龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/766179385.html, USP13抑制溶瘤病毒诱导的肝癌细胞凋亡机制
作者：朱海珍黄湘王静静许艳陈瑾文王鑫涛
来源：《湖南大学学报·自然科学版》2019年第12期
实验七、Hela细胞凋亡诱导及检测 一、实验目的 学习细胞凋亡诱导及检测。 二、实验原理 1.细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细 胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，是一种自然的生理学 过程。与细胞坏死不同，不会引起炎症反应，不释放细胞内容物。 2.DAPI是一种荧光染料，它可以与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与 DNA紧密结合，可在紫外下激发蓝光。 三、实验材料 8.8mol/L的H2O2溶液，甲醇，PBS溶液，10μg/mL的DAPI染液 四、实验步骤 1.细胞传代（上一次实验完成） 2.凋亡诱导 1)取做H.E染色的小皿，加H2O2溶液150μL使终浓度为0.8mol/L 2)24小时后收集细胞进行染色和形态学观察。 3. 染色 1）收集细胞，观察，贴壁细胞较多，直接用PBS溶液洗 2）吸出洗液，加入500μL甲醇，室温固定10min 3）倒掉甲醇，PBS洗净，加500μLPBS溶液和50μLDAPI母液，于37℃染色10min 4）倒掉染液，用PBS洗净（注意避光），加入500μLPBS溶液，倒置荧光显微镜 下观察并拍照。 五、实验结果与分析 1.观察： 实验开始前镜检： 细胞贴壁较多，细胞有的仍呈不规则状，有的细胞已皱缩，还有一些细胞呈圆形浮在培养基中，核质分界不明显。可以看到有的细胞处于裂解状态。 染色后： 由于DAPI染料只对核进行染色，所以在紫外下只可见核的结构。 视野里最多的是正常细胞，其特点是染色质均一且核表面光滑，说明凋亡是不同步的。 凋亡各时期的细胞也都可见，其主要特点是染色不均一。凋亡前期和中期的细胞较多。很少看到凋亡末期的细胞，除了这个时期细胞较少外，还可能因 为在前期操作中很多凋亡小体被洗掉了。而且有的细胞在正常光下观察是明显 的裂解状态，但是到紫外光路下就变得很不明显了。 另外，可以看到很多分裂期的细胞，其特点为染色深，细胞核染色质浓缩，但是看起来较均一，往往有对称性，特别是分裂末期的细胞两个子细胞会靠在 一起。 2.照片及分析：
病毒感染与靶细胞凋亡 【摘要】病毒感染与靶细胞凋亡之间存在着密切的关系,细胞凋亡在维护机体正常功能中发挥着重要作用,宿主细胞的凋亡,导致被感染细胞的死亡和病毒的清除;病毒为了生存与扩散而抑制凋亡。在病毒感染引起细胞凋亡的过程中有许多基因和蛋白得到表达,并参与作用。另外，细胞因子和免疫细胞也直接或间接地参与了该过程。对细胞凋亡与病毒感染关系的进一步研究,为病毒感染性疾病的预防和诊治提供新的思路和手段。 【关键词】细胞凋亡病毒感染 细胞凋亡（apoptosis）又称程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）,是多细胞有机体为调控机体发育,维护内环境稳定,由基因控制的细胞主动死亡过程,是一种生理性细胞死亡。细胞凋亡既可自发产生,也可由特殊介导物在一定条件下诱导产生。 病毒（virus）是一种非细胞型的微生物,个体微小,结构简单,由蛋白质与核酸组成,缺乏产生能量的酶系统,只能在敏感的活细胞内以复制的方式进行增殖,为 严格细胞内寄生。病毒侵入机体并在易感细胞内复制增殖,与机体发生相互作用的过程称为病毒感染。病毒感染细胞后,宿主细胞对病毒感染表现出不同的反应:（1）细胞无明显变化；（2）因病毒的致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE ）,引起细胞损伤、死亡；（3）引起细胞增生,继而使细胞死亡或使细胞继续生长失去生长控制,转化为癌细胞。
越来越多的资料表明,病毒感染与细胞凋亡有着密切的联系。一方面,病毒感染诱导细胞凋亡。另一方面,病毒感染抑制细胞凋亡。本文就近年来有关病毒感染诱导和抑制细胞凋亡的研究进展做一简述。 1 病毒感染诱导细胞凋亡 病毒感染细胞的凋亡,大多数由病毒编码的蛋白产物直接诱导,其次是病毒感染机体后,刺激机体细胞产生细胞免疫反应间接诱导。其机制是病毒感染细胞后通过关闭或干扰宿主细胞正常合成代谢诱发细胞凋亡,或由病毒编码的蛋白因子直接作用于细胞与凋亡有关的因子及蛋白水解酶而诱发细胞凋亡，主要有以下几种方式。 1.1 病毒蛋白直接诱导病毒进入机体细胞后,表达一些蛋白将会引起细胞凋亡过程。如人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）是获得性免疫缺陷综合征（acquire immune deficiency syndrome,AIDS）病因。当HIV侵入人体后,能选择性地侵犯CD4分子的细胞,CD4分子是HIV包膜蛋白gp120的受体,结合后可激活钙通道,使CD4+细胞胞内Ca2+浓度增高,导致CD4+细胞凋亡。最终引起以CD4分子细胞缺损和功能障碍为中心的严重免疫缺陷,从而导致机会性感染和肿瘤。再如VBV的HBx蛋白、EB病病毒的gp350、HPV病毒的E2和E7蛋白［1，2］。 1.2 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）间接诱导病毒感染机体后,刺激免疫系统,
