红曲霉深层发酵法生产红曲红
杨晓暾
红曲红色素生产由固态转向液体深层发酵在中国是近10余年的事，而目前国内深层发酵生产红曲红色素水平尚较低，多数厂家仍是利用红曲米提取生产红曲红色素。由于受条件限制（如设备、场地）、发酵水平等因素的影响，产品的产量和质量均难以达到理想水平。因红曲红液体深层发酵是利用纯种经一、二级种子罐培养后，直接进入发酵罐培养，故摸索和掌握适于红曲霉液体生长的最佳工艺条件和配方是十分重要的，只有找到最适生产配方及工艺条件，才有希望突破固态法生产水平，从而降低生产成本，提高生产效益，生产出高色价、高质量的红曲红产品，以满足当今市场需求。
笔者从事红曲红研究及规模化生产多年，有着丰富的生产经验。红曲红色素液体深层发酵工艺经十余年研究发展，目前已达到相当高的生产水平，东莞市天益生物工程有限公司生产的红曲红无论从产品质量或生产能力都居国内同行领先水平。我们的宗旨是科学技术为指导，坚持科技创新，严格加强生产管理。具体作法主要有以下几个方面：
一、筛选高色价、性能稳定的红曲霉菌种，是降低生产成本、提高红曲红液体深层发酵水平的关键所在。
我们公司除了按常规的霉菌分离方法之外，主要利用红曲霉的特性（耐酸性及抵抗酒精能力强等）。具体做法是：用含乳酸0.7%、酒精约10%的麦芽汁或大米进行分离、纯化培养红曲霉，同时还对生产菌种进行不同方式的诱变、驯化（如紫外诱变、酸热处理等），以此来增强其逆境生存能力。经紫外诱变处理5~10min；耐高温（55~65℃）、耐高压（0.8-1.0Mpa）、耐酸（pH2.0-3.0）等方面情况下生长性能测试后，筛选出的高色价菌株，具有优良、稳定和培养粗放等特点，在生产上便于操作和应用。除此之外，我们还特别注意保持菌种的强壮与新鲜，太嫩或太老均不可取（斜面菌种一般生长7-8d 为最佳）。不仅如此，我们还采取多种方式经常改变培养基配方用于菌种培养及保藏试验，以减少红曲霉菌因多次传代而发生变异。为进一步验证其生产种性能是否优良、稳定，我们还经常进行摇瓶分离试验、改变配方等，从中摸索出一整套相关的红曲霉生产试验配方，使生产工艺得到不断改进与完善，也使菌种在大生产中充分得以驯化，更加适应液体深层发酵，为生产稳定、质量提高打下坚实的基础。经长期不懈的努力，严格把好菌种质量关，使生产水平稳中有升，发酵水平比两年前提供了近1倍，产品总收率比原来提高了20％，从而大大降低了生产成本，使产品在市场中更加有竞争力。
二、制定合理的生产工艺及配方，是发酵高水平的重要前提。
目前我公司红曲红液体深层发酵经不断摸索、改进后，已初步形成了一套较为成熟、完善的生产工艺流程：
（一）斜面与平板培养基：可溶性淀粉3％、麦芽糖3％、蛋白胨2％、琼脂2％，ｐH自然约5.0-5.5。（二）种子液体培养基组分：淀粉3％、NaNO30.25%、KH2PO4 0.2-0.3％、MgSO47H2O 0.2％-0.3％、黄豆粉1.0％、玉米浆1.5％。
（三）发酵罐培养基组分：米粉6％-7％、黄豆粉2％-3％、NaNO3 0.2%-0.3％、KH2PO4 0.2-0.3％、
MgSO4·7H2O 0.2％-0.3％，用乳酸调节发酵液初始pH值为3.0-3.5。其中，碳源、氮源的比例一定要协调，适宜的碳氮比对红曲霉生长及产色都是非常关键的，当碳源过高时，发酵液偏黄，显橙红色重，菌丝易衰老、孢子较多；当氮源过高时，发酵液偏紫、色暗、菌丝细长，且着色重，但较难提取。故把握好发酵培养基的配方是非常重要的。此外，红曲霉菌是好气性菌株，其细胞的生长和色素产生都要有足够的氧气，故通气量的大小对发酵过程的影响不可忽视。在发酵的3个时期（前期、中期、后期）应有不同的要求：前期需氧量较小，即风量要适量；中期因菌体的大量繁殖，升温较快、耗氧较多，需通入较大风量；后期则应适当减小风量，以利于代谢产物的生成和积累――产色素高，及时处理好深层发酵各个时期的风量大小是很重要的，只有不断地摸索和总结大规模生产经验，才能有效地提高生产发酵水平，为确保后处理收率高打下基础。
