂犬病毒糖蛋白的基因导入小鼠，已获得免疫耐受的转基因小鼠，为培养抗狂犬病毒的转基因动物打下了基础。
3.3 提高动物的繁育速度
利用转基因动物个体改进常规育种，目前在转基因兔研究中以转入GH基因和hGRF基因为多见。在提高生产速度和体型方面，Hammer等(1985) 率先报道了将含有mMT启动因子和人GH基因的融合基因导入家兔受精卵试验，但其转基因子代并没有表现明显的促生长效应。而部分实验表明，外源GH基因可促进转基因兔生长，如和协超等(1995) 获得的转oGH基因兔体重比对照兔高出
1.7倍。
转基因动物的研究和应用将是21世纪生物工程技术领域最活跃、最具有应用价值的项目之一。它将给人类的医药卫生、生物材料、家畜改良等领域带来革命性的变化，尤其是在乳腺生物反应器生产药物方面，它带来的经济效益和社会效益更是难以估量的。在未来的研究中，转基因动物及其产品必将进入全面产业化和市场化阶段，转基因动物乳腺生物反应器产业将成为最具高额利润的新型行业。在改良家畜方面，转基因技术在新的世纪也将成为培育动物新品种的革命性途径之一。
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转基因研究的现状及发展 转基因作物是当今世界各国现代生物技术产业研究的热点，中国的转基因生物技术发展一、我国转基因作物的发展现状迅速，由于科学界对转基因作物对人类及生态环世界上最早的转基因作物诞生于年，是一境利与弊的争论，措政府应制定相应的政策、施对到种含有抗生素药类抗体的烟草。世纪年代，其进行安全管理。本文论述了转基因作物在国际农业生物技术已逐渐成为各国现代生物技术产业研国内的发展现状，分析了转基因作物对人类及生态环境的利与弊以及关于我国转基因作物安全管究的热点。 转基因技术的应用 1．在畜牧兽医中的应用 应用于动物抗病育种转基因技术可以用于动物抗病育种，通过克隆特定基因组中的某些编码片段，对之加以一定形式的修饰以后转入畜禽基因组，如果转基因在宿主基因组能得以表达，那么畜禽对该种病毒的感染应具有一定的抵抗能力，或者应能够减轻该种病毒侵染时对机体带来的危害。（其用于遗传育种，不仅可以加速改良的进程，使选择的效率提高，改良的机会增多，并且不会受到有性繁殖的限制。）例如Clements等将绵羊髓鞘脱落病毒的表壳蛋白基因转入绵羊，获得的转基因动物抗病力明显提高；丘才良把一种寒带比目鱼抗冻基因成功地转移到大西洋鲑中，为提高某些鱼类的抗寒能力做了积极的尝试。 2．在医学领域中的应用 用于生产药用蛋白用转基因动物的乳腺生产重组蛋白（乳腺生物反应器）可能是转基因动物的最大应用，这也是世界范围内转基因研究的热点之一。Swamdom （1992）用β-球蛋白的4个核酸酶I的高敏位点与人的两个基因相连，融合基因产生的转基因猪与鼠的原型相似。目前，把转基因动物当作生物反应器来生产药用蛋白已经受到国际社会的极大关注，不仅各国政府投资，一些私人集团也不惜投入大量资金加以研究和开发。 3．转基因的应用存在的问题及展望 （1）转基因表达水平低，许多转基因的表达强烈地位受着其宿主染色体上整合位点的影响，往往出现异位表达和个体发育不适宜阶段表达，影响转基因表达能力或基因表达的组织特异性，从而使大部分转基因表达水平极低，极少部分基因表达水平过高。 （2）难以控制转基因在宿主基因组中的行为，转基因随机整合于动物的基因组中，可能会引起宿生细胞染色体的插入突变，还会造成插入位点的基因片段丢失，插入位点周围序列的倍增及基因的转移，也可能激活正常状态下处于关闭状态的基因。 （3）不了解哪些基因控制多数生理过程，不了解基因表达的发育控制和组织特异性控制的机制。 （4）制作转基因动物的效率低，这是目前几乎所有从事转基因动物研究的实验室都面临的问题，也是制约着这项技术广泛应用的关键。 （5）对传统伦理是一种挑战，对人类的生存有一定的负面作用等。 当然，我们不能因为这些缺点的存在就否定转基因技术的研究价值。因为它作为一种新兴的生物技术，配合其他相关的生物技术将具有广阔的应用前景。随着这一技术日趋成熟，许多问题有望逐步得到解决。
转座子（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）又称跳跃因子，其实质是基因组上不必借助于同源序列就可移动的ＤＮＡ片段，它们可以直接从基因组内的一个位点移到另一个位点。自１９５１年美国Ｍｃ－Ｃｌｉｎｔｏｃｋ在玉米中首先发现了ＤＮＡ转座子（ＤＮＡｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）以来，转座子已成为各种生物的基因分析的有效工具之一。不仅利用转座子诱变已找到原核生物的单性生殖基因［３］；而且在真核生物中，Ｐ－转座子的发现和运用极大地促进了果蝇遗传学的发展。近来，一些其他的转座子元件，如ｈｅｒｍｅｓ，ｈｏｂｏ，ｍａｒｉｎｅｒ，ｍｉｎｏｓ和ｐｉｇｇｙＢａｃ已成功在Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ、Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ、Ａｎａｓｔｒｅｐｈａｓｕｓｐｅｎｓｅ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｖｉｒｉｌｉｓ、家蚕（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）以及包括鱼类、禽类在内的多种生物转基因中获得应用，２００５年７月复旦大学的丁昇在《ｃｅｌｌ》杂志上发表关于运用ｐｉｇ－ｇｙＢａｃ转座子作载体成功制作转基因脊椎动物—— —小鼠，更加显示了转座子作为转基因载体的优势与潜力。 １转座子的类型和基本结构 １．１ＤＮＡ转座子ＤＮＡ转座子是以ＤＮＡ－ＤＮＡ方式转座的转座子，可通过ＤＮＡ复制或直接切出两种方式获得可移动片段，重新插入基因组ＤＮＡ中，导致基因的突变或重排。但一般不改变基因组的大小。