新生大鼠皮层神经元的培养与鉴定
作者：邓莉， 代荣阳， 廖彦生， 高小青， 杨朝鲜， Deng Li， Dai Rongyang， Liao
Yansheng， Gao Xiaoqing， Yang Chaoxian
作者单位：邓莉,廖彦生,高小青,杨朝鲜,Deng Li,Liao Yansheng,Gao Xiaoqing,Yang Chaoxian(泸州医学院神经生物研究室,四川,646000)， 代荣阳,Dai Rongyang(泸州医学院生物化学教研室
,四川,646000)
刊名：
西南军医
英文刊名：JOURNAL OF MILITARY SURGEONIN IN SOUTHWEST CHINA
年，卷(期)：2011,13(4)
参考文献(6条)
1.Chernova T;Nicotera P;Smith AG Heme deficiency is associated with senescence and causes suppression of N-methyl-D-aspartate receptor subunits expression in primary cortical neurons[外文期刊] 2006(03)
2.Soundarapandian MM;Zhong Xiaofen;Peng li sheng Role of K(ATP) channels in protection against neuronal excitatory insults[外文期刊] 2007(05)
3.Farkas Q;Povlishock JT Cellular and subcellular change evoked by diffuse traumatic brain injury:a complex wed of change extending far beyond facial damage[外文期刊] 2007(01)
4.Lee SJ Origins and effect of extracellular alpha-synnuclein:Implications Parkinson's disease[外文期刊] 2008(10)
5.Hamabe W;Fujita R;Ueda H Insulin Receptor-Protein Kinase C-Signaling Mediates Inhibition of Hypoxia Induced Necrosis of Cortical Neurons[外文期刊] 2005(3)
6.姜茜;姜王武;王静敏一种改进的大鼠皮层神经元原代培养方法及其性质鉴定[期刊论文]-北京大学学报（医学版） 2009(02)
引用本文格式：邓莉.代荣阳.廖彦生.高小青.杨朝鲜.Deng Li.Dai Rongyang.Liao Yansheng.Gao Xiaoqing.Yang Chaoxian新生大鼠皮层神经元的培养与鉴定[期刊论文]-西南军医 2011(4)
第２３卷第２期化 学 研 究中国科技核心期刊２０１２年３月ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ｈｘｙｊ＠ｈｅｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 雄黄染毒后大鼠脑组织中氨基酸类神经递质含量的变化 霍韬光，畅 蓓，李维凯，杨卉蕾，张颖花，姜 泓＊ （中国医科大学公共卫生学院，辽宁沈阳１１０００１） 摘 要：研究了雄黄对大鼠脑组织氨基酸类神经递质含量的影响．将３２只Ｗｉｓｔａｒ大鼠随机分为对照组（０．５％ ＣＭＣ－Ｎａ）以及低剂量（０．３ｇ／ｋｇ）、中剂量（０．９ｇ／ｋｇ）、高剂量（２．７ｇ／ｋｇ）雄黄染毒组，通过连续灌胃给予雄黄混 悬液两周．采用高效液相色谱－柱前衍生化法测定了大鼠脑组织中氨基酸类神经递质含量的变化．结果表明，与 对照组比较，低剂量组大鼠脑组织中丝氨酸、甘氨酸和γ－氨基丁酸含量明显增加．中、高剂量组大鼠脑组织中同 型半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和天冬氨酸含量明显比对照组的低．总体而言，雄黄可对大鼠脑组织氨基酸类神 经递质产生影响，氨基酸类神经递质可能是雄黄毒性作用的靶点之一． 关键词：雄黄；大鼠；脑组织；氨基酸类神经递质 中图分类号：Ｏ ６１３．６３文献标志码：Ａ文章编号：１００８－１０１１（２０１２）０２－００８７－０４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒｅａｌｇａｒ ｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｒａｔｓ ＨＵＯ Ｔａｏ－ｇｕａｎｇ，ＣＨＡＮＧ Ｂｅｉ，ＬＩ Ｗｅｉ－ｋａｉ，ＹＡＮＧ Ｈｕｉ－ｌｅｉ， ＺＨＡＮＧ Ｙｉｎｇ－ｈｕａ，ＪＩＡＮＧ Ｈｏｎｇ＊ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ｃｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００１，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒｅａｌｇａｒ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｒａｔｓ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．