三、加强红曲霉液体深层发酵的管理及质量监控
根据我公司的生产经验，要搞好红曲霉液体深层发酵的管理及监控，首先，必须严格把好生产工艺操作关。具体操作主要有一下几个方面：
（一）灭菌：这一步是深层发酵的关键，空消、实消一定要严格把关，必须小心细致地检查各路管道、阀门，以防止“死角”发生。
（二）配料：一定要严格按照工艺配方执行，做到专人专职负责，绝对不可出差错。
（三）负责发酵生产的操作工应进行岗前专业培训，严格按工艺操作程序，做好每项工作，特别是一、二级罐培养条件的控制（温度、压力、风量三要素），经显微镜观察菌种生长情况在决定是否接入发酵罐（每一级种子液培养时间一般为7—8h），菌丝粗壮、横隔明显、成网状则优良；若菌丝成球状、细长或变形等，则会影响发酵水平，降低产品收得率。此外，在发酵过程中，要特别注意温度和风量的控制，红曲霉菌产色素最适温度为32-35℃，一般控制在33±1℃为佳，风量则根据发酵罐有效体积计算，一般比值在1：0.3-0.4左右较好，风量过大，促使红曲霉耗氧过快，菌体易衰老，发酵代谢过快，产色素少；风量过小，则菌体生长慢，代谢产物少，发酵时间延长，能耗增加。由于控制发酵过程中通风量在不同时期有不同要求，应根据具体发酵罐、发酵液中菌体生长情况而定。
作者简介：
杨晓暾，东莞市天益生物工程有限公司副总经理，华南理工大学生物工程专业毕业，长期从事微生物发酵生产及研制工作，曾获省科技进步奖2项。尤其在红曲霉液体深层发酵有丰富的生产经验。发表工业发酵方面的论文多篇。
红曲色素及其应用
一、红曲在国内外的发展现状
1.1 食用色素发展现状
食用色素是食品工业、制药工业和日化工业不可缺少的一类添加剂，按其来源可分为纯天然色素、仿天然色素和合成色素三大类。近年，由于毒性问题，某些合成色素的应用受到了限制，因此，开发和利用无毒或基本无毒的天然色素，日益受到人们的重视。开发天然色素，改善食品加工品质，是我国食品添加剂工业“十五”期间的发展重点。中国列入GB-2760的食用着色剂有60钟，其中合成着色剂13种，天然着色剂47种，已经成为世界品种最多的生产和消费大国。
由于在自然资源方面的优势，天然色素已成为食品着色剂的主力军。2004年合成色素产量2500吨，产值1.9亿元，天然色素产量26.5万吨，产值11亿元，其中焦糖色素占80%以上，主要品种有辣椒
红、红曲红、姜黄、栀子黄、高粱红等，其中红曲等产品一直是中国的传统出口产品。
合成色素，是指自然界不存在，用化学合成制造的色素，如日落黄和食用黄色4号。仿天然色素，是指天然存在色素结构，凭借化学合成或化学提取方法制成的色素，如红曲红色素、β-胡萝卜素、核黄素和4-二酮β-胡萝卜素。纯天然色素，来自天然可食用原料，以适当的生物或食品加工方法生产的有机色素，如红曲色素（红曲米粉）。
天然色素并不包括叶绿素铜和氨及糖类制得的焦糖色素，因为两者都是以化学修饰法生产，因此被归类为仿天然色素。一般所说的天然色素包括“仿天然色素”和“天然色素”。
合成色素的优点是色泽鲜艳，着色力强，不易褪色，用量较少，性能稳定。20世纪，由于合成色素易于获取和价格低廉，其产量持续增加，不过科学界却对它的安全性提出质疑。的确，有部分合成色素有损健康，许多国家现在已经陆续禁用，如1976年，美国和挪威都禁用了苋菜红，即食用红色2号。
天然色素的优点在于安全性高、来源丰富，而缺点是稳定性较差、着色力较低、成本较高。但因多来自水果、蔬菜、动植物、微生物等天然物，对人体的安全性较高，有的天然色素本身就是一种营养素，具有一定的营养效果和药理作用，能更好的模仿天然物的颜色，色调较自然。基于以上原因而备受推崇，近来发展很快，需求量呈不断增长的态势。
