人外周血白细胞分离液使用说明
货号:P8670
规格：200ml/kit
保存：18℃-25℃避光保存，有效期两年。启封后置4℃保存，有效期一周。
一、分离方法说明及图例
A．取1ml新鲜抗凝血，与全血及组织稀释液1:1混匀后小心加于1份本分离液之液面上；
B.以500g（约1800转/分）离心25分钟(半径15cm水平转子)。此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层；为血浆层。第二层；为环状乳白色的白细胞层。第三层；为略带混浊的分离液层（富集一定量的白细胞）。第四层；为红细胞层。弃去第一层血浆层，收集第二层细胞、第三层分离液层和第四层红细胞层，放入含细胞洗涤液10ml的试管中，充分混匀后，以500g 约（1800转/分）离心30分钟。沉淀经1次洗涤后用红细胞裂解液裂解红细胞，再经3次洗涤去除红细胞内溶物和碎片后取沉淀细胞即为所需白细胞。
注：提取率约为80%。
二、红细胞裂解液使用说明
红细胞裂解液用于从血液或组织细胞样品中裂解并去除无细胞核红细胞的溶液。不适用于禽类等有细胞核红细胞的裂解。本裂解液经过无菌处理，分离的细胞可以用于后续的原代培养、
细胞融合以及核酸或蛋白的提取及各种常规的分析和检测。
使用说明：
A.对于组织细胞样品：
a.新鲜组织经过胶原酶或胰酶等消化处理，通过适当方法分散成细胞悬液，离心弃上清。
b.加入3-5倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。如细胞沉淀的体积为1ml，则加入3-5ml的红细胞裂解液。
c.400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。
d.如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。
e.洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心2-3分钟，弃上清。可再重复1次，共洗涤1-2次。洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀体积的5倍。4℃离心效果更佳。
f.根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。
注：对于常规步骤，多一步洗涤过程中的离心，但可以节省洗涤液的用量，并且洗涤效果也更好一些，同时不需要大体积的离心管。快速步骤少了一次离心，但洗涤效果略差一些，同时需要大体积的离心管。
B.对于血液样品：
a.取新鲜抗凝血，400-500g离心5分钟，离心弃上清。
b.加入6-10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。例如细胞沉淀的体积为1ml，则加入6-10ml的红细胞裂解液。本步骤在室温或4度操作均可。注意：对于鼠的血液，裂解1-2分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间至4-5分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。
c.400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。
d.如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。
e.洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心2-3分钟，弃上清。可再重复1次，共洗涤1-2次。洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀体积的5倍。4℃离心效果更佳。
f.根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。
注：对于微量或少量的血液样品，可以在第一步中不进行离心弃上清的操作，直接在第二步中加入10倍血液体积的红细胞裂解液，并在室温或4℃裂解4-5分钟。对于鼠的血液，裂解4-5分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间至10分钟，但通常不宜超过15分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。后续步骤相同。
三、注意事项
A．本分离液是敏光型的，在运输和贮藏过程中应在18℃-25℃避光保存，启封后置4℃保存避免微生物污染。另外，本品为真空包装，未启封前置于10℃以下易出现白色结晶，影响分离效果。
B．待分离的样本要求新鲜，避免冷冻和冷藏。分离液和所分离样本一定在20℃水浴箱中复温20分钟保证分离液和所分离样本温度在20℃±2℃时分离效果最好，且所有操作过程一定要在无菌条件下进行。
C．由于各品牌离心机的性能不同，国内南北地区温度环境和四季的差异，可能影响分离效果，用户可以调节离心转数，调节离心的时间，摸索最佳的分离条件（具体分离条件各实验室自定）。
D．最好使用无静电反应的离心管，推荐使用未经过碱处理的玻璃离心管。
E．最优抗凝剂选择：EDTA、枸橼酸、肝素。应注意在血液稀释过程中应去除抗凝剂体积。
四、产品性能指标
pH7.0-7.5
渗透压280-340mOsmol/kg
内毒素≤0.5EU/mL
无菌直接接种培养14天后培养基澄清
澄明度及不溶性颗粒物每50mL溶液中含10μm以上的不溶性微粒20粒以下，含25μm以上的不溶性微粒5粒以下