３２Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｃａｔｅｇｏｒｉｚｅｄ ｉｎｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ，ｌｏｗ ｄｏｓａｇｅ， ｍｏｄｅｒａｔｅ ｄｏｓａｇｅ，ａｎｄ ｈｉｇｈ ｄｏｓａｇｅ ｒｅａｌｇａｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅ ｒｅａｌｇａｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅａｌｇａｒ ｂｙ ｇａｓｔｒｉｃ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ａｔ ａ ｄｏｓａｇｅ ｏｆ ０．３ｇ／ｋｇ，０．９ｇ／ｋｇ，ａｎｄ ２．７ｇ／ｋｇ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｏｒａｌｌｙ ｇｉｖｅｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ０．５％ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ （ＣＭＣ－Ｎａ）ｆｏｒ ２ｗｅｅｋｓ．Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｒｅｃｏｌｕｍｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ，ｇｌｙｃｉｎｅ ａｎｄγ－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｌｏｗ ｄｏｓｅ ｒｅａｌｇａｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ ａｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｅｌｅｖａｔｅｄ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ；ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ａｓｐａｒｔａｔｅ，ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ，ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ｓｅｒｉｎｅ ｉｎ ｍｏｄｅｒａｔｅ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ ｒｅａｌｇａｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐｓ ａｒｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ．Ｉｎ ｏｎｅ ｗｏｒｄ，ｒｅａｌｇａｒ ｈａｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｒａｔｓ，ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ ｍａｙ ｂｅ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｘｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｒｅａｌｇａｒ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒｅａｌｇａｒ；ｒａｔ；ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ；ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ 雄黄为硫化物类矿物，作为药用在我国已有上千年的历史，主要成分为二硫化二砷（Ａｓ２Ｓ２）［１］．近些年， 收稿日期：２０１１－０７－２３． 基金项目：国家自然科学基金（８１０７３１４４）；辽宁省自然科学基金（２００９２１３３）；辽宁省教育厅高等学校科研资助项目（Ｌ２０１０７０８）． 作者简介：霍韬光（１９８３－），女，讲师，博士，研究方向：含重金属矿物药毒作用机制研究．＊通讯联系人．
关键词：郁证；应激；大鼠模型中图分类号：R2-332 文献标志码：B 文章编号：1004-5627（2010）03-0030－03 抑郁症是一种常见的情感障碍性精神疾病，是一种以显著而持久的心境低落为主要特征的综合征，其主要表现有情绪低落，言语减少，精神、运动迟缓，常自责自罪，甚至企图自杀等，并常伴有睡眠异常、食欲减退、体重减轻、性欲减退等躯体症状，是目前世界上最易致残的疾病之一［1］。它与中医郁证有若干相通之处，属于中医“郁证”范畴，多因情志所伤或素体偏弱，致气机失和，脏腑气血阴阳失调所致［2］。研究表明，抑郁症的发生与应激性事件有着密切关系，慢性应激可以诱导抑郁。我们采用慢性轻度应激和孤养2种经典造模结合的方式，利用长期不可预见性的轻度应激，造成动物的抑郁状态，类似中医的“郁证”，并对此模型的建立和有效性作出评价。 1材料和方法 1.1动物分组健康SD 成年大鼠，体重180～200g ，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，批号：SCXK （沪）2007、0005。用敞箱实验进行行为学评分，选择得分相近的大鼠30只，随机分为3组：①生理盐水组（正常对照组）10只，大鼠笼每笼喂养5只：②慢性轻度不可预见性应激抑郁组（模型组）10只，每笼孤养1只：③造模加百忧解组（阳性对照组）10只，每笼孤养1只。慢性轻度不可预见性的应激抑郁模型造模过程持续24d 。1.2抑郁大鼠模型的建立按照Katz ［3］248的方法略加改进，将明暗颠倒24h 、夹尾1min 、禁食24h 、禁水24h 、160Hz 摇晃5min 、30V 电压电击足底5s 、40℃环境5min 、冰水游泳8种刺激，随机安排到24d 内，每日1种刺激，每种刺激出现3 次，同种刺激不能连续出现，使动物不能预料刺激的发生。 