我国许可使用的食用天然色素
分类代码名称分类代码名称分类代码名称
08.101 08.102 08.103 08.104 08.105 08.106 08.107 08.108 08.109 08.110 08.111 08.112 08.113 08.114 08.115 08.116 甜菜红
姜黄
红花黄
紫胶红(虫胶红)
越橘红
辣椒红
辣椒橙
焦糖色(不加氨生产)
焦糖色(NH4SO3法)
焦糖色(加氨生产)
红米红
栀子黄
菊花黄浸膏
黑豆红
高粱红
玉米黄
08.117
08.118
08.119
08.120
08.121
08.122
08.123
08.124
08.125
08.126
08.127
08.128
08.129
08.130
08.131
08.132
萝卜红
可可壳色
红曲米
红曲红
落葵红
黑加仑红
栀子蓝
沙棘黄
玫瑰茄红
橡子壳棕
NP红
多穗柯棕
桑椹红
天然苋菜红
金缨子棕
姜黄素
08.133
08.134
08.135
08.136
08.137
08.138
08.139
08.140
08.041
08.142
08.143
酸枣色
花生农红
葡萄皮红
蓝靛果红
藻蓝(淡/海水)
植物碳黑
密蒙黄
紫草红
茶黄素
茶绿素
柑橘黄
胭脂树橙(红木素/降红木素)
胭脂虫红
天然β-胡萝卜素
氧化铁红(黑)
现在国内外对合成色素的限制越来越严格，而对天然色素的开发使用是方兴未艾，已相继开发出在食品中使用的水溶性和油溶性性天然色素几十种，商品化的产品也有十几种。改革开放20多年来，我国开发出近七、八十种不同原料来源的食用天然色素。至1998年，列入“中华人民共和国国家标准食品添加剂使用卫生标准GB2760-1996”中允许使用的食用天然色素有40多个品种，已经制定中华人民共和国国家标准或行业标准的食用天然色素共有19个品种。红曲米及红曲粉，每年约产4000多吨；
红曲红，每年约产200多吨，辣椒油树脂及辣椒红，每年约产250吨；栀子黄，每年约产10吨；栀子蓝，每年约产10吨，高粱红，每年约产45吨；可可壳棕，每年约产10吨；甜菜红，每年约产20吨；虫胶红，每年约产45吨。国内对天然色素的需求量逐年上升。
国外对天然色素的研究开发与应用力度更大。据估计，全球天然色素市场规模约为2.5亿美元（其中美国占1.0亿美元），仿天然色素为1.9亿美元，市场年增长率约为5%-10%。在日本市场，天然已成为色素的主流。在1995年5月食品卫生法修改后的目录中，日本许可使用的天然色素有97种。天然色素市场规模达到200多亿日元，占食用色素市场的90%，其中红甘蓝色素年需求量约为90吨，葡萄皮色素约100吨，萝卜红色素也有几十吨的需求量。我国食品行业是国民经济的支柱产业之一，每年的产值几千亿。现在食用色素还主要以合成色素为主，随着我国经济的发展，人民生活水平的提高，食品中天然色素的比重会越来越大。
1.2 红曲的发展现状
红曲生产及应用，在我国已有1000多年历史，是古代中国人民的伟大发明创造，是中华民族的科学文化遗产。在《日用本草》、《天工开物》、《本草纲目》中均有记载。李时珍《本草纲目》谷部第二十五卷记载：红曲甘、温、无毒，主治消食活血，健脾燥胃，治赤白痢下水谷。酿酒、破血生药势。现代医学研究表明：红曲具有降低血胆固醇、降血脂、降血压、降血糖和抗疲劳，增强免疫力等功能，红曲及制品主要用于医药、食品、日用化工、酿造领域，在肉制品、饮料、食品、酱油、红醋、化妆品中也广泛使用，代替人工合成红色素。近年来，发现人工合成红色素具有致畸致突变的潜在危险，其安全性受到严重挑战，天然红色素日益受到国际上重视，红曲色素以其安全性和良好的稳定性受到国际市场的青睐。因大多数天然红色素稳定性较差，且从动植物中提取生产成本较高，而红曲色素可以经过生物技术发酵大规模生产，生产成本较低，所以极具市场竞争力。
