诱导性多能干细胞相关基因OCT4过表达对
He p2细胞增殖及迁移的影响
贾淑芹1
,孟兴凯2
,王万祥2
,董培德2
,任建军
2※
(内蒙古医学院附属医院
1
外科实验室,
2
普外科,呼和浩特010050)
中图分类号:R739.6 文献标识码:A 文章编号:1006-2084(2012)06-0923-03
基金项目:内蒙古卫生厅2010年医疗卫生科研计划项目(2010038)
摘要:目的 应用基因转染技术将诱导性多能干细胞(iPS)相关基因OCT4过表达于喉癌Hep2细胞,观察其对Hep2细胞增殖力和侵袭迁移力的影响。方法 构建重组质粒真核表达载体pcD-NA3.1-OCT4,将重组表达质粒用脂质体Lipofactamin TM 2000转染人喉癌Hep2细胞,通过G418筛选,RT-PCR 及Western-blot 印迹法鉴定,进而筛选出稳定表达pcDNA 3.1-OC T4的Hep2细胞系;M TT 实验检测细胞的活力,Transw ell 法检测细胞的侵袭和迁移。实验分为三组,Hep2-pcDNA3.1-OCT4组、H ep2-pcDNA3.1组及Hep2空白对照组。结果 成功将OC T4基因转染入Hep2细胞中,Hep2-pcD-NA3.1-OCT4组可检测到目的基因在核酸、蛋白水平的高表达。转染后的细胞增殖、迁移加快,但细胞形态基本无变化。结论 iPS 相关基因OC T4的转染能加快肿瘤细胞的生长和迁移,使Hep2细胞具有干细胞属性。
关键词:诱导性多能干细胞;OCT4;增殖;迁移
Overexpress ion of Induc ed Pluripo tent Stem Cell Related G ene OCT4on Hep 2Cell Proliferation and Migration Variabilit y JIA S hu-qin 1,MENG Xing-kai 2,W ANG Wan-xiang 2,DONG Pei-de 2,REN Jian-jun 2.(1.Sur gery Lab oratory;2.Dep artment of Surgery,the Fir st Affiliated Hos pital of Inner Mongolia M edical C ollege,Hohhot 010050,China)
Abst rac t:Objective To obser ve over expr ession of induced pluripotent stem cell (iPS)r elated gene OCT 4in Hep2cell and its influence on cell pr oliferation and migration w ith gene transfection method.Meth-ods Recombinant plasmid eukary otic expression vector pcDNA3.1-OCT4was constr ucted and transfected into Hep2cells,then,cells wer e screened by G418and detected by qualitative PCR,real time PCR and Western blot.Cell prolifer ation inhibition was measured by MTT assay,cell m igration was obser ved by Tr an-sw ell assay.The cells were divided into 3gr oups,group Hep2-pcDNA3.1-OCT 4,group Hep2-pcDNA3.1and H ep2blank control group.Re sult s pcDNA3.1-OCT 4was tr ansfected into Hep2cells,and the expression of OCT 4was detected in nucleic acids and pr otein.M TT results showed that Hep2-OCT4cells grew faster tha n H ep2cells.C ell migration results showed the number of cell m ig ration in H ep2-OCT 4cells were higher tha n the number of Hep2cells.Conclus ion iPS related gene tr ansfection of OCT4could make Hep2cells get stem cell proper ties,a ccelera te the gr owth of tumor cells and mig ration.
Key words :Induced plur ipotent stem cell;OCT4;Pr oliferation;M igration
2006～2007年,日本和美国的干细胞科学家初步实验发现,用反转录病毒把OCT 4、SO X2、NANOG 、LI N28、KLF 4、C-MYC 中若干基因的组合转染进离体培养的成年动物(包括人、小鼠)已分化体细胞,可以使之具有干细胞属性,称为诱导性多能干细胞(in-duced pluripotent stem cell,iPS)[1-3]
,确认了OCT4、S OX2、NANO G 在干细胞中扮演着几乎不可或缺的角色。O CT 4、S OX2、N a nog 过量表达于正常成体细胞起始于近年的研究,它们在肿瘤细胞系的人为过量表达
或抑制表达才刚刚引起人们的注意[4]
。本实验将O CT 4基因转染入人喉癌Hep2细胞中,观察其对细胞增殖、迁移潜能的影响以及细胞是否获得干细胞属性。1 材料与方法
1.1 主要材料和试剂 细胞总RNA 提取试剂Triz ol (美国Invitor gen 公司),反转录酶M-M LV(美国Pro-mega),DM EM 培养基(Hyclone 公司),DMEM 培养基
(美国Invitrogen 公司);一抗anti-SOX2、anti-OCT4、a n-ti-N anog(美国Abcam 公司);二抗donkey a nti-rabbit 、don-key a nti-m ouse(S ANTA CRUZ
公司);脂质体Lipofecta m ine TM
2000试剂(美国Invitrogen 公司)。
1.2 目的基因的克隆1.