根据转座的自主性，ＤＮＡ转座子又分为自主转座子（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｅｌｅｍｅｎｔ）和非自主转座子（ｎｏｎａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｅｌｅｍｅｎｔ），前者本身能够编码转座酶而进行转座，后者则要在自主转座子存在时才能够实现转座。玉米的Ａｃ／Ｄｓ体系就是典型的一例。活化子Ａｃ（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）属于自主转座子，解离子Ｄｓ（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）属于非自主转座子，只有在Ａｃ存在时，Ｄｓ才能转座。 １．２反转录转座子反转录转座子不同于转座子，是以ＤＮＡ－ＲＮＡ－ＤＮＡ的途径来实现转座的，在整合酶的作用下新生成的以ＤＮＡ状态存在的反转录转座子整合到宿主基因组中。这样，反转录转座子在宿主基因组中的拷贝数得到不断积累，从而使基因组增大。由于反转录转座子带有增强子、启动子等调控元件，所以会影响宿主基因的表达，在生物进化过程中反转录转座子起着不可忽视的作用［４］。 根据是否具有编码反转录酶的能力，反转录转座子可以分为两个家族：自主性反转录转座子和非自主性反转录转座子O按照序列结构中有无长末端重复序列（ｌｏｎｇｔｅｒｍｉｎａｌｒｅ－ｐｅａｔｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＬＴＲ）又可分为有ＬＴＲ反转录转座子和无ＬＴＲ反转录转座子。自主性反转录转座子包括内源性反转录病毒（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，ＥＲＶ）、ＬＴＲ反转录转座子及长散在元件（ｌｏｎｇｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄｎｕｃｌｅａｒｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＬＩＮＥｓ）O非自主性反转录转座子包括短散在元件（ｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄｎｕｃｌｅａｒｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＳＩＮＥｓ）及修饰性反转录假基因（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄｒｅｔｒｏｐｓｅｕ－ｄｏｇｅｎｅ）。 ２转座子的转座机制 转座子都具有编码与转座作用有关的酶—— —转座酶的基因，而末端大多数都是反向重复序列。转座酶既识别转座子的两末端，也能与靶位点序列结合。转座作用的机制是转座子插到新的位点上产生交错切口，所形成的突出单链末端与转座子两端的反向重复序列相连，然后由ＤＮＡ聚合酶填补缺口，ＤＮＡ连接酶封闭切口，交错末端的产生与填补说明了靶ＤＮＡ在插入位点存在正向重复，两条链上切口之间的交错取决于正向重复的长度，因此，每个转座子所特有的靶重复序列，反映了切割靶ＤＮＡ的酶的几何形状。 ３主要运用于动物的几种转座子 ３．１Ｐ－转座子Ｐ－转座子最初于果蝇中发现，并研究了其结构与功能，建立了Ｐ－转座子和转座酶辅助系统。该转座子能只在果蝇中作用。但该系统为以后的转基因动物提供了理论和实验基础。Ｐ－转座子长度为２．９ｋｂ，具有３１ｂｐ的末端反向重复序列（ＩＲＴ）。中间有编码转座酶的可转录单位，以此产生转座子的精确切出和准确插入另一染色体位点（切出—粘贴反应）。Ｐ—转座子的功能还受其他核因子的影响，这些因子可能是不同昆虫中转座子发挥功能与否的条件。３．２Ｍｉｎｏｓ转座子Ｍｉｎｏｓ转座子是从海德尔果蝇Ｄ．ｈｙｄｅｉ中分离得到的，并首先应用与果蝇以外的昆虫转基因。Ｍｉｎｏｓ转座子长度位１．４ｂｐ，具有较长的１００ｂｐ的末端反向重复序列（ＩＲＴ）。可转录单位为１个内含子。以地中海果蝇白眼基因为报告基因的研究表明，Ｍｉｎｏｓ转座子的转座效率在ＧＯ带１～３％，并能在双翅目核鳞翅目昆虫细胞及按蚊Ａｎｃｐｈｅｌｅｓｓｔｅｐｈｅｎｓｉｉ和大果蝇Ｄ。Ｖｉｒｉｌｉｓ昆虫个体中实现转座。３．３Ｍｏｓｌ（ｍａｒｉｎｅｒ）转座子Ｍｏｓｌ（ｍａｒｉｎｅｒ）转座子是从马里塔尼亚果蝇Ｄ。Ｍａｕｒｉｔｉａｎａ中发现的。长度２８ｂｐ的末端反向重复序列（ＩＲＴ）和特意性的ＴＡ目标结合位点。Ｍｉｎｏｓ转座子是至尽为止研究最深入的转座子之一。 ３．４ｈｏｂｏ转座子因为Ｐ转座子只能在果蝇中实现转座，因此寻找其他转座子系统十分必要。Ｈｏｂｏ转座子就是其中 转座子在转基因动物中的应用 刘冬 （山西农业大学研究生学院，太谷０３０８０１） 摘要：转座子是发现新基因和基因功能分析的有效工具之一，作为插入突变原和分子标签已被广泛用于基因的分离和克隆，一些转座子已作为转化载体用于制备转基因动植物。转座子对多种生物尤其是对脊椎动物的成功转化让人们看到了他们作为转基因载体的巨大潜能。 关键词：转座子；转基因动物；昆虫；鱼类；哺乳动物 专论与综述 畜牧兽医科技信息２００７．０７ １８
转基因动物技术应用研究进展 摘要：本文主要对动物转基因技术发展状况作了概述，重点是近年发展的提高转基因效率的非定点整合转基因方法, 如睾丸转基因法和卵巢转基因法; 提高转基因精确性的定点整合转基因的基因打靶法作了介绍。然后对转基因技术的应用作了论述，最后对转基因技术的发展前景作了展望。 关键字：动物转基因技术；应用；展望 Progress on Techniques for Producing Transgenic Animals And their Application Abstract: This review describes the recently developed animal gene transfer techniques, including gene transfer into the testis and ovary for easily making non-site specific methods; gene targeting in embryonic stem cells, somatic cells and primordial germ cells for site specific methods.The application and prospect of transgenic technology was also discussed. Key words: animal gene transfer technique; application;prospect 动物转基因技术是将外源基因移入动物细胞并整合到基因组中, 从而使其得以表达。