现代红曲研究是日本最先开始的，1979年日本学者远藤章教授从红色红曲霉中分离出一种命名为莫那可林K（Monacolin K）的物质，后来被美国学者进一步证明Monacolin K是胆固醇合成酶HMG-CoA 的专一性抑制剂，能有效抑制胆固醇的合成，并开发为治疗高胆固醇血症、降血脂的药物。美、日、法、德、比利时和我国的学者都对功能性红曲开展了大量的研究，进一步研究发现红曲中除含有Monacolin K外，还含有麦角甾醇、生物黄酮、皂甘、膳食纤维、氨基多糖等丰富的生理活性物质。
1998年7月在法国图卢兹大学举办了“红曲的培养与应用专题研讨会”，会议汇集了来自世界各地的30多位研究者。研讨会议题涉及到红曲色素的生产、红曲霉的次级代谢产物（Monacolin K）的功能和桔霉素的毒性等。2000年10月，由浙江工业大学主办的“2000东方红曲国际学术研讨会”在我国举行，与会代表国外20余名，国内40余名，大会宣读论文30余篇。
红曲作为一种微生物发酵产品，被广泛应用于食品着色、食品发酵、中医药和饲料中。目前市场上的红曲产品有红曲米、红曲红、功能红曲、红曲酒（醋、酱油）、红曲豆腐、红曲茶等。我国的红曲米和功能红曲已进入了国际市场，美国以食品辅料从中国进口功能红曲，欧洲则以食品配料名义从中国进口红曲，用于火腿肠生产。目前市场上出售的降脂药物，有多种是红曲制剂。
1.3 红曲产品分类
目前，根据生产工艺的不同，红曲产品主要有三种：
1.3.1 红曲红色素
采用液体深层发酵培养，所得色素纯度高、水溶性好，用于肉制品着色。
1.3.2 红曲米（粉）
采用液---固培养发酵，含有多种色素组分和功能性组分。目前用于肉制品的着色、酒类（醋、酱油）
的发酵生产、红曲豆腐制作和作为医药原料用于药品保健品的生产。
1.3.3 医用原料（功能红曲）
红曲发酵过程中产生的Monacolin、γ-氨基酪酸、麦角固醇等活性成分，具有降低血压、血脂、胆固醇，抑制癌细胞生长的药理作用。目前市场上有很多降血脂类药物都不同程度上使用功能红曲。功能红曲在医药上的应用已受到了各大医药厂家的重视。
二、红曲的基本组成成份
2.1 色素组分
红曲色素是一种复合色素，其主要组分为：
红色素：红斑素、红曲红素
紫色素：红斑胺、红曲红胺
黄色素：红曲素、赤红曲黄素
2.2 生理活性组分及功能
2.2.1药用物质：Monacolin K（J、L）、麦角固醇、α-氨基酪酸等
1979年日本远藤章首次从红色红曲霉（M.ruber）中分离出具有抑制胆固醇合成限速酶HMG-CoA 还原酶活性的物质，命名为Monacolin K。此后美国和日本的科学家用Monacolin K对动物进行了大量试验，并对Monacolin K对动物肝细胞的影响进行了研究，结果表示，Monacolin K对动物是安全的，他们研制的纯品药物洛伐他汀（Lovastatin）应用于临床观察后认为，洛伐他汀对人体也是安全的，此药已在美国的一些医院里进行临床应用，我国市场上出售的降压灵也属此类药。
我国的北大维信公司开发了“血脂康”，成都地奥公司开发了“地奥心血康”、“脂必妥”，均获得了较大成功，其主要作用成分均为Monacolin K。
1987年，小滨靖弘等研究发现，红曲具有降低血压的作用。经试验分析后，认为其降血压物质为红曲所产生的α-氨基酪酸和乙酰胆碱。
红曲霉还具有其它的多种药理活性物质可以预防和治疗胆结石，前列腺肥大和肿瘤，还可以治疗胺血症，可能是优良的防腐物质。
2.2.2 酶类：淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等
