植物学通报 2004, 21 (1): 61￣65
Chinese Bulletin of Botany
水母雪莲愈伤组织cDNA文库的构建①
１金治平 １赵德修② ２乔传令 １付春祥
1（中国科学院植物研究所北京 100093) 2(中国科学院动物研究所北京 100090）
摘要用TRIZOL Reagent提取水母雪莲红色系1~15 d愈伤组织总RNA，用SMART cDNA Library Construction Kit构建cDNA文库。经测定原始文库滴度达到1.5~4×106，扩增总文库滴度达到1011，重组率达到98%，插入片段在0.5 kb到3 kb之间，多在1 kb左右。通过PCR检测，从总文库中检测到了雪莲CHS、DFR及SmP基因的特异片段。SmP基因是转录调控因子，其表达丰度很低。各项指标都表明，已获得高质量的cDNA文库，为雪莲基因资源保存，雪莲类黄酮次生代谢分子调控奠定了坚实的基础。
关键词水母雪莲, 愈伤组织, cDNA文库
Construction of cDNA Library from the Callus of
Saussrea medusa Maxim
1JIN Zhi-Ping 1ZHAO De-Xiu②2QIAO Chuan-Ling 1FU Chun-Xiang
1(Institute of Botany, the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093)
2(Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100090)
Abstract Total RNA of 1~15 d red line callus of S.medusa was extracted by TRIZOL Reagent. cDNA library was constructed with SMART cDNA Library Construction Kit. The primary library has a high titer from 1.5×106 to 4×106, in which 98% clones are recombinant and the insert cDNAs are from 0.5 kb to 3 kb. The amplified library has a titer of 1011. The positive signals of CHS, DFR and SmP gene were detected by PCR in the amplified library, though SmP gene was expressed at low abundance . This high quality cDNA library provides a useful tool for the study of the molecular mechanisms of the secondary metabolism of the flavonoids of S.medusa.
Key words Saussrea medusa Maxim, Callus, cDNA library
水母雪莲(Saussrea medusa Maxim)是我国珍稀传统中药材，其主要有效成分为类黄酮类次生代谢产物，其中高车前素（hispidulin）和金合欢素（jaceosidin）两种3-脱氧类黄酮具有抗腹水型肝癌等多种功能（韩书亮，1995）。类黄酮生物合成途径是目前研究得比较清楚的次生代谢途径之一（ Koes et al,1994）。该途径的大多数关键酶基因都已被克隆，尤其是能对多个关键酶基因同时进行调控的转录调控因子C1、R、P等基因也被克隆并已在玉米的类黄酮生物合成
①国家自然科学基金资助项目(No.39970896);中国科学院知识创新项目(No.KSCXI-09)。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: zhaodx@https://www.doczj.com/doc/7113388583.html,
作者简介：金治平，中国科学院植物研究所2000级博士生。赵德修，中国科学院植物研究所研究员，博士生导师。长期从事植物次生代谢研究。
收稿日期：2002-12-29 接受日期：2003-07-07 责任编辑：孙冬花
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调控中取得成功（Paz-Ares et al, 1987; Roth et al,1991; Grotewold et al，1998），为研究类黄酮次生代谢的分子调控奠定了基础。本研究以水母雪莲红色系愈伤组织为材料，构建cDNA文库，为保存雪莲基因资源，分离克隆雪莲类黄酮生物合成途径中的关键酶基因如CHS (chalcone synthase)、DFR (dihydroflavonol 4-reductase)等及调控该途径的R2R3-Myb转录调控因子SmP（S. medusa Myb-related P gene）基因，及开发雪莲有效成分与相关基础研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
建库所用水母雪莲（S. medusa）1~15 d愈伤组织红色系为本实验室保存。文库构建试剂盒SMART cDNA Library Construction Kit (Catlog# : K1051-1)购自CLOTECH公司，包装蛋白Packagene Lambda DNA Packaging System 购自PROMEGA公司，RNA提取试剂TRIZOL Reagent购自GIBCO 公司，其他常规试剂及耗材均为国产。
1.2 引物设计
检测文库插入片段大小的PCR引物根据文库载体λTripIEx2的MCS位点已知序列设计：Pλ1 5＇- AAG CGC GCC ATT GTG TTG - 3＇
Pλ2 5＇- AAG TGA GCT CGA ATT GCG G - 3＇
检测文库覆盖度的三对基因特异引物都是根据雪莲CHS、DFR、SmP基因的特异探针(本实验室克隆，将另文发表)设计：
P CHS1 5＇- GGC ATT AAG GAA TGG GGC A - 3＇
P CHS2 5＇- GCA ACC CTG CTG ATA CAT CAT - 3＇
P DFR1 5＇- GAG AAT GAA GTG ATC AAA CC - 3＇
P DFR2 5＇- AAA ATA CAT CCA TCC GGT CAT - 3＇
P SmP1 5＇- CAT GTC GGT TGA GTT GGG TG - 3＇
P SmP2 5＇- CGT TGT CAC TTC TTC CAG GCA - 3＇
1.3 方法
1.3.1 总RNA的提取取雪莲愈伤组织红色系1~15 d细胞，每天50 mg，混合共计750 mg，加入液氮迅速研磨后，立即加入8 mL TRIZOL Reagent，待解冻混匀后，分装到8个DEPC处理的1.5 mL离心管中，接下来的操作参照TRIZOL Reagent说明书进行。用75%乙醇洗涤后，取一管RNA用DEPC处理的水溶解，分成三份，第一份用于检测RNA的纯度及含量，将第二份置于37℃下保育2 h后，再与第三份做非变性琼脂糖电泳，检测RNA的完整性和稳定性。
1.3.2 cDNA第一链的合成与LD-PCR（long distance PCR）取2 μL（约1.5 μg）总RNA，参照试剂盒操作程序做反转录及LD-PCR。取5 μL LD-PCR产物，1.1%TAE胶电泳检测。
1.3.3 cDNA的纯化与回收参照试剂盒操作程序，取50 μL LD-PCR产物，加入2 μL蛋白酶K （20 μg/μL），于45℃保育20 min消化残存的Taq酶。纯化回收cDNA，用SfiⅠ于50℃酶切2 h产生粘性末端。将酶切产物过CHROMA SPIN-400柱，每管过柱收集物取3 μL电泳检测，回收500 bp以上的cDNA片段。
1.3.4 cDNA与λTripIEx2的连接与包装参照试剂盒要求分别取0.5 μL、1.0 μL、1.5 μL cDNA 与1 μLλTripIEx2载体设置三个试连接反应，16℃下连接过夜，22℃包装3 h，每管中加225 μL
６３２００４金治平等：水母雪莲愈伤组织cDNA 文库的构建1×λdilution buffer 与12.5 μL 氯仿，混匀后高速离心分层，获得原始文库。测定三个试连接滴度后，按最高滴度试连接的cDNA 与载体比例，放大连接和包装。