自Palmiter等[1] (1982)把大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵获得超级巨鼠以来,世界各国科学家对转基因技术应用于动物生产的研究产生了极大的兴趣,并相继在兔、羊、猪、牛、鸡、鱼等动物上获得转基因成功。转基因动物研究是近年来生命科学中最热门、发展最快的领域之一,其应用已广泛渗透于分子生物学、发育生物学、免疫学、制药及畜牧育种等各个研究领域中。这项技术正在对动物生产产生一场新的革命,在提高生长速度、生产性能,改善产品品质、抗病育种、基因治疗等方面取得了可喜的进展,显示出诱人的应用前景。 1 转基因动物技术 1.1 显微注射法 这一方法是发展最早,目前应用最广泛和最为有效的制作转基因动物的方法,创始人是Jaenisch和Mintz等,Gorden等[2]和最先通过此法获得转基因动物。其基本原理是:通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵,利用受精卵繁殖过程中DNA的复制过程,将外源基因整合到DNA中,发育成转基因动物。 1.2 逆转录病毒载体导入法 将目的基因重组到逆转录病毒载体上,制成高滴度的病毒颗粒,人为感染着床前后的胚胎,
转基因动物的应用前景 冯彦东，马小军，李越，马志辉，肖海元，马永刚，马聪 甘肃农业大学动物科学技术学院甘肃兰州 (730070) 摘要：本文较为全面的综述了各种转基因动物技术的方法，以及提高转基因效率的方法；指出了目前研究中存在的问题，并对其发展前景进行了展望。 关键词：转基因动物、基因、方法、应用、前景 科学家预言，21世纪是生命科学的世纪，生物技术产业已成为科学家和企业家开发的热点。转基因动物技术是21世纪发展最为迅速的生物高新技术之一，是建立在细胞遗传学、分子遗传学、胚胎发育学和DNA重组技术基础之上的生物工程技术。转基因技术就是利用工程技术的实验手段将特定外源基因导入受体细胞中，由此整合到受体细胞的染色体上，并使外源基因得到表达和遗传的生物技术。携带外源基因并能表达和遗传的支物称为转基因动物。转基因技术是新兴的生物技术，具有广阔的应用前景。目前利用转基因技术获得的主要是粮食作物，其中转基因植物及产品已进入商品化生产阶段。转基因动物的研究尚处于实验室研究阶段，获得转基因动物技术难度较大。但它是一种通过对基因的操作，在RNA、蛋白质、形态学或生理学等水平直接观察基因在活体内的活动情况，并观察其表达产物所引起的表型效应的四维实验体系，其应用已广泛渗透于分子生物学、发育生物学、免疫学、制药及畜牧育种等各个研究领域中，既具有深远的理论价值，又有重大的应用价值。据统计，全球已有以转基因动物技术为核心的公司43家，并将成为21世纪生物技术领域的支柱产业。1998年全球动物生物技术产品总销售额估计为6.2亿美元，预计到2010年仅在农业领域总销售额将达到110亿美元，其中75亿美元来自转基因动物品种。而利用转基因动物制作生物反应器生产药品物和功能蛋白的销售市场预计可达500亿美元。毫无疑问，转基因动物正在改变着生物医药、农业生产、环境保护、生物材料，甚至是整个生命科学研究与发展面貌。利用转基因动物技术，既可加快家畜品种的改良速度，提高肉、奶、蛋的产量和品质，又可生产珍贵的药物蛋白，为大量患者造福。可以说转基因动物技术对于人们千百年来追求的丰衣足食，延年益寿两大目标都会做出具大的贡献。[1，2，3，4，5，6，7] 1 转基因动物的制作方法 1.1 显微注射法 是由美国人Gordon于1980年首次发明。显微注射法的制作过程是将SV40的TK基因整合的质粒以显微注射法注入到小鼠受精卵原核中,首次成功地培育出转基因小鼠。其基本原理是通过显微镜注射将外源基因直接注射到受精卵的雄原核内,将外源基因整合到DNA中,发育成转基因动物。其优点是直接对基因进行操作,整合率较高.缺点是技术难度高,成功率低。[3，8，15，18] 1.2 逆转录病毒传染法 此法的研究是1974年Janenissh等将SV40DNA注入小鼠囊胚腔中，获得转基因小鼠。其原理是利用逆转录病毒的LTRs区域具有的转录启动子活性这一特点，将外源基因连接到LTRs的下部进行重组后，再使之包装成为高滴度的病毒颗粒，直接感染受精卵或注入囊胚中，携带外源基因的反转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。逆转录病毒法的优点是操作简单，外源基因的整合率高，动物病毒所具有的启动子不但可以引发一些选择标记基因的表达，还能引发所导入的外源基因的表达，缺点是逆转录病毒载体容量有限，并且外源基因