2.1 人Hep2细胞的培养 人Hep2细胞株复苏后,加入含10%胎牛血清的DM EM 培养基,37℃、5%CO 2培养箱密闭培养,每2～3天传代1次,选择20代以内的生长状态良好的Hep2细胞进行转染。
1.2.2 细胞RNA 的提取及全长基因的扩增 Tr izol 试
剂提取细胞总RN A 。经紫外分光光度仪检测纯度,RNA A260/A280的比值在1.8～2.0间者应用反转录试剂盒按照操作说明进行总RN A 的反转录。基因序列通过GeneBank 获得,应用引物5设计全长扩增引物,OCT 4ATG sense:5′-ATGGCGG GACACCTG -GCTT-3′,O CT4TGA a ntisense:5′-TCAG TTTGAATG -CATGG GAG AGCC-3′,产物长度1083bp,电泳,切胶回收。
1.2.3 TA 克隆 将纯化得到的基因D NA 片段连接至pM D 18-T Vector(TaK aRa 公司)上,转化J M 109感受态细胞,37℃振荡培养60min 。摇菌,在LB 琼脂平板培养基上培养,挑选白色菌落,测序鉴定,并保存菌种。
1.2.4 过表达质粒载体的构建 以OCT 4基因的TA 克隆为P CR 模板,所用上游引物加B am HI 酶切位点,OC T4-1:5′-CCC GG ATC CAT GG CGG G ACACCT GG CT-3′,下游加N ot Ⅰ酶切位点,OC T4-2:5′-ATAAGAATG CG GC -CG CTCAGT TTGAATG CATGG G AG AG C-3′。扩增,全部
P CR产物于1.2%浓度的琼脂糖凝胶电泳,得产物1108bp,切胶纯化。
1.2.5 酶切及连接转化将纯化得到的OCT4基因的D NA片段及pcDNA3.1载体分别用Ba mHⅠ和N otⅠ双酶切并回收酶切产物。连接、放置过夜。转化感受态细胞。挑取克隆加入到加有1‰抗生素的培养基中,摇菌过夜。
1.2.6 质粒抽提及鉴定质粒抽提按照试剂盒操作说明进行,抽提获得的质粒进行酶切和测序鉴定。
1.2.7 稳定转染表达实验转染按照脂质体Lipo-fecta mine TM2000试剂盒操作说明进行。质粒转染后,用0.8mg/L G418完全培养基筛选,10d后大部分细胞死亡。将还存活的细胞转移至细胞瓶中用含0.8m g/L G418完全培养基培养,传代并冻存。从中取两瓶细胞(P5)抽提蛋白、RN A进行O CT4蛋白和核酸水平的检测。
1.2.8 过表达O CT4对Hep2细胞迁移的影响实验分三组:Hep2组、空载体组和pcD NA3.1-O CT4组,每组5个复孔。首先把Tr answ ell倒置,在Tra nsw ell 的PVPF膜(0.8μm)下的表面涂一层fibronectin (10μg/mL),37℃,2h,PBS清洗1遍后,放入预先每孔加有600μL的RPM I-1640培养基(含10%血清)的24孔板内后在Tra nsw ell的内室加入细胞(100μL,用含0.1%血清的培养基稀释细胞悬液至1×105个/mL),放入培养箱,24h后,取出Tr answ ell,用棉签擦去PVPF膜靠近内室一面的细胞,另一面的细胞用甲醛室温固定30m in,结晶紫染色20min,用PBS清洗3遍后在显微镜下观察细胞计数。
1.3 统计学方法采用SPS S13.0软件进行统计学处理,计量资料应用方差分析O ne-Wa y ANOVA,P< 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 质粒酶切鉴定质粒经酶切后,在目的位置分别有相应条带,表明载体中已包含目的片段(图1)。
图1 pcDNA3.1-OCT4质粒酶切鉴定电泳图2.2 基因转染结果显微镜下观测转染效率,从图2中可以看出,质粒转染效率较高。
图2 质粒转染效率观察图
2.3 RT-PCR法检测O CT4及内参GAPDH的表达
图3中的1、2、3、4分别代表pcDN A3.1-O CT4质粒转染组、空载体组、正常组、阴性对照。其中图3-A 是GAPDH基因检测结果,pcD NA3.1-OCT4质粒转染组、空载体组、正常组均正常表达G APDH,且表达量基本一致。图3-B是O CT4基因检测结果,只有pcDNA3.1-OCT4质粒转染组结果呈阳性,表明转染成功。
A.GAPDH基因检测结果
B.OCT4基因检测结果
图3 pcDNA3.1-OCT4质粒转染核酸检测结果
2.4 W estern检测OCT4蛋白水平图4中的1、2、3分别代表正常组、空载体组、pcD NA
3.1-O CT4质粒稳定转染组。OCT4蛋白只有在pcDN A3.1-OCT4质粒稳定转染组检测呈阳性。
1.正常组;
2.空载体组;
3.质粒转染组
图4 pcDNA3.1-OCT4质粒转染蛋白检测结果
2.5 MTT实验通过M TT方法,对Hep2正常组细胞和2种质粒(Hep2-pcDN A
3.1、Hep2-OCT4)稳定转染组细胞的活力的检测(表1),每组5个复孔。Hep2-OCT4质粒转染后的细胞与正常细胞组及空载体组比较差异有统计学意义(F=
4.798,P<0.05),
说明OCT4目的基因对细胞增殖活力有影响,即细胞的增殖活力增强。
表1 稳定转染M TT检测结果
吸光度值Hep2Hep2-pcDNA3.1Hep2-OCT4
10.4420.4560.466
20.4560.4720.473
30.4680.4650.498
40.4750.4580.475
50.4530.4460.483
均值0.45880.45940.477
2.6 O CT4基因转染对Hep2细胞迁移的影响通过对正常对照组、空载体对照组、稳定转染组细胞的迁移实验进行细胞计数,稳定转染组细胞迁移数176.36±4.61,明显多于正常对照组细胞数124.40±7.26和空载体对照组细胞数127.30±5.60,三组比较差异有统计学意义(F=121.205,P<0.01),说明PCDNA
3.1-OCT4质粒稳定转染后目的基因OCT4对细胞迁移活性有增强作用。
表2 OCT4基因转染前后Hep2细胞迁移数量的变化吸光度值Hep2Hep2-pcDNA3.1Hep2-OCT4 1132.90134.05183.60
2128.70132.70176.20
3126.72124.11177.00
4116.53123.44173.00
5117.15122.20171.80标准差7.26 5.6 4.61
2.7 细胞学观察pcD NA
3.1-O CT4质粒稳定转染,试验通过显微镜下拍照、观察,pcDNA3.1-OCT4质粒稳定转染的细胞生长较快,且生长比较聚集,呈梭型,细胞形态与正常组相比,未发生变化(图5)。
正常组pcDNA3.1-OCT4质粒转染组图5 pcDNA3.1-OCT4质粒稳定转染细胞观察图
3 讨论
干细胞是具有多向分化潜能的细胞,理论上能分化形成任何组织细胞类型,因此引起研究者们的极大关注。近年又建立起的肿瘤干细胞学说[5-7],认为肿瘤干细胞源于自发突变或诱发突变的干细胞,是恶性增殖的罪魁祸首。此理论与实际的符合性相当高:①肿瘤发生概率小,不是每个细胞都可能变为肿瘤细胞;符合体内干细胞数量少的特点。②肿瘤多发于细胞分裂能力大的组织器官(肺、胃、肝、骨髓等),少发于细胞分裂能力小的组织器官(心脏、肌肉、脑等)。③肿瘤(干细胞)和干细胞都具有几乎无限的分裂能力和寿命。④符合放化疗的治肿瘤原理———能杀灭分裂迅速的肿瘤细胞,处于休眠状态而存活的肿瘤干细胞在一定条件下会导致肿瘤复发,因此放化疗治标难治本。iPS相关基因OCT4, SO X2和NAN OG都表达于胚胎干细胞、原始生殖细胞及相应来源的未分化肿瘤,是干细胞研究领域较热门的几个基因。