1.3.5 文库质量评价
1.3.5.1 原始文库与扩增文库滴度测定 取5 μL 原始文库做10倍梯度稀释，测定原始文库滴度。按每个12 cm 平板5×104个独立克隆扩增原始文库。单独收集每个平板的裂解物，加入少许氯仿，混匀后7500 r/min 离心10 min ，取上清作为一个亚文库，每个亚文库取1 mL 混匀为总文库。取5 μL 总文库做梯度稀释，测定总文库滴度。每个亚文库及总文库各取1 mL 保存于4℃随时备用，其余的均加入7%DMSO ，保存于－70℃。
1.3.5.2 文库插入片段大小及重组率检测 从原始文库中随机挑选50个单噬菌斑与100 μL 1×λdilution buffer 中，振荡洗脱，于4℃冰箱中过夜。取3 μL 洗脱物为模板，以P λ1和P λ2为引物，做PCR 检测插入片段大小并估计文库重组率。扩增条件：在95℃变性10 min 裂解噬菌体后，再加入PCR 反应混合物，并按以下程序扩增：94℃预变性4 min ；94℃变性1 min ，56℃退火1 min ，72℃延伸4 min ，25循环；72℃延伸10 min 。
1.3.5.3 从扩增总文库中检测目的基因 三个特异基因检测都采用Touch down PCR ，并以各自片段克隆质粒为阳性对照，用相同的扩增条件：在95℃变性10 min 裂解噬菌体，加入PCR 反应混合物，并按以下程序扩增：94℃变性4 min ；94℃变性1 min ，65~50℃退火1 min ，每循环退火温度下降0.5℃，72℃延伸1 min ，30循环；94℃变性1 min ，50℃退火1 min ，72℃延伸1min ，15循环；72℃延伸5 min 。
图1 RNA （A ）与 LD-PCR cDNA （B ）电泳检测1.总RNA; 2.在37℃下温浴2 h 的总RNA;M. 1 kbDNA 分子标记; SM.雪莲cDNA ；CK. 人胎盘cDNA Fig.1 Total RNA from S. medusa （A ）and LD-PCR cDNA （B ） on 1.1% agarose 1.Total RNA; 2. Total RNA incubated at 37℃ for 2 h; M. 1 kb DNA ladder; SM.cDNA of S. medusa ; CK. Human placenta
cDNA
2 实验结果
2.1 RNA 的提取
在非变性胶中， 28S rRNA 与18S rRNA 的比例约为
2左右，没有明显的5S rRNA ，总RNA 的完整性良好
（图1A ）。测得A 260/A 280=1.863，表明RNA 的纯度很
高。RNA 于37℃下保育2 h （图1A,2），与对照（图
1A,1）无明显的差异，表明RNA 的稳定性良好，完全
符合建库要求。
2.2 cDNA 第一链合成及LD-PCR
LD-PCR 产物主要集中在0.4~3.0 kb 之间，在
0.4 kb 、0.6 kb 及接近1 kb 处有较清晰的丰富带的产生(图
1B)。由于植物的mRNA 相对而言较短，因此，在这个
范围内的cDNA 是比较完整的。
2.3 cDNA 的纯化与回收
过柱分离的cDNA 片段主要集中于第六到第九
管中，但第十管中已有十分明显的＜500 bp 的小片
段，因此收集并回收第六到第九管的cDNA ，用于
连接实验。
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3 讨论
构建cDNA 文库的关键是要保证文库的完整性与覆盖度。本实验采用CLONTECH 公司的SMART TM cDNA Library Construction Kit 试剂盒及SMART （Switching Mechanism At 5＇end of RNA Transcript ）技术，构建了高质量的水母雪莲cDNA 文库。SMART 技术可以以微量的总RNA （＞50 ng ）为起始材料，利用反转录酶的SMART 特性（在mRNA 反转录结束时会自动在第一链cDNA 末端添加3个C 的特性），自动地将两端接头同时加在cDNA 上，避免了mRNA 的纯化、cDNA 第二链合成、甲基化、接头平端连接等繁琐的操作，大大简化了建库程序，并减少了RNA 降解的机会，可以有效地保证cDNA 的完整性。水母雪莲cDNA 文库重组率达到98%，插入片段最大可达3 kb ，并从文库中检测到了类黄酮生物合成中的关键酶基因CHS 、DFR 图3 文库特异基因检测
M. 100 bp DNA 分子标记; +CK. 阳性对照;－CK. 阴性对照; CHS. 查尔酮合酶DFR. 二氢黄酮醇-4-还原酶; SmP . 水母雪莲Myb 相关P 基因
Fig.3 Gene special detection of the library M. 100 bp DNA Ladder; +CK. Positive control;-CK. Negative control; CHS. chalcone synthase;DFR. Dihydroflavonol 4-reductase; SmP . S. medusa
Myb-related P gene 图2 cDNA 文库插入片段大小及重组率检测
M. 1 kb DNA 分子标记; -CK. 阴性对照; 1~21. 单噬菌斑编号
Fig.2 Detection of inserts of the library and the combining rate M. 1 kb DNA ladder; -CK. Negative control; 1~21. The number of single plaques
2.4 cDNA 文库的质量评价
三个试连接的原始文库滴度分别为1.5×
106、3.2×106、2.6×106 ，放大连接的原始文
库滴度达到4×106。扩增总文库滴度接近
1011。文库插入片段在0.5 kb 到3 kb 之间，1 kb
以上的占62%（图2），最大片段约为3 kb （图
2未显示）。重组率达到98%。
以雪莲CHS 、DFR 、Myb 转录调控因子SmP
基因的特异引物从总文库中分别扩增出了169
bp 、208 bp 、150 bp 的带，并与各自的阳性对照
相同（图3）。CHS 与DFR 是雪莲类黄酮生物合
成中的两个关键酶基因，它们的表达量较高，但SmP 基因是Myb 转录调控因子，其表达量大约为10-6~10-5(金治平等，2003)，仍能检测到阳
性，这表明文库的覆盖率很高，足以获得目的基因。以上各指标都表明已获得高质量的cDNA 文库。
６５２００４金治平等：水母雪莲愈伤组织cDNA文库的构建
和对植物次生代谢有重要调控作用的R2R3 Myb 转录调控因子SmP基因，不仅可以保存珍稀植物水母雪莲的基因资源，而且为克隆雪莲类黄酮代谢途径中的主要基因并进一步对该代谢途径进行分子调控打下了坚实的基础。用噬菌体直接做模板以目的基因的特异引物进行扩增，可以检测到强阳性信号，这为用PCR对文库进行筛选提供了可能性（Isola et al，1991）。
参考文献
金治平，赵德修，乔传令，瞿文全，陈亚琼，付春祥,2003.水母雪莲Myb转录调控因子SmP基因的克隆及序列分析，生物工程学报，19：368~371
韩书亮, 1995. 大苞雪莲四种成分抗癌作用分析. 癌变畸变突变，7 (2): 80~83
Grotewold E , Chamberlin M , Snook M , Siame B , Butler L , Swenson J , Maddock S, Clair G S, Bowen B, 1998.
Engineering secondary metabolism in maize cells by ectopic expression of transcription factors. The Plant Cell, 10:721~740
Isola N R , Harn H J, Cooper D L, 1991. Screening recombinant DNA libraries: a rapid and efficient method for isolating cDNA clones utilizing the PCR. Biotechnol Tech,11:580~582
Koes R E , Quattrocchio F, Mol J N M, 1994. The flavonoid biosynthetic pathway in plants: function and evolution.