1.3行为测定按Open-Field 法［3］248测定行为。 敞箱装置由不透明材料制成，底面为76cm ×76 cm 的正方形并被等分为25个等边方格，周围有高40cm 的墙壁。在安静的房间内进行此项试验观察，每日早晨8∶00―12∶00进行此项试验观察。将大鼠置于中心方格内，观察大鼠在5min 内穿 越格数（四爪均进入的方格方可计数，为水平运动得分），后肢直立次数（两前爪腾空或攀附墙壁）为垂直运动得分，彻底清洁敞箱后再进行下1只大鼠的观察。每周进行1次行为评分。 1.4体液消耗实验按Willner P 等的实验方 法［4］，试验前，在隔离噪音的安静房间内，训练动物适应含糖饮水，每笼同时放置2个水瓶，第1个24 h ，2瓶均装有1%蔗糖水，随后的24h ，1个瓶装1%蔗糖水，1个瓶装纯净水。24h 的禁食禁水后，进行大鼠的基础糖水／纯水消耗试验，同时给予每只大鼠事先定量好的2瓶水：1瓶为1%蔗糖水，1瓶为纯净水，计算大鼠1h 饮用1%蔗糖溶液的量。1.5统计学处理数据用x ±s 表示，用SPSS 11.5统计软件处理数据，采用t 检验，P ＜0.05为有显 著性差异。 2结果 实验结果 见表1～表4。 3讨论 3.1从中西医不同角度看，抑郁症的发生是受到 外界的不可知的慢性刺激后引发的。为了便于实验研究抗抑郁药的作用，我们需要根据其发病原因在动物身上模拟抑郁症的症状。目前本病的动物模型国内外报道较多，一般可分为应激模型、孤养或分养模型、药理学抑郁模型、脑损伤模型、操作应激模型、遗传选择性抑郁模型等［5］，其中慢性轻度不可预见性的应激（CUMS ）抑郁模型主要模拟了人类抑郁的核心症状即快感缺乏，同时模拟了其它重症抑郁障碍的症状表现，如运动能力及社会交往能力下降、探索行为能力下降、侵犯攻击 郁证的大鼠模型 王玉露1，林于雄2，陈 燕 1 （1.福建中医药大学药学院，福建福州350108；2.福建中医药大学学报编辑部，福建福州350003） 收稿日期：2010-03-13 作者简介：王玉露（1975—），女，讲师，医学硕士，主要从事药理学的研究。 Journal of Fujian University of TCM June 2010，20（3） 福建中医学院学报2010年6月第20卷第3期30
大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养 南京军区总院神经内科实验室许丽丽2012年10月 一、试剂 1)Poly-L-lysine（Sigma,P2636） 2)DMEM（Invitrogen,11995-065） 3)FBS（Invitroge,10099-141） 4)Neurobasal（Invitrogen, 21103-049） 5)B27（Invitrogen ,17504-044） 6)GlutaMAX （Invitrogen ,35050-061） 7)HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112） 8)0.25% Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056） 9)DPBS（HyClone，SH30028.01B） 10)dd H2O 11)10％水合氯醛 12)75％酒精 二、器械 1)手术器械：组织剪x2、组织镊x1、直弯镊各x1、眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显 微镊x2（金钟，WA3050）、显微剪x1 2)200 ml小烧杯（盛放胎鼠） 3)200目不锈钢筛 4)细胞计数器（求精） 5)50ml离心管（Corning，430828）、15ml离心管（Corning，430790）
6)6孔板（Corning，3516）或24孔板（Corning，3524）96孔板（cosrer,3599） 7)直径为60mm的培养皿（LabServ,310109010） 8)3ml移液管（Biologix, 30-0138A1） 9)过滤器（Millex-GP, SLGP033RB） 10)注射器：50ml、5ml各 1 11)Pipette and pipette tips 12)冰袋、手套、棉球、棉签
原代新生大鼠心肌细胞的分离与培养 1.动物与仪器 1.1实验动物：选择出生第2 d的SD乳鼠,雌雄不拘。 1.2主要仪器与试剂:二氧化碳培养箱，Olympus倒置显微镜，超净工作台，低速自动平衡离心机,恒温磁力搅拌器；DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、D-Hank′s 液、溴脱氧尿核苷、小鼠抗大鼠Sarcomerie actin 单抗；山羊抗小鼠IgG。 2.方法 2.1心肌细胞的分离：取第2 d的SD乳鼠，无菌条件下开胸取心尖部，用预冷的D-Hank′s 液洗涤3遍，将心脏剪成约1mm3大小；用0.0625％的胰酶在37℃恒温磁力搅拌器中消化心肌组织，消化过程中采用分次消化时间(5min×5次,6min×5次,7min×5次,8min×5次)，第一次消化后自然沉淀并弃上清，以后自然沉淀后取上清；每次分离的上清液加等量含10％胎牛血清的DMEM培养液轻轻吹打制成细胞悬液，1 000 r/min离心10 min，重复3次。 2.2心肌细胞的培养:细胞悬液放CO2培养箱培养90min后，采用差速贴壁分离技术,吸收培养瓶中的细胞悬液，调整细胞浓度为5.0×105细胞/mL，将单细胞悬液接种于培养板中，前3 d滴入Brdu使其终浓度为0.1mmol/L，并继续培养；24h后换液,以后隔日换液。 2.3心肌细胞搏动率的观察:在倒置显微镜下观察第1 d至第7 d心肌细胞的生长状态、形态变化，并摄像记录自发搏动频率。随机计数培养至第4 d的心肌细胞的搏动率。细胞搏动率(％)=搏动细胞数／细胞总数×100％。 2.4心肌细胞存活率的测定:取相同量的0.4％台盼蓝液与细胞悬液混匀后再取适量混合液滴于细胞计数板上，随机取10个高倍（20×）视野计数4个大格中的细胞总数及未染成蓝色的活细胞数，计数10次，取平均值。细胞存活率(％)=活细胞数／细胞总数×100％. 2.5心肌细胞纯度的鉴定:取培养72 h后心肌细胞进行纯度鉴定，用横纹肌肌动蛋白(a actin)单克隆抗体作为一抗，用SABC法进行免疫细胞化学染色，用磷酸盐缓冲液（PBS）作为一抗的阴性对照。随机取10个高倍（20×）视野计数阳性细胞及细胞总数。阳性细胞率=阳性细胞数/细胞总数×100％。