实验14 细胞凋亡的诱导和检测 20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。 细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。 1．细胞凋亡的检测方法 凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。
形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征： （1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。 （2）Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。 （3）吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （4）吖啶橙(A())／溴化乙啶(EB)复染可以更可靠地确定凋亡细胞的变化，AO只进入活细胞，正常细胞及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；EB只进入死细胞，将死细胞及凋亡晚期的细胞的核染成橙红色。 （5）台盼蓝染色对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助，如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。使用透射电镜观察，可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 （6）木精-伊红（HE）染色是经典的显示细胞核、细胞质的染色方法，染色结果清晰。发生凋亡的细胞经HE染色后，其细胞大小的变化及特征性细胞核的变化：染色质凝集、呈新月形或块状靠近核膜边缘，晚期核裂解、细胞膜包裹着核碎片“出芽”凸出于细胞表面形成凋亡小体等均可明显显示出来。 DNA凝胶电泳：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞小分子 质量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180～200 bp DNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
1、细胞氧化 细胞生命活动过程中所需的能量约有95%是来自于线粒体，其来源是将细胞内的供能物质氧化、分解、释放能量，并排出CO2和H2O，这一过程称之为细胞氧化（cellular oxidation)，又称细胞呼吸（cellular respiration)。其基本步骤有：糖酵乙酰辅酶A（CoA)的形成、进行三羧酸循环及电子传递和化学渗透偶联磷酸化作用。酶能使细胞的氧化过程在此比较低的温度下进行，并释放出仅仅使细胞能够扑获和储存的能量。这个受生物学控制的氧化结果起初就和简单的燃烧现象一样：复杂的分子被降解为水，二氧化碳，并释放能量。这个过程中一些经过交换的电子永久地逃离细胞的呼吸或从呼吸中心遗漏掉并同周围的氧分子相互作用，产生有毒性氧分子—自由基。在细胞呼吸的过程中，估计有2-5%的电子转化为过氧化物分子和其他类型的氧化自由基，自由基的持续增加就对机体组织造成大量的氧化压力。自由基被认为与大约60种(而且至少是60种)疾病的发生有关，科学有证据证实，抗氧化剂能停止甚至逆转(在某些疾病中)由于自由基所导致的损伤。自由基与机体细胞发生作用后，给机体留下了毁灭性的灾难。在细胞膜上留下了许多微笑的孔洞，使细胞的分子结构发生改变，破坏了细胞的蛋白和脂类分子。一旦我们机体细胞内有足够的抗氧化剂储备，我们就能将自由基对机体的损伤程度降到最低。 2、OS 氧化应激（Oxidative Stress，OS）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。指机体在内外环境有害刺激的条件下，体内产生活性氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）和活性氮自由基（Reactive Ntrogen Species，RNS）所引起的细胞和组织的生理和病理反应。ROS有超氧阴离子（.O2-）、羟自由基（.OH-）和过氧化氢（H2O2）等等；RNS有一氧化氮（NO）、二氧化碳（CO2）和过氧亚硝酸盐（.ONOO-）等等。由于它们可以直接或间接氧化或损伤DNA、蛋白质和脂质，可诱发基因的突变、蛋白质变性和脂质过氧化，被认为是人体衰老和各种重要疾病如肿瘤、心脑血管疾病、神经退行性疾病（老年痴呆）、糖尿病-最重要的危氧化应激和抗氧化不单纯是一种生化反应，它更有着极其复杂的细胞和分子机制，包括膜氧化、线粒体代谢、内质网应激、核的重构、DNA损伤修复、基因转录表达、泛素和泛素化、自吞和溶酶体、细胞外基质、信号传递、蛋白折叠等多重的细胞和分子改变。 3、ROS 需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇( reactive oxygen species, ROS)，包括：O2 -·、H2O2 及HO2·、·OH 等。 4、细胞凋亡 细胞凋亡（apoptosis ）是维持正常组织形态和一定功能的主动自杀过程，是在基因控制下按照一定程序进行的细胞死亡，故又称为程序性细胞死亡（ PCD ） 5、SOD 超氧化物歧化酶Orgotein (Superoxide Dismutase, SOD)，别名肝蛋白、奥谷蛋白，简称：SOD。SOD 是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD 具有抗衰老的特殊效果。是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。