BioEssays, 16(12): 123~132
Paz-Ares J , Ghosal D , Wienand U , Peterson P A, Saedler H, 1987. The regulatory c1 locus of Zea mays encodes a protein with homology to myb proto-oncogene products and with structural similarities to transcriptional activators. EMBO J, 6: 3553~3558
Roth B A , Goff S A , Klein T M , Fromm M E, 1991. C1-and R-dependent expression of the Maize Bz1 gene requires sequences with homology to mammalian myb and myc binding sites. The Plant Cell, 3: 317~325
青海湖环湖地区生物多样性保护现状 青海湖国家级自然保护区位于青藏高原东北部，地理位置为东经97°53′—101°13′，北纬36°28′—38°25′之间，地域上涉及海北藏族自治州的刚察、海晏两县和海南藏族自治州的共和县，总面积495200 hm2，范围包括青海湖整个水域及鸟类栖息的岛屿和湖岸湿地。湖面海拔3193m，湖体东西长 104km，南北宽68km，水域面积431700hm2。1992年被列入《关于特别是作为水禽栖息地的国际重要湿地公约（拉姆萨公约）》国际重要湿地名录 青海湖国家自然保护区规划以青海湖为主体，包括湖周的湿地、沼泽等所有鸟类栖息、活动的地段，保护目标是青海湖的水鸟，核心区在鸟禽的重点栖息地、繁育地，包括鸟岛、海心山、三块石、沙岛、泉湾的鸟类栖息地，其它为缓冲区。在鸟岛保护区中，实际控制区仅仅在鸟岛和湖中的鸟类栖息地，即只是鸟类在湖中的核心活动区。只占青海湖地区生态系统类型中的湖水及湖周水漫滩生态系统很小的一部分。 青海湖环湖地区具有代表性的生态系统类型得到保护。保护区至少应包括沙漠生态系统、高寒灌丛、高寒草甸等生态系统的代表性地段。从保护区的功能来看，湖水周围的生态系统的健康持续发展是湖区热点地区得到真正保护的基础。所以青海湖环湖自然保护区有必要将整个青海湖流域的部分作为保护
区，而保护区的核心系统应该包括各个自然生态系统。从物种多样性来看，湖周地区是脊椎动物种类较多的地区，在鸟类方面，具有全球意义，所以需要进行重点保护。另一方面，从物种特有性来分析，国家I级保护动物普氏原羚在青海湖的东面、东北和鸟岛有分布，在青海湖湖周山地草原和山地荒漠是普氏原羚的活动地区，在鸟岛有普氏原羚活动，由于被围栏的核心区内面积太小，加上狼的捕杀，普氏原羚数量越来越少。普氏原羚的其它活动区由于围栏与过度放牧对其生存造成极大威胁，所以在建立自然保护区的重点保护地区（即核心区）时是必须考虑的。高寒灌丛动物和高山草甸和高山裸岩动物中有多种国家 I 级保护动物和青藏高原特有动物，在进行保护区设计时，应该将这些地区包括在自然保护区内的重点保护之内。 根据自然植被类型、动植物物种的分布与人类活动影响，青海湖环湖地区可以分为以下几种生态系统类型。 一、湖区水域及湖周水漫滩生态系统 包括青海湖水体、湖中岛屿、入湖河口、湖湾及沼泽地带。海拔在3190～3300m之间。湖体水生植物发育不良，主要是蓖齿眼子菜和莎草科的个别属。水草丰美，丰富的动植物种类，为脊椎动物栖息、分布、繁殖提供了丰富的食物来源和栖息场所。湖中的鱼类有裸鲤（湟鱼）、硬刺高原鳅和隆头高原鳅。鸟类种类多，数量大，构成青海湖鸟类主要群落。有雁鸭类、
扎如沟生态旅游攻略1、地理位置、范围
扎如沟是九寨沟的一条支流，位于九寨沟东北角偏北方向。地理位置约介于东经103016′—104050′，北纬33011′—33020′之间。南北长约17公里，东西宽14公里。东以白河自然保护区区界和勿角自然保护区区界为界，南以扎如沟主沟源头分水岭为界，西以扎如沟和九寨沟主沟交汇处为界，北以扎如沟北面大山脊为界，开发总面积106Km2。扎如沟主沟水流方向自西南向东北方向汇入九寨沟主沟内。 2、地质地貌 （1）、地质构造 扎如沟流域位于白马弧形构造带西缘隆康倒转复背斜和日则复背斜之间。后者的西南翼构成扎如沟东北侧的山岭和谷地岩层，前者的西北翼构成扎如沟西南侧的山岭和谷地岩层。第四纪以来的新构造运动，具有继承性强烈抬升。第四纪冰后期以来，地壳至少抬升了600—800m，河流急剧下切，从而形成了今日之高山深切峡谷地貌。（2）、气候、水文特征 扎如沟内气候表现为气候温和、降水适中的冷凉干燥季风气候特征。在海拔为2026m扎如沟口，年平均气温为9.3℃，一月极端最低气温-16.4℃，七月极端最高气温32.4℃，年降雨量706.7mm，降雨集中在5—9月，丰水期和枯水期河流地表径流水位变化大。太阳总辐射量为每年115cal/cm2，年日照时数为1800h左右。蒸发量大于降水量。
扎如沟流域面积106Km2，主沟长22.6Km，沟口海拔2026m，最高峰扎依扎嘎海拔4528m，最大相对高差2502m。河网密度较低，约0.31Km2/20m，河谷宽深比为2.75：1—2.83：1，地貌侵蚀力系数高达498.5。水质类型属HCO3-—Ca++—Mg++型，即重碳酸盐类钙镁软水，且属于冷水，水的矿化度不高，小于0.5g/l，PH值介于7.5—8.8之间，呈碱性。 3、生物资源 （1）植物： 由于扎如沟未开展过旅游活动，植被垂直分布明显，自然植被保存完好，已定名植物有七百多种。海拔2500米下为温性针叶林带，植被类型主要有油松纯林和油松、辽东栎混交林，此带为居民点和原农耕地集中分布区。2500米—2800米为针阔混交林带，其下部油松常居优势，并与华山松、紫果云杉及粗枝云杉等混交成林。阔叶树种多见五角枫、红桦、白桦、辽东栎与花揪等。海拔2800—3500米为寒温性针叶林带，主要树种为岷江冷杉，向阳地段与有粗枝云杉、鳞皮云杉、紫果云杉相杂，阔叶树种以红桦为主。海拔3500米—4300米为高山灌丛草甸，由低矮、耐寒、耐旱的木本及草本植物组成，常见灌木有小叶杜鹃、高山柳、高山柏、鲜卑花、蚤缀、甘肃锦鸡儿等，草本有园穗蓼、珠芽蓼、高原毛茛、多种风毛菊、毛莲蒿、苔草等组成。海拔4000米以上由寒冻风化强烈、坡陡土瘠，植被不甚发育，
雪莲培养物 一、来源 1、野生雪莲 国家重点保护野生植物2级、国家重点保护野生药材物种名录3级，禁止采摘 2、人工栽培雪莲 1）培植难度大、生长缓慢； 2）成活率低、质量差； 3）成本高，物种退化严重 3、雪莲细胞培养——技术成熟、安全可靠 雪莲培养物，是在无菌条件下，将雪莲离体的植物器官、组织、细胞、胚胎或原生质体培养在人工配制的培养基上，在人工控制的条件下进行培养，使其组织或细胞增值进而按照需要进行培养的技术；或使其脱分化产生愈伤组织，并再逐步分化出器官并长成完整的植株而生产的培养物。 二、营养成分 天山雪莲培养物是甄选最佳的野生天山雪莲种子，在人工控制的条件下进行细胞培养的新资源食品，经检测含有黄酮、多糖、绿原酸、紫丁香甙等功效成分，具有与野生天山雪莲相似的成分和药效。雪莲培养物可应用于功能食品(固体饮料、压片糖果、高档饮品、养生酒等)、保健食品(片剂、胶囊、冲剂、口服液、保健酒等)、日化品(防晒霜、祛斑霜、美容霜、精华素、牙膏等)及医药(口服制剂、药酒、风湿消痛贴、妇科护垫等)等。 三、功效作用
研究结果标明雪莲培养物具有抗风湿、消炎、镇痛作用；雪莲培养物具有抑制非特异性免疫、细胞免疫以及增强体液免疫的功能，即具有免疫调节作用；雪莲培养物的水溶性多糖对氧自由基和羟自由基都具有明显的清除作用，是一种清除自由基良好的抗氧化剂；雪莲培养物具有抗辐射作用等。参考文献： 1、天山雪莲的开发与应用，新疆中医药，贾丽华，2016,34(1):126-128. 2、赵晓玫.雪莲培养物的抗炎镇痛作用研究【J】.北方药学，2012,9（3）： 50-51. 3、赵晓玫.天山雪莲培养物的抗辐射作用研究【J】.中外医疗， 2012,8:26-27. 4、张柏青.天山雪莲培养物对小鼠运动后血乳酸和肝糖原含量的影响 【J】.中国医药指南，2012,3,10（7）：94-95. 5、赵晓玫.天山雪莲培养物抗疲劳作用的研究【J】.中外医疗，2012,7:30. 6、贾景明.天山雪莲培养物的毒性实验研究【J】.中国民族医药杂志， 2007,3（3）：52-55.