在研究中发现喉癌Hep2细胞不表达OCT4、SOX2和NANOG基因。将OCT4目的片段构建到真核表达载体pcDNA3.1中,获得pcDNA3.1-OCT4载体,将这个载体稳定转染到Hep2细胞中,经过筛选,在细胞中检测到有OCT4的表达,且转染pcD-NA3.1-OCT4后的Hep2细胞生长速度明显快于对照组。细胞迁移速度也快于对照组。这说明OCT4基因具有相当高的胚胎干细胞特异性,能促进细胞的发生、发展。后期研究还采用OCT4-siRNA、SO X2-siRNA和N anog-siRNA分别干扰稳定转染pcDNA3.1-OCT4、pcDNA3.1-SO X2和pcDN A3.1-Na nog后的Hep2细胞,结果OCT4、SO X2和NANOG 的表达在核酸水平和蛋白水平上都明显减少。细胞增殖活力也受抑制,细胞迁移数低于未干扰组,再一次证明了OCT4、S OX2和Na nog基因在iPS中的重要性。
参考文献
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收稿日期:2011-10-27 修回日期:2012-02-28 编辑:伊姗
诱导性多功能干细胞 ——产生，发展，应用及展望 张博文，杨星九，李玖一，白末* 摘要：在胚胎干细胞研究因伦理道德和免疫排斥问题而受阻的时候，诱导性多功能干细胞(induced pluripotent stem cell，以下简称iPS细胞)的横空出世为干细胞研究指明了一条新的方向。近几年来iPS细胞研究取得了许多突破性的进展，其广泛的应用前景更向人们昭示着一个新的时代的到来。本文主要从iPS细胞的发展历程入手，综述了iPS细胞的理论及应用研究的关键进展，并对之后的研究进行了展望。 关键词：诱导性多功能干细胞，胚胎干细胞，病毒，癌变，细胞治疗 Abstract:When the embryonic stem cell research was blocked by ethical issues and immune rejection, induced pluripotent stem cell (hereinafter referred to as iPS cells), turned out for stem cell research indicated a new direction. iPS cells’ research in recent years has made many breakthroughs, prospects for its wide application to remind people of a new era. This article summarizes the theory and application of iPS cells, and the key to progress in the study, from the iPS cells to start the development process, and discussed the study in the future. Key words：induced pluripotent stem cell, embryonic stem cell, virus, Canceration, cell therapy IPS细胞是通过向体细胞中导入诱导基因，使体细胞重编程获得具有胚胎干细胞样特性的多能干细胞。iPS细胞的产生可谓干细胞领域的新里程碑。近几年，iPS细胞的研究突飞猛进，本文中结合最新的研究结果，综述了iPS细胞的产生背景、发展历程及其应用前景，并对今后iPS的研究发展进行了客观的展望。 1产生背景 干细胞(stem cells, SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。其中胚胎干细胞(Embrtibuc stem cell)更是具有全部的全能性，能够分化成人体内的所有细胞，具有非常广阔的应用前景。 早在上个世纪，人类就已经开始针对干细胞进行研究，试图通过各种不同的方法得到多能干细胞，其中突出的方法有胚胎干细胞（ES细胞）直接植入法；体细胞核转移 ----------------------------------------- *张博文，杨星九，李玖一：资料查阅与论文编写白末：资料查阅与论文整合
文献综述 诱导性多能干细胞的研究进展及其在再生医学上的应用 摘要：通过特定转录因子的过表达使体细胞重编程为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells， iPS 细胞），这一成果引起了整个生命科学领域的广泛关注. 由于 iPS 细胞不仅具有与人类胚胎干细胞（embryonic stem cell， ES 细胞）相似的基本特征，而且与 ES 细胞相比，不存在免疫排斥和伦理道德问题，因此，具有重要的临床应用潜能. 目前， iPS 细胞主要用于细胞分化和移植，并可提供体外的疾病模型，以便于研究疾病形成的机制、筛选新药以及开发新的治疗方法. 从 iPS 细胞的产生、诱导方法、生物学特征和在再生医学中的应用作以研究！ 关键词：诱导性多能干细胞；胚胎干细胞；重编程；再生医学 正文 1iPS 细胞的产生 主要经历了 3 个大的阶段. 1981 年，小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES 细胞）建系干细胞是近 30 年来生物学发展最快的领域（Evans 和 Kaufman），这些具有全能性的细胞在体外可以诱导分化为不同类型的细胞，为组织修复开辟了新途径. 尽管这些细胞来源于囊胚内细胞团，基本不存在去分化和重编程的问题，但自诞生之日起，就一直深受伦理道德和异体排斥等问题的困扰. 随着克隆羊“多利”的诞生，开创了体细胞在卵母细胞中去分化和重编程的先河. 2000 年，Munsie等从小鼠体细胞核移植囊胚中分离得到了小鼠 ES 细胞，从而拉开了治疗性克隆研究的序幕，使利用病人的健康体细胞对自身的病变组织进行修复成为了可能，尽管这一技术可以避免异体移植所造成的排斥反应，但仍然深陷伦理道德争论的漩涡之中.2006 年，Yamanaka 等将 4 个转录因子导入已分化的小鼠皮肤成纤维细胞，进而获得了类似于 ES 细胞的多能性干细胞，即“诱导性多能干细胞”（induced pluripotent stem cells，iPS 细胞）. 2007 年，Yu 等和 Takahashi 等又分别采用相同的基因改造的方法将人的体细胞逆转为类 ES 细胞，这些划时代的成果不仅解决了利用干细胞进行组织修复所面临的免疫排斥和伦理学问题，在利用病人正常细胞进行组织自我修复方面具有巨大的应用前景，而且是用来研究细胞去分化和基因组重编程的重要途径（不需要胚胎或卵母细胞）. 这个具有里程碑意义的发现揭开了再生医学领域的新篇章. 2iPS 细胞的诱导方法 迄今为止，短短几年的时间内 iPS 细胞的研究取得了突飞猛进的发展，仅诱导方式而言，从病毒方法如逆转录病毒、慢病毒和腺病毒，到非病毒的转座子载体和蛋白质均能介导外源转录因子诱导产生 iPS 细胞. 利用逆转录病毒和慢病毒载体诱导生成 iPS 细胞时，可能会引起外源基因整合到体细胞基因组，引起插入突变，如果将这些 iPS 细胞应用于临床治疗，会存在安全隐患. 因此，Aoi 等利用不与宿主细胞整合的腺病毒、质粒为表达载体瞬时转染靶细胞可以获得 iPS