红曲霉在生长过程中能产生多种酶类，如淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶、果胶酯酶等。有的菌株还能产较高活性的蛋白酶。
2.2.3 其他抗菌成份。
红曲霉素能够产生抗菌活性物质Monascidin A，它可以抑制蜡状芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌等食品有害菌。
三、红曲生产工艺及特点
3.1 传统固—固发酵
传统工艺适合小型或家庭作坊式生产红曲。它是从明代宋应星的《天工开物》和李时珍的《本草纲目》中红曲制作法发展演变而成，其主要特点是地面培养红曲（或竹匾、曲盒培养）；工具设备简陋；代代相传；红糟接种，达到选育和驯养的功效；采用大米为培养基（早稻米或晚稻米—最有利于红曲的繁殖和色素的生成）；选择自然气温培养条件（节约能源，巧妙地采取堆积与分堆的办法，达到控制品温的目的）；创造出分段补水法（以满足红曲霉固体培养所需水分的要求）。现在仍在应用于小
红曲厂家或农村家庭副业红曲制造，如浙江义乌、兰溪、金华等地农村。
3.2 液态发酵（液—液发酵）
此法主要用于生产水溶性的红曲红色素，在我国有十多年的历史。其主要特点是从种子培养到制曲都处于液体环境，生产的色素发酵期短，色价高，水溶性好，产品收得率也较高。
其生产工艺流程如下：平板与斜面培养（7-8d）→种子液培养（24-26h）→一级种子罐培养（7-8h）→二级种子罐培养（7-8h）→发酵罐培养（70-75h）→板框压滤→浸泡滤渣（用70%-80%酒精浸泡搅拌约26-38h）→再次压滤→真空浓缩（回收酒精）→喷雾干燥（粉状红曲红）→成品包装
3.3 液固发酵（液—固发酵）
先用种子罐液体培养种子，代替固体种曲接种，后用固体培养发酵，简称液—固法，适用于产量大的红曲厂。它与传统生产工艺不同的是：纯种培养制种；提高发酵厚度（占地面积少，节省厂房）；采用通风措施和自控设备装置来控制培养品温；利用烘干设备进行成品干燥等。同时，产品质量比较稳定。
这种液体种子培养法有利于实现机械化，缩短种子培养时间，质量好，生长繁殖速度快等，提高了红曲质量，同时有利于科学管理。
四、红曲色素在肉制品加工中的应用
4.1 红曲色素的基本特点
4.1.1 对酸碱度稳定
它的水溶液在pH11为橙色，pH12时呈黄色，也就是当酸碱度极度上升时，它的水溶液颜色才会发生变色。但是红曲色素的乙醇溶液在酸碱度pH11时仍保持稳定的红色。
不同pH值对色相的影响
pH值≤3.0 3.1-3.4 4.0-4.5 6.5-8.0≥8.2
色相黄桔黄大红紫红暗
澄清度沉淀清清清清
稳定性差较好好好差
4.1.2 耐热性好
在一般的肉类制品加工温度下（＜1300C）其颜色不会发生明显变化。此外，红曲色素和红曲红素在酸碱度为中性范围内加热时也比较稳定。
4.1.3 耐光性好
红曲色素和红曲红素对日常光线是比较稳定的，红曲色素的乙醇溶液对紫外线相当稳定。但在太阳光强烈直射下则色泽减弱。
4.1.4 不受金属离子的影响
在1000倍稀释的红曲色素的溶液中加入0.01mol钙离子、镁离子、铜离子，经48小时以后，其红曲色素的残存率均达97%以上。
4.1.5 不受氧化剂和还原剂的影响
400倍稀释的红曲色素溶液中，添加100mg/kg抗坏血酸、亚硫酸钠或过氧化氢，经48小时，其溶
液的颜色仍和最初颜色相同，没有变化。
4.1.6 着色性好
红曲色素和红曲红素对原料的着色性好，尤其是蛋白质或含蛋白质较高的原料着色性更好。这些原料一经着色后再用水洗也很难洗去。
4.1.7 安全性好
红曲色素的安全性很好。动物试验表明，食用红曲色素制作的食物均未发现任何急性、慢性中毒现象。
4.2 肉制品中可应用的几种天然着色剂的特性比较