人外周血白细胞DNA提取标准操作规程(SOP) （血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)） 1实验原理 本法采用血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)，从全血中分离白膜层，去除其中的红细胞及蛋白质，裂解白细胞释放DNA，再通过去除DNA中的杂质使其纯化，得到高纯度的DNA原液，最后使用微量紫外可见分光光度计对DNA 的浓度及纯度进行定量检测。 2实验仪器 EP管 微量移液器，10μL、50μL、200μL、1000μL 涡旋振荡器 数显恒温搅拌循环水箱 吸附柱CB3 收集管 离心机 涡旋振荡器 微量紫外可见分光光度计（Thermo NanoDrop1000） 3实验试剂 正常人混合血液，应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。 红细胞裂解液（裂解红细胞） 缓冲液GA（轻微裂解作用，为蛋白激酶K提供反应环境），若溶液产生沉淀，使用前应在37℃水浴中预热10min,以溶解沉淀。 蛋白激酶K（裂解蛋白质） 缓冲液GB（裂解白细胞，释放DNA），若溶液产生沉淀，使用前应在37℃水浴中预热10min,以溶解沉淀。 无水乙醇（沉淀DNA，去除杂质） 缓冲液GD（去除蛋白质），使用前应按照试剂瓶标签的说明加入无水乙醇。缓冲液PW（去除盐），使用前应按照试剂瓶标签的说明加入无水乙醇。 洗脱缓冲液TE（保存DNA） 4实验步骤 样品的采集与保存：用装有EDTA的塑料管采集2mL静脉血，2000rpm离心 5min，可见分层，分别为血浆层、白膜层、红细胞，将血浆吸出弃去，再通过点吸的方式将白膜层全部吸出，置于干净的EP管备用。如无法及时提取DNA，则应置于-80℃进行保存。 样品预处理：
https://www.doczj.com/doc/6f2919631.html,/bbs/topic/791076?keywords=淋巴细胞 分离淋巴细胞是许多实验最基本的技术，也是关键的技术之一。现在大多数用的密度梯度离心法。一般我用5ml抗凝血就可以得到pbmc大约4－5x106的细胞。现在将我分离淋巴细胞的经验于大家共分享。 我的经验 1，新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1 稀释 2. 在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些，我的经验是1：1；1足够了！！） 3.小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。 4. 离心 .转速：1500/分 温度20c －28c 时间：20分钟 no break（就是不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞层又弄混了，加速度也最好不要太大) 5。取出试管，看看是不是分为好几层？？顺次为血浆---单个核细胞层－－分离液－－红细胞 6.用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，留着有用！！！！ 7.用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）.你会问：混在其中的淋巴细胞分离液怎么办？别着急。还有办法的。 8 离心。转速：2000－2300/分（转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开！！) 时间：10分钟 温度：4c 9震荡后，用培养液重悬至1ml（为什么？嘿嘿，马上告诉你） 10.细胞计数＋洗涤细胞。刚才不是重悬到1ml吗？取一些放于96孔板中留着计数用（100ul足够了），然后细胞悬液在离心机上离心，在离心的同时，计数你得到的pbmc吧。这样是不是很节省时间？？ 11.计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16个小正方形. a. 取96板中的细胞悬液10ul，用3％冰醋酸稀释到原来的4倍（这样既能溶解红细胞，又保证细胞浓度不是很大，方便计数） b. 从上面的稀释悬液中取9ul于细胞计数板上，开始计数细胞 c.计数原则：对于压线的细胞，只说左边的和上边的。总共数4大正方形 d.计算细胞浓度：4大格细胞的平均数x 104 x 4 得到的就是细胞的浓度 e 细胞总数是：细胞浓度x1ml（现在知道为什么重悬到1ml了吧？） 12.培养：取出离心的细胞，震荡，按照每个孔1－2x106个/ml的浓度，将细胞用10％NCS+1640重悬后加入到24孔板中，然后拿出保存的人血浆，2滴/孔（经验得知这样，淋巴细胞生长情况会更好）。加入rIL-2 25－50u/孔后，放入培养箱. 看了pbmc 的经验很受启发，我不是做pbmc分离的，但曾经用过淋巴细胞分离液，谈几点体会，希望能共同提高！ 1、因为吸取上层血浆的时候很容易打乱层次结构，离心后我一般直接用吸管伸入中间层吸出所需细胞，然后再吸血浆，如果与淋巴细胞分离液交界处变混浊，少吸一点就是了，反正血浆多得是 2、吸取细胞的时候尽量不要吸到下层的淋巴细胞分离液，因为淋巴细胞分离液的比重比淋巴细胞大，用离心的方法是不可能去除的 3、重悬细胞的时候不要用含血清的培养基，因会使细胞粘附成团 建议; 不同厂家生产的淋巴细胞分离液，密度不同。所以第一步离心的转速也会有所不同。最好是按照说明书摸出最合适的转速，这是分离成败的关键！！！！！！。
人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 The final edition was revised on December 14th, 2020.