动物转基因技术及其应用 摘自（作者：幸宇云任军江西农业大学来源：《百名专家谈转基因》） 转基因是指利用现代分子生物学技术，将某些生物的基因导入到其他物种中，由于导入基 因的表达，引起这些物种性状发生可遗传的变化。转基因动物就是利用转基因技术获得的、具 有正常表达和可稳定遗传外源基因的动物。自1982年第一只转基因动物——一只因导入大鼠 生长激素基因而使生长速度倍增的转基因鼠诞生以来，各种转基因动物，如鱼、兔、猪、牛、 羊等先后问世，1997年，举世轰动的“多莉”克隆羊的诞生使转基因克隆动物成为现实，转 基因动物研究得到了进一步发展。 生产转基因动物的方法有很多，如：显微注射法、精子载体法、逆转录病毒载体法、胚胎 干细胞介导法、体细胞克隆介导法、人工染色体介导的基因转移法等，这些方法各有其优缺点，在转基因动物生产中有着不同程度的应用。 显微注射法是动物转基因技术中最早使用的方法。1982年，美国人Gordon就是利用这种 方法获得了名噪一时的转基因鼠。其基本原理是在显微镜下直接将目的基因注射到受精卵细胞 的原核内，在目的基因与胚胎基因组融合后进行体外培养，最后移植给受体母畜“借腹怀胎”。这种方法的优点是：可靠性高，重复性好，目的基因的整合效率相对较高，导入基因片段的大 小和类型不受限制，转基因在世代之间可以稳定遗传。该方法也有其缺点，主要体现在导入基 因整合的随机性和不可见性，这样会导致基因表达不稳定及可能出现不希望的插入突变。该方 法成功的范例很多，如：美国科学家Hammer等在1985年获得一批转基因兔、绵羊和猪；荷兰 科学家KrimPenfort等于1991年获得了转基因牛；1985年，我国朱作言院士等成功获得了世 界上首例转基因鱼；由中国农业大学李宁院士领导的课题组于2008年获得了一头导入人CD20 抗体基因的转基因奶牛——贝贝。 有的学者另辟蹊径，创立了精子载体转基因法。该方法是将精子与目的DNA进行预培养后，使精子具有携带目的基因进入卵子的能力，精子与卵子结合后，该基因被整合到受精卵的DNA 中。同显微注射法相比，该方法有几个明显的优点：无需显微注射操作，不会对胚胎造成损伤，整合率高，成本很低，不需要对动物进行胚胎移植手术处理等。但该方法成功率不高、效果不 稳定，有待科研人员进一步探索和改进。与显微注射法相比，该方法成功的例子不多。1989 年意大利Lavitrano等首次报道利用精子载体法获得转基因鼠；1996年意大利Sperandio科 研小组报道了采用该方法生产转基因牛和猪。 谈到病毒，人们往往面容失色，殊不知病毒在科学上有很多妙用。逆转录病毒是一种RNA 病毒，在转基因技术中有着独特的应用。人们将目的基因结合到逆转录病毒上，通过病毒感染 可将目的基因插入到宿主基因组中去。该方法具有可同时感染大量胚胎、不需要昂贵的显微注 射设备等优点，但也存在插入外源DNA大小有限、外源基因易发生重排和丢失、逆转录病毒的 序列可能干扰转基因表达等缺点。应用该方法，美国人Salter等（1987）生产出转基因鸡； 德国学者Hofmann等获得绿色荧光蛋白转基因猪（2003），随后又生产出转基因牛（2005）； 来自冷泉港实验室的Michael获得能够发荧光的山羊（2006）。 胚胎干细胞是生命体中保留的未成熟细胞，具有再分化形成其他细胞和组织器官的潜力， 被称为“万能细胞”。利用胚胎干细胞生产转基因动物的原理是将外源基因导入分离好的胚胎 干细胞，然后将转基因的胚胎干细胞注射于受体动物胚胎后，参与宿主的胚胎融合形成嵌合体，从而得到转基因动物。这一方法的优点是可以对胚胎干细胞进行特定选择。缺点是目前只有小 鼠干细胞系比较成熟，而家畜干细胞系还未完全建立，有不少问题尚待解决。 体细胞克隆介导的转基因是动物转基因技术中的“高级版本”。说到体细胞克隆，很多人都会想到一位“动物明星”——多莉羊，它是于1997年由英国Wilmut等获得的杰作。转基因 克隆技术是转基因技术和动物克隆技术的有机结合，其基本原理是将目的基因导入动物体细胞
生命科学院 分子生物学 期末综述 题目：基因工程在转基因动物领域的应用现状及展望班级： 09动物科学 姓名：曾雪婷 学号： 2009084548
【摘要】本文阐述了基因工程和转基因技术研究的原理、基本路线，介绍了转基因技术和生产转基因动物的方法，总结转基因技术在哺乳动物领域的应用，提出了转基因动物面临的问题，并对转基因技术及转基因动物的前景进行了展望。 【关键词】基因工程；原理；转基因动物；应用；展望 基因工程是改变生物的遗传组成，增加生物的遗传多样性，赋予转基因生物新的表型特征，使其能够更好地服务于人类社会的一项工程技术。基因工程在转基因动物领域的应用具有巨大的发展潜力，促进了转基因方法的不断发展和转基因动物应用领域的迅速扩大。 1.基因工程与动物基因工程的原理 基因工程又名遗传工程(genetic engineering)、一主要包括DNA 重组技术、分子克隆或基因克隆等技术，它是指在分子水平上提取(或合成)不同生物的遗传物质，在体外切割，再和一定的载体拼接重组，然后把重组的DNA分子引入细胞或生物体内，使这种外源DNA(基因)在受体细胞质中进行了复制与表达，按人们的需要繁殖扩增基因或生产不同的产物或定向创造生物的新性状，并能稳定遗传给后代[1]。基因工程的核心内容包括基因克隆和表达。 动物基因工程就是利用基因工程技术来人为地改造动物遗传特性的技术体系。它的具体应用就是生产转基因动物(transgenic animal)，即用基因工程的方法获得目的基因并导入到动物的受精卵中，使外源基因与动物本身的基因组DNA整合到一起，并随细胞的分裂而增殖，从而在动物体内得到表达，产生具有特定性状的个体。这种在基因组中稳定有效地整合有人工导入外源基因的动物称转基因动物。应用实验胚胎学和分子生物学原理，将来自一种生物的特定基
转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。 1992年荷兰培育出植入了人促红细胞生成素基因的转基因牛，人促红细胞生成素能刺激红细胞生成，是治疗贫血的良药。转基因技术标志着不同种类生物的基因都能通过基因工程技术进行重组，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，创造新的生命类型。同时转基因技术在药物生产中有着重要的利用价值。转基因技术，包括外源基因的克隆、表达载体、受体细胞，以及转基因途径等，外源基因的人工合成技术、基因调控网络的人工设计发展，导致了21世纪的转基因技术将走向转基因系统生物技术2000年国际上重新提出合成生物学概念，并定义为基于系统生物学原理的基因工程与转基因技术。 1.转基因的细胞学原理： (1)细胞周期及MPF：细胞周期可人工分成4个时期，分别为G1期、S期、G2期和M期。细胞在正常情况下，沿着G1-S-G2-M路线运转。S期为DNA合成期，M期为有丝分裂期，M期结束到S期开始之前为G1期，S期末到有丝分裂期(M期)为G2期。