根据我国《食品添加剂使用卫生标准》（GB2760－1996）规定，在熟肉制品中可以应用的天然着色剂有辣椒红、高粱红、红曲色素、胭脂虫红等。红曲色素除对光的稳定性较差以外，其他特性都较好。胭脂虫红的各方面性质都较好，但色调偏紫；高粱红和辣椒红耐热性不如红曲色素和胭脂虫红，并且高粱红色调发暗，辣椒红色调发黄。从经济效益上分析，达到肉制品色泽要求时，每吨肉制品需要添加不同色素的成本分别为：红曲红25元，红曲色素粉为20元，辣椒红80元，高粱红107元，胭脂虫红200元。在肉制品中添加红曲色素是最经济最合适的。如下是几种色素的特点比较：
4.3 红曲色素粉与亚硝酸盐的使用比较
红曲添加到肉制品中，可以部分代替肉制品中的发色剂—亚硝酸盐。红曲色素的原理是直接染色。红曲色素具有与硝酸盐或亚硝酸盐相似的赋予肉制品良好的外观色泽和风味，抑制有害微生物的生长以延长保存期和防止食物中毒等功能，并且能赋予肉制品特有的“肉红色”，使产品的颜色更自然。
德国肉类研究中心对此进行了研究和探索，结果表明，在腌制类产品添加红曲色素后，完全可以将亚硝酸盐量减少60%，而其感官特性和可贮性不受影响。如果再进一步降低亚硝酸盐用量，则产品风味略有别于原产品。添加红曲色素并减少60%的亚硝酸盐的产品，不仅色泽均匀，其颜色稳定性也远优于原产品。研究人员证实了以1600mg/kg红曲色素为着色剂制作的发酵香肠，其颜色接近以
150mg/kg NaNO2为发色剂制作的发酵香肠。重要的还在于亚硝酸盐的大幅度减少，可使产品中亚硝残留导致的亚硝胺类致癌物出现几率大大下降，对健康意识较强的消费者来说，添加红曲色素加工的产品显然更具有吸引力。
4.4 红曲色素的抑菌与防腐作用
人们很早就知道红曲有一定的抑菌性，我国从古代起就将红曲用做食品保藏剂。红曲色素对肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有较强的抑制作用有抑制作用，对大肠杆菌（Escherichia coli）、灰色链霉菌（Stereptomyces griseus）的抑制作用较弱。
德国肉类研究中心对红曲米提取色素的研究。结果反映出红曲色素的抑菌效果取决于受抑菌群、菌群所处的基质，以及色素对菌群的作用时间，对红曲色素特别敏感的是几种杆菌和单核细胞。如果作用时间较长，则金黄色葡萄球菌也能受到抑制。总的来讲，对革兰氏阳性菌的抑制性比对革兰氏阴性菌强。在波罗维亚型香肠中红曲色素添加的推荐量为4000 ppm，将香肠切片后真空包装，于7℃下贮存时，红曲色素对有害乳酸菌的抑制作用比常规添加80 ppm亚硝酸钠的抑制作用强得多，而对致病性单核细胞增生李司特菌(Listeria monocytogenes)两者抑制效果相等。在发酵香肠中无论是添加红曲色素还是亚硝酸钠，均不会对有利的发酵乳酸菌起到抑制作用。
4.5 红曲色素的保健作用
中医认为，在摄取含脂肪过高，对机体不利的食物时，红曲提取物具有稳定脂肪代谢的保健作用。在肉制品加工中，特别是脂肪含量较高的产品中显得尤为重要。红曲霉发酵在产生红曲色素时，也产生了莫那可林（Monacolin K、L、J）和r－氨基酪酸等具有显著抑制胆固醇合成、降低人体血液中血脂含量、降低血压的药物，以及丰富的麦角固醇、长链脂肪酸及多种抗菌活性物质，这些有益物质对于高血脂病人、肥胖病人，有良好的保健作用。
4.6 红曲色素的使用方法
产品种类
建议使用量
（以色价1000 u/g的产品计）
建议使用方法
肉制品0.3－3g/kg 热水分散或用淀粉预混合后加入
冰淇淋、饮料0.2－2g/kg 用水或食用酒精溶解后加入
鱼制品3－10g/kg 直接加入或用水溶解后加入
辣椒酱0.6－1％直接加入或用水溶解后加入
甜酱 1.4－3.0％直接加入或用水(食用酒精)溶解加入