西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分 析 学院：生命科学学院 专业：生物科学 年级班级：2010级5班 校区编码：北区 姓名：陈建坤 二零一二年十二月四日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。 【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养 一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科
外周血白细胞的分离：（细胞分离液有市售，有各种型号：白细胞、单核细胞淋巴细胞等分离液） 1> 取3ml正常人的外周血（枸橼酸钠抗凝）与等体积pbs混匀后小心的加于6ml白细胞分离液液面上，1500r/min离心20 min。（或先将抗凝血离心，然后吸取中间白细胞层，再混以等体积pbs然后小心加于等体积细胞分离液液面上，离心同上） 2> 吸取中间云雾状白细胞，加3－4mlPBS后3000 r/min离心10 min。 3> 弃上清，加1ml PBS洗涤沉淀后，将细胞悬液转移至1.5mLEp 管中。 4> 3000r/min离心20 min，弃上清。 即得白细胞 可以试试红细胞裂解液 提供我的配方： 氯化铵82.9克；重碳酸钾10.0克；EDTA0.37克；用三蒸水配成1升 所有的细胞培养都应该坚守无菌操作原则 2.分层后的确有3层，准确说来是4层，最下面是红细胞，上面的一层不应该是稍微混浊的白色，应该也 比较透明，这一层上面就是我们需要的薄细胞层，最上面是血清 3.细节： a.淋巴细胞分离液要避光保存 b.就您的试验看来，淋巴细胞分离液的问题可能是最主要的 c.首先再离心管中加入淋巴细胞分离液，然后把标本缓慢加在淋巴细胞分离液表面上，一定要缓慢小心操作，切不可混匀 d.所有操作都应在无菌环境进行 e.把离心管放入离心机是也应小心，不要太大幅度的摇幌离心管，当然离心后拿出来也要小心 就这么多了吧，这个操作是不是很难的，比较基本 祝您好运了！
.参考方法： 人外周血, 肝素抗凝(100U ?m l) , 等量无血清培养液（或者PBS等缓冲液）稀释。按1∶2 的体积比缓置于比重1. 077 g/m l 的淋巴细胞分离液, 1000 ×g 离心 30 m in, 收集培养液2分离液界面上的单个核细胞。于无血清培养液, 400×g 离心10 m in, 洗涤2次。用培养液重新悬浮细胞并计数 我也是最近要做所以查了一下，仅供分享，呵呵！ 一外周血白细胞的分离 1> 取3ml正常人的外周血（枸橼酸钠抗凝）与等体积pbs混匀后小心的加于6ml白细胞分离液（（33.9%泛影葡胺和9%Ficoll液按1：2.4体积比混合））液面上，1500r/min离心20 min。（或先将抗凝血离心，然后吸取中间白细胞层，再混以等体积pbs然后小心加于等体积细胞分离液液面上，离心同上） 2> 吸取中间云雾状白细胞，加3－4mlPBS后3000 r/min离心10 min。 3> 弃上清，加1ml PBS洗涤沉淀后，将细胞悬液转移至1.5mLEp管中。 4> 3000r/min离心20 min，弃上清。 即得白细胞 二自然沉降法 本法是利用血細胞自然沉降率的分離法，採集血液後應及時抗凝，通常選用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原轉化為凝血酶，從而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白而防止血液凝固。操作原則是將含抗凝血的試管直立靜置室溫30～60min後，血液分成明顯三層，上層為淡黃色血漿，底層為紅細胞，緊貼紅細胞層上面的灰白層為白細胞，輕輕吸取即得富含白細胞的細胞群，離心洗滌後加入少量蒸餾水或含氯化銨的Gey溶液，經短時間的低滲處理，使紅細胞裂解，經過反復洗滌可得純度較高的白細胞懸液。
实验二十四外周血单个核细胞的分离 (Separation of mononuclear cell in peripheral blood) 免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。 【实验原理】 血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。 【主要试剂和器材】 1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。 2.5g/L台盼蓝。 3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。 4.Hank,s液。 5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。 6.水平离心机、显微镜。 【操作方法】 1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。再加入等量Hank,s液混匀。 2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。 3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。 4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。 5. 用滴管直接吸出单个核细胞层，或吸去血浆层后再吸了该层，置于另一离心管中。 6.加入4倍量以上的Hank,s液，充分混匀，1000r／min离心l0min。离心后倾弃上清液，再用Hank,s液洗2次。 7.用含10%～20%灭活小牛血清的Hank,s液或培养液配制细胞悬液。计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。【结果判断】 【注意事项】 1.将血液进行稀释可降低血液黏稠度和红细胞的聚集，提高单个核细胞的收获量。 2.温度变化可直接影响分层液的密度，即影响细胞的收获率和纯度。故应在室温(18～25℃)下进行实验，分层液使用前应预温至室温。温度过低，淋巴细胞丢失增多；温度过高，会影响淋巴细胞活性。