雪莲花的特性有什么 雪莲花高贵优雅，很多人恐怕都对这种植物感到好奇，想要知道这种植物到底怎么样，雪莲有着适应高山环境的生物学特性，它叶极密状如白色长绵毛，宛若绵球，绵毛交织，形成了无数的“小室”室中的气体难以与外界交换，白天在阳光的直接照射下，它比周围的土壤和空气所吸收的热量要大，那么雪莲花的特性有什么呢？ 雪莲西藏境内有下列7种：（1）喜马拉雅雪莲，产亚东、聂拉木；（2）三指雪莲，产八宿、波密、加查、错那和亚东；（3）绵头雪莲，产乃东和错那；（4）小果雪莲，产申札、南木林、仲巴、普兰、札达；（5）错那雪莲，特产错那；（6）丛生雪莲，产吉隆；（7）水母雪莲，广布全区。以上7种，全草均可入药，有祛寒、壮阳、补血和暖宫之功能；主治妇女病、风湿性关节炎及肾虚、腰痛等症，水母雪莲还有强心作用。 雪莲花主要指菊科风毛菊属多肉植物，又名新疆雪莲、天山雪莲、高山雪莲。它是难得一见的奇花异草。雪莲花的形态特征你了解吗？下面小编带大家来看看雪莲花的神奇功效。 整体特征 雪莲花多年生草本，高15-35厘米。根状茎粗，颈部有多数褐色的叶残迹。茎粗壮，基部直径2-3厘米，无毛。 叶片特征 雪莲花的叶密集，基生叶和茎生叶无柄，叶片椭圆形或卵
状椭圆形，长达14厘米，宽2-3.5厘米，顶端钝或急尖，基部下延，边缘有尖齿，两面无毛；最上部叶苞叶状，膜质，淡黄色，宽卵形，长5.5-7厘米，宽2-7厘米，包围总花序，边缘有尖齿。 花朵特征 头状花序10-20个，在茎顶密集成球形的总花序，无小花梗或有短小花梗。总苞半球形，直径1厘米；雪莲花总苞片3-4层，边缘或全部紫褐色，先端急尖，外层稀疏的长柔毛，外层长圆形，长1.1厘米，宽5毫米，中层及内层披针形，长1.5-1.8厘米，宽2毫米。小花紫色，长1.6厘米，管部长7毫米，檐部长9毫米。 瘦果特征 瘦果长圆形，长3毫米。冠毛污白色，2层，外层小，糙毛状，长3毫米，内层长，羽毛状，长1.5厘米。雪莲花的花果期7-9月。 雪莲的有很多特性，相信大家对他已有了深刻的了解，雪莲的它的不可攀，而让人向往，它也有很多的功效，不像其他花一样，需要经受高山的寒冷，在于没雪莲的这种适应高山环境的特性是它长期在高山寒冷和干旱的条件下形成的。雪莲的不怕寒冷的优点，雪莲就是靠这种抗寒特性，生存于高寒山中。
雪莲培养物干品 1 范围 本标准适用于以选取雪莲离体组织，经脱分化形成的愈伤组织作为继代种子，给予一定条件进行继代培养而获得的团块状颗粒，该颗粒经干燥粉碎得到的粉末。 2 规范性引用文件 本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 3 技术要求 3.1 原料要求 雪莲培养物应符合相应的食品标准和有关规定。 3.2 生产用水 应符合GB 5749的要求。 3.3 感官要求 感官要求应符合表1的规定。 表1 感官要求 3.4 理化指标 理化指标应符合表2的规定。 表2 理化指标 3.5 污染物限量 污染物限量应符合表3的规定。 表3 污染物限量
3.6 微生物限量 3.6.1 致病菌限量应符合GB 29921中的规定。 3.6.2 微生物限量还应符合表4的规定。 表4 微生物限量 3.7 食品添加剂 食品添加剂的使用应符合GB 2760的规定。 4其他 4.1 产品标签应符合GB 7718、GB 28050的规定。 4.2食用量：干品≤4 克/天；不适宜人群：婴幼儿、孕妇。
附录A （规范性附录） 雪莲培养物干品总黄酮的测定方法 A.1 方法提要 黄酮类化合物母核中含有碱性氧原子，一般又多带酚羟基，能和铝离子产生黄色络合物，又加入亚硝酸钠和氢氧化钠，使在碱性溶液中呈红色，溶液在510nm 处有最大吸收。芦丁是最为常见的黄酮类化合物，选用芦丁作为对照品，用硝酸铝作为黄酮类比色测定的显色剂，吸光度与芦丁的浓度呈线形关系，采用分光光度法对总黄酮进行含量测定。 A.2 试剂 本方法所用试剂除特殊注明外，均为分析纯；所用水为纯化水。 A.2.1 70%乙醇溶液 A.2.2 4%氢氧化钠溶液 称取4.0 g氢氧化钠，用水溶解后定容至100 mL。 A.2.3 5%亚硝酸钠溶液 称取5.0 g亚硝酸钠，用水溶解后定容至100 mL。 A.2.4 10%硝酸铝溶液 称取10.0 g硝酸铝，用水溶解后定容至100 mL。 A.2.5 芦丁标准溶液 取芦丁对照品适量，精密称定，加70%乙醇适量，超声溶解，放冷，加70%乙醇定容，制得质量浓度为1mg/ml的芦丁标准液（芦丁标准品供UV法测定，含量按说明书折算）。 A.3仪器与设备 A.3.1 分光光度计。 A.3.2 容量瓶：10 mL、100mL。 A.3.3 分析天平：感量为0.1 mg。 A.4分析步骤 A.4.1 试样的制备 取本品约0.1克（干品），精密称定，置于100ml磨口三角烧瓶中，加70%乙醇40ml，加热回流提取1h，趁热滤过，滤于100ml容量瓶中，残渣再加40ml 70%乙醇加热回流30min，趁热滤过，合并滤液，用少量70%乙醇洗涤残渣与容器，洗液并入容量瓶中，再加70%乙醇稀释至刻度，摇匀。 A.4.2 标准曲线的制备
雪莲的药用价值很高，它主要产于新疆天山。 一、风湿性关节炎、妇女小腹冷痛、闭经，胎衣不下，雪莲15克水煎服，每日二次，连服数日；雪莲15克，黄酒或白酒200克，浸泡7天，口服2次每次20毫升。 二、妇女崩漏，雪莲6克，党参12克，炖鸡服。 三、男子阳萎，雪莲6克，当归、枸杞各3克，水煎服；雪莲15克，冬虫夏草6克，白酒2000毫升，泡一月，口服二次，每次20毫升。 四、肩肘炎、腰腿病，雪莲50克，腹蛇一条，白酒1000毫升，泡一个月，每次10毫升，每日二次。 五、雪莲花6克，浸入1000克白酒或黄酒中，密封浸泡30日后服用。每次饮30-40毫升。有补肾阳、强筋骨之功效。 六、雪莲花6克，装入纱布袋内扎口，老母鸡一只，加水文火炖1.5小时，滤出药液约100克，每饮30-40毫升。调筋补血、滋阴补肾。 七、雪莲花5克，党参15克，苁蓉10克，红花5克，鸡肉1000克。上药洗净，同装入纱布袋内扎口将鸡肉与药袋同下锅，文火炖2-3小时，滤出药液约1500克，每次适量。温肾壮阳、补中益气。 八、外伤出血，雪莲适量敷患处。 一、雪莲的形态特征： 雪莲为多年生草本植物，高15－25（－35）厘米；根状茎粗，黑褐色，基部残存多数棕褐色枯叶柄纤维；茎单生，直立，中空，直径2－4厘米，无毛。叶密集，近革质，绿色，叶片长圆形或卵状长圆形，长约14厘米，宽2－4厘米，先端钝或微尖，基部下延，边缘有稀疏小锯齿，具乳头状腺毛，最上部苞叶13一17，膜质透明，淡黄色，边缘具整齐的疏齿，稍被腺毛，先端钝尖，基部收缩，常超出花序2倍。头状花序10－30，聚集于茎端呈球状；总苞半球形，总苞片3－4层，近膜质，披针形，急尖，边缘黑色，彼毛；花蕊紫色，长约14毫米。瘦果长圆形，具纵肋；冠毛2层，外层短，糙毛状，内层长，羽毛状。雪莲不是雪莲果。 二、雪莲特性： 雪莲通常生长在高山雪线以下。气候多变，冷热无常，雨雪交替，最高月平均温3--5℃，最低月平均温-l9---21℃，年降水量约800毫米，无霜期仅有50天左右。土壤以高山草甸土为主，有机质含量为8.5--11％，含氮量4.5--10％。由于环境条件恶劣，一般植物难以生长，只有少数耐寒、耐低温的苔草属 Carex spp.，嵩草属 Kobresia spp．和各种高山多年生草本植物与之伴生。雪莲在这种高山严酷条件下，生长缓慢，至少4--5年后才能开花结果。但是，由于生长期短，它能在较短的时间内迅速发芽、生长、开花和结果。花期7月，果期8月。（西藏nb的东西真是多！） 三、生长环境 雪莲种子在零摄氏度发芽，三到五摄氏度生长。幼苗能经受零下二十一摄氏度的严寒。在生长期不到两个月的环境里，高度却能超过其他植物的五到七倍，它虽然要五年才能开花，但实际生长天数只有八个月。这在生物学上也是相当独特的。雪莲形态娇艳，这也许是风云多变的复杂气候的结晶吧！它根黑、叶绿、苞白、花红，恰似神话中红盔素铠。绿甲皂靴。手持利剑的白娘子，屹立于冰峰悬崖。狂风暴雪之处，构成一幅雪涌金山寺的绝妙画图。 关于雪莲的形态和生境，贾树模一九三六年在《新疆杂记》中就有这样的描述：“ 雪莲为菊科草本……生雪山深处，产拜城、哈密山中”雪莲在医药上应用以有数百年的历史。汉族人民多视为治疗风湿关节炎之珍品；维吾尔、哈萨克族则当作妇科良药。雪莲种类繁多，如水母雪莲。毛头雪莲、绵头雪莲、西藏雪莲等。新疆雪莲，在《本草纲目拾遗》的记载中被视为正品。以天池一带的博格达峰所产者，质量最佳，并