《细胞增殖》第一课时教学设计和反思 汉口铁中栾奕 教材分析 本节是现行人教社高中《生物》(必修本)第一册第二章第二节内容，“细胞增殖”是讲述细胞的一种生命现象，只有了解了这一生命现象，我们才能让学生逐步认识生物体的生命现象，例如，生物体的生殖和发育，生物体具有的遗传和变异，所以本节是我们学习生物学知识、了解生物生命现象的细胞学基础。“细胞增殖”之所以作为本章乃至本册的难点，就是因为这一知识非常抽象化，没有具体的实物模型，又不是我们生活中所见，因此，在讲解知识的时候，我们直接示意这是本章中的难点，引起注意。 教学目标 知识目标：细胞增殖的方式和意义。（A：知道） 有丝分裂周期的概念。（B：识记） 有丝分裂过程各时期的特点。（C：理解） 能力目标：凭借有丝分裂过程图，图文结合，培养学生的识图能力，形象思维能力。 情感目标：细胞分裂——运动是物质的根本属性，建立生命活动的唯物主义观点。 重点和难点 “细胞增殖”一节主要向学生展示的是有丝分裂──生物体普遍存在的一种分裂方式，结合学生认知的规律性，基础知识的讲解要重难点突出，有渗透力和感染力，本节重点内容就是让学生理解真核细胞有丝分裂的细胞周期的概念和特点，以及真核细胞有丝分裂过程，由于细胞分裂这一现象的特殊性──整个过程是一动态变化，要让学生具体把握这个过程中细胞内部所发生的变化，特别是遗传物质的变化，从而让学生明确细胞的周期变化，这一内容是本节课教学的难点。 学法指导 指导学生在学习本节知识的时候，准确识别分裂图像，观察染色体DNA在细胞有丝分裂各时期变化规律，利用口诀巧记各时期变化特征，由这几个方面的归纳总结，培养学生养成一种由观察现象→解决问题→总结体会→知识提升的学习习惯，另外我们可以使学生在这种环境中发展他们的思维能力。 教具准备 植物细胞有丝分裂周期挂图；自制教具染色体的复制及螺旋过程。 教学过程设计
细胞凋亡和细胞增殖都是生命的基本现象，是维持体内细胞数量动态平衡的基本措施。在胚胎发育阶段通过细胞凋亡清除多余的和已完成使命的细胞，保证了胚胎的正常发育；在成年阶段通过细胞凋亡清除衰老和病变的细胞，保证了机体的健康。和细胞增殖一样细胞凋亡也是受基因调控的精确过程，在这一节我们就细胞凋亡的分子机理作简要的介绍。 细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase、一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。这些活化的可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。 一、凋亡相关的基因和蛋白 细胞凋亡的调控涉及许多基因，包括一些与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基因。其中研究较多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。 1．Caspase家族 Caspase属于半胱氨酸蛋白酶，相当于线虫中的ced-3，这些蛋白酶是引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。它们均有以下特点：①酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性；②总是在天冬氨酸之后切断底物，所以命名为caspase（cysteine aspartate-specific protease），方便起见本文称之为凋亡酶； ③都是由两大、两小亚基组成的异四聚体，大、小亚基由同一基因编码，前体被切割后产生两个活性亚基。 最早发现人类中与线虫ced-3同源的基因[1]是ICE，即：白介素-1 β转换酶（Interleukin-1 β-converting enzyme）基因，因该酶能将白介素前体切割为活性分子，故名。通过cDNA杂交和查找基因组数据库，在人类细胞中已发现11个ICE同源物[2]，分为2个亚族（subgroup）：ICE亚族和CED-3家族（图15-6），前者参与炎症反应，后者参与细胞凋亡，又分为两类：一类为执行者（executioner或effector），如caspase-3、6、7，
数、着床数与空白对照组比较差异均无显著性。胎鼠发育良好,内脏观察指标均未见异常。说明复方枸杞子口服液在本实验规定剂量下未引起母体毒性、胚胎及胎鼠毒性,无明显的致畸作用,为生育期妇女服用该药的安全性提供了实验依据。 实验结果显示,低剂量组胎鼠表现为体质量较重、身长较长(P<0.01);中剂量组表现为活胎率高(P<0.05),死胎率低(P<0.05);3个剂量组的胎鼠骨骼发育都较空白对照组好,尤其是高剂量组胎鼠骨骼发育完全,无胸骨异常胎鼠(P<0.05),也无肋骨异常胎鼠(P<0.01)。表明复方枸杞子口服液对胎鼠发育有一定保健作用,尤其对骨骼发育的影响较大,为今后复方枸杞子口服液的药效学研究奠定了基础。本实验不足之处在于由于胎鼠出生率低,实验结果有待于进一步的实验证实。 参考文献: [1]汪建龙.枸杞多糖药理作用的研究进展[J].时珍国医 国药,2005,16(10):1032-1033. [2]张庆.大枣多糖体外抗补体活性剂促进小鼠脾细胞的 增殖作用[J].中药药理与临床,1998,14(5):19-22. [3]保健食品检验与评价技术规范[S].国家食品药品监督 管理局,2003. [4]陈平雁.SPSS13.0统计学软件应用教程[M].北京:人 民卫生出版社,2005:255-269. 使用诱导性多能干细胞(i PS c ells)修复心脏 梅约临床和医疗中心(Mayo Clinic)研究人员进行的一项概念验证研究显示,诱导性多能干细胞(iPS cells)可用于心脏病治疗。诱导性多能干细胞是被重新编程从而进入一个类似胚胎干细胞状态的成年细胞。在该项研究中,研究人员对普通的成纤维细胞进行重新编程,有助于结痂的细胞(譬如那些因心脏病发作产生的细胞)转化为干细胞,修复因心肌梗死造成的心脏损伤。 该项研究结果于2009年7月20日提前发表于Circulation杂志在线版。 论文第一作者Ti mothy Nelson博士指出:“这项研究发掘了在心脏治疗中使用诱导性多能干细胞的真正潜力,使生物工程成纤维细胞获得修复和再生梗死心脏的能力。” 这是基于诱导性多能干细胞的技术首次用于心脏疗法。在此之前,诱导性多能干细胞仅用于帕金森氏症、镰状细胞性贫血和甲型血友病3种疾病模型,最终目标是使用诱导性多能干细胞修复损伤。在此过程中使用患者自身的细胞,避免了排斥反应的风险及抗排斥药物进行维持治疗的需要。该再生医学策略将有助于缓解受限于捐赠者短缺的器官移植需求。 论文通讯作者Andre Terzic博士指出:“这项诱导性多能干细胞创新性研究为转化应用奠定了基础。借助于核编程方面的进展,我们将能逆转成年细胞,在心血管再生医学中实现按需定制。” 该研究团队通过“干性相关”人类基因集(“stemness2related”human gene set)对成纤维细胞进行遗传重编程,使其反分化成诱导性多能干细胞,进而重新分化为新的心肌细胞。移植入受损的小鼠心脏后,诱导性多能干细胞在2周后实现嫁接,4周后明显有助于改善受损心脏结构和功能。相比之下,普通成纤维细胞则无此功效。 与非工程化成纤维细胞相比,诱导性多能干细胞能够恢复心脏病发作后缺失的心肌功能,阻止受损心脏功能损伤进程,并在心脏受损部位再生组织。 (C irculation,2009:published online before p rint,July20,2009) 883广东药学院学报 第25卷