溶瘤病毒载体制备及纯化策略 基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。也包括转基因等方面的技术应用。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。2017年10月19日，美国政府批准第二种基于改造患者自身免疫细胞的疗法（yescarta基因疗法）治疗特定淋巴癌患者。（选自搜狗百科） 近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。
1. 逆转录病毒(retrovirus vectors，RVJ载体 逆转录病毒载体基因转移系统包括两部分：一部分是用外源基因替换病毒结构基因的 逆转录病毒载体；另一部分是包装细胞的基因组DNA中整合了逆转录病毒结构基因。到目前为止，RV载体是基因治疗临床试验使用最多的载体，较常用的是基于moloney 鼠白血病病毒(MMLV)改造而来的各种Rv载体。RV载体具有基因表达持久而稳定、转染效率较高等优点，但只能感染分裂期细胞，载体容量<8kb，与宿主细胞基因组的随机整合可引起基因突变及产生可复制的野生型病毒等危险故需要进一步的改造完善。 2. 腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒载体自1993年首次被应用于临床试验以来，迄今为止大约有40％基因治疗临 床试验方案采用腺病毒为载体，仅次于RV载体_3 J。至今AV载体已经发展了4代，第2、3代腺病毒去除EI、E2和E4编码序列，与第一代相比，有更低的免疫原性和更大的载体容量。第四代腺病毒仅含有反向末端重复序列(1TRs)和包装信号，载体容量 达37kb，进一步降低了免疫原性，被称为“高容量”载体。AV载体具有宿主范围广、基因转移效率高、对非分裂细胞也有感染性、比较容易制备和操作、理化性质稳定、遗 传毒性较低及比较安全等优点。 3. 腺相关病毒(adeno-associated virus，AVV)载体 腺病毒相关病毒(AAv)是一种缺陷型的单链DNA病毒，只有在辅助病毒如腺病毒、单 纯疱疹病毒、痘苗病毒等存在的情况下，才能进行最佳复制，产生新的病毒颗粒，否 则只能进行潜伏感染。从v载体既可以转染分裂细胞又可以转染非分裂细胞，在宿主 体内以定向整合的方式存在，70％以上的整合位点位于第19号染色体q13．3-qter 区，且对人体无致病性，故AAv重组体在细胞内能长期稳定地表达，还可避免随机整 合可能引起的抑癌基因失活和原癌基因激活的危险，且在体内不引起明显的病理变化，表明AAV是一种很有前途的基因治疗载体_9j。AAv载体在多种组织已进行了成功的转染，如肝、脑、心肌、骨骼肌、视网膜和呼吸道上皮等组织，未发现对机体有致病性。 4. 慢病毒(1eraivlrus)载体 慢病毒属逆转录病毒科，为二倍体RNA病毒，分为灵长类病毒如人类免疫缺陷病毒一 1(HIV-1)、猴免疫缺陷病毒(SIV)和非灵长类病毒如马传染性贫血病毒(EIAV)，但它与 逆转录病毒不同，能感染非分裂细胞。 5. 单纯疱疹病毒(herpes si卫叩Iex virus，I-ISV)载体 单纯疱疹病毒是一种双链DNA病毒，作为基因治疗载体具有以下优点：①容纳外源基因的长度达4o～50I，是目前容量最大的病毒载体。②具嗜神经性，可在神经元中建
第五章病毒与宿主细胞的相互作用 第一节病毒与宿主细胞的相互作用 1.1病毒感染及病毒性疾病 １.病毒感染(viral infection)：病毒侵入体内并在靶器官细胞中增殖，与机体发生相互作用的过程为病毒感染，有时虽发生病毒感染，但并不形成损伤或疾病。 ２病毒性疾病(viral disease)：感染后常因病毒种类、宿主状态不同而发生轻重不一的具有临床表现的疾病，称为病毒性疾病 ３病毒的感染性：病毒能够进入敏感细胞内，并能在其中生存的一种特性。取决于病毒的致病性、毒力及病毒的量。（具有种的特异性）。 ４显性病毒感染：有的病毒如天花病毒、麻疹病毒等进入机体，到达靶细胞后大量增殖，使细胞和组织损伤，机体出现明显的临床症状，这样的感染称为显性病毒感染或临床感染；按症状出现早晚、持续时间的长短以及病毒在体内持续存在状态等显性感染又分为急性病毒感染和持续性病毒感染两种。 ５病毒在宿主易感细胞内增殖造成细胞破坏与死亡，这种感染称杀细胞性感染。 ６病毒在细胞内增殖引起细胞变性、死亡裂解的作用称病毒的细胞病变效应（CPE）。 ７细胞凋亡：多细胞生物的一种生理性细胞死亡的过程，是形态上术语。细胞程序性死亡：细胞内特定基因的程序性表达介导的死亡，是功能性术语。 1.2病毒在机体内的散播 局部散播:病毒只在入侵部位感染细胞局部散播。 血行散播：病毒可在入侵局部增殖进入血液经血流或神经系统向全身或远离入侵部位的器官散播。 神经散播：HSV单纯疱疹病毒（herpes simplex virus）、VZV水痘-带状疱疹病毒、狂犬病病毒。 