人体外周血淋巴细胞培 养与染色体核型分析 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分 析 学院：生命科学学院 专业：生物科学 年级班级：2010级5班 校区编码：北区 姓名：陈建坤 二零一二年十二月四日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。 【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养 一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科
实验原理 人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。 人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。 1912年，Warfter 最先研究人类染色体。1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。 细胞遗传学、组织培养技术为 人类染色体的研究提供了条件。 技术突破主要在于： （1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。 （2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。 （3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。 1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。 实验试剂 RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。 磷酸缓冲液的配制 0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6): A:Na2HPO4?12H2O 28.8克B:Na2HPO4?7H2O 2.164克 KH2PO4 2.67克NaH2PO4?2H2O 0.3克 溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中 实验设备 2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。实验材料 人的外周血淋巴细胞
RDW 均增大,属不均一性大细胞贫血,红细胞巨幼样变。红细胞指标M CV 、M CH 、H CHC 的测定是进行形态学分类的依据,过去把贫血分为大细胞、正细胞正色素、小细胞低色素、单纯小细胞4个类型,此法忽视了红细胞体积的异质性对指标准确性的影响,不能全面反映红细胞的病理变化。 笔者认为,M CV 及R DW 测定结合了红细胞形态学分类,可得到较可靠的初步诊断意见,进而做特殊检查可明确诊断。 M CV 、RDW 对缺铁性贫血与巨幼红细胞性贫血有较好的诊断价值,可作为一种快速、简单、方便、准确的筛选方法。参考文献 [1] 丛玉隆.今日临床检验学[M].北京:中国科学技术出版社,1997:9. (收稿日期:2010-12-16) v 通讯作者,E -mail:zh anggu oyuan9826@sin https://www.doczj.com/doc/6f2919631.html, 。 #经验交流# 外周血淋巴细胞培养及染色体制备的几点体会 马 强,刘青松,蔡 燕,邢 艳,张国元 v (川北医学院附属医院检验科,四川南充637000) 摘 要:目的 总结该室外周血淋巴细胞培养及染色体制备的成功经验,供同行参考与借鉴。方法 采用外周血淋巴细胞培养基接种外周全血,按照常规方法制作染色体标本,进行镜检。结果 该室培养的淋巴细胞数量稳定,染色体核型质量佳。结论 该室制作的染色体标本质量能满足临床染色体核型分析需要。 关键词:染色体; 外周血; 淋巴细胞DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2011.14.061文献标识码:B 文章编号:1673-4130(2011)14-1641-02 染色体检查作为干预出生缺陷、提高人口素质的一个重要内容和措施,对优生优育工作有着重大意义[1]。然而,染色体制备过程缺乏有效的质量控制,经验在染色体标本制备过程中占有重要的地位。为了获得良好的制片,在笔者及同事的摸索下,本室制作的染色体标本质量稳定,基本满足临床分析需要。笔者就这一过程中的要点与大家分享,以供同行参考。1 淋巴细胞培养 1.1 外周血采集 一般情况下,在采集外周血时,采用5mL 空针吸取0.5mL 左右无菌肝素作为抗凝剂,再采集患者外周静脉血。然而,在当今复杂的医疗环境下,这样的操作可能会给患者带来不符合操作规范的感觉。为了避免不必要的医疗纠纷,本室采用动脉血气针(BD 公司生产)抽取2~3mL 外周静脉血,备用。在操作过程中要始终保持无菌观念,用碘酒和乙醇消毒皮肤,自肘静脉采血,然后要把注射器内的血液充分轻轻混匀,以防止血液凝固,影响细胞培养质量[2]。 1.2 接种 培养基的质量在影响染色体质量方面最为关键,从营养不良的培养基中获得的细胞所制备的染色体质量差,不利于染色体核型分析。本室采用湖南湘雅基因技术有限公司生产的成品外周血淋巴细胞培养基(5mL ),只需将采集的外周血接种适量在培养基中,摇匀后置入CO 2孵箱中培养即可。接种时,若血液过少,获得的淋巴细胞少;而接种过多,淋巴细胞增殖不良,染色体稀少。经过摸索,发现成年人接种血气针采集的血液20~25滴为宜,4岁以下儿童接种15~20滴为宜,新生儿则只需8~10滴。 