关于诱导多功能干细胞的介绍和思考 ——2012年诺贝尔生理学或医学奖解读班级：生物技术基地姓名：林立梅学号：0131122635 【摘要】John B. Gurdon和Shinya Yamanaka获得2012年诺贝尔生理学或医学奖，他们的相继研究成果证明，成熟、分化的细胞可以被重新组装或诱导重新编程，变成未成熟的干细胞，能够发育成机体内所有种类的组织。 【关键字】重新编程干细胞诱导定向分化临床医学 【内容】 （一）两位科学家的实验概述 （1）约翰.格登：用“细胞核重编程”克隆出新动物 所谓“细胞核重编程”，就是将已经分化了的成年体细胞进行诱导，让其重新回到发育早期多能性干细胞状态，重新获得发育成各种类型细胞的能力。通俗一点讲，就是在细胞层面实现“返老还童”。 1962年，格登做了一个划时代的实验：他假设：这些细胞的基因组仍然包含着驱动它发育成机体所有不同类型的细胞所需的信息。并进行相关实验，将非洲爪蟾（Xenopus，一种蛙）卵细胞内不成熟的细胞核移除，然后把非洲爪蟾的成熟肠细胞的细胞核注入其中。在此过程中，他采用核标记技术（Elsdale et al，1960），将标记的供体细胞核移植到未标记的受体卵。在实验中，控制由囊胚或原肠胚（简称胚胎细胞核）穿插与转让肠细胞核。移植的胚胎中，所有那些超出了囊胚期的细胞中包含明显的被标记的核，可以证明它们来源于核移植而不是从卵核。核标记只出现在渡过了囊胚期胚胎中。整个实验的目的很简单，就是想看看这个卵子最终会变成什么。结果发现，一部分卵依然可以发育成蝌蚪；其中的一部分蝌蚪，可以继续发育成为爪蟾。 (2)山中伸弥：用基因技术制造出“诱导多能干细胞” 2006年Shinya Yamanaka教授从数据库中筛选出大约100个有可能在ES细胞中特别活跃的基因。再经过近4年的紧张工作，从这100个基因中筛选出24个活跃
《细胞的增殖》教材分析 1.教学重点 （1）细胞生长和增殖的周期性。 （2）真核细胞有丝分裂的过程。 2.教学难点 真核细胞有丝分裂过程中，各个时期染色体行为和数目的变化，以及DNA数量的变化。 首先让学生了解细胞增殖的必要性，再来学习细胞增殖的方式。多细胞生物体的生长，既靠细胞的生长，还要靠细胞的分裂。这是因为细胞不能无限长大。教科书让学生通过探究细胞表面积与体积之比，与物质运输效率之间的关系，探讨细胞不能无限长大的原因。实验操作过程比较简单，但是实验后的讨论题却有相当的思维力度，教师应给予足够重视。 既然细胞越小，细胞的物质运输的效率就越高，细胞体积不是越小越好吗？学了这部分内容，学生可能会产生这样的疑问。逆向思维将有助于对问题的理解。因而教科书在旁栏的“批判性思维”中把这个问题提了出来，以培养学生批判性思考的能力。由于这个问题有一定的思维难度，因此，教科书给了一些必要的提示，如有人估计完成细胞的各项功能至少需要100种酶，每个酶促反应需占有直径约50 nm的空间，每个核糖体直径为10～20 nm等。 真核细胞分裂的方式有3种：有丝分裂、无丝分裂和减数分裂。有丝分裂是真核生物进行细胞分裂的主要方式，本节重点介绍有丝分裂，简要介绍无丝分裂。减数分裂是一种特殊方式的有丝分裂，它与有性生殖细胞的形成有关。有关减数分裂的内容安排在《遗传与进化》的相关章节中让学生学习。 关于有丝分裂，与原来的高中教材相比，新教材对这一问题的叙述，基本没有什么变化。仍然是分为前期、中期、后期、末期四个时期叙述，突出这四个时期中染色体行为和数目的变化。首先以植物细胞为例详细地介绍这一过程，然后再采取对比的方法，列举动物细胞有丝分裂的过程与植物细胞的不同点。最后归纳有丝分裂的重要意义。在以前的教学中，教师往往把重点放在对有丝分裂过程的详细介绍上，要求学生理解并熟记有丝分裂过程中染色体行为和数目的变化，这固然很重要。但是为细胞分裂进行活跃的物质准备的分裂间期也应该引起学生重视，以便学生对细胞的生命周期形成完整的认识。“图6-1有丝分裂细胞周期”和“表6-1不同细胞的细胞周期持续时间”，提示学生注意分裂间期在细胞周期中所占时间的比例，反映出分裂间期在细胞周期中的重要性。 无丝分裂的过程比较简单，这种分裂方式也不是很常见，因而教科书只用一小段文字和一幅图做了简单介绍。关于无丝分裂的问题，长期以来就有不同的看法。有些人认为无丝分裂不是正常细胞的增殖方式，而是一种异常分裂现象；另一些人则主张无丝分裂是正常细胞的增殖方式之一，主要见于高度分化的细胞，如肝细胞、肾小管上皮细胞、肾上腺皮质细胞等。有关无丝分裂的不同观点，教师可根据教学情况的需要，适当补充介绍。 《观察根尖分生组织细胞的有丝分裂》是一个经典的高中生物学实验，从实验要求来说与以前变化不大。为了便于学生操作，增强操作步骤的目的性和条理性，教科书的实验指导在装片制作这一步，把装片制作的过程、方法、所需时间和操作的目的用列表的形式展示出来。本实验增加的一个内容，是让学生学习记录细胞周期不同时期的细胞数，通过统计每一时期的细胞数与计数细胞总数的比值，比较细胞周期不同时期的时间长短。这里运用了间接转换的方法。因为学生并没有真正记录下细胞周期不同时期的时间，而是根据得到的每一时期的细胞数与计数细胞总数的比值，来比较细胞周期不同时期的时间长短。这种思维上的转换有一定难度，是对学生想像力的一种挑战。
教案背景： 1，面向学生：高中 2，学科：生物 3，总课时：2 教学课题：细胞增殖 教材分析： “细胞增殖” 是《分子与细胞》这一模块第六章第1节的内容。是学生在学习了细胞生命系统的物质组成、结构之后，来认识细胞这个系统的产生、发展和消亡的过程。其中有丝分裂是教学的重点也是教学的难点,有丝分裂是学生以后学习减数分裂和遗传规律的基础，也是学习DNA复制及遗传信息传递的重要基础，甚至是生物班的学生学习选修模块的基础。 细胞分裂的三种方式中，有丝分裂是最主要、同时也是最重要的方式。多细胞生物的生长发育过程中，体细胞的增多就是通过有丝分裂实现的。无论是单细胞真核生物还是多细胞生物他们各种形式的无性生殖也是通过有丝分裂完成的。有丝分裂还是学习减数分裂的基础，而减数分裂知识又是学习遗传变异规律的基础。由此可见有丝分裂是非常重要的基础知识。因此在教学过程中一定要讲透，要让学生真正掌握有关知识。可以通过不同方式；从不同的角度进行分析，要充分调动学生参与整个学习过程。通过学习使学生了解到认识和分析一个生命现象可以有多种不同的方法——除了一般的文字描述外，还可以用图形描述特点；用图解和表格突出重点；用曲线描述量的变化规律和趋势；通过实验观察、验证生物学知识等……。使学生在掌握知识的同时了解一些常用的生命科学研究的基本方法。 教学方法： 本节课教学内容理论性强、抽象复杂，所以课前我指导学生做好预习，课堂上充分利用多媒体辅助教学，增强教学的直观性和形象性性通过上一节课的模拟探究使学生了解了细胞增殖的必要性，明白了生物体的生长还要靠细胞增殖增加细胞数量。 在讲有丝分裂各时期的主要特点时，我采用了FLASH动画逐步演示有丝分裂各时期，很好地让学生感受细胞分裂过程的动态性和连续性。黑板粘贴模型克服了多媒体手段转瞬即逝的弊端，较好地化难为易，化抽象为形象。 《细胞增殖》教学设计 教学目标： 知识目标： 1、了解真核细胞增殖的方式及意义。 2、理解细胞周期的概念。 3、准确描述细胞有丝分裂各阶段的重要特征。了解动、植物细胞有丝分裂过程的异同。 4、掌握有丝分裂的过程、特征和意义。尤其是DNA和染色体的规律性变化。
细胞凋亡及相关因素的研究进展 论文摘要：细胞凋亡(Apoptosis)是一种生理性死亡Physiogicalcell death，PCD)，是细胞对内外信息刺激的 应答反应，[1]它与细胞的生长、分化一样．属于最基本的 细胞学事件或过程．它决定着生物体的基本特征和转归．是胚胎发生和个体发育中清除细胞以维持细胞数目正常的调 节机制。 [2]当组织细胞发生异常调亡时，即可引起疾病的发生。一般来讲．凋亡过多会引起退行性变或早衰，调亡过少．易诱发肿瘤。[3] 因此，细胞凋亡近年来引起生命科学研究领域的广泛关注。本文仅就细胞调亡的概念及相关因素作一简要的概述。 【Summary】 Apoptosis is a kind of Physiogicalcell death and a reaction of cells to around informations stimulate .[1] It is same as cells’ growth and differentiation which belong to the basic cell subject’s incident or process.it decide living things’essential character- Istics ,and used to clear away cells to keep it rgular number’s regulation mechanism in the procees of embryo occur and individual growth.[2]there will couse ill- Ness when the organization cells come into being particularly apoptosis .Generally speaking ,more cell