大鼠行为学实验评价汇总 大鼠行为学评定方法比较 大鼠进行行为学评定(behavior test)的十分重要，对其评定的方法也颇多，但究竟那种方法更适用，目前未有人进行过比较。为了合理选择MCAO后的评定方法，如下对目前常用的几种行为学评定方法进行比较。 行为学检查方法:由3位参加试验的人员分别以单盲法对试验的大鼠进行打分和记录.然后将3组的记分结果进行平均后的得分进行统计计算。（国内） 由一个对试验实施过程不了解的观察者对大鼠进行行为学评测。评测续贯进行。如果大鼠在一次评测中出现恰当的行为，而以后却未出现，按前者记分。(国外) 1. 神经行为学检查Longa评分法 2．Berderson评分法姿势反射测验（postural reflex test） 3. 攀绳实验 4．网屏测验（screen test） 5．肢体放置测验（limb-placement test）Elicited Forelimb Placing 6．开野试验（Open－Field法）测定行为 7．MNSS 8.转动杆测验（rotating pole test） 9．Rotation 10．肢体对称试验评分法 11. rotarod test 12. adhesive-removal somatosensory test 13．Spontaneous Activity 14．Symmetry in the Movement of Four Limbs 15．Forepaw Outstretching 16．Climbing 17．Body Proprioception 18. Response to Vibrissae Touch 改善记忆作用 1.跳台试验 2.避暗试验 3.穿梭箱试验 4.水迷宫试验 Motor behavior (1) observation of spontaneous ipsilateral circling, (2) contralateral hindlimb retraction, (3) beam walking ability,平衡木测验（balance beam test） (4) bilateral forepaw grasp, Skilled forelimb function (1)staircase feeding apparatus nociception (1) plantar test
大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代 、试剂 Poly-L-lysine (Sigma,P2636) DMEM (Invitrogen,11995-065) 二、器械 手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2 （金钟，WA3050）、显微剪 x1 3ml 移液管( Biologix, 30-0138A1) 南京军区总院神经内科实验室 许丽丽 2012-12-01 1) 2) 3) FBS (Invitroge,10099-141) 4) HBSS, no Calcium, no Magnesium (Invitrogen, 14170-112) 5) 0.25% Trypsin-EDTA ( Invitrogen, 25200-056) 6) DPBS (HyClone ，SH30028.01B ) 7) dd H 2O 8) 75％酒精 1) 2) 100 ml 小烧杯 3) 200 目不锈钢筛 4) 细胞计数器（求精） 5) 50ml 离心管( Corning ， 430828)、 15ml 离心管( Corning ， 430790) 6) 25ml 培养瓶( Corning ， 430639)或 75ml 培养瓶( Corning ， 430641) 7) 100ml 玻璃瓶（蜀牛） 8) 直径为 60mm 的培养皿 LabServ,310109010) 9)
10) 过滤器( Millex-GP, SLGP033R)B 11) 注射器：50ml、5ml 各1 12) Pipette and pipette tips 13) 冰袋、手套、口罩
图Ⅷ-1整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral View 图Ⅷ-2整体骨骼左前面观The skeleton. Left anterior view 1肋骨rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cervical vertebra 4颅骨cranium 5肩胛骨scapula 6肱骨hiimeius 7桡骨radius 8尺骨ulna 9掌骨metacarpal bone 10指骨digital bone 11腰椎lumbar vertebra 12髂骨ilium 13尾骨coccyx 14股骨femur 15髌骨patella 16腓骨fubula 17胫骨tibia 18跖骨metatarsal bone 19趾骨digital bone
图Ⅷ-4头骨侧面The skull. Lateral aspect
图Ⅷ-6下颌骨侧面The mandible. Lateral aspect