1.3病毒感染的条件 ａ．病毒的感染性：病毒能够进入敏感细胞内，并能在其中生存的一种特性。取决于病毒的致病性、毒力及病毒的量。（具有种的特异性）。 ｂ．合适的感染途径。 c．宿主的易感染性细胞：跟细胞表面的病毒受体、宿主机体的免疫状态、其他物理分子（如体温、营养及年龄、病毒的致病机制）有关。 1.4病毒的致病机理 病毒对细胞的致病作用包括来自病毒的直接损伤和机体免疫病理应答两个方面。敏感的宿主细胞被病毒感染后，两者相互作用下可表现为：杀细胞性感染；稳定状态感染；细胞凋亡；包涵体的形成；细胞增殖和转化；病毒基因的整合。 1.病毒对细胞的直接致病作用 由于病毒在细胞内增殖，干扰和破坏了宿主细胞的正常代谢，造成细胞死亡即所谓杀细胞效应(cytocidal effect)。 2.机体的免疫应答引起的免疫病理作用 病毒感染细胞后，细胞表面可产生新的病毒抗原，可诱发宿主产生免疫应答，也能造成
细胞凋亡与疾病 一、基本要求 （一）掌握细胞凋亡的概念、生物学意义 （二）掌握细胞凋亡的发生机制 （三）熟悉细胞凋亡的过程及细胞凋亡与坏死的差别 （四）熟悉细胞凋亡的主要变化 （五）熟悉细胞凋亡的调控 （六）了解细胞凋亡与常见疾病或病理过程的关系 （七）了解细胞凋亡在疾病防治中的意义 二、知识点纲要 一、基本概念 （一）细胞凋亡的定义：由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞自杀过程称为细胞凋亡(apoptosis)，也称为程序性细胞死亡(programmed cell death， PCD)。 （二）细胞凋亡的基本过程 1．凋亡信号转导 2．凋亡基因激活 3．细胞凋亡的执行 4．凋亡细胞的清除 （三）凋亡时细胞的主要变化 1．细胞凋亡的形态学改变：胞膜空泡化，细胞固缩，染色质边集，凋亡小体。 2．细胞凋亡的生化改变：DNA“梯”状条带，内源性核酸内切酶激活，caspases（凋亡蛋白酶）激活。 （四）细胞凋亡的调控 1．细胞凋亡相关因素 细胞凋亡相关因素分诱导性因素和抑制性因素两大类 (1) 诱导性因素:激素和生长因子失衡,理化因素,免疫性因素,微生物等 (2) 抑制性因素: 某些激素（ACTH、睾丸酮）或细胞因子(IL-2，神经生长因子等) 的去除,某些二价金属阳离子如:Zn2+，药物如: 苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂，病毒如：EB病毒，牛痘病毒CrmA等及中性氨基酸具有抑制细胞凋亡的作用。 2. 细胞凋亡信号的转导 (1)特点:凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DNA片段化断裂及细胞结构蛋白降解的中间环节。这个系统的特点是:①多样性;②偶联性;③同一性;④)多途性。 （2）研究较多的信号转导系统有：①胞内Ca2+信号系统；②cAMP/ PKA信号系统；③) Fas蛋白/Fas配体信号系统；④神经酰胺信号系统；⑤二酰甘油/蛋白激酶C信号系统；⑥酪氨酸蛋白激酶信号系统。 （五）凋亡相关基因 细胞凋亡相关基因多达数十种，根据功能的不同可将其分为三类:抑制凋亡基因（EIB、I AP、Bcl-2），促进凋亡基因（Fas、Bax、ICE、P53），双向调控基因（c-myc、Bcl-x）。 1． Bcl-2 是抑制凋亡的基因。 2.Fas Fas基因的表达可促进细胞凋亡。 3．p53 野生型P53基因具有诱导细胞凋亡的功能，当该基因发生突变后反而可抑制细胞凋亡。 4. c-myc，Bcl-x c-myc是一种癌基因，它能诱导细胞增殖，也能诱导细胞凋亡，具有
溶瘤病毒产品的研发和申报 1、溶瘤病毒的作用机理 现在普遍认为，大部分溶瘤病毒主要通过以下两种机制抗肿瘤： 1）激发机体的免疫反应： 通过抗原（病毒自身和肿瘤）激活机体的天然免疫和继发性免疫反应，杀死肿瘤； 2）裂解肿瘤细胞： 通过选择性的在肿瘤细胞中大量复制，使肿瘤细胞裂解死亡。 图1 溶瘤病毒在肿瘤细胞中的选择性复制 那么溶瘤病毒为什么如此“钟爱”肿瘤细胞？ 1）首先，大多数肿瘤细胞较正常细胞的抗病毒活性差，导致肿瘤细胞更容易感染病毒； 2）其次，肿瘤细胞由于自身高代谢和复制活跃的内环境给病毒复制提供了更好的环境； 3）最后，人类通过基因工程手段使得病毒对肿瘤细胞具有选择性，例如针对特定的肿瘤细胞表面受体改造病毒。
图2 溶瘤病毒的综合作用机理 可以看出溶瘤病毒疗法最核心要素就是病毒本身，溶瘤病毒大致可以分为两类： 1）在自然界里存在的，这一类不是特别的多； 2）经过基因改编的病毒，对肿瘤细胞更加具有选择性，目前常见的溶瘤病毒均属于这一类。