CDNA文库 1. CDNA文库中重组DNA片断得原始供体来源与细胞中表达出得mRNA,将某一特定类型细胞表达得mrna经反转录酶催化形成与之互补得CDNA，重组克隆后得到得CDNA文库有各自不同得适合范围。CDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组得表达状态以及表达基因得功能鉴定方面具有特殊得优势，从而使它在个体发育，细胞分化，细胞周期调控 2. CDNA文库得质量 （1）文库的代表性 CDNA文库的代表性是指文库中包含得重组CDNA分子是否能完整地反映出来原细胞中表达地全部信息（即mrna种类），它是体现文库质量地最重要标本。文库地库容量，它是指构建建出地原始CDNA文库中包含地独立地重组子克隆数。具备完全好代表性地CDNA文库需要满足地库容量取决与来源细胞中表达出地基因序列地总复杂程度。具体来就是来源细胞中表达出地mrna种类和每种MRNA序列地拷贝数 N=ln(1-p)/ln(1-n/t)，P为文库中包含细胞中任何一种mrna序列信息地概率，通常设为99％，N为文库中P概率出现细胞中任何一种mrna序列理论上应具有地最少重组克隆数，n为细胞中最稀少地mrna序列地拷贝数，t为细胞中表达出地所有mrna地总拷贝数，以人类细胞为列，人类基因组携带地遗传基因总数约为100000种，具体到某一特定类型地细胞中，表达出地基因种类仅为基因组全部基因地15％。因此对于巨大部分地人类细胞，每个细胞内具体表达地mrna种类约为15000种，全体mrna序列地总拷贝约为500000个，而细胞中稀少地mrna种类地拷贝数平均为8个。因此，用人类细胞来构建CDNA文库时候，要以99％概率保证文库中包含有细胞表达地任何一种mrna地序列信息，构建出地原始CDNA文库理论上应具有地最少独立克隆数为 N=ln(1_99%)/ln(1-8/500000)=2.9*10(5) 一个具有完好代表性地CDNA文库至少具有10（6）以上的库容量 3．MRNA是由5‘端非编码区，中间地编码序列和3’端非翻译区。非翻译区地序列特征对基因地表达具有重要地调控作用，其中编码产生地蛋白质产物都具有在结构上相对独立地结构域，存在与同一分子上地结构域对体现出蛋白产物在细胞中所行使地生物学功能。因此要从CDNA文库中分离获得目的基因完整地序列信息和功能信息，要求文库中地重组CDNA片断应尽可能完整获得目的基因结构 4．构建文库的载体系统 （1）入噬菌体载体系统是在CDNA文库构建中最早使用地载体系统，在载体本身地设计方面已经相当成熟，其主要优点是插入片断地装载容量大，适合与全长CDNA地克隆。重组子经专门地体外包装系统包装成有感染力地噬菌体颗粒，对宿主大肠杆菌地转染效率高，通常1ugCNDA构建出地CDNA文库，转染宿主菌后，都可以得到10（6）－10（7）以上地原始库容量，同时对重组克隆是否含有CDNA文库地插入片断地实际情况，有较好地质量控制指标，因此用这类载体地系统构建地CDNA文库质量高，代表性好，此外这类载体系统构建出地CDNA文库以重组噬菌体颗粒形式存在，这些重组噬菌体颗粒地感染活性在4度环境比较稳定，非常适合长期保存，但是可以采用地文库筛选方法很有限，文库中地CDNA 片断在宿主细胞无法功能性表达。 （2）质粒载体系统 可以功能性筛选：利用基因在体内体现其生物学活性所依据地生化基础，从文库中分离鉴定
藏药种类 从有关资料的统计来看，目前我国有藏药3000种左右，西藏是藏医药的发源地，藏药应用历史悠久。这一地区常用藏药有360多种，主要来源于菊科、豆科、毛莨科、罂粟科、伞形科、龙胆科、蔷薇科、玄参科、十字花科和百合科等植物，重要的药用属有：绿绒蒿属、马先蒿属、紫堇属、报春花属和虎耳草属等。常用藏药中，含生物碱的种类约占50%，这些活性较强的成分多见于乌头属、翠雀属、唐松草属、莨菪属、槐属、龙胆属和小檗属等药用植物。例如，大黄是一味重要的藏药，青藏高原分布大黄属植物28种，其中藏药应用的有21种，藏药用大黄分为上、中、下三品：上品（君母札）的种除掌叶大黄、唐古特大黄之外，尚有藏边大黄、喜马拉雅大黄、塔黄，西藏大黄等，青海、甘肃等地还用波叶大黄；中品（曲什札）有穗花大黄、歧穗大黄、长穗大黄、网脉大黄、心叶大黄、红脉大黄、卵叶大黄；下品（曲玛札）有小大黄。 目前，藏药已制定了统一的用药规范，即由西藏、青海、四川、甘肃、云南、新疆等6省区合编的《藏药标准》，共收载藏药227种，其中植物类197种、动物类17种、矿物类13种，主要种有：藏茴香、山莨菪、藏党参、藏紫草、水母雪莲花、唐古特红景天、堪巴色宝（阿氏蒿）、曲玛孜（打箭菊）、达玛（凝花杜鹃）、野牛心、秃鹫、紫草茸、紫胶虫等。藏药资源丰富，分布在青藏高原藏胞居住的广大地区，并为很多藏医药文献所收录。 藏药主要分布于青藏高原。这里具有复杂而独特的自然条件，形成了丰富多彩的植物资源种类，从藏东南的热带季雨林到藏北茫茫无际的草原，依次分布着能反映热带、亚热带、温带、寒带的植物种类，据资料记载藏区维管束植物种类达6144种，居于全国第四位。有史以来，藏区就是我国药用植物的一大宝库，据初步统计，野生药用植物资源有千种以上，其中冬虫夏草、贝母、三七、天麻、灵芝等为畅销国内外的名贵药材；海南粗榧、红豆杉、鬼臼、八角莲、软紫草、纤细雀梅藤、野百合等为一类有开发潜力的抗癌药用植物。此外，还有传统中药砂仁、钩藤、秦艽、丹皮、木瓜、重楼、麻黄、桃仁、黄连、柴胡、当归、黄芪、龙胆、党参、乌头、大黄、三颗针、雪莲花、五昧子等各类药材。 藏药学理论及用药原则 藏医学理论认为药物与五行有关，其性、味、效亦源于五行。五行（土、水、火、气、空）中土为生物生长之本源；水为生长之汁液；火为生长之热源；气为生长运行之动力；空为生物生长之空间。五行缺一，生物则不能生长。这就阐明了药物生长与自然环境的统一关系。同时又指出；土水偏盛的药物味甘；火土偏盛的药物味酸；水火偏盛的药物味咸；水气偏盛的药物味苦；火气偏盛的药物味辛；土气偏盛的药物味涩。藏医在临床上用药是根据药物的六味、八性、十七效辩证主方。 六味 即甘、酸、咸、苦、辛、涩。药物的六种味对于治疗疾病贩作用也就各不相同。总的来说，甘、酸、咸、辛能治隆病；苦、甘、涩味能治赤巴病；辛酸、咸味能治培根病。还详细指出了每一味各自的作用和过量的过失。例如：甘味具有增强体力、补气固本，荣润肤色，延年益寿，开窍舒胸，生肌愈疮，治隆赤病的功效。用量过度，滋生培根病及脂肪，降低阳气等过失。甘味能治隆赤病，但是除了甘味陈青稞及干燥地区之畜肉外，多数甘味易于滋生培根病，惟有野牛肉、鱼、羊肉、蜂蜜却对治病培根病有益等。