酱鸡、酱鸭0.1－1.0％直接加入或用水(食用酒精)溶解加入
腐乳0.8－2.0％腌制时加入
4.7 红曲色素在几种肉类制品中的使用方法
红曲色素的使用可由应用厂家根据自己的工艺特点灵活使用，亦可根据下述参考方法使用。添加量为0.1-0.3%。
4.7.1 高温火腿肠类
腌制过程中与亚硝酸盐（硝酸盐）一同添加参与腌制。或在搅拌工序中，与其他辅料一同添加混合均匀。其他工艺不变。
4.7.2 灌肠制品
在搅拌过程中与亚硝酸盐（硝酸盐）及其他辅料按比例添加进行搅拌，混合均匀。其他工艺不变。
4.7.3 广式腊肠
制馅过程中与亚硝酸盐（硝酸盐）及其他辅料按比例加入适量清水中进行溶解分散，再将处理好的肉粒加入，搅拌混合均匀，进行腌制。其他工艺不变。
红曲色素资源的利用现状与开发展望
食用色素是食品工业、制药工业和日化工业不可缺少的一类添加剂，按其来源可分为天然色素和合成色素两部分。近年，由于毒性问题，某些合成色素的应用受到了限制，因此，开发和利用无毒或基本无毒的天然色素，日益受到人们的重视。开发天然色素，改善食品加工品质，是我国食品添加剂工业“九五”期间的发展重点。
红曲是具有我国特色的自然资源。我国是红曲的主要生产国，历史悠久，工艺成熟，生产潜力很大。近年，由于国内消费结构的变化，红酒的消费量逐年减少，导致红曲生产企业普遍不景气，亟待调整产品结构。转产色素有利于这类企业的产品升级换代和提高经济效益。
一、红曲色素的资源特点及其利用现状
红曲色素以粮食为原料，是红曲菌培养过程的代谢产物，基本原料充足，可以满足长年大规模生产的需要。一般情况下，以大米为原料，生产红曲米的回收率可达50％～60％，红曲米的色素含量可达5％～10％，而其它天然色素在原料中的含量则大多在3％以下。由于原料含量较高，因而有利于减少辅助原料消耗和设备占用率，降低生产成本。目前已经在浙江、广东、宁夏、江苏、上海等省、市形成了年产近百吨红曲色素的生产能力，主要生产粉末状和液体红曲红色素。
经过提取，制成红曲色素商品，仅仅是近二三十年的事。随着科学研究的不断深入，红曲色素的应用范围正在逐年扩大。一般情况下，红曲色素可用于各种肉制品、水产品、奶制品、植物蛋白、果品的着色剂和质量改良剂。
二、红曲色素衍生物的开发研究
近年，我们在对红曲色素文献进行系统检索，对红曲色素的成分分析、分离方法、结构改性和性能表征进行了一系列探讨的基础上，制备了一系列红曲色素衍生物，结果表明，红曲色素是一种具有广泛开发前景的天然色素品种。
2.1水溶性红曲红色素的制备
红曲菌代谢过程中产生的红曲色素主要为水不溶性的红斑素和红曲红素，它们只溶于乙醇等有机溶剂。在其分子中含有内酯键，将其碱解，生成羧酸盐，有利于提高其亲水性。采用这一方法，我们解决了红曲红色素的水溶性问题。针对水溶性红曲红色素不耐酸的问题，我们改进了制备工艺，使其耐酸性得到改善。针对水溶性红曲色素亲水性强，容易潮解，不易干燥的问题，我们比较了多种实验方案，探索出一种物耗低、操作简单的制备不含载体的粉末状水溶性红曲红色素的方法。通过实验，我们确定了水溶性红曲红色素采用下述工艺路线制备：醇溶性红曲红色素—碱解—中和—过滤—浓缩—后处理—真空干燥—粉碎—包装。
2.2红曲红（TH型）色素的开发
开发黄色素是扩大红曲色素品种的重要手段。在前期工作中，我们采用硼氢化钠还原红曲色素，得到了黄色素。但受生产成本和安全性方面的制约，很难最终开发成工业产品。在这一基础上，我们探讨了各种还原、氧化、磺化条件对红曲色素显色性能的影响。结果表明，这些条件在不同程度上均能使红曲红色素转化成黄色素。通过对反应条件、原材料物耗、对设备配套的要求、生成物的综合性能等多种因素的综合比较，确定了以含硫化合物与红曲色素反应，生成黄色素。