1.3 细胞培养 细胞培养阶段也是极为关键的一步,细胞的旺盛生长与培养时间、温度、CO 2浓度等条件。1.3.1 培养时间 经过试验,分别取培养24、(48?2)、(72?2)、(96?2)h 的培养物分离淋巴细胞,制片,核型分析后发现:培养24h 者几乎见不到分裂象;培养(48?2)h 者,每张制片上可见中期分裂象小于10个,且染色体质量差;培养(72?2)h 者,每张制片上分裂象大于200个,染色体质量佳;而培养96h 者,其质量与培养(48?2)h 者相差无几。因此,本室培养细胞的时间控制在72h 左右,制作出的染色体核型佳,有利于 分析。 1.3.2 培养温度与气体 淋巴细胞培养的适宜温度为(36.5?0.5)e ,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至死亡。如果温度高于37e ,细胞的生长速度减慢;如果温度高于40e ,细胞受损,超过43e ,则导致细胞死亡。气体是人体细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有O 2、CO 2。CO 2既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH 值。大多数细胞的适宜pH 为7.2~7.4,培养基的pH 值也应调整到7.2~7.4,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。偏酸性时细胞发育不良,偏碱性时细胞会出现轻度固缩[3]。培养箱的温度和CO 2浓度应严格控制在(37?0.5)e 、5%以获得良好的中期分裂象。2 细胞收获 2.1 秋水仙素与作用时间 秋水仙素作为细胞培养中的纺锤体阻断剂,可使分裂象细胞停留在分裂中期而获得大量分裂中期染色体以便于核型分析。加入秋水仙素的剂量、作用时间与处于分裂中期细胞数量、染色体长短密切相关。加入的秋水仙素过量、作用时间过长,染色体浓缩,不利于分析;若加入的秋水仙素量不足、作用时间过短,则染色体细长或无染色体,同样不利于核型分析。只有适量的秋水仙素与适量的作用时间,才能获得较好的分裂象。本室加入秋水仙素使最终浓度为0.025%,作用1~1.5h 可获得数量多、浓缩程度适中的染色体。 2.2 离心力 将培养物收集到15mL 的离心管中,通过离心获得需要的细胞。整个过程中,离心力的大小很关键。离心力过大会导致细胞之间粘连过紧,低渗时细胞不能被充分混匀,影响低渗效果。这一步本室选择1900r /min 离心10min 。而低渗过后预固定与固定过程中,去除固定液时由于细胞少,过小的离心力不能将细胞充分沉淀。为了尽可能的获得多的细胞,本室采用2500~3000r/min 离心10min 。此外,在去除上清液的时候不要将上清液吸尽,以免造成细胞丢失。 2.3 低渗 低渗的目的是让水分进入细胞,使细胞肿胀、破裂,是染色体制备过程中的关键环节之一。低渗液渗透压过
血液中的白细胞有五种，按照体积从小到大是：淋巴细胞，嗜碱性粒细胞，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞和单核细胞。 白细胞是无色有核的血细胞，在血液中一般呈球形，根据形态差异可分为颗粒和无颗粒两大类。颗粒白细胞（粒细胞）中含有特殊染色颗粒，用瑞氏染料染色可分辨出三种颗粒白细胞即中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。 中性粒细胞具有变形运动和吞噬活动的能力，是机体对抗入侵病菌，特别是急性化脓性细菌的最重要的防卫系统。当中性粒细胞数显著减少时，机体发生感染的机会明显增高。嗜酸性粒细胞具有粗大的嗜酸性颗粒，颗粒内含有过氧化物酶和酸性磷酸酶。嗜酸性粒细胞具有趋化性，能吞噬抗原抗体复合物，减轻其对机体的损害，并能对
抗组织胺等致炎因子的作用。嗜碱性粒细胞中有嗜碱性颗粒，内含组织胺、肝素与5-羟色胺等生物活性物质，在抗原－抗体反应时释放出来。在人体的正常粪便中偶尔能见到少许白细胞，所以粪便检查中白细胞的多少可以作为肠道是否有炎症的一种依据，无颗粒白细胞无细胞质颗粒，但有圆形细胞核，包括单核细胞和淋巴细胞。单核细胞是血液中最大的血细胞。目前认为它是巨噬细胞的前身，具有明显的变形运动，能吞噬、清除受伤、衰老的细胞及其碎片。单核细胞还参与免疫反应，在吞噬抗原后将所携带的抗原决定簇转交给淋巴细胞，诱导淋巴细胞的特异性免疫反应。单核细胞也是对付细胞内致病细菌和寄生虫的主要细胞防卫系统，还具有识别和杀伤肿瘤细胞的能力。淋巴细胞则为具有特异性免疫功能
的细胞。T淋巴细胞主要参与细胞免疫反应而B 淋巴细胞参与体液免疫反应。 成年人白细胞数为每立方毫米5000～9000单位，其中中性粒细胞占0.50～0.70，嗜酸性粒细胞占0.005～0.05，嗜碱性粒细胞占0.005～0.01，单核细胞占0.03～0.08，淋巴细胞占0.20～0.40。幼儿血液中白细胞数高于成年人。不同生理状态（如妊娠期）会引起白细胞数量的变化。有炎症时，血中的白细胞数明显增加。各类白细胞的防御保护作用各不相同。 瑞氏染色外周血五种白细胞形态特征：细胞类型大小（μm）外形细胞核细胞质功能核形染色质着色颗粒中性杆状核粒细胞10～15 圆形弯曲呈腊肠样，两端钝圆深紫红色粗糙淡橘红色量多，细小，均匀布满胞质，浅紫红
小鼠外周血白细胞 小鼠外周血白细胞产品说明： 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠外周血白细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠外周血白细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠外周血白细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠外周血白细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞
实验五人的外周血淋巴细胞培养 一、实验原理 外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期(或Go期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素(PAH) 时，这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学，药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 二、实验目的 掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。 三、实验材料 人的外周血。 四、实验器具和药品 1．用具: 2毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒，天平，离心机，恒温培养箱，显微镜。 2．器皿的清洗和消毒 玻璃器皿在使用前，均应用肥皂水洗刷，清水冲净，烘干后浸泡在洗液中至少2h，再用流水冲洗，烘干待消毒。 将已洗净、烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装，放入干燥消毒箱内；150℃1h。 隔离衣、口罩。橡皮塞，注射用针筒等则用高温高压消毒(15磅15min)。 3．药品 (1) RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末10.5克，用1000ml的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或CO2气体处理，如pH值降至6.0时，则可溶解而透明。每1000ml溶液加NaHCO， 1.0－1.2g，以干冰或CO2气体校正pH至7.0－7.2。立即以5号或6号细菌漏斗过滤灭菌，分装待用。 (2) 肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末160mg(每mg含126U)，用40ml的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每ml 500U。高压消毒8磅15min。 (3) 秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度；抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素4mg，用100ml生理盐水溶解，用6号细菌漏斗过滤，然后放入冰箱4℃保存。使用时用1ml注射器吸取该溶液0。05－0.1ml加入5ml的培养物中，其最终浓度为0.4—0.8ug／ml。 (4) 植物凝血素(PHA)：是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。提取PHA的方法有两种。一种比较简单，直接用四季豆的浸出液；另一种较复杂，最后制品为粉末。如用之得当，二种方法均可获得良好的效果。 盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑色、黑色.黄色，白色的四季豆亦可。取豆子20g，用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。先在水中浸过夜(4℃)，次日倒去水分，将豆子放入组织搅碎器内，加30ml生理盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加70ml生理盐水，混合均匀。置冰箱24h。然后以3000转／min离心15min，取上清液，用生理盐水稀释10倍，5号除菌滤斗过滤，分装小瓶，冰冻保存。
红细胞裂解液使用说明 货号：R1010 规格：100ml/500ml 保存：2-8℃保存，保质期2年。常温运输。 产品简介： 红细胞裂解液是利用细胞内外存在盐离子浓度差而导致细胞膜胀破的原理来裂解无核红细胞的。 红细胞裂解液经无菌处理，主要用于经酶消化分散的组织细胞的分离纯化，淋巴细胞的分离纯化以及组织细胞蛋白与核酸提取等实验中红细胞的去除。 使用说明： 1.1倍体积的新鲜全血，加入3倍体积的红细胞裂解液。如1ml新鲜全血加入3ml红细胞裂解液，轻轻涡旋或颠倒混匀。 2.冰上放置15分钟，其间轻轻涡旋混匀两次，红细胞裂解后，溶液应该是清亮透明的。 3.收集细胞：4℃，450×g离心10分钟以沉淀白细胞，小心吸弃上清液。 4.向白细胞沉淀中加入两倍体积的红细胞裂解液，轻轻涡旋充分重悬白细胞。如起始血液为1ml，则加入2ml的红细胞裂解液。 5.4℃，450×g离心10分钟沉淀白细胞，小心并彻底吸去上清液。 6.重悬细胞，用于后续实验；如提取RNA，最好于此步开始使用DEPC水配制的溶液进行操作。 （组织细胞处理：新鲜组织经胰酶或胶原酶等消化分散成单个细胞悬液，离心弃去上清液，其余同上。） 注意事项：
本裂解液为无菌产品，分离细胞用于细胞培养时请注意无菌操作。为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 相关产品： D8210DEPC P10201×PBS，PH7.2-7.4，0.01M H1020Hanks，含钙镁，含酚红 31800RPMI Medium1640 T1300胰蛋白酶－EDTA消化液(0.25%)不含酚红 P1400青链霉素混合液(100×) D1800全血基因组DNA提取试剂盒 G1010姬姆萨染色液（工作液）