简述cDNＡ文库构建的方法 1．１ mＲNA纯化 构建一个cＤNＡ文库的第一步是分离在某一给定的组织或细胞类型表达的mＲＮA。ｍRNA仅占细胞总RNＡ的1%～5％,因而需要另外的纯化技术来富集ｍＲNA。从细胞总RＮA中分离mRＮＡ是根据实际上所有真核细胞mＲNA 3’端有一长的伸展的腺嘌呤核苷，这个序列被称为ｐolｙ(A)尾巴，是mRNＡ分子特有的而其他主要RNA 没有，pｏly(Ａ)尾通常有足够的长度因而能与人工合成的互补的寡脱氧胸苷酸(oligo(ｄT)）杂交。正是这种特性使得mRＮA从ＲNＡ分子的混合物中分离出来。 方法有三种： ·寡脱氧胸苷酸亲和层析:即分离mRＮA的标准方法，将一个寡脱氧胸苷酸（12~１8碱基）连接到纤维素的亲和层析柱法，总ＲNA混合物上样后,mRNA与寡脱氧胸苷酸退火。非pｏlｙ(A)ＲNA不结合并很容易从柱子洗去。用低盐缓冲液洗柱，己结合的mRNA很快洗脱出来。 ·溶液杂交:本方案也用寡脱氧胸苷酸－纤维素，但不用层析柱,而是将基质直接加到总ＲNA溶液中。退火和洗涤步骤通过离心含有ＲＮA沉淀的基质在溶液中完成。 ·生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠:本方案中，一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总ＲNA退火,然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠,用磁分离器从大量溶液中分离球珠－mRNA复全体。移去磁分离器，加入洗脱缓冲液,并重复磁性分离步骤。在无盐的状态下,寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。 １.2ｃＤＮA的合成与克隆 1.2.1 cＤNA第一条链的合成 所有合成cＤNA第一条链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应，有两个关键的因素，一个是ｍＲNA模板,另一个反转录酶。 目前商业化的反转录酶主要有两种:一种是禽源反转录酶（reｖeｒse tranｓcripｔａse)，另一种是鼠源反转录酶。两种酶都无3’-5’外切酶活性，但禽源反转录酶有很强的RNAase H酶活性,鼠源的具有相对较弱的RNＡａｓeH酶活性。RＮAasｅ H酶活性在反应中起负作用,可降解mRＮA分子末端的polｙ(Ａ)序列和cDNA-ＲNA杂交分子中的RＮA。因此一般反转录过程都是采用鼠源反转录酶。ＧIBCO-BＲL公司出品一种鼠源反转录酶，称为SUPERＳCRIPT反转录酶,缺少C-末端18０个氨基酸,完全去除了其 ＲNAａｓe H酶活性，保持完整的DＮＡ聚合酶活性。 1.2．２ cDNA第二条链的合成 合成cDNA第二条链的传统方法是“自身引导法”,即将第一条链合成过种中形成的cDNA/ＲNＡ杂交分子变性,降解RNA，则单链cＤＮA分子的3’末端自身环化,形成发卡结构。以此为引物,在DNA聚合酶作用下合成第二条链。所得到的产物是双链ｃDNA，在其相当于ｍRＮA５’端的地方有一发卡闭环结构。然后用单链特异性的SI核酸酶消化该环,得到可供克隆的双链cDＮA分子。由于SI酶的消化反应难以控制，不可避免地导致对应于mＲNＡ5’的序列出现缺失和重排,并造成克隆效率偏低,故该法基本上己被一些改进的方法所代替。主要的改进之处是在合成第一条链的反应体系中加入4ｍmol/L的焦磷酸钠,以抑制发卡结构的形成,这样便避免了使用SI 核酸酶。然后再用其他方法合成第二条链的引物。 1.2．3 cDNA的克隆 dscDNA（双链cDNA)合成后，将此ＤＮA与载体(质粒或噬菌体)组成重组分子,然后转化到受体菌中进行扩增。cDNA文库可用质粒载体或噬菌体载体构建。质粒文库
雪莲文化手册 第一节：雪莲花的精神…………………………………… 1页 第二节：天山雪莲概述……………………………………2-3页 第三节：雪莲的化学成份及药理作用……………………… 3-5页 第四节雪莲的传说………………………………………… 5-8页 第五节雪莲的文献记载……………………………………8-13页 第六节雪莲的使用方法………………………………… 13-16页 第七节雪莲的濒危现状………………………………… 16-18页 第一节雪莲花的精神 ★洁身自爱、坚韧不拔、奋发向上 洁身自爱：道德高尚、行为磊落，不被社会不良风气所玷污，始终廉洁自律。坚韧不拔：勇于直面艰难困苦，不畏艰险、不惧重压，竭尽全力、勇往直前。奋发向上：保持旺盛斗志，勇挑重担，化压力为动力，化危机为转机，不断突破环境限制和超越自我。 不输给千年雪，挺拔成长的雪莲花，富于强韧的生命力、坚韧不拔。 天山雪莲花的故乡年覆盖积雪，来自于土壤的养分非常少，同时暴露在强烈的紫外线下。高寒地带的植物种类稀少，海拔4000公尺以上只剩苔藓与地衣类，以及唯一的植物天山雪莲花。 生长在海拔4000公尺以上的高山地带，属于菊科多年生凤毛菊属草本植物。菊科植物的种类多达2500到3000,其中生长在高山上的只有雪莲花一种。雪莲花的植株低矮，高度不到20公分。虽属菊科，名称却有个雪字，主要来自于其姿态，雪莲花就好像是从地面长出来的莲花一般。 天山雪莲花虽小，力量却很惊人。不仅能够抵挡强风吹拂，也不会被大雪折断，屹立在严酷的环境中。 天山雪莲花的生命力极强，在寸草不生的严酷环境中，利用雪量较少的3个月内，挺出厚叶，伸展根部，吸收强烈的阳光、稀薄的大气、大地的有机物质以及冰冷的雪水，不断的成长茁壮。 天山雪莲花不仅红黑色的花朵部分散发芳香，连整株草都带有香气。形成干燥雪莲花特
自然选择及其类型
一. 自然选择定义 自然选择定义一：生物在自然界生存竞争中适（应）者能生存和生殖，而不适（应）者被淘汰的现象。 自然选择定义二：群体中“等位基因有差异的延续”，即群体中适应性较强等位基因的频率增加的过程。
二. 自然选择的主要类型 1. 定向选择（directional selection): 某种(些)等位基因或性状被自然选择“留下”，而其他则被淘汰，某种(些)等位基因的频率或性状向单一方向“移动”例子： ?工业化造成的黑蛾 ?病原菌对抗生素的拮抗 ?有害昆虫对杀虫剂的抗性 著名的例子：DDT特征
DDT（氯代烃化合物）于1874年被发现 1939年由瑞士化学家Paul Muller发现其对昆 虫是一种有效的、广谱的神经性毒剂 DDT在第二次世界大战中开始大量地以喷雾 方式用于对抗黄热病、斑疹伤寒、丝虫病等 虫媒传染病 1945年开始转为民用，在疟疾病区使用，效果特别显著；如印度疟疾在十年内从7500万人/年下降至500万人/年。 Muller因此获得诺贝尔生理/医学奖(1948)
同年，美国海洋生物学家Rachel Carson（1907-1964）发表了《寂静的春天》，质疑DDT的安全性 1963年美国科学顾问委员会建议DDT应在短期 内禁用 1970年代，昆虫对DDT产生了抗性，疟疾迅速 上升至2亿/年 1972年美国决定全面禁止DDT在农业方面的 应用 2006年世界卫生组织有条件解禁DDT的使用， 建议在室内喷洒杀蚊