如何对溶瘤病毒进行基因工程改造？ 1）一方面可以直接创造一个多样性的病毒库，从中筛选具有选择性的病毒； 2）另一方面可以通过研究病毒的基因，改变相应的基因达到具有选择性的目的； 3）结合以上两种方法先从库中选择具有选择性的病毒，再通过基因改造使其更具选择性。 2、溶瘤病毒的局限性 虽然溶瘤病毒疗法已有两款产品上市，但是市场表现一直不理想，主要在于该技术还存在着以下局限性: 1)因为病毒是外源性物质，人体会产生抗体清除病毒，使其不能发挥作用 2)病毒的稳定性：病毒进入人体会不断的复制，经过几代复制之后发生可能 突变导致无效； 3)给药方式：目前主要有两种方式，直接注射肿瘤部位或者通过静脉给药， 比较大的肿瘤可以直接注射，但是比较小的肿瘤如何给药还存在问题。 4)病毒脱落：病毒最终会去哪里。 5)溶瘤病毒的生产、提纯、运输这些都是非常困难。 除了以上局限性，有效性仍是目前溶瘤病毒最大的问题，目前单用溶瘤病毒的治疗肿瘤的效果不是很理想，但是目前临床研究表明溶瘤病毒和免疫监测点抑制剂联用效果比较好，原因在于溶瘤病毒能够将"冷"肿瘤变"热"，提高肿瘤细胞对免疫监测点抑制剂的反应。 一项2期临床研究表明病毒T-VEC（Tailmogene laherparepvec）联合Ipilimumab（伊匹单抗）和单独使用Ipilimumab（伊匹单抗）单独治疗黑色素瘤，联合用药可以显著提高治疗效果。所以未来溶瘤病毒的联用会成为研究的一个热点，这也正说明了上药启动安柯瑞再上市计划的原因。 溶瘤病毒的局限性和溶瘤病毒在联合用药的前景是企业在溶瘤病毒产品研发中需要认真考虑的问题。
病毒感染呼吸道时机体的固有免疫和适应 性免疫的参与机制 以呼吸道病毒感染为例，当病毒入侵机体时将会产生以下几个阶段的防御反应。 一、呼吸道粘膜以及细胞分泌物的机械和化学屏障 当病毒通过呼吸道入侵机体时，首先遇到由完整粘膜组成的免疫系统第一道防线，黏膜产生阻挡作用的同时还通过纤毛的不断同向摆动，清除粘膜表面的病原体。除机械性作用外，粘膜细胞分泌的多种物质亦可阻挡病毒的入侵。 二、固有免疫细胞和免疫分子的免疫应答作用 当病毒突破机体屏障结构进入体内时，固有免疫细胞和免疫分子启动免疫应答——第二道防线。 首先发挥作用的是游离在血液中小吞噬细胞中性粒细胞，感染发生初期在炎性细胞因子等的作用下，血管内皮细胞表达E-选择素，诱导吞噬细胞表达相应配体，并与血管内壁黏附，沿内皮细胞表面滚动，以致穿越血管内皮，接着在趋化因子作用下向感染灶募集和迁移，聚集在感染灶的吞噬细胞PRR与病毒PAMP识别结合启动吞噬与杀灭作用。 NK细胞通过识别受感染的靶细胞表面HLA-I类分子，激活杀伤
活化受体，与HLA-I类分子表达下降的感染细胞表面相应配体结合，从而产生杀细胞效应。同时通过NKG2D和自然细胞毒性受体识别受病毒感染细胞高表达的相应配体，选择性的杀伤靶细胞。 此外，NKT细胞、B1细胞、γδT细胞、树突状细胞(DC)等也起到了相当重要的免疫应答作用。以上均为固有免疫的参与机制，为感染发生后的96小时内反应，固有免疫将贯穿整个免疫应答过程。 三、T淋巴细胞介导的细胞免疫应答 1.T细胞识别抗原 病毒被DCs吞噬、加工、处理后，以抗原肽-MHC II类分子复合物的形式表达在细胞表面，再将抗原呈递给初始CD4+ T细胞；而吞噬细胞通过对病毒的吞噬、加工、处理后，以抗原肽-MHC II类分子复合物的形式表达在细胞表面，再将抗原呈递给效应CD4+ T细胞和记忆CD4+ T细胞识别。由此激活由T细胞介导的细胞免疫应答。 被病毒感染的细胞通过表达病毒肽-MHC I类分子分子复合物，被初始CD8+ T细胞识别。 2.T淋巴细胞活化 CD4+ T细胞表面的TCR与ACPs表面的抗原肽-MHC II类分子复合物结合后，以及CD8+ T细胞表面的TCR与靶细胞表面病毒肽-MHC I类分子分子复合物结合后引发第一信号，促进免疫突触的形成，启动信号传导途径，导致T细胞基因表达改变，表达基因编码了介导T细胞生物学效应的蛋白质。同时，T细胞将第一信号整合，直至达
细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。 在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp 或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。 相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。 一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。 三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA 中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。
氧化应激与心肌 1957年美国克里夫兰临床中心，首先将大隐静脉搭桥术应用于冠心病病人，此后冠状动脉粥样硬化性心脏病血运重建治疗快速发展。冠状动脉溶栓术、经皮冠状动脉成形术、冠状动脉支架植入术、冠状动脉旁路手术已成为挽救缺血心肌的重要治疗方式。但血流恢复本身也会引起显著的损伤，部分患者在血供恢复后，出现细胞超微结构变化、细胞代谢障碍、细胞内外环境改变，导致缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion-associated tissue injury，IRI），临床表现为心律失常、心力衰竭等。IRI也出现在心脏手术、心脏移植、心肺复苏等临床情况后。目前研究表明细胞IRI的机制主要包括：氧自由基含量增多、细胞内钙超载、线粒体膜去极化等。氧化还原失衡是IRI发生的重要起始因素，但其机制和细胞中存在的保护机制尚不完全明确，本文重点对氧化应激与心肌IRI的研究进展做一综述。 1.氧化应激和ROS 氧化应激（oxidative stress，OS）主要是由于内源性和(或)外源性刺激引起机体代谢异常而骤然产生大量活性氧簇（ROS）。ROS是指在外层电子轨道含有一个或多个不配对电子的原子、原子团或分子，包括超氧阴离子（O2- ·）、过氧化氢（H2O2）、过氧亚硝酸盐（ONOO-）和羟基自由基（·OH）。