动物固体组织蛋白提取-Protocol
2017-07-18
动物固体组织蛋白提取 Protocol
1、前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也
可放入烤箱中，速度较快。
2、裂解液配制：RIPA：PMSF=100：1，现配现用。
（1000ulRIPA+10ulPMSF）。置入4℃冰
上。
3、抽蛋白（应冰上进行）：
a、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。一般10ml管体系中加入：7-8粒磁珠、100mg组织、1mlRIPA+10ulPMSF、1 tablet Cocktail。
b、匀浆。
手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。
机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。
超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。
反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。 c、将组织匀浆转入1.5ml的EP管中（eppendorf 管、离心管）。12000r/min 4°C 离心
15min。 d、离心后EP管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的EP管中。可-80℃保存。 4、蛋白浓度测定。
a、配工作液：溶液A：溶液B=50：1（200ul：4ul）。
需测试复孔。标本X，则需A量=2*（
X+1+1）*200；B=2*（X+1+1）*4。
c、复孔，取蛋白6ul加入0.6mlEP管，再加入54ulH2O，混匀。即10倍稀释。
d、取20-25ul 10倍稀释蛋白样本加入96孔板平底板内，再加入200ulAB工作液，混匀振荡后，37℃ incubate 30min。
注：应现加蛋白样本，再加工作液。因为每次加蛋白后需换tip，再加入工作液即起反应，应缩短时间。
e、酶标仪检测562nm吸光度。Program
f、计算蛋白浓度。
根据标准曲线，如 Y=1.2745X-0.1684 其中Y：蛋白浓度；X：吸光度。最终蛋白浓度为：10*Y（ug/ul、mg/ml） g、蛋白样本放-80℃冻存。
大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化，这一变化可由分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标
准曲线作比较。博士德为大家提供两种蛋白测定手段，每种都有其独特的优点。如果样品数量较多，可以同时使用两种测定用酶标仪自动检测。当你选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个因素：缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。
Commassie法（Bradford法）：原理：在酸性条件，蛋白质与考马斯染料G-250结合，颜色从棕色变为蓝色，在595nm处检测吸光值然后与标准曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。
BCA法：
原理：在碱性条件下，蛋白将Cu++还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
现对这两种方法进行比较：一、实验材料：
细胞总蛋白提取试剂盒（AR0103） M231
BCA蛋白定量试剂盒（AR0146）
Commassie改良增强型蛋白质定量试剂盒（AR0145）二、操作步骤：Commassie法： 1.将BSA冻干标准品（10mg/支）用生理盐水或PBS稀释成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml八个浓度的蛋白标准溶液。
2.M231用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。
3.各取20ul蛋白标准品和待测M231样品至相应标记的微孔板中。
4.滴加
200ul考马斯增强型试剂（溶液A）至每孔混匀并充分震荡30S 5.停止震荡，在室温孵育样品10min 6.在酶标仪中测量595nm时的吸光值。
7.绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。 BCA法：
1.按50体积BCA试剂A加入1倍体积BCA试剂B配置适量BCA工作液，充分混匀。
2.将BSA冻干标准品（10mg/支）用生理盐水或PBS稀释成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25
ug/ml,15.625 ug/ml八个浓度的蛋白标准溶液。
3.M231用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。
4.各取20ul蛋白标准品和待测M231样品至相应标记的微孔板中。
5.滴加
200ulBCA工作液至每孔混匀并充分震荡30S 6.停止震荡，在37度孵育样品
30min 7.在酶标仪中测量562nm时的吸光值。
8.绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。三、实验结果
其中1到8为2000ug/ml，1000,500,250,125,62.5,31.25,15.625的标准浓度的BSA蛋白，9为空白孔，样品1为8倍稀释M231总蛋白，样品2为32倍稀释M231总蛋白
Commassie法：
为了测试准确，应在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。由标准曲线可以算出样品原始浓度为14.4mg/ml
Commassie法优点是：
1.灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1ug。这是因为蛋白质与染料结合后产生的'颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
2.测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
3.干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
1.由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g―球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