有丝分裂的启动由成熟促进因子也叫M期促进因子(maturation/mitosism/meiosis promoting factor，MPF)调控，MPF 在细胞分裂中呈周期性变化即分裂后逐渐积累，到G2晚期达到高峰，由中期向后期转换时骤然消失。因此推测MPF是真核细胞M期的一个基本调节物质，能引导细胞由间期向M期转变。MPF由蛋白激酶激活，存在于所有的真核细胞中(包括减数分裂的性细胞)。但并非所有的细胞都是周期中细胞，某些细胞在一定的条件下可以脱离细胞周期进入G0期或分化为不分裂的细胞，而且G0期细胞可通过诱导重新进入周期。 (2)通过MⅡ期的卵母细胞转基因：MⅡ期的卵母细胞的MPF含量很高，可以诱导细胞核发生一系列变化包括核膜破裂(NEBD)和早熟染色体凝集(premature chromosome condensation，PCC)，处于减数分裂MⅡ期的卵母细胞无核膜的时间远远长于有丝分裂M期的细胞。所以此时期的卵母细胞可作为基因导入的受体。据此1998年Anthonv等对逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎方法加以改进，用逆转录病毒载体注射MⅡ期的卵母细胞，注射完毕的卵母细胞同获能后的精子共同孵育后，体外发育至囊胚，再移植到母牛体内得到了转基因小牛。1999年Anthonv等又将精子与外源基因共孵育，然后将精子头部显微注射入MⅡ期的卵母细胞，这两种方法共同之处都是利用MⅡ期的卵母细胞无核膜，外源基因易导入的 特点。 2.转基因的胚胎学原理： (1)哺乳动物转基因的胚胎学原理：精子和卵子只有发育成熟后，精卵相遇时才能完成受精过程。精子进入卵子后头尾分离，胞核出现核仁，形成核膜，头部膨大形成雄原核；同时卵子排出第二极体形成雌原核。一般来说雄原核比雌原核大。接着雌雄原核的核膜消失，雌雄原核融合。随后细胞周期性卵裂，分裂球增加到32个时形成桑葚胚，进入子宫再发育至囊胚，此前的胚胎细胞具有很强的分化能力。从哺乳动物受精卵分裂发育的规律来看，转基因操作时较合适的部位是受精卵的雄原核，精子进入卵细胞后的1小时，雄原核和雌原核还未融合，在显微镜下容易看到雄原核。多数研究者在此时期把外源基因显微注射到雄原核，通
转基因动物及其在医学中的应用 转基因动物是指通过加减特定的DNA片段而改变了基因构成和性状 的动物，也可以认为是指体内基因组中稳定地整合有外源基因的动物。该项技术始于80年代初，很快便成为研究动物基因表达特性及其功能的重要手段，在基因表达的调控机制等方面的基础理论研究、家畜家禽的遗传性状改造、培育能为人类提供器官移植材料的家畜、培育人类疾病的模型动物、作为生物反应器主产工业和医学所需要的珍贵生物活性蛋白等方面被广泛应用。本文主要对其在人类医学方面的应用现状及前景作以论述。 1转基因动物的制备技术 用以培育转基因动物的技术叫做转基因技术或基因转移。其总体过程是：首先从某种动物分离目的基因或人工构建该目的基因，把该目的基因在体外进行重组和扩增，然后再把加工好的目的基因设法导入另一个同种或异种动物受精卵的原核内（或细胞质内），使其稳定地整合到受体细胞的基因组中，最后使该受精卵发育成携带外源目的基因的个体，即产生了转基因动物。目前常用的转基因技术主要有： 1）原核内显微注射法是将在体外构建的目的基因，在显微操作仪下用极细的微吸管注射到处于原核时期的受精卵的原核中，让这种外源基因通过某种方式整合到受体细胞的基因组中去，以实现转基因的目的。 2）转染技术主要以RNA病毒或DNA病毒为载体，在体外将目的基因或连同启动子等序列一同重组到病毒的核酸载体上。再让该病毒感染受精卵或胚胎于细胞，利用载体病毒具有主动整合到受体细胞基因组中去的特性，让其连同所携带的目的基因等也一同整合到受体细胞的基因组上去。 90年代后又出现了两种较新的方法，即基因剔除和基因楔入技术。 3）细胞载体技术主要使用胚胎干细胞（ES）作为操作对象。胚胎干细胞是从哺乳动物早期胚胎的内细胞团中分离得到的一种二倍体细胞，可在体外培养并保持全能分化的潜能，一旦回复到适当的环境条件下即可形成胚系集落。可以用转基因技术将外源目的基因转移到胚胎干细胞中，通过同源重组或转换的方法使外源基因整合到胚胎干细胞的基因组中。而且，还可以根据由于外源基因的插入所产生的基因表达方面的改变，来对胚胎干细胞进行预筛选，从而大大提高转基因的成功率。被转基因后的胚胎干细胞经鉴定后可被移植到正常发育的囊胚中，再将囊胚导入假孕的代理母亲子宫内发育而产生出嵌合体动物，然后与正常的雄性动物交配即可获得生殖系携带外源基因的纯合转基因动物。 目前还有用快速分裂的哺乳动物乳腺肌上皮细胞或小鼠精子作为细胞载体。 2转基因动物在医学中的应用
动物转基因技术的研究现状与应用 课程：基因工程姓名：迪丽努尔·尼扎木墩学号：2013081605 摘要转基因动物就是指通过人工的方法将外源基因导人动物染色体基 因组，使之稳定表达并能遗传给后代的一类动物。转基因技术的一般方法有原核期胚胎的显微注射法（Microjection）、逆转录病毒载体法、精子载体法、体细胞核移植技术、胚胎干细胞介导的基因转移，这几种方法各有其公优缺点，在动物转基因上均有不同的应用，目前在动物抗病育种、建立诊断和治疗人类疾病的动物模型、利用转基因动物生产药用蛋白质等方面应用越来越广泛。 关键词转基因技术方法研究现状 转基因动物（transgenicanimal）指通过基因工程技术将目的基因导入生殖细胞、早期胚胎干细胞和早期胚胎，并整合到受体细胞的基因组中，它们经过各种发育途径形成所有细胞都包含目的基因的个体，称转基因动物（也称个体表达系统）。导入的基因称为转入基因（transgene），而整个技术则称为转基因技术（transgenictechnology或transgenesis）[1]。现代转基因动物（tx-ansgenicanimal）研究始于20世纪80年代以后,1980年，Gordon等首次获得转基因小鼠目前除转基因小鼠外，转基因兔、绵羊、猪、牛及转基因山羊、转基因鸡、转基因大鼠、转基因猴等陆续育成[2，3]。本文将从转基因动物的原理、主要方法和应用等方面作一综述。 1转基因技术的一般方法