ROS作为第二信使介导了许多生理性与病理性细胞事件，包括细胞分化、过度生长、增殖及凋亡。超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶作为体内清除自由基的重要物质，在维持体内氧化还原平衡方面发挥重要的作用。但在IRI过程中，参与合成ROS的酶体系增多，且活性更强，如NADPH氧化酶、线粒体黄素酶、黄嘌呤氧化酶、未偶联的一氧化氮合酶、细胞色素P450、脂氧合酶、环氧合酶和过氧化物酶体，ROS的生成量明显高于细胞内的清除能力，导致氧化还原失衡。ROS虽然半衰期很短，但具有极强的氧化活性，与细胞内脂质、蛋白质、核酸等生物大分子发生过氧化反应，造成细胞结构损伤和代谢障碍。 2.ROS的主要来源 NADPH氧化酶是细胞内ROS的最主要来源，是由催化亚基gp91phox或其同系物，即非吞噬细胞氧化酶1~4(NOX1~4) 、双功能氧化酶1~2(Duox1~2) ，跨膜亚基p22phox，胞浆亚基p47phox、p67phox等蛋白分子共同组成的多亚基蛋白复合体。NOX家族蛋白亚型与跨膜亚基、胞浆亚基结合并组装成有活性的复合体后发挥其生物学功能。活化的NADPH氧化酶复合物与NADPH结合并释放2个电子，通过黄素腺嘌呤二核苷(FAD)传递给亚铁血红素，与细胞膜的外侧的2个氧分子结合生成O2-，最后生成H2O2、过氧化硝酸盐(ONOO-) 、羟基团(-OH) 及其它基团[1,2]。NOX源性的ROS在维持机体稳态中是把双刃剑，NOX源性ROS 一方面在氧化还原信号通路中起到了第二信使作用，参与多种细胞生理功能；另一方面，在高血压、动脉粥样硬化以及心肌IRI的病程中发挥了重要作用，因此单一抑制NOX活性对治疗心肌IRI并不是最好的选择。Vincent等[3]研究发现在30分钟缺血-24小时再灌注小鼠模型中，NOX4基因敲除组与NOX1和NOX2敲除组相比，表现出更大面积的心肌梗死，提示内源性NOX4 在H/R损伤中可能发挥着心肌细胞保护作用。 黄嘌呤氧化酶（XO）是IRI中ROS产生的另一重要来源，与合成抗氧化剂尿酸的黄嘌呤还原酶（XDH）作用相反。XDH/XO活力受细胞因子、细胞内化学物质及激素的调节。细胞缺血时XO活力升高，并且A TP分解产物次黄嘌呤积聚，再灌注时O2大量介入，次黄嘌呤和氧在XO作用下反应生成O2- ·和H2O2。有研究指出，XO不仅通过合成ROS参与心肌缺血再灌注损伤，XO本身可以与白细胞产生相互作用，造成微循环阻塞，导致再灌注的无复流现象。此外，XO可以直接损伤血管内皮细胞（EC）或通过ROS间接损害EC，影响心肌血流再灌注[4]。 3.ROS与细胞损伤
表1 常见的细胞凋亡诱导剂和抑制剂 诱导剂与抑制剂靶细胞诱导剂 激素地塞米松T细胞 细胞因子IL—2 胸腺细胞 TGF—β肝细胞、上皮细胞、慢性B淋巴瘤细胞 IL—10 髓样白血病细胞 IFN—Υ前B细胞、T细胞抗体抗IgM抗体B细胞 抗IgD抗体B细胞 抗HLA—II抗体静止B细胞 超抗原SPE CD4+T细胞 胞内信号分子调节 剂 放线菌酮T细胞 PKC激活剂胸腺细胞 其他DNA拓扑异构酶抑制 剂 白血病细胞放射线淋巴样细胞 抑制剂 细胞因子IL—2 T H1细胞 IL—4 T H2细胞 IL—10 B、T细胞 IFN—ΥT细胞 IL—4 B细胞 黏附分子LFA—1、ICAM—1 B细胞 VLA—4、VCAM—1 B细胞 胞内信号分子调节 剂 PKC激活剂T、B细胞 细胞凋亡（apoptosis）是一种由基因控制的细胞自主死亡方式。1972年，英国教授Kerr首先提出凋亡的概念。近十余年来，细胞凋亡现象引起了广泛重视，有关的研究工作取得重要进展，并成为医学生物学各学科共同关注的极为活跃的研究领域。 细胞凋亡与组织器官的发育、肌体正常生理活动的维持、某些疾病的发生以及细胞恶变等过程均有密切的关系。
1．形态学变化： 细胞凋亡的形态变化大致可分为三个阶段： 1）胞体缩小，与周围细胞失去联系，细胞器变致密，核体积缩小，核仁消失，染色质浓集于核膜内表面下，形成新月形致密小斑块。 2）染色体断裂，核膜与细胞膜均内陷，包裹胞内成分（胞浆、细胞器、碎裂的染色质及核膜）形成“泡”样结构，此为“凋亡小体”。最后，整个细胞均裂解成这种“小体”。 3）凋亡小体被邻近的巨噬细胞、上皮细胞等识别、吞噬、消化。 上述三个阶段维持时间很短，通常在几分钟、十几分钟内即可完成。 2．细胞凋亡的生化改变： 1）胞内Ca2+浓度增高 所有细胞凋亡过程中均出现胞内Ca2+浓度增高，这可能是Ca2+内流所致。 2）内源性核酸内切酶激活 细胞发生凋亡时，由于内源性核酸内切酶被激活，DNA被从核小体连接处水解，形成180—200bp 或其整倍数的片段。 3）生物大分子的合成 凋亡过程的发生一般依赖于新的RNA和蛋白质的合成，如在激素、射线作用下，或由于去除生长因子等所引起的细胞凋亡中，情况均为如此。 常用的检测方法： 1．形态学方法 借助普通光学显微镜、荧光显微镜或透射电镜可对组织切片、切片涂片或细胞悬液进行形态学观察，凋亡细胞在组织中散在分布，表现为核致密浓染、核碎裂等。该方法简便、经济，可定性、定位。但在组织成分及细胞死亡类型复杂的情况下，难以判断结果，也无法定量。 2．电泳法 对凋亡细胞的基因组DNA进行琼脂凝胶电泳，由于存在180—200bp或其整倍数的片段，故电泳结果可见“梯状”（ladder）DNA条带。该法简便，可定性及定量，但无法显示组织细胞形态结构，也不能反映凋亡细胞与周围组织的关系。
病毒与细胞凋亡