人类诱导性多能干细胞（iPS细胞） 技术指导手册 目录： 1. 前言 (1) 2. 人类胚胎成纤维细胞培养 (2) 3. 重编程载体构建 (3) 4.病毒包装 (4) 5.人类iPS细胞的诱导 (6) 6. iPS细胞鉴定 (8) 6.1碱性磷酸酶活性检测 (8) 6.2干细胞表面marker的免疫染色检测 (9) 6.3干性因子的去甲基化程度分析 (10) 6.4干细胞内源基因的表达分析 (13) 6.5端粒酶活性检测 (14) 6.6核型检测 (15) 6.7拟胚体形成 (15) 6.8畸胎瘤形成实验 (15) 7．干细胞技术培训及服务一览表 (15) 8．附录 (16) 1. 前言 iPS细胞最初从成纤维细胞重编程而来，因为它们准备和操作相对简单。其他细胞类型，包括来自外胚层、中胚层和内胚层的细胞也可以用于产生iPS细胞（Eminili et al 2008）。2006年Y amanaka 和Takahashi利用逆转录病毒系统在成鼠的成纤维细胞导入四个转录因子（Oct3/4,Sox2,c-Myc, 和Klf4，Y amanaka 因子），将其重编程为iPS细胞，它具有跟小鼠ES十分相似的特性，尤其重要的是，iPS细胞也能产生后代。2007年，iPS技术在人类体细胞中得以应用，人类iPS 细胞的产生对退行性疾病的治疗产生巨大的影响（Takahashi et al ;Yu et al, 2007）。由于iPS细胞具有和ES类似的功能，却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多瓶颈，因此在医疗领域的应用前景非常广阔，成为干细胞研究的热点，《自然》和《科学》杂志分别将其评为2007年第一和第二大科学进展。随后，
项目名称：非整合人诱导性多能干细胞（iPS）及相 关技术用于β地中海贫血治疗的研究首席科学家：潘光锦中国科学院广州生物医药与健 康研究院 起止年限：2012.1至2016.8 依托部门：中国科学院
一、关键科学问题及研究内容 1、安全高效，具有临床实用性的非整合iPS新技术的优化及建立。 安全高效获得非病毒非整合iPSC的新技术 建立综合的诱导系统获得非病毒非整合的iPSC：利用mRNA及microRNA诱导体细胞获得iPSC，筛选能够加速iPSC重编程的小分子化合物及蛋白；筛选高效的iPSC诱导培养液。在此基础上，建立综合的诱导系统获得非病毒非整合的iPSC。 iPSC的鉴定：核型、基因表达、体外分化能力、体内多能性检测等多方面检测iPSC是否符合干细胞的标准；分子水平检测外源基因的插入；测序分析iPSC 的基因组稳定性。 建立非病毒非整合小鼠ESC样的人类iPSC（ESC-like-iPSC） 筛选能够稳定培养ESC-like-iPSC的培养环境：通过传统的病毒诱导获得小鼠ESC样的人类iPSC（ESC-like-iPSC）；筛选小分子化合物稳定培养 ESC-like-iPSC；筛选mRNA及microRNA支持ESC-like-iPSC的自我更新； 建立非病毒非整合ESC-like-iPSC：开发诱导获得ESC-like-iPSC的诱导系统；在全基因组表达、小RNA表达等方面比较两种不同的iPSC的差异。 2、利用体外受精胚胎建立多株正常人及地贫病人的ES细胞系。对比地贫iPS及ES，评价iPS多能性，安全性等应用指标。 建立非整合β地中海贫血病人iPS细胞库，约含各突变类型β地中海贫血iPS 细胞株50～100株。 优化和完善建立人胚胎干细胞的技术体系，并在此基础上建立地贫胚胎干细胞库。本研究拟对现有的胚胎干细胞培养技术进行改进：利用不同发育阶段的IVF
生物化学与生物 物理进展 PROGRESS IN BIOCHCMISTRY AND BIOPHYSICS 1999年 第1期 No.1 1999 TF-1细胞凋亡相关基因的研究 刘红涛 王玉刚 张颖妹 宋泉声 敬保迁 袁 勇 马大龙 摘要 利用近年来发展起来的代表差异分析（cDNA representational differences analysis, cDNA-RDA）技术研究了在人红白血病细胞株TF-1细胞撤除细胞因子后进入凋亡时诱导表达的基因.发现了6个新基因片段.其中有三个经与GenBank nr和dbEST查询均没有发现同源性，已经向GenBank进行登记，登记号分别为U83208，U83279， U83397.此外还发现一批已知基因的表达与凋亡相关，其中包括Hou和人硫氧还原蛋白等, 提示它们在凋亡中可能起作用.这项工作为进一步研究凋亡相关基因打下了良好基础.通过RDA的研究结果，有可能发现人白血病细胞凋亡的特异标记蛋白或发挥作用的重要蛋白，以期为白血病治疗提供理论基础. 关键词 TF-1细胞株，代表差异分析，凋亡 学科分类号 R392.1 Studies on the Apoptosis-Related Genes of TF-1 Cell Line by cDNA-RDA Technique. LIU Hong-Tao, WANG Yu-Gang, ZHANG Ying-Mei, SONG Quan-Sheng, JING Bao-Qian, YUAN Yong, MA Da-Long (Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing 100083, China). Abstract The genes effecting in the process of the apoptosis of TF-1 cell line when it is deprived of the cytokine in the culture medium were studied by RDA (representational difference analysis) method. The TF-1 cell depriving of cytokines for 8 hours was selected as the Tester and normal-cultured TF-1 cell as the Driver. Seven gene fragments were found uniquely expressed or highly expressed in the process of apoptosis of TF-1 cell line which include some known genes such as Hou and thioredoxin that formerly suggested to play a role in apoptosis.There are three fragments are complete novel after searching the nr and EST