1枕骨occipital bone 2顶间骨interparietal bone 3矢状缝sagittal suture 4颧骨malar bone 5上颌骨maxillary bone 6前颌骨premaxillary bone 7枕外嵴external occipital creat 8顶骨parietal bone 9额骨frontal bone 10鼻骨nasal bone 11鼻间缝internasal suture 12前筛孔preethmoid pore 13蝶腭孔sphenopalatine foramen 14门齿 incisor tooth 15下颌骨mandible 16视神经孔optic foramen 17枕骨occipital bone 18茎突styloid process 19外耳道external acoustic meatus 20颞骨temporal bone 21 腭裂patoschisis 22臼齿molar tooth 23腭骨palatine bone 24翼孔pterygoid apertures 25破裂孔foramen lacerum 26枕大孔foramen magnum 27腭后孔posterior palatine foramen 28鼻后孔posterior nasal apertures 29卵圆孔foramen ovale 30鼓骨tympanic bone 31舌下神经孔hypoglossal foramen 32下颌联合mandibular symphysis 33颏孔mental foramen 34冠状突coronoid process 35下颌支ramus of mandible 36角状突process of horn 37下颌孔mandibular foramen 38翼肌窝pterygoid fossa 39髁突condylar process
基金项目:新疆石河子大学科学技术研究发展计划项目(ZRK X2006 Q04) 新生大鼠心肌细胞培养技术 新疆石河子大学医学院(832002) 李润琴 慕晓玲 摘 要 目的 探讨新生大鼠心肌细胞的分离、培养方法。方法 取1~3d 龄新生大鼠的心室肌细胞,用胶原酶!分离心肌细胞,离心收集心肌细胞,差速贴壁法纯化后培养于DM EM 培养基。显微镜下鉴定心肌细胞的纯度和形态结构,锥虫蓝染色检查心肌细胞成活率。结果 心肌细胞纯度为96%,平均成活率95 43%,并出现同簇细胞的同步跳动。结论 该方法简单有效,为研究心肌细胞的人员提供了一种实验手段。 关键词 细胞培养技术; 心肌; 大鼠 Culture method of the myocardial cell in Neonate Rats LI Run qin,M U X iao lin.M edical College of Shi hez i Uni versity ,X inj iang 832002,China Abstract Objective T o find an easy way to separ ate and cultur e myocardial cells of neonate rats.Methods T o obtain ventr icular myocardium of neonate rats about 1~3years o ld.We separate myo cardial cell w ith collag enase I,and collect myocar dial cell w ith centrifug alization.M yocar dial cell was cultur ed in DM EM and was separated by the t ime of adherence.W e observed the structure of myocar dial cell from lig ht microscope and stained living my ocardial cell with trypan blue.Results W e find 96percent cells ar e myocardial cells and 95.43percent ar e alive.A ll the myocardial cells were jumping synchronously.C onclusion T his is an effective w ay to study myocardial cells. Key words Cell culture techniques; M yocardial; Rats 原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型, 被广泛地应用于心血管疾病的研究中。我们经过长期摸索总结出一套简便、有效的大鼠心肌细胞的培养技术,为研究心肌细胞的人员提供一种实验手段[1]。1 材料和方法 1 1 主要试剂和仪器 1 1 1 试剂:小牛血清:购自Sigma 公司。DM EM (Dulbcc co ?s M odified Eagle M edium)合成培养基:购自Sigma 公司,含10%的小牛血清,100万U 青霉素,100万U 链霉素。胶原酶!0 8g/L:购自Sig ma 公司(现用现配)。磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline,PBS ):购自Sigma 公司。锥虫蓝:购自G ibco 公司,加无菌三蒸水配成浓度0 04%备用。 1 1 2 仪器:超净工作台,CO 2培养箱,倒置相差显微镜,离心机等。所有手术器械高压灭菌。玻璃品均强酸浸泡过夜,流水冲洗20遍,蒸馏水冲洗3遍,烤干后高压灭菌备用。 