人外周血白细胞分离液使用说明 货号:P8670 规格：200ml/kit 保存：18℃-25℃避光保存，有效期两年。启封后置4℃保存，有效期一周。 一、分离方法说明及图例 A．取1ml新鲜抗凝血，与全血及组织稀释液1:1混匀后小心加于1份本分离液之液面上； B.以500g（约1800转/分）离心25分钟(半径15cm水平转子)。此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层；为血浆层。第二层；为环状乳白色的白细胞层。第三层；为略带混浊的分离液层（富集一定量的白细胞）。第四层；为红细胞层。弃去第一层血浆层，收集第二层细胞、第三层分离液层和第四层红细胞层，放入含细胞洗涤液10ml的试管中，充分混匀后，以500g 约（1800转/分）离心30分钟。沉淀经1次洗涤后用红细胞裂解液裂解红细胞，再经3次洗涤去除红细胞内溶物和碎片后取沉淀细胞即为所需白细胞。 注：提取率约为80%。 二、红细胞裂解液使用说明 红细胞裂解液用于从血液或组织细胞样品中裂解并去除无细胞核红细胞的溶液。不适用于禽类等有细胞核红细胞的裂解。本裂解液经过无菌处理，分离的细胞可以用于后续的原代培养、
细胞融合以及核酸或蛋白的提取及各种常规的分析和检测。 使用说明： A.对于组织细胞样品： a.新鲜组织经过胶原酶或胰酶等消化处理，通过适当方法分散成细胞悬液，离心弃上清。 b.加入3-5倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。如细胞沉淀的体积为1ml，则加入3-5ml的红细胞裂解液。 c.400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。 d.如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。 e.洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心2-3分钟，弃上清。可再重复1次，共洗涤1-2次。洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀体积的5倍。4℃离心效果更佳。 f.根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。 注：对于常规步骤，多一步洗涤过程中的离心，但可以节省洗涤液的用量，并且洗涤效果也更好一些，同时不需要大体积的离心管。快速步骤少了一次离心，但洗涤效果略差一些，同时需要大体积的离心管。 B.对于血液样品： a.取新鲜抗凝血，400-500g离心5分钟，离心弃上清。 b.加入6-10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。例如细胞沉淀的体积为1ml，则加入6-10ml的红细胞裂解液。本步骤在室温或4度操作均可。注意：对于鼠的血液，裂解1-2分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间至4-5分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。
PBMC的分离 物品准备：外周血来源的白细胞浓缩液、生理盐水、50ml注射器×1、20ml注射器×3、10ml注射器×2、50ml离心管×7、15ml离心管×4、淋巴细胞分离液分离步骤： 1、将外周血来源的白细胞浓缩液用生理盐水1：1稀释，从离心管边缘轻轻加于淋巴细胞分离液上面（淋巴细胞分离液与外周血来源的白细胞浓缩液等体积），离心（2000r/min，20min，22℃），分离白膜层细胞即外周血单个核细胞（PBMC）。 2、用培养液洗涤5-6次（离心速度1500r 15min-1500r 15min-1000r 10min-800r 10min-800r 5min），用含10%的胎牛血清的RPMI 1640液调整细胞浓度为2×106 /ml，加入6孔板，于37℃，5% CO2孵育箱培养2h，吸去悬浮的细胞，用温热的RPMI 1640培养液洗涤2遍，所得的贴壁细胞即DC前体细胞。 3、所吸去的悬浮细胞为淋巴细胞，用含10％的胎牛血清的RPMI 1640（含终浓度为800U/L的rhIL-2）重悬，计数并调整细胞密度为1×106/ml，置于75cm2培养瓶内，37℃，5% CO2孵育箱培养，隔天换含新鲜IL-2的RPMI 1640培养液维持细胞活力，待用。 注意事项： 1、密度梯度离心时，加速度宜慢 2、密度梯度离心时间不宜过长，对细胞损伤较大 3、如分离后的细胞悬液中有较多红细胞，可使用红细胞裂解液，37℃裂解5min，注意裂解时间不宜过长，以免一项单核细胞活性 4、稀释血和分离液的比例可以是1：1或2：1，最好达离心管的1/2-2/3，1/2最好，分层明显，即50ml的离心管只装到30ml 5、、 6、吸取白膜层时，注意不要吸到分离液，可以先吸去血浆层 7、注意淋巴细胞分离液和细胞培养液使用前都应水浴至室温 8、离心后离心管中液体分为5层：血浆层、PBMC层、分离液层、粒细胞层、红细胞层。
小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告 一、实验目的 1. 了解淋巴细胞分离的意义和原理 2. 掌握淋巴细胞分离的技术，为进行下一步生物实验奠定基础 二、实验材料 1.淋巴细胞分离液 2.EDTA抗凝剂 常用EDTA的钠盐或钾盐作为抗凝剂，能与血液中的钙离子结合成螯合物，而是钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固 3.PBS缓冲液 PBS缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用 4.戊巴比妥钠溶液 作用与苯巴比妥相同，为中时作用的巴比妥类催眠药，作用时间可维持3～6小时，显效较快。用作催眠和麻醉前给药，亦可用于治疗癫痫和破伤风的痉挛。 5.其他实验材料：健康的小白鼠一只、注射器（1ml，10ml）1ml、20ul的枪以及相应的枪头、滴管、水平离心机、医用镊子、EP管（5ml，10ml） 三、实验原理 外周血中各种细胞的密度不同。密度离心法的原理主要根据各类血细胞的比重差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立区带，从而达到分离的目的。 第一层为血浆层。第二层为环状乳白色淋巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层