能否将在细胞中进行的遗传修饰过渡到整体以及实现向后代的传递，主要取决于所进行修饰的细胞类型和与其相应的育种技术。迄今为止，能够被有效地用来进行转基因动物研究的途径主要有以下几种[4]： 1.1原核期胚胎的显微注射法（Mi-crojection） 该法由美国人Gordon发明，其主要步骤包括：（1）分离、克隆和重组外源基因，构建载体；（2）将融合基因注入受精卵的原核（一般是雄原核）；（3）将微注射后的受精卵移入假孕母畜的输卵管继续发育。Palmiter等（1982）将带有小鼠金属硫蛋白I基因启动子的大鼠生长激素基因导入小鼠的受精卵，获得“巨型小鼠”，在生命科学领域引起了不小的轰动。按照转基因小鼠的思路，转基因兔、转基因绵羊、转基因猪、转基因山羊都相继成功。显微注射方法相对简单，整合率高，是目前应用比较广泛，效果比较稳定的制作转基因动物的方法之一。但该方法的整合位点随机，整合一般是多拷贝首尾串联相接，不利于研究基因的结构、功能及表达调控。 1.2逆转录病毒载体法 1.2.1逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎：该方法主要利用逆转录病毒的长末端重复序列（longtermi-nalrepeats，LTRs）区域具有转录启动子活性以及逆转录病毒可以直接整合到宿主染色体上的特点，将外源基因连接到LTRs下部，构建重组载体，直接感染受精卵或微注入囊胚腔中。达到外源基因在宿主染色体上的整合、表达。Salter和Haskell等分别用此方法作出了转基因鸡和牛[5]。 1.2.2逆转录病毒载体注射MⅡ期的卵母细胞：Anthony等[6]（1998）对逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎的方法进行了改进。他认为逆转录病毒载体介导的基因整合的关键在于细胞分裂时出现核膜分解。有丝分裂时核膜降解的时间很短。细胞分裂完成后，核膜很快重新形成。而处于减数分裂中期（MⅡ）的卵母
转基因动物制药 20世纪70年代后期，随着DNA重组技术的问世，诞生了基因工程药物或称基因药物。高产值、高效率的基因药物的出现给药物生产带来了一场革命，推动了整个医药产业的发展、极大地加速了基因工程药物的研制进程。 1 转基因动物概述 转基因动物（transgenic animals）就是用实验室方法将人们需要的目的基因导入其基因组，使外源基因与动物本身的基因整合在一起，并随细胞的分裂而增殖，在动物体内得到表达，并能稳定地遗传给后代的动物，且使遗传信息得到表达。整合到动物基因组上的外来结构基因称为转基因，由转基因编码的蛋白质称为转基因产品，通过转基因产品影响动物性状。如果转基因能够遗传给子代，就会形成转基因动物系或群体。 目前一般使用逆转录病毒载体法（应用较为成功的方法）、显微注射法、精子载体法及等来制作转基因动物。 2 生物制药产业的发展 生物医药产业的发展经历了3个不同的历史阶段。早期是天然药物，如中草药（或加工成中成药）。但人类并不满足于此，以后通过化学方法合成新的药物。合成的药物成分单纯，有些是天然药物没有的，有些是对天然药物的改进，使它更为有效。到20世纪70 年代后期，随着DNA重组技术的问世，诞生了基因工程药物或称基因药物。 3 转基因动物制药 基因工程药物的发展经历了三个阶段：第一阶段是细菌基因工程，第二阶段是细胞基因工程，第三阶段就是用转基因动物来生产药用蛋白。 3.1转基因动物制药的应用 转基因动物在生物制药中的应用主要包括以下几个方面：改良动物品种和生产性能；生产人药用蛋白和营养保健蛋白；生产人用器官移植的异种供体；建立疾病和药物的筛选模型；生产新型生物材料等。 1）利用转基因动物生产药用蛋白
课程论文规范 一、论文组成及顺序 封面、中英文摘要、正文、参考文献、致谢、有关附件等(可选)。 论文电子版上交。 二、规范要求 1．正文中论文题目使用黑体三号字，正文使用宋体小四号字，1.25倍行距；表格为单倍行距；一级标题段前段后为0.5行，正文段前段后为0，字符间距为标准。 2．页边距：上2.5㎝,下2.5㎝,左3㎝,右2.5㎝。方向：纵向。 页脚：1.5㎝.页码：页面底端（页脚），居中，格式如·X·，封面不编页码，从正文开始。 3．论文字数不少于5000字。 4．论文中的表格采用三线表，必要时可以加辅助线，表头放在表格的上方，5号黑体，中；表格内为5号宋体，左对齐。 5．论文中的图，图题放在图的下方，不要外框。 6．表序、图序均以阿拉伯数字连续编号。 7．参考文献不少于10篇，采用顺序编码制，文中参考文献[数字]上标。 8．中英文摘单独成页。 9．为保证打印效果，全文字体的颜色统一设置成黑色。均用A4纸单面打印。
青岛农业大学 动物基因工程课程论文 题目：转基因动物的应用前景 姓名：宋增财 学院：动物科技学院 专业：兽医 班级：2010-02 学号：20106576 任课教师：闵令江 二Ｏ一一年十月二十日
转基因动物的应用前景 兽医宋增财 指导老师闵令江 摘要：转基因动物不仅可以用来研究基因功能，还可以按照人的意愿改良动物的遗传品质，为人类探讨疾病发病机理，寻求有效治疗途径，提供筛选和鉴定药物的理想模型；改良家畜生长特性，提高饲料利用率和产量，为人体提供异体移植器官和生产珍贵药物蛋白。转基因生物研究蕴含着巨大的经济价值，具有非常广阔的应用前景，在国际上成为生物工程的投资热点之一。本文较为全面的综述了各种转基因动物技术方法和动物转基因技术的应用，并对其发展前景作了展望。 关键词：转基因动物基因方法应用前景