1 2 实验动物 Wistar 大鼠,1~3d 龄,新生大鼠心肌细胞在出生后3d 内具有部分增殖能力,大鼠出生时间越短,其心肌细胞分离后成活率越高,越容易贴壁生长。1 3 心肌细胞的制备和培养 取一窝1~3d 龄新生大鼠,不用麻醉和处死,用手固定住四肢,75%的酒精消毒皮肤,无菌眼科剪在剑突上一肋处入剪(注意避免剪破消化道预防污染)。开口0 5cm,心脏自然跳出,将心尖部组织剪下迅速置于预冷的不含Ca 2+、M g 2+的PBS 中,反复冲洗3遍,洗去残留的血细胞,将其剪成0 5~1mm 3大小的组织块,放入锥形瓶中[2],加入8mL 0 8g/L 的胶原酶!,在37#水浴,磁力搅拌器转速为100r/min,消化10min 。将黏附在搅拌子上的心肌组织吹散,当组织液由红转白呈半透明状态时,应停止消化。用吸管吸取第一次消化后的上清液弃去,再次以同上的方法消化3次,收集以后每次的消化后的上清液,加适量含10%的小牛血清的DM EM 培养基,终止胶原酶!对心肌细胞的继续作用。将收集到的上清液在500r/min 的离心机上离心10min,弃去上清液,用PBS 吹散沉淀细胞,同条件下再次离心,弃上清,然后加含10%的小牛血清,100万U 青霉素,100万U 链霉素,p H =7 2的DM EM 培养基制成细胞悬液接种于培养瓶中,放入37#,5%CO 2培养箱中静置培养90min 后,轻轻振摇后倾出尚未贴壁的心肌细胞,重新接种。将纯化的心肌细胞以1 5?106/mL 接种于预先用50mg /L 多聚赖氨酸涂布的25mL 培养瓶中,每瓶3mL ,放入37#,5%CO 2培养箱中培养,每48h 更换1次培养基,取培养72h 的单层细胞进行实验。1 4 心肌细胞质量评价 1 4 1 心肌细胞纯度鉴定[3]:显微镜下观察、计数纯化后的细胞,心肌细胞成圆型,成纤维细胞成梭形,计算心肌细胞纯度=心肌细胞数/(心肌细胞数+成纤维细胞数)?100%。
新生鼠海马、皮层神经元原代培养 实验材料 1. 实验动物 新生Wistar大鼠，当天出生（<12 h）的乳鼠，SPF级。 2. 试剂 Hibernate A Neurobasal A B27 serum-free supplements Papin （木瓜蛋白酶） DNAase I OptiPrep Density Gradient Medium Poly-L-lysine （多聚赖氨酸） L-glutamine （L-谷氨酰胺） Penicillin （青霉素） Streptomycin （链霉素） D-Hank’s solution dd H2O 3. 溶液配制 1. 多聚赖氨酸：取多聚赖氨酸25 mg，用双蒸水溶解并稀释浓度为50μg/ml，用0.2 μm的微孔滤膜过滤，4 °C保存备用。（可配成25×） 2. 解剖液：HA：含0.5mM L-谷氨酰胺的Hibernate A，0.22μm微孔滤膜过滤，4°C保存备用。 3．Papin：用HA配制含Papin 2mg/mL的消化液，37°C孵育20~30min，0.22μm 微孔滤膜过滤，冰上保存至实验。在使用前3h内配制。
4．DNAase I：取DNAase I粉末用D-Hank’s液配制成50μg/mL，0.22μm微孔滤膜过滤。可一次配好，-20°C保存，每次取用。 4．终止消化液：HABG：含2% B27的HA。现用现配，37°C保存备用。 5．Optiprep离心介质：Optiprep medium∶HABG为124∶876，每离心管1~1.5mL。 5．种植液和培养液：Neurobasal-A/B27：含2% B27，0.5mM L-谷氨酰胺的Neurobasal-A。现用现配，37°C保存备用。 4．实验方法 1. 包被培养皿 使用前2 d，在无菌条件下取6孔培养板，加多聚赖氨酸1 mL/孔，放置2 h，吸去多余多聚赖氨酸，自然干燥，灭菌水洗板2次，干燥备用。 2. 组织剥离 取出生12 h以内的Wistar大鼠，用75%乙醇擦拭全身消毒。无菌条件下断头，沿正中剪开皮肤和颅骨，向两边分开，小心取出全脑，浸于冰浴的解剖液。首先切除小脑和脑干部分，然后沿正中切为左右两半球，海马位于半球的腹内侧。分别在解剖显微镜下剥离出海马并置于冰浴的解剖液中，完整的海马（半侧）呈月牙形。用精细镊小心除去中脑、纹状体等非皮层结构，剥离出皮层。 3. 消化和分散 用精细剪将海马剪成1~2 mm3的组织块，在6 cm培养皿中用配好的木瓜蛋白酶在37 °C下消化30 min，4个半皮层或16个半海马/10mL消化液，并加入500 μL DNAase I。消化结束后小心吸去消化液，加入2~3mL HABG，200 μL DNAase I，
1、由日本Okamoto从Wistar大鼠中填培育的一种白化高血压大鼠，10周龄后动脉收 缩压雌鼠可达180mmHg雄鼠可达200mmHg以上。这个大鼠品系是 A ACI B F344 C SHR D WKY 2、由美国某兄弟农场培育，产仔多、生长最快、性情温顺、对性激素感受性高，在我国广泛使用的封闭群大鼠是 A Wistar B Sprague-Dawley D C Long－Evans D LOU/C 3、下列动物中垂体一肾上腺系统发达垂体摘除容易的动物是。 A 小鼠B大鼠 C 豚鼠 D 地鼠 4、下列动物中，对致畸药物十分敏感，适宜作致畸实验的动物是 A 狗 B 兔 C 豚鼠D大鼠 5、对大鼠外观描述正确的是。 A 成年大鼠一般体长10-15cm B 大鼠与小鼠同属一个属是小鼠长大成年而成 C尾巴上被有短毛和环状角质鳞片 D 前足有四趾，后足有三趾 6、下列均可导致大鼠产生攻击人的倾向。 ①粗暴操作②营养缺乏③母鼠哺乳④雄性大鼠关养在一起 ⑤雄性激素 A ①②③ B ①③④ C ②③④⑤ D ①②③④⑤ 7、严重缺乏时雄性大鼠可终生丧失生殖能力。 A VitA B Vit C C VitE D VitB2 8、大鼠比较活跃，采食、交配多在此期间发生。 A 夜间和黄昏B夜间和清晨 C 白天和黄昏 D 白天和清晨 9、大鼠对极为灵敏，长期慢性刺激时，会引起大鼠肺炎和进行性肺组织坏死。 A 噪声 B 高于临界的温度C粉尘、氨气 D 光照强度 10、大鼠，对外界刺激反应敏感，适宜作行为学研究。 A喜独居，喜安静的环境 B 喜群居，耐噪声环境 C 喜独居，耐噪声环境 D 喜群居，喜安静环境 11、由于，大鼠适于建立龋齿的动物模型 A门齿终身不断生长，需经常磨损以维持其恒定 B大鼠上下颌各有2个门齿和6个臼齿 C大鼠有乳齿 D磨牙的解剖形态与人类e相似，产生与人一样的龋损 12、由于，导致大鼠不会呕吐。 A在界限嵴存在一个褶 B 大鼠属于单室胃 C 胃分为非腺胃和腺胃 D 食管细长 13、对大鼠的肝脏描述正确的是。 A大鼠的肝重量约占体重的10% B 大鼠肝脏分为五叶 C再生能力很强，切除90%后可再生D肝Kupffer’s细胞95%有吞噬能力14、大鼠与小鼠相比较，叙述正确的是。