catalogues of GenBank and were banked into GenBank. The accession numbers for them are U83208, U83279, U83397 respectively. From the novel gene fragments, the complete cDNA sequence of them can be fished and the bioactivity and function of them in apoptosis of TF-1 cell and other hematological tumors can be further studied. On the other hand, the function of some known genes which were not suggested formerly in the course of apoptosis can be studied. Key words TF-1 cell line, representational difference analysis(RDA), apoptosis
文章编号（Article ID）：1009－2137（2014）04－0883－06·专论·诱导性多能干细胞技术的研究进展及其应用前景 吴翠玲，张玉明* 南方医科大学南方医院小儿科，广东广州510515 摘要在分化的体细胞中表达转录因子可以诱导体细胞重编程，获得诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）。这些细胞具有不断的自我更新能力和多向分化潜能，这些细胞重编程领域的突破性研究进展，为细胞重编程机制、人类疾病发病机制的研究及发展新的治疗方法提供了一种强有力的工具。iPS细胞技术是当前干细胞研究领域的热点之一，近年来取得了迅猛的发展。最初，研究者利用逆转录病毒作为载体将4种转录因子导入小鼠成纤维细胞诱导其重编程。近年来，iPS细胞的诱导方法不断改进，包括使用不整合入宿主细胞基因组的病毒载体、非病毒载体或者用基因敲除的方法切除导入的外源基因，从而产生了更为安全的iPS细胞系，许多小分子化合物也被证实能显著提高重编程效率。iPS细胞在再生医学、疾病模型的建立及药物筛选等领域正逐渐显现出它巨大的应用价值。本文回顾过去几年iPS细胞技术的研究进展，包括诱导方法的改进、iPS细胞诱导效率的提高和安全性的提高，并探讨iPS细胞的临床应用前景及当前研究存在的问题。 关键词干细胞；诱导性多能干细胞；体细胞重编程；临床应用 中图分类号Ｒ329．28文献标识码A doi：10．7534/j．issn．1009-2137．2014．04．001 Progress and Potential Applications of Induced Pluripotent Stem Cell Technology———Editorial WU Cui-Ling，ZHANG Yu-Ming* Department of Pediatrics，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou510515，Guangdong Province，China *Corresponding Author：ZHANG Yu-Ming，Associate Professor，Tutor of Master Postgraduate．E-mail：yumingzhang1966@hotmail．com Abstract Differentiated somatic cells can be reprogrammed to a pluripotent state through ectopic expression of specific transcription factors．These reprogrammed cells，which were designated as induced pluripotent stem（iPS）cells，are detected to exhibit unlimited self-renewal capacity and pluripotency．This breakthrough in stem cell research provides a powerful and novel tool for the studies on pathogenesis of diseases，reprogramming mechanism and development of new therapies．For this reason，the iPSC technology has currently become one of the hot topics in stem cells research．Ｒecently，major progress in this field has been achieved：initially，researchers succeeded in inducing the reprogramming of mouse fibroblasts by retroviral transduction of four specific transcription factors；in succession，the accelerated development of iPSC technology by employing non-integrating viral vectors，non-viral vectors or removing the introduced foreign genes via gene knock-out has ensured the yields of much safer iPSC；meanwhile，some researches discoversed the proofs that a number of micromolecular compounds were potent in accelerating the cellular reprogramming．For a prospect，iPSC are highly promising for regenerative medicine，disease modeling and drug screening．In this review，the recent progress in the generation of iPSC，prospects of their possible clinical applications and problems in the iPSC research are summarized and discussed． Key words stem cell；induced pluripotent stem cell；reprogramming；clinical application J Exp Hematol2014；（4）：883－888 2006年，日本京都大学的山中伸弥研究小组［1］报道了关于诱导性多能干细胞的研究成果，引起了极大反响并迅速成为干细胞领域的研究热点。该研究小组从24个候选基因中筛选出4个与细胞多能性密切相关的转录因子，利用逆转录病毒载体将这4个转录因子（Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc，以下简称OSKM）导入小鼠成纤维细胞内，使其重编程得到一种多潜能干细胞。这种细胞在形态学、生长特性、基因表达、畸胎瘤形成及嵌合体形成等方面都与胚胎干细胞非常相似，研究人员把这些细胞命名为诱导性多能干细胞。在iPS技术出现之前，实验研究的干细胞来源主要是从胚胎内细胞团直接分离得到 基金项目：广东省自然科学基金（S2011010003914）；国家自然科学基金（81270632）；广州市科技计划项目（2013j4100108） *通讯作者：张玉明，副教授，副主任医师，硕士研究生导师．E-mail：yumingzhang1966@hotmail．com 2014－02－08收稿；2014－04－23接受 · 388 · 中国实验血液学杂志Journal of Experimental Hematology2014；22（4）：883－888