2009年，中国环保局等10个相关管理部门联合发布公告，决定自2009年5月17日起，禁止在我国境内生产、流通、使用和进出口滴滴涕、氯丹、灭蚁灵及六氯苯（DDT用于可接受用途即用于疟疾防治除外）
植物学通报 2004, 21 (1): 61￣65 Chinese Bulletin of Botany 水母雪莲愈伤组织cDNA文库的构建① １金治平 １赵德修② ２乔传令 １付春祥 1（中国科学院植物研究所北京 100093) 2(中国科学院动物研究所北京 100090） 摘要用TRIZOL Reagent提取水母雪莲红色系1~15 d愈伤组织总RNA，用SMART cDNA Library Construction Kit构建cDNA文库。经测定原始文库滴度达到1.5~4×106，扩增总文库滴度达到1011，重组率达到98%，插入片段在0.5 kb到3 kb之间，多在1 kb左右。通过PCR检测，从总文库中检测到了雪莲CHS、DFR及SmP基因的特异片段。SmP基因是转录调控因子，其表达丰度很低。各项指标都表明，已获得高质量的cDNA文库，为雪莲基因资源保存，雪莲类黄酮次生代谢分子调控奠定了坚实的基础。 关键词水母雪莲, 愈伤组织, cDNA文库 Construction of cDNA Library from the Callus of Saussrea medusa Maxim 1JIN Zhi-Ping 1ZHAO De-Xiu②2QIAO Chuan-Ling 1FU Chun-Xiang 1(Institute of Botany, the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093) 2(Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100090) Abstract Total RNA of 1~15 d red line callus of S.medusa was extracted by TRIZOL Reagent. cDNA library was constructed with SMART cDNA Library Construction Kit. The primary library has a high titer from 1.5×106 to 4×106, in which 98% clones are recombinant and the insert cDNAs are from 0.5 kb to 3 kb. The amplified library has a titer of 1011. The positive signals of CHS, DFR and SmP gene were detected by PCR in the amplified library, though SmP gene was expressed at low abundance . This high quality cDNA library provides a useful tool for the study of the molecular mechanisms of the secondary metabolism of the flavonoids of S.medusa. Key words Saussrea medusa Maxim, Callus, cDNA library 水母雪莲(Saussrea medusa Maxim)是我国珍稀传统中药材，其主要有效成分为类黄酮类次生代谢产物，其中高车前素（hispidulin）和金合欢素（jaceosidin）两种3-脱氧类黄酮具有抗腹水型肝癌等多种功能（韩书亮，1995）。类黄酮生物合成途径是目前研究得比较清楚的次生代谢途径之一（ Koes et al,1994）。该途径的大多数关键酶基因都已被克隆，尤其是能对多个关键酶基因同时进行调控的转录调控因子C1、R、P等基因也被克隆并已在玉米的类黄酮生物合成 ①国家自然科学基金资助项目(No.39970896);中国科学院知识创新项目(No.KSCXI-09)。 ②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: zhaodx@https://www.doczj.com/doc/7113388583.html, 作者简介：金治平，中国科学院植物研究所2000级博士生。赵德修，中国科学院植物研究所研究员，博士生导师。长期从事植物次生代谢研究。 收稿日期：2002-12-29 接受日期：2003-07-07 责任编辑：孙冬花
c D N A文库的构建方法与原理 蛋白质是细胞的功能分子：它们构成结构和调控分子，动力和泵蛋白，酶和受体。然而，如果仅用传统的生化方法确定某一特异蛋白的全序列，或制备足够量的蛋白进行操作和鉴定都是使人厌烦且昂贵的步骤。基因克隆和遗传工程对生化领域有很大贡献。如果只限于将基因组DNA作为材料来源，由于其中仅2%被认为可能编码蛋白质，那么确定蛋白质序列仍然是令人生畏的工作。其他部分包括结构和调节因子、内含子、非编译外显子和重复及功能未知的非编码序列。如果分析仅局限在编码序列，那么确定基因产物序列所需的努力就会大大的降低。因此分子生物学主要原则之一是mRNA作为蛋白质合成的模板，所以mRNA是确定蛋白质序列的理想底物。不幸的是，现有通用的克隆载体没有一个能容纳mRNA分子作为插入片段。因此，产生表达序列文库的一个基本步骤是将mRNA分子转变成双链DNA。来自mRNA分子的DNA拷贝称cDNA，由来自细胞或组织mRNA种类的DNA拷贝组成的文库称为cDNA文库。 1．基本原理 cDNA（Complementary DNA）是以mRNA为模板，在反转录酶作用下合成的互补DNA，它的顺序可代表mRNA序列。cDNA文库的构建是指将cDNA与克隆载体DNA体外重组，然后去转化克隆载体DNA 的宿主细胞，从而得到一群含重组DNA的细菌或噬菌体克隆的过程。这些序列来自并代表一定组织或细胞类型特定发育或分化阶段的整个mRNA群体。其过程可概括为：（1）通过反转录酶将各种mRNA转变在cDNA；（2）cDNA与合适的载体重组并导入到宿主中。 cDNA基因文库具有许多优点和特殊用途： 首先，cDNA克隆以mRNA为起始材料，这对于有些RNA病毒来说非常适用，因为它们的增殖并不经过DNA中间体，研究这样的生物有机体，cDNA克隆是唯一可行的方法。 第二，cDNA基因文库的筛选简单易行，恰当选择mRNA的来源，使所构建的cDNA基因文库中，某一特定序列的克隆达到很高的比例，简化了筛选特定基因序列克隆的工作量。 第三，每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，在选择中出现假阳性几率比较低，从阳性杂交信号选择出来的阳性克隆一般含有目的基因序列。 第四，cDNA克隆的另一用途是用于基因序列的测定，读码框（ORF）的界定，只有通过对mRNA5’核苷酸序列才能获得。 2．基本方法 2．1 mRNA纯化 构建一个cDNA文库的第一步是分离在某一给定的组织或细胞类型表达的mRNA。mRNA仅占细胞总RNA的1%～5%，因而需要另外的纯化技术来富集mRNA。