大鼠和小鼠解剖图谱
图Ⅷ-1整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral View 图Ⅷ-2整体骨骼左前面观The skeleton. Left anterior view 1肋骨rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cervical vertebra 4颅骨cranium 5肩胛骨scapula 6肱骨hiimeius 7桡骨radius 8尺骨ulna 9掌骨metacarpal bone 10指骨digital bone 11腰椎lumbar vertebra 12髂骨ilium 13尾骨coccyx 14股骨femur 15髌骨patella 16腓骨fubula 17胫骨tibia 18跖骨metatarsal bone 19趾骨digital bone
图Ⅷ-4头骨侧面The skull. Lateral aspect
图Ⅷ-6下颌骨侧面The mandible. Lateral aspect
1枕骨occipital bone 2顶间骨interparietal bone 3矢状缝sagittal suture 4颧骨malar bone 5上颌骨maxillary bone 6前颌骨premaxillary bone 7枕外嵴external occipital creat 8顶骨parietal bone 9额骨frontal bone 10鼻骨nasal bone 11鼻间缝internasal suture 12前筛孔preethmoid pore 13蝶腭孔sphenopalatine foramen 14门齿 incisor tooth 15下颌骨mandible 16视神经孔optic foramen 17枕骨occipital bone 18茎突styloid process 19外耳道external acoustic meatus 20颞骨temporal bone 21 腭裂patoschisis 22臼齿molar tooth 23腭骨palatine bone 24翼孔pterygoid apertures 25破裂孔foramen lacerum 26枕大孔foramen magnum 27腭后孔posterior palatine foramen 28鼻后孔posterior nasal apertures 29卵圆孔foramen ovale 30鼓骨tympanic bone 31舌下神经孔hypoglossal foramen 32下颌联合mandibular symphysis 33颏孔mental foramen 34冠状突coronoid process 35下颌支ramus of mandible 36角状突process of horn 37下颌孔mandibular foramen 38翼肌窝pterygoid fossa 39髁突condylar process
条件恐惧大鼠模型的行为比较 【摘要】目的探讨不同性别条件恐惧大鼠的恐惧记忆保持和矿场行为是否存在差异。方法利用巴甫洛夫经典条件反射建立声音+电击,建立条件恐惧大鼠模型，于训练前1天及训练后第1、3、7、20天进行恐惧记忆保持测和试旷场测试。结果 (1)恐惧记忆保持测试实验结果显示,雄性大鼠的恐惧记忆保持水平高于雌性大鼠，其僵立时间百分比在个时段均高于雌性大鼠，尤其在训练后训练后1天和训练后20天，雄性性大鼠为67.90±34.74与 27.4±22.51，雌性大鼠为23.60±21.10和3.10±3.07,存在统计学差异（P<0.05）。（2）旷场实验结果显示,除修饰次数外，雌雄大鼠旷场行为比较存在明显统计学差异（P<0.05）。结论雌雄条件恐惧大鼠存在行为学差异。 【关键词】应激恐惧记忆保持旷场行为 创伤后应激障碍（post traumatic stress disorder,PTSD）是指在强烈的精神创伤后发生的一系列心理、生理的应激反应所表现出的一系列临床综合征。 PTSD临床表现多样，从临床症状来看,其核心症状是创伤性记忆的不断闯入导致恐惧情绪、逃避行为和过度唤起的生理反应。有研究表明,社区普通人群中PTSD的终生患病率男性为5%,女性为10.4% 。普通人群中女性的患病率是男性的2倍。制备理想的模型是研究PTSD发生、发展规律机制的一个重要环节。目前PTSD的动物模型，多采用条件恐惧模型。一般认为，雌性动物由于生理周期的影响，在PTSD的动物实验研究中，制备动物模型多采用雄性动物，那么动物雌雄间是否具有差异，未见报道。本研究中依照文献所用的方法[3]，建立条件恐惧大鼠模型，观察雌雄大鼠条件恐惧记忆保持及其行为活动的差异。 1 材料和方法 1.1实验动物与材料 健康成年Sprague-Dawley（SD）大鼠20只，雌雄各10只,体重200±30g,由第三军医大学实验动物中心提供。自制足底电刺激控制箱，该装置由电刺激箱、电压控制仪一季声音发生器组成。旷场行为观察箱为90m×90m×45cm(安徽正华生物仪器设备有限公司提供),底被划分为等面积的25格正方形方格。 