转基因动物的实际应用 姓名：张家耀学号：080108121 摘要： 经过 20 多年的长足发展。生物工程药品（重组 DNA 药品）现已成为世界医药市场上不可或缺的重要组成部分。据不完整统计数字。迄今为止世界各国已开发上市的生物工程药品（含疫苗及诊断试剂在内）至少在 500～600 种。年销售额高达 400 多亿美元。在世界第一新药研制大国美国 2004 年经 FDA 批准上市的生物工程新药即有 25 只。所有上市的生物工程药品基本上采用以下两种手段生产，即 1．大肠杆菌（DNA 杂合瘤）发酵法2．中国仓鼠卵巢细胞培养法。 关键词：转基因动物生物制药产业 正文： 许多科学家预言，21 世纪是生物科学的世纪，生物技术产业已成为众多科学家和企业家竞相研发的热点。转基因动物技术和转基因动物制药则更是近年来世界范围内研究热点中的热点。作为一门生物高新技术，转基因动物研究既具有深远的理论价值，又有重大的应用价值，因而成为近年来生物工程领域研究的热点之一。而转基因动物的重要应用领域之一就是利用转基因动物作为生物反应器生产药用或食品蛋白，即转基因动物制药。本文试图通过回顾转基因动物技术和转基因动物技术生产药物的研究进展来对转基因动物制药进行概括介绍。 1 转基因动物概述 1.1 概念 所谓转基因动物,就是用实验的方法将人们所需要的外源目的基因导入动物的生殖细胞受精卵里,并整合该细胞后发育成为个体整合的外源基因,整合的外源基因在染色体组内稳定整合,并能稳定地遗传给后代。 1.2 应用 1.2.1促进动物生长、提高畜产品产量、改善产品品质
转基因技术可以改良家畜、家禽的经济性状,增强抗病力等。还可以培育出微型动物,其生长快、易处理、饲料成本低,更加适用于药物筛选和疾病研究。另外,对于挽救濒危物种、保护动物遗传资源的意义更是十分重大。1.2.2利用转基因动物生产目的基因产物即利用转基因动物作为生物反应器,从动物的乳汁或血液中获得目的产物,提高转基因动物的基因表达水平和基因表达量,降低成本,带来巨大的经济效益和社会效益。 1.2.3进行动物品种改良 将有利目的基因转入受体动物,为家畜品种的改良提供一条非常有效的育种新途径。 1.2.4 生产可用于人体器官移植的动物器官 目前,世界范围内普通存在器官短缺的问题,异源器官移植是解决此问题的有效途径; 转基因动物将是人类最好的“器官库”,提供从皮肤、角膜到心、肝、肾等,给需要器官移植的患者带来了希望。 2 生物制药产业的发展 生物医药产业的发展经历了 3 个不同的历史阶段。早期是天然药物，如中草药（或加工成中成药）。但人类并不满足于此，以后通过化学方法合成新的药物。合成的药物成分单纯，有些是天然药物没有的，有些是对天然药物的改进，使它更为有效。到 20 世纪 70 年代后期，随着 DNA 重组技术的问世，诞生了基因工程药物或称基因药物。生物制药业的发展趋势我们可以从处于临床试验或申报阶段的生物技术药物、已批准上市的生物技术药物以及生物技术药物的年销售额等在制药业中的比例变化看出生物制药的发展势头。 处于临床试验阶段的生物技术药物。生物技术药物的发展非常稳健和健康，根据 IMs 的统计数据旧，截止到 2003 年 2 月，美国、欧盟和日本等大约有 500 种生物技术药物处于临床试验或申报阶段，占全部临床试验药物的 27％。在研的生物技术药物中，除了基因重组蛋白类产品外，还有核酸类产品，如基因治疗产品和 DNA 疫苗产品，有不少核酸类产品已进入 II 期或 III 期临床试验，有较好的发展前景。 研究与开发的高速增长。生物技术药物的发展仍比较平稳，从 1996 年到 2002 年，每年约有 5～9 种创新生物技术药物上市。2002 年 FDA 批准的创新药物中，生物技术药物已占当年创新药物的 1／3 以上。 3 转基因动物在生物制药中的应用
锌指核酸酶技术在动物转基因中的应用 摘要:锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)具有特异性识别并敲除DNA片段中特定基因的特点,通过对DNA片段上的特定基因进行靶向修饰产生新型细胞,是能够应用于动物转基因上的一种新技术?该技术已在一些动物的研究上取得了一定的成果,相对于传统的转基因技术,该技术在简化操作程序?缩短操作时间及提升成功率上都有很大的提高?就常用的动物转基因方法?锌指核酸酶技术的作用原理以及在动物转基因上的应用及其前景进行了论述? 关键词:锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN);动物转基因;靶向修饰 动物的转基因技术是建立在分子生物学基础上,利用基因工程等试验方法将外源基因导入动物的受体细胞,并通过受体细胞的分裂与繁殖,将整合在受体细胞基因组中的目的基因有效遗传给后代个体,并得到预期结果的一种方法?该技术始于20世纪80年代,1980年Gordon等[1]通过核显微注射技术在小鼠体内的试验,成功获得了第一个转基因动物?后来一些研究人员又利用该方法陆续在兔?绵羊?猪的转基因上获得成功,在此基础上人们通过不断试验探索出其他的转基因技术,并且也在一些动物的转基因上获得成功?如逆转录病毒载体法?精子载体法?胚胎干细胞介导法等分别在牛?鸡?小鼠等动物的转基因上获得成功?但是,随着分子生物学的不断发展,研究人员对转基因结果的要求也越来越高,而这些传统的技术在一定程度上已不能满足人们的要求?为了得到更好?更符合人们意愿的试验结果,研究人员不断地探索着更为先进的转基因技术,锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)技术就是一种新的转基因技术,由于其具有独特的剪切功能而引起了研究人员的极大兴趣?1986年Diakun等[2]首先在真核生物转录因子家族的DNA结合区域发现了Cys2-His2锌指模块,到1996年Kim等[3]人工合成了第一个ZFN,再到Urnov等[4]发现的由4个锌指连接而成的ZFN可识别24 bp的特异性序列,ZFN在转基因中的作用逐渐受到了研究人员的关注? 1 动物转基因技术的常用方法 1.1 逆转录病毒载体法 逆转录病毒载体法是利用病毒作为载体,将外源基因片段插入病毒载体的长末端重复序列的下游并通过其侵染作用将目的片段整合到宿主细胞的基因组中?该方法主要应用于转基因鸡和牛的生产?1974年Janenisch等[5]发现注入小鼠囊胚腔中的SV40DNA能够在其体内发生整合?但真正用于转基因动物的则是Salter 等[6]研究人员,他们在1987年利用该方法生产出了转基因鸡;而Biery等[7]则在1995年以劳式肉瘤病毒(RSV)为载体,通过将目的基因片段导入牛的胚胎,获得了转基因牛?此方法操作简便,整合效率高且整合的外源基因多为单拷贝,所以非常有利于对基因结构?功能及表达调控的研究[8]?