从细胞总RNA中分离mRNA是根据实际上所有真核细胞mRNA 3’端有一长的伸展的腺嘌呤核苷，这个序列被称为poly(A)尾巴，是mRNA分子特有的而其他主要RNA没有，poly(A)尾通常有足够的长度因而能与人工合成的互补的寡脱氧胸苷酸（oligo(dT)）杂交。正是这种特性使得mRNA从RNA分子的混合物中分离出来。方法有三种： ·寡脱氧胸苷酸亲和层析：即分离mRNA的标准方法，将一个寡脱氧胸苷酸（12~18碱基）连接到纤维素的亲和层析柱法，总RNA混合物上样后，mRNA与寡脱氧胸苷酸退火。非poly(A)RNA不结合并很容易从柱子洗去。用低盐缓冲液洗柱，己结合的mRNA很快洗脱出来。 ·溶液杂交：本方案也用寡脱氧胸苷酸－纤维素，但不用层析柱，而是将基质直接加到总RNA溶液中。退火和洗涤步骤通过离心含有RNA沉淀的基质在溶液中完成。 ·生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠：本方案中，一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总RNA退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，用磁分离器从大量溶液中分离球珠－mRNA复全体。移去磁分离器，加入洗脱缓冲液，并重复磁性分离步骤。在无盐的状态下，寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。 2.2 cDNA的合成与克隆
1998-04-10收到,1998-09-03接受。 国家自然科学基金(No.39570862)资助项目。 光质、光强和光期对水母雪莲愈伤组织生长和黄酮生物合成的影响 赵德修1 李茂寅1 邢建民1,2 童 哲1 (1中国科学院植物研究所,北京100093;2中国科学院化冶研究所,北京100080) 摘要:白光、蓝光、红光和远红光等不同光质照射及不同的白光强度对水母雪莲愈伤组织生长、苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL )活性及黄酮合成有不同的影响。红光明显促进愈伤组织的生长,但强烈抑制PAL 活性和黄酮的合成。蓝光对愈伤组织生长无明显影响,但显著提高PAL 活性和黄酮的合成。白光的作用介于红光和蓝光之间。远红光的作用与蓝光相似,但作用比较弱。每天16h 蓝光加8h 白光和8h 蓝光加16h 白光的组合产生最高的黄酮含量和黄酮生产率。关键词:水母雪莲,愈伤组织培养,苯丙氨酸氨基裂解酶,黄酮,光质,光辐照度学科分类号:Q945 水母雪莲属于菊科(Compositae)凤毛菊属(Saussurea DC.)植物,为我国传统的中草药,民间用于治疗风湿性关节炎、月经不调、宫寒腹痛和高山不适应症等(李观海等1980)。雪莲(Saussurea )含生物碱、黄酮等多种有效成分,其中4.,5,7-三羟基-3.,6-二甲氧基黄酮(jaceosidin)和4.,5,7-三羟基-6-甲氧基黄酮,即粗毛豚草素(hispidulin)对治疗腹水型肝癌有良好的作用(刘力生等1985)。水母雪莲分布于甘肃、青海、西藏等地,生长在海拔4000~4700m 的高山流石滩。雪莲人工栽培困难,自然资源有限,难以满足临床上日益增长的需要。因此,利用雪莲细胞大量培养技术获得人们所需要的活性产物具有重要意义。 光照对许多植物中黄酮类化合物,如黄酮、黄酮醇和花色素苷的合成,具有诱导作用(Fuglevand 等1996)。李树敏和朱慰 华等(1990)研究发现,白光和蓝光对人参色素细胞中花青苷的形成有较好的促进作用,而红光、黄光抑制细胞内花青苷的形成。玫瑰细胞只在光照条件下合成花色素,暗培养条件下细胞完全不合成花色素(Mizukami 等1988)。大量研究已证实苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)是植物细胞中黄酮生物合成途径中的第一个关键酶。本文研究不同光质、光强对水母雪莲愈伤组织生长、PAL 活性和黄酮形成的影响,以探索提高雪莲愈伤组织中有效成分含量的方法。 1 材料与方法 1.1 材料和愈伤组织培养 用水母雪莲(Saus -su rea medusa Maxim.)的茎与叶片作外植体,在附加BA 0.2mg/L 、NAA 2mg/L 、蔗糖30g /L 、琼脂6g/L,pH 5.8的MS 培养基上诱导出愈伤组织,并进行固体继代培养。经过不断筛选得到2个细胞系(A 系为黄色,B 系为红色),本试验所用材料为细胞系A 。培养条件:50ml 三角瓶内有20ml 固体培养基,每瓶接种量为鲜重0.5g ,25e 下培养,每隔16d 继代一次。 1.2 光源 所有光源装置均放在控温室中,温度为(25?1)e 。40W 白色荧光灯管为国产华新牌GB 10682-89。40W 蓝光和红光荧光灯管产自荷兰Philips 公司,以联邦德国产的PG 501/3红色滤光片过滤红色荧光灯光线得到纯红光,其最强波长在658n m 、半高宽为25n m;以PG 627/3蓝色滤光片过滤蓝色荧光灯光线得到纯蓝光,其最强波长在450n m 、半高宽为43nm 。20W 远红光荧光灯管由日本东芝公司生产,经PG501/3和PG627/ 127 植物生理学报,Acta Phytophysiologica Sinica 1999,25(2):127~132
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。 其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。（2）cDNA第一条链的合成。（3）cDNA第二条链的合成。（4）双链cDNA的修饰。（5）双链cDNA的分子克隆。（6）cDNA文库的扩增。（7）cDNA文库鉴定评价。 一、Superscipt II—RT合成第一链 1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul) (5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water （大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。）。
2. 混匀后，70℃反应10分钟。 3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。 4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂： （1）4 ul 5×first strand buffer （2）2 ul 0.1 M DTT （3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制) 5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。 6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。 7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。 二、cDNA第二链的合成