1.2实验方法 1.2.1条件恐惧大鼠模型制备 先将大鼠在动物饲养室中适应1周,室温22～25 ℃, 分隔喂养, 自然昼夜节律光照,通风良好, 自由摄食、饮水。期间实验者每天抚摸大鼠5分钟以使动物适应。并将大鼠放入电击箱内10分钟，使其熟悉电击箱并观察大鼠行为。模型制备前一天，进行一次旷场测试。所有的行为实验均在8:00AM- 12:30AM 间进行。 采取声音信号提示结合电击大鼠足底产生条件性恐惧的方法,制造创伤后应激障碍动物模型。将大鼠放入电击箱中，适应3分钟允许自由探索，3分钟之后由扬声器输出声音信号（4.5kHz,80db；条件性刺激，conditioned stimulus CS）；持续30秒，在30秒声音最后两秒同时加以不可逃避的足底电刺激(40V～45V，10秒；非条件性刺激，unconditioned stimulus, US )，反复10次，两次间隔1～4分钟。当给予声音信号，动物出现显著僵立行为或逃避反应，表示声音信号提示的恐惧性条件反射建立。电刺激结束后动物继续在该箱中停留1～4分钟然后放回日常饲养笼中。每只大鼠训练结束取出后及时地清理其排泄物，将电击箱打扫干净，并用90%酒精檫洗箱底。 1.2.2 行为学测定 1.2.2.1恐惧记忆保持测验 主要测定僵立行为（僵立行为是一种普遍见于啮齿类的防御行为，表现为刻板式的蹲伏姿势，大鼠外观除呼吸运动以外其余的肌肉运动均消失，是大鼠恐惧表达的行为方式。于训练后第1、3、7天和训练后20天时观察两组大鼠情感行为改变，将大鼠放入电击箱中，适应3分钟允许自由探索。然后，只予以声音刺激而无电击,其他条件同模型制作时，观察3分钟内大鼠僵立时间，僵立时间之和占总时间的百分比即为僵立时间百分比。间隔0.5-1min 后，重复上操作，连续5次。不同性别条件恐惧大鼠模型的行为比较 1.2.2.2旷场实验(Open-field test ) 于训练前1天及于训练后第1、3、7天和训练后20天时各组大鼠进行旷场实验，实验在安静、光线较暗的环境中进行, 将大鼠轻轻放入旷场行为观察箱中央小方格内，观察3min内大鼠的情感行为情况:①大鼠运动活性：穿行格数, 指三爪以上跨入邻格的次数；②探究行为: 直立次数,指两前爪腾空1cm 以上或攀附墙壁次数； 1.3数据处理 采用SPSS13.0统计软件进行分析，所有数据均由（x-±s）表示，进行t检验确定组间差异，检验结果以P <0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1恐惧记忆保持测验结果 大鼠在重新置入电击箱中呈明显僵立行为。雄性大鼠在不同的时间点僵立时间百分比均明显高于雌性大鼠。尤其在训练后训练后1天和训练后20天差异具统计学意义，结果见表1。 表1 条件恐惧大鼠模型恐惧记忆保持测试僵立百分比() 与雌性比较 * P<0.05
晶须桶皮质增量振荡和伽玛电在清醒小鼠都与呼吸 现有的证据表明增量振荡（0.5-4赫兹）在大脑中被涉及皮质和丘脑电路固有的网络机制产生。在这里，我们报告说，在尖峰和局部场电位（LFP）的活性清醒小鼠的胡须桶状皮层三角洲波段振荡相位锁定到呼吸。此外，LFP振荡伽马频带（30-80赫兹）是振幅调制的相位与呼吸节律。去除嗅球消除呼吸锁定增量振荡和Δ-γ相振幅耦合。我们的研究结果表明这样的呼吸锁定嗅球活性在清醒状态下的胡须桶皮质三角振荡和伽玛功率调制背后的主要驱动力。 振荡神经元的活动是在哺乳动物大脑皮层的普遍现象，可在局部场电位（LFP）和脑电图（EEG）信号1很容易观察到。振荡发生在广泛的频率范围内，包括慢（0.5-8赫兹）增量/ theta和高频伽马射线波段（30-80赫兹）oscillations2。如何振荡的脑活动产生和控制，特别是在低（三角形，0.5-4赫兹） - 频率范围，以及如何振荡涉及行为仅部分understood3。在增量频率范围（0.5-4赫兹）新皮层神经元的振荡被认为是通过包括两个新皮质和丘脑神经元circuits4,5机制所产生的，并与慢波睡眠在人类和动物的通常相关联。然而，在LFP和尖峰活动三角形带振荡活动中的清醒，头部固定mice6-8.At其余晶须桶皮质中也观察到，小鼠呼吸节奏地在1和3HZ之间的频率，其对应于所述差分频率范围神经元振荡。虽然已经示出在行为水平的呼吸和晶须的流动是动态锁相在这个频率band9-11，在桶皮质神经节律是否与呼吸仍未得到研究。 为了检验清醒小鼠呼吸休息时呼吸频率桶皮质三角振荡之间可能存在的联系，我们同时测量呼吸节奏和神经元的活动在清醒的头固定小鼠的胡须桶状皮层。我们发现，在胡须桶状皮层2的增量带神经元振荡。
新生大鼠心肌细胞培养技巧 原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中.我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下： 1新生大鼠鼠龄的选择新 生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳. 2消化酶的选择及使用 新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g?L1,我们使用的为0.8 g?L1.胶原酶最好现用现配. 3消化程度的把握 新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意:(1)转速一般控制在60~80 r?min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化. 4接种的细胞密度 心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个. 5细胞的分散度与接种的均匀性 分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染.