病毒与细胞凋亡 万文娟 2011302220031 摘要：细胞凋亡的概念、与细胞凋亡有关的病毒和基因、病毒调控细胞凋亡的机制 关键词：病毒细胞凋亡 1细胞凋亡的概念 细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应 生存环境而主动争取的一种死亡过程。根据形态学特征，细胞凋亡可分为三个阶段（1）：第 一阶段为核碎裂阶段，此阶段细胞要经过核固缩、染色质凝聚、胞浆浓缩等变化；第二阶段为凋亡小体形成阶段，包括细胞膜形成泡状突起、突起与胞体分离形成凋亡小体等过程；第三阶段为凋亡小体被临近细胞吞噬或凋亡小体自行降解阶段。 细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→进入连续反应过程 （1）凋亡的启动阶段 细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭，客观上说对细胞凋亡过程中信号传递系统的认识还是不全面的，目前比较清楚的通路主要有： 1）细胞凋亡的膜受体通路：各种外界因素是细胞凋亡的启动剂，它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号，引起细胞凋亡。 2）细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途经：实验表明了细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合，使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，从而诱导细胞凋亡。 （2）．凋亡的执行 尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程。
细胞凋亡诱导剂 在凋亡研究中，成功的诱导细胞凋亡是最关键的前提条件。凋亡诱导试剂多种多样，每种诱导剂均有其敏感的细胞，而不同的细胞也有其最佳的诱导剂。因此，选择合适的、有效的、特异性的诱导剂也就成为至关重要的问题。Biovision公司作为世界主要的凋亡试剂供应商，提供各种不同的凋亡诱导剂供研究者选择。 放线菌素D（Actinomycin D） 放线菌素D是一种抗肿瘤的抗生素类药物。通过脱氧鸟苷残基与DNA形成复合物，从而抑制DNA依赖的RNA聚合酶的活性，阻断转录过程。是多种哺乳动物细胞强有力的凋亡诱导剂(1)。Camptothecin 可以结合并稳固拓普异构酶－DNA复合物，从而达到可逆性的抑制拓普异构酶I活性的目的，而诱导细胞凋亡。可抑制Tat介导的HIV-1的转录。常用于诱导Jurkat、骨肉瘤和肝细胞癌细胞的凋亡。Cycloheximide 是一种非常有效的抗多种酵母和真菌的抗生素，可抑制真核生物蛋白
质的合成，而多数原核生物则无效。在100ug/ml的浓度时可抑制多种霉菌，而对大部分的致病细菌则无抑制作用。通过作用于真核细胞60S核糖体而抑制蛋白质合成的起始和延长过程。常被作为抑制剂用于研究真核生物无细胞蛋白质合成，也被用于阻断体外核糖体依赖的多肽合成。可诱导多种细胞的凋亡。 Dexamethasone 是一种具有抗炎症作用的皮质类固醇，同时具有抗炎症和抗风湿的特性。可抑制血管内皮细胞表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS），但对cNOS则无效。在主动脉平滑肌细胞通过刺激Na+-K+泵，可加速活化阳离子的转位。一般用于诱导人胸腺细胞凋亡（500-1000nM，37°C 6小时） Etoposide 是拓普异构酶II的抑制剂。是从鬼臼毒素来源的衍生物，主要可以抑制多种肿瘤，包括生殖细胞肿瘤、小细胞肺癌、恶性淋巴瘤。可用于诱导人T细胞、小鼠胸腺细胞、HL-60细胞凋亡。Staurosporine Staurosporine是蛋白激酶C和其他大部分激酶（包括酪氨酸蛋白激
细胞凋亡与免疫 细胞凋亡（apoptosis），又称程序性细胞死亡(PCD)，指的是细胞将自身裂解为许多膜包小泡的一种精确调节的细胞死亡过程，是目前生物界最热门的话题之一。细胞凋亡之所以引起学者们的广泛关注，在于它在保证许多生物的健康生存上起到了十分关键的作用。它在生物的发育过程中塑造了神经系统，并且保证了免疫系统行使正常功能。细胞凋亡是免疫应答和免疫调控的重要形式之一，免疫细胞的增殖与分化过程是与免疫细胞的正常死亡相统一的，免疫应答的效应过程也是与靶细胞的死亡相伴随的。细胞凋亡的研究也是免疫学的重要课题。 1.概念 1972年，Kerr首先提出细胞凋亡是不同于坏死的一个主动的自我破坏过程。1980年，Wyllie等在糖皮质激素诱导胸腺T细胞死亡的过程中，观察到一系列形态学和生物化学的变化，与常规坏死不同，认为这是细胞内基因调控发生的有序的死亡过程，并提出了细胞程序性死亡（PCD）的概念。作为生命过程中同一个过程的两个方面，凋亡和增生同样不可缺少，二者是辨证统一的。对免疫学来说，细胞凋亡有特殊的意义。免疫系统识别外来异物和自身组织的形成，必须依靠对自身起反应的淋巴细胞的删除，而这种删除主要是通过细胞凋亡来完成的。淋巴细胞对靶细胞的杀伤过程部分也是通过靶细胞凋亡来实现的。细胞凋亡如果出现紊乱，机体可能出现严重的病理状态，如肿瘤、白血病、自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎等）、免疫缺陷等。