诱导多能干细胞：过去，现在和未来 介绍 在2006年，我们发现，干细胞与胚胎干细胞相似的属性，可以同时引入四种基因（高桥和Yamanaka，2006年）从小鼠成纤维细胞产生。我们指定了这些细胞的iPS细胞。在2007年，我们报道了类似的方法适用于人类成纤维细胞，并通过因素引入了一把，人类iPS细胞可以生成（Takahashi等，2007）。就在同一天，詹姆斯·汤姆森的研究小组还报告了人类iPS细胞的生成，使用不同组合的因素（Yu等人，2007）。 合并三个科学流LED iPSCs的生产 像任何其他科学的进步，过去和现在的科学家在相关领域众多研究结果的基础上，建立了IPSC的技术。有三个主要的数据流的研究导致我们生产的iPS细胞（图1）。第一个数据流进行重新编程核移植。1962年，约翰·格登报道，他的实验室已经收到了成年青蛙肠细胞的细胞核（格登，1962）的未受精的卵子产生的蝌蚪。超过三十年后，伊恩·威尔莫特及其同事报道多莉诞生的第一只哺乳动物体细胞克隆产生的乳腺上皮细胞（威尔莫特等人，1997）。在这些成功的体细胞克隆显示出，即使是分化的细胞中含有的所有的发展所需要的整个生物体的遗传信息，而卵母细胞包含体细胞核重新编程的因素，可以。2001年，田田隆的研究小组发现，胚胎干细胞也含有因素，可以重编程体细胞（田田等人，2001）。第二个流是“大师”的转录因子的发现。在1987年，果蝇的转录因子，触角，异位表达时（Schneuwly等人，1987）表明，诱导形成的腿代替触角。在同一年，哺乳动物转录因子，调节因子MyoD ，显示转换成纤维细胞，成肌细胞（Davis等人，1987）。这些结果导致“主调节器，”一个给定的血统的命运决定和诱导的转录因子的概念。许多研究人员开始寻找各种谱系单主监管。尝试失败，也有少数例外（Yamanaka和布劳，2010）。 第三，同样重要的是，流是涉及胚胎干细胞的研究。自第一代在1981年小鼠胚胎干细胞（埃文斯和考夫曼，1981年，1981年，马丁），奥斯汀·史密斯和其他人已经建立了培养条件，使长期维持多能性（史密斯等人，1988）。维持小鼠胚胎干细胞的一个关键因素是白血病抑制因子（LIF ）。同样地，由于第一代的人胚胎干细胞（Thomson等人，1998年），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF ）的最佳培养条件已经成立。 组合第一两个流的研究使我们假设，这是在卵母细胞或胚胎干细胞，体细胞重新编程到胚胎状态，设计实验，以确定该组合的多个因素的组合。使用信息所需要的文化多能干细胞的培养条件，我们就能够识别四个因素可以产生iPS细胞。 IPSC的技术成熟和理解 后不久，其他各组小鼠iPSCs的初次报告，概括了基于因子重编程的小鼠（Maherali等，2007年，Wernig等人，2007）和人类（Lowry等，2008年，公园等。2008B ）。iPS细胞技术的优点之一是它的简单性和重现性。许多实验室开始探索相关机制和修改程序。 尽管iPSCs的重复性，可以生成过程中的效率仍然很低，通常小于1 ％转成纤维细胞成为iPS细胞。最初这种低效率的提高iPS细胞的可能性，来自罕见的干或者未分化的细胞，成纤维细胞培养共存（山，2009A ）。然而，随后的研究表明，iPS细胞可以是来自于终末分化的淋巴细胞（罗等人，2009）和有丝分裂后的神经元（Kim等人，2011a的）。因此，大部分的，如果不是全部，体细胞有可能成为iPS细胞，尽管有不同的效率。 怎能只是一小部分因素诱导体细胞重编程？这是超出了本文的范围，提供一个概述的许多研究已经解决了这个重要的问题。从我的角度来看，许多科学家的共识似乎是重编程因子的启动重编程过程中有更多的不到1％的转染细胞，但该过程没有完成在大多数细胞中。知之甚少的随机事件似乎需要完全重新编程的地方（Hanna等人，2009年，山中伸弥，2009年a）。正如我在下面的讨论，培养条件似乎为动力，可以帮助促进全重编程功能。 最初的iPSCs可以使用逆转录病毒或慢病毒，这可能会造成插入突变，从而会带来风险转化
教学准备 1. 教学目标 1.简述细胞的生长和增殖的周期性。 2.描述细胞的无丝分裂。 3.概述细胞的有丝分裂过程。 2. 教学重点/难点 教学重点： 真核细胞有丝分裂的细胞周期和有丝分裂的过程。 教学难点： 真核细胞有丝分裂的细胞的染色体形态、数目、位置和运动的变化是一个动态而又微观的过程。 3. 教学用具 教学课件 4. 标签 教学过程 教学过程设计 （一）、导入新课 [师]从细胞水平来看，一个蛙的受精卵需要怎样的途径才能成为一只成蛙呢？ 学生小组讨论、代表回答：需要不断进行细胞体积的扩大与细胞分裂，还要细胞的分化等。 [师]细胞生物学的研究也证明了以上观点，生物体的体积增大，即生物体的生长，既靠细胞生长增大细胞的体积，还要靠细胞分裂增加细胞的数量。事实上，不同生物同类器官或组织的细胞大小一般无明显差异，器官大小主要决定于细胞数量的多少。 （二）、细胞不能无限长大 [师]细胞为什么不能无限长大？什么因素限制了细胞的长大？
[生]细胞体积越大，需要的营养物质越多，需要排出的代谢废物也越多，物质的输入和输出也会遇到困难。 [师]随着细胞的长大，细胞膜的面积不是也在扩大吗？下面通过模拟实验来探讨这个问题。 学生分组实验：①将实验桌上准备好的琼脂块（内含酚酞）切成边长分别为25px、2 cm、3 cm的立方体；②将以上三种琼脂块样品，同时置于盛有适量0.1%的NaOH溶液的烧杯中，处理10 min；③取出琼脂块样品，吸干浮液后，分别将每一样品切成两半，观察切面，测量每一切面上NaOH扩散的深度并记录数据。 学生活动：各小组对实验采集的数据进行讨论分析，小组代表陈述观点。 分析： （1）琼脂块的边长越长，NaOH在琼脂块中的扩散效率越差。 （2）边长为3 cm、2 cm、1 cm的琼脂块分别看作三个植物细胞的话，那么细胞表面积与体积的比值是依次增大的。 （3）因而，我们有理由相信，生物的异常旺盛的代谢与其细胞的S/V相对直接有关。细胞体积越大，其相对表面积越小，细胞的物质运输的效率就越低。 [师]细胞表面积与体积的关系限制了细胞的长大。可见，生物体的长大主要靠细胞的数量增多，即细胞的增殖来实现。 （三）、细胞周期 [师]细胞以分裂的方式进行增殖。 [师]像草履虫、变形虫这些单细胞生物，细胞分裂有什么作用呢？ [生]通过细胞分裂可以产生后代，起到生殖和繁衍种族的作用。 [师]对多细胞生物来讲，细胞分裂又有什么作用呢？ [生]细胞分裂可以增加体细胞的数目，是细胞分化、组织与器官形成的基础。 [师]细胞的增殖是生物体生长、发育、生殖和遗传的基础。 [师]下面我们就来探讨细胞增殖的问题。我们先以动物细胞为例，看看细胞是如何增殖的。 呈示多媒体信息：播放一段草履虫有丝分裂的视频。 [师]大家看到了一个动物细胞经过一系列复杂的变化，最后形成两个完全一样的子细胞，也就是说它完成了一次细胞增殖。并且这样的增殖具有周期性。科学家采用放射性同位素标记法，用32P标记蚕豆根尖细胞并观察它的有丝分裂过程，揭示了细胞周期的基本规律。