图1 小鼠外周血离心前后示意图 四、实验步骤 1.给小鼠注射适量的戊巴比妥钠麻醉剂，使其麻醉 2.用镊子用力拉扯掉麻醉完全小鼠的其中一只眼睛，将血液滴入事先已经加入100ulEDTA抗凝剂的5mlEP管中，取足1ml新鲜血液 3.用滴管将抗凝后的血加入事先加入1mlPBS缓冲液的5ml的EP管中稀释(血液与PBS的比率为1:1) 4.用滴管将稀释后的1ml新鲜血液沿试管壁缓缓（一定要慢）加到含有2ml淋巴细胞分离液(事先要恢复到室温)的10mlEP管中（稀释血液：分离液=1:1），沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面 5.经水平式离心机离心（1500r/min）15分钟，小心取出试管 6.用平口滴管小心吸取中层呈白絮状的淋巴细胞，用PBS溶液洗涤两次，每次离心1800r/min，离心10min 7.弃上清液，加入4mlPBS待用
人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead 等所建立的。 人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。 1912年，Warfter 最先研究人类染色体。1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。 细胞遗传学、组织培养技术为 人类染色体的研究提供了条件。 技术突破主要在于： （1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。 （2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。 （3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。 1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。1968年，T.U. Casperssan提出染色体显带技术。 实验试剂 RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。 磷酸缓冲液的配制 0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6): A:Na2HPO4?12H2O 28.8克B:Na2HPO4?7H2O 2.164克 KH2PO4 2.67克NaH2PO4?2H2O 0.3克 溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中 实验设备 2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。
人外周血白细胞分离液试剂盒 规格：200mL/kit 保存：本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。无菌开封后，保存于室温。 试剂盒组成： 各种动物外周血白细胞分离液 200mL 细胞洗涤液 200mL 红细胞裂解液100mL 操作步骤： 1.取新鲜抗凝全血（EDTA 、枸橼酸钠或肝素抗凝均可）或者去纤维蛋白血液。 2.在离心管中加入适量分离液（血液体积小于5mL 时，加入5mL 分离液；大于等于5mL ，加入等体积分离液。但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果），将血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管 吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差 异，将形成明显的分层界面。如果样品较多，加样的时间较长，在 离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。） 3.室温，水平转子500~1000g ，离心20~30min （血液的体积越大所 需的离心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需摸索，离心转 速最大不超过1200g ）。 4.离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层；血浆与分离 液之间是淋巴细胞层；分离液中为粒细胞层（个体差异或者是分离 条件不同，粒细胞层可能分离不明显）；最下层为红细胞层。 5.小心的吸取淋巴细胞层及分离液层细胞到15mL 洁净的离心管 中，10mL PBS 或细胞洗涤液洗涤细胞。250g ，离心10min （如有红 细胞混杂则加入适量红细胞裂解液） 6.弃上清，5mL 的PBS 或细胞清洗液重悬细胞，250g ，离心10min 。 7.重复步骤6 8.弃上清，细胞重悬备用。注意事项： A.开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物污染。。 B.分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。4℃或者是温度较低的条件下离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重。 C.血液样本最好为新鲜抗凝血（采血2h 以内），为保持淋巴细胞的活性，应避免冷冻和冷藏。 D.血液样本不需稀释，直接进行分离即可。 E.稀释血液或洗涤细胞，不可使用含Ca 、Mg 离子的缓冲液及培养液，其成分会导致血细胞凝集，分离示意图 血浆层红细胞层淋巴细胞粒细胞分离液层