转基因动物与生物制药相关问题 姓名学号：班级：学院： ［摘要］21世纪将是生命科学突飞猛进的时代。转基因动物的研究作为一个崭新的学科已经成为生命科学研究和讨论的热点，本文简要论述了转基因动物的概念及应用,就转基因动物在生物制药方面的研究与开发应用情况，转基因动物与生物制药及其优越性等方面进行了阐述,同时提出了转基因动物制药存在的问题,并对其发展前景进行展望。 ［关键词］转基因动物生物制药基因工程药物转基因动物制药 ［正文］许多科学家预言，21世纪是生物科学的世纪，生物技术产业已成为众多科学家和企业家竞相研发的热点。转基因动物技术和转基因动物制药则更是近年来世界范围内研究热点中的热点。作为一门生物高新技术，转基因动物研究既具有深远的理论价值，又有重大的应用价值，因而成为近年来生物工程领域研究的热点之一。而转基因动物的重要应用领域之一就是利用转基因动物作为生物反应器生产药用或食品蛋白，即转基因动物制药。本文试图通过回顾转基因动物技术和转基因动物技术生产药物的研究进展来对转基因动物制药进行概括介绍。 生物医药产业的发展经历了三个不同的历史阶段。最早期是天然药物，如中草药，从中提取我们所需要的成分，或加工成中成药，这是第一步。但人类并不满足于此，以后通过化学方法合成新的药物。合成的药物有些是天然没有的，有些是对天然药物的改进，使它更有效或更廉价。到了70年代后期，随着DNA重组技术的问世，诞生了基因工程药物（简称基因药物）。高产值、高效率的基因药物的出现给药物生产带来了一场革命，推动了整个医药业的发展。 1 转基因动物概述 1.1转基因动物的概念 转基因动物（transgenic animals）就是用实验室方法将人们需要的目的基因导入其基因组，使外源基因与动物本身的基因整合在一起，并随细胞的分裂而增殖，在动物体内得到表达，并能稳定地遗传给后代的动物，且使遗传信息得到表达。整合到动物基因组上的外来结构基因称为转基因，由转基因编码的蛋白质称为转基因产品，通过转基因产品影响动物性状。如果转基因能够遗传给子代，就会形成转基因动物系或群体。
转基因动物的研究及其应用综述 [摘要] 转基因动物是现代生物技术中一个极其重要的研究领域, 目前已经有转基因小鼠、兔、绵羊、山羊、猪、牛、鸡和鱼等多种转基因动物问世。本文综述了转基因动物应用研究以及所取得的重要成就, 并指出了转基因动物存在的主要问题, 展望了其发展前景。 [关键词]转基因动物; 基因转移;基因打靶;显微注射；核移植 [中图分类号]S811. 5 转基因动物技术始于 20 世纪 80 年代，近 30多年来，随着研究的深入，转基因动物的研究工作取得了突破性的发展，并且是目前生物技术领域研究的热点之一，具有重大的科学意义和应用价值。这项技术是继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后的第四项技术。转基因动物是通过向受精卵或早期胚胎中导入外源基因，有目的地对生物的遗传物质基础进行修饰改造培育新的品系。若外源基因与动物本身的基因（染色体）整合在一起，外源基因就能随生物的分裂而增殖，在体内得到表达，并能稳定地遗传给后代。 转基因技术是将外源基因通过载体导入受体生物体内，让其获得新特性的一门复杂技术。转基因技术在定向改造生物体中有着无法可比的优越性。随着生物技术的发展转基因技术相继在微生物、植物、动物中取得了成功。目前，已经有转基因小鼠兔绵羊、山羊、猪、牛、鸡和鱼等多种转基因动物问世。 1．转基因动物的研究概况 现代转基因动物研究始于 20 世纪 80 年代以后。1980 年, Go rdon 等[ 1 ]首次获得转基因小鼠。1982 年, Palm iter 等[ 2 ]分别将小鼠金属硫蛋白基因启动子(M T 21)与大鼠生长激素( rGH)结构基因和人生长激素(hGH )结构基因融合并导入小鼠受精卵中, 获得了生长超过正常小鼠的超级小白鼠, 其中一只阳性鼠生后74 d 的体重达到同窝非转基因小鼠平均体重的 1. 87 倍, 这便是著名的“巨型小鼠”事件, 是转基因动物发展史上的一个里程碑。目前除转基因小鼠外, 转基因兔、绵羊、猪及转基因山羊, 转基因鸡[ 3 ], 转基因大鼠及转基因鱼[ 4 ], 转基因牛[ 5 ], 转基因猴[ 6 ]等陆续育成。我国转基因动物研究起步较晚, 但已取得一定进展。中科院发育所与扬州大学合作, 将EPO 基因(促红细胞生成素) 和人乙型肝炎表面抗原(HBSA g)导入山羊, 获得两种乳腺特异性表达的转基因山羊[ 7 ], 同时也获得许多重要的基因重组表达产品[ 4 ], 标志着我国转基因技术进入了新的阶段。 2．转基因动物的原理 转基因动物（transgenic animal）指通过基因工程技术将目的基因导入生殖细胞、早期胚胎干细胞和早期胚胎，并整合到受体细胞的基因组中，它们经过各种发育途径形成所有细胞都包含目的基因的个体，称转基因动物（也称个体表达系统）。导入的基因称为转入基因(transgene)，而整个技术则称为转基因技术(transgenic technology或 transgenesis)。 利用转基因技术，人们可以在动物基因组特定的位点引入所设计的基因突变，模拟造成人类遗传性疾病的基因结构或数量异常；可以通过对基因结构进行修饰，在动物发生、发育的全过程研究体内基因的功能极其结构功能的关系；可以在动物基因组引入病毒基因组以模拟病毒性疾病的发病过程；可以通过引入具有重要药用价值蛋白的编码基因，使动物成为该药物蛋白的生产场所；可以将所引入的DNA片段作为环境诱变剂作用的靶DNA，通过对它回收后的结构分析，研究诱变剂造成的DNA损伤和诱发基因突变的规律。转基因动物技术不仅在生命科学研究中的应用越来越广，技术本身发展也越来越快，逐步逼近修饰的精确性与可调性。 转基因动物技术已经经历了近二十年的发展，从原理、技术及在生命科学研究领域中的应用来看，可将转基因动物研究大致分为以下3个部分：（1）上游部分克隆目的基因，分析基因的结构并在体外或其他系统中进行功能研究；（2）中游部分：设计遗传修饰策略（包括载体系统的构建等），选择适当的靶细胞进行基因转移和鉴定，在此基础上将遗传修饰由细胞向整体动物过渡，实现对整体动物基因组进行认为修饰的目的；（3）下游部分：按育种程序进行工程动物的选育和建系，在整体动物的背景上对目的基因的功能进行详细的研究，并进一步地开发利用符合设计要求的遗传工程动物。 转基因动物的遗传修饰策略包括：（1）导致产生新功能的基因组修饰（gain of function, GOF），主要有普通转基因及基因重复；（2）导致功能丢失的基因组修饰（loss of function, LOF），主要有插入突变、大片段缺失突变、点突变及条件性基因缺失突变；（3）导致基因替换的基因组修饰，主要利用基因打靶技术