以下对细胞凋亡的基本机制、信号传导、分子事件及疾病治疗等方面的研究成果综述如下。 （1）基本机制 多细胞动物体内的细胞具有一套相似的酶系统，激活后可以启动细胞凋亡。线虫Caenorhabditis elegans是研究细胞死亡机制的一种很好的生物模型。C.elegans 的三种基因产物：CED-3，CED-4和CED-9对凋亡而言是十分重要的，CED-3和CED-4促使凋亡，CED-9抑制凋亡。CED-3是一种caspase,即一种半胱氨酸蛋白酶，它在天门冬氨酸存在的部位之后切断蛋白。CED-3是一种酶原，通过自身切割而活化。CED-4与CED-3结合并激活CED-3，CED-9与CED-4结合从而阻断CED-4激活CED-3。通常，CED-9与CED-4和CED-3形成复合物是CED-3保持无活性状态。当引起细胞凋亡的刺激发生时，CED-9会分解从而活化CED-3，继而导致细胞死亡。脊椎动物已进化出一整套基因族，类似于C.elegans的死亡基因。哺乳动物的caspase类似于CED-3。Apaf-1是目前唯一已知的哺乳动物体内CED-4类似物。哺乳动物Bcl-2基因族产物与CED-9有关，但包括两个蛋白亚群，一个亚群抑制凋亡，一个亚群促进凋亡。 （2）死亡受体直接介导凋亡机制 从细胞生存环境发出的生存信号和内部感受器对细胞完整性的感知使细胞的凋亡机制随时处于戒备状态。一旦细胞失去与外界的联系或内部发生难以修复的损伤则启
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溶瘤病毒与肿瘤治疗 作者：钟江 作者单位：复旦大学生命科学学院 刊名： 国外医学（微生物学分册） 英文刊名：FOREIGN MEDICAL SCIENCES 年，卷(期)：2004,27(6) 被引用次数：1次 参考文献(35条) 1.Bergsland EK;Venook AP查看详情 2002(09) 2.Shah AC;Benos D;Gillespie GY查看详情 2003(03) 3.Cornelis J J;Salome N;Dinsart C查看详情 2004(z1) 4.Herrero Y;Calle M;Cornelis J J查看详情[外文期刊] 2004(01) 5.Moehler M;Zeidler M;Schede J查看详情 2003(06) 6.Yang WQ;Senger D;Muzik H查看详情 2003(12) 7.Hriasawa K;Nishikawa SG;Norman KL查看详情 2003(02) 8.Thirukkumaran CM;Luider JM;Stewart DA查看详情 2003(01) 9.Sinkovics JG;Horvath JC查看详情[外文期刊] 2000(01) 10.Szeberenyi J;Fabian Z;Torocsik B;et a查看详情 2003(02) 11.Pecora AL;Rizvi N;Cohen GI查看详情[外文期刊] 2002(09) 12.Peng KW;Ahmann GJ;Pham L查看详情[外文期刊] 2001(07) 13.Stojdl DF;Liehty B;Knowles S查看详情[外文期刊] 2000(07) 14.Stojdl DF;Lichty BD;Tenoever BR查看详情 2003(04) 15.Cinatl J Jr;Cinatl J;Michaelis M查看详情 2003(07) 16.Thomas DL;Fraser NW查看详情 2003(04) 17.Ries SJ;Brandts CH;Chung AS查看详情 2000(10) 18.Lee B;Choi J;Kim J查看详情[外文期刊] 2002(02) 19.Vecoil GG;Lang FF查看详情 2003(03) 20.Bergmann M;Romirer I;Sachet M查看详情[外文期刊] 2001(22) 21.Muster T;Rajtarova J;Sachet M查看详情 2004(01) 22.Mizuguchi H;Hayakawa T查看详情[外文期刊] 2002(1-2) 23.Bernt K;Ni S;Li ZY查看详情 2003(05) 24.Kim J;Lee B;Kim JS查看详情[外文期刊] 2002(01) 25.Bristol JA;Zhu M;Ji H查看详情 2003(06) 26.Bernt K;Liang M;Ye X查看详情[外文期刊] 2002(21) 27.Soya P;Ren XW;Ni S A tumor-targeted and conditionally replicating oncolytic adenovirus vector expressing TRAIL for treatment of liver metastases.[外文期刊] 2004(04) 28.Jarnagin WR;Zagr JS;Klimstra D Neoadjuvant treatment of hepatic malignancy: an oncolytic herpes simplex virus expressing IL-12 effectively treats the parent tumor and protects against recurrence-after resection.[外文期刊] 2003(03)