实验结果表明，以含硫化合物还原红曲色素，使红斑素和红曲红素分子中的环羰基还原成羟基；以碱解使其分子中的内酯键打开，生成羧酸盐，可以明显提高其亲水性，得到水溶性良好的黄色素。黄色素制备工艺路线为：醇溶性红曲红色素—还原—过滤—浓缩—后处理—干燥—粉碎—包装。
2.3红曲色素的提取方法及其工艺条件探讨
红曲色素的分离提取方法直接影响其产品及后续衍生产品的质量和效益。目前生产红曲色素主要采用提取浓缩法或发酵液直接浓缩法，工艺复杂，产品不易干燥，而且纯度较低，耐酸性也不好。我们采用浓缩结晶法从红曲中分离红曲色素，并探讨了溶剂浓度、温度、时间、物料用量比例等因素对色素提取率的影响。结果表明，采用浓缩结晶法，避免了高浓度时红曲中溶解性糖类对浓缩干燥过程的干扰，减少了杂质夹带，降低了物耗，提高了产品纯度。实践证明，这是一条切实可行的工艺路线，其工艺流程如下：红曲米—浸提—过滤—预浓缩—脱杂质—浓缩—结晶—分离—粉碎—干燥—包装。
2.4红曲色素衍生物的理化性能测定及稳定性比较
经测试表明，我们制备的一系列红曲色素可适用于多种用途，其性能指标如表1所示。
将开发的水溶性黄色素的稳定性与现已规模生产的天然黄色素栀子黄和β－胡萝卜素进行了比较，结果表明，水溶性黄色素的主要优点是着色能力较强，热稳定性、耐氧化剂和耐还原剂的性能较好，但是其耐光性较差。其基本性能与β－胡萝卜素相近，而优于栀子黄。
表1红曲色素衍生物性能比较
指标醇溶性红色素水溶性红色素耐酸水溶性红色素水溶性黄色素
λmax(nm)500 488 488 476
溶解性溶于乙醇
溶于水
（pH≥5.5）、乙醇
溶于水
（pH≥3.0）
溶于水
（pH≥3.0）、乙醇
色调色调均不随pH变化
耐热性于100℃下加热2h，吸光度下降率均低于5%
耐光性光照对色素稳定性有一定影响，碱性条件下的光稳定性高于酸性条件下
金属离子的影响对各种离子稳定
Sn2+、Al3+、Fe3+
基本上不影响稳定性
Sn2+、Ca2+、Fe3+、Al3+
不影响其稳定性
2.5水溶性红曲红（TH型）色素毒性试验
我们按照“食品安全毒理学试验方法”，进行了LD50小鼠蓄积毒性试验，小鼠精子畸形试验，小鼠微核试验和Ames试验，结果表明，开发的水溶性黄色素可以达到无毒水平。
2.6试生产产品的应用
通过比较可以发现，开发的水溶性黄色素的λmax与合成色素日落黄十分接近，因而有可能取代这种合成色素。将黄色素试用于芒果汁、水蜜桃汁等饮料，红色素试用于西瓜汁、肉松及其它饮料。结果表明，无论在着色性能上，还是在稳定性上，均有良好的效果。
三、红曲色素资源开发展望
目前，我国已经开发利用的天然食用色素品种较少，大多受生产条件和季节的限制，原料来源不稳定，而且原料成分复杂，色素含量不高，生产成本高，不利于广泛推广。
调节有机物分子中共轭链的长度，改变分子中助色基的种类，可能改变其显色性能。不同极性的基团，则可能改变其溶解性。实验结果表明，红曲色素分子中的内酯键很容易由碱解打开，生成羧酸盐。若将其进一步酯化，形成一系列羧酸酯，就有可能降低其分子极性，提高其亲酯性，得到一系列不同溶解性的色素。采用还原法使红曲色素分子中的环羰基转化成羟基，改变共轭链的长度和助色基的类型，得到黄色素。将这些方法结合，有可能得到一系列脂溶性的红色素或黄色素。色淀法制备不同分散性色素制品有助于改善色素的使用性能和稳定性。开发红曲色素色淀产品，也有助于拓宽这一产品的应用范围。
研究和开发红曲色素系列产品，提供具有我国特色的、溶解性配套的、稳定无毒的红曲红、黄色素产品的生产方法，以便取代安全性较差的合成色素，对于保障人民身体健康，提高农副产品的经济价值，均具有积极深远的意义。
我国允许生产和使用的食用天然色素
食用天然色素是指从植物、微生物、动物材料取得的天然食用着色物质。
它们大多是从植物、微生物、动物可食部分用物理方法提取、纯化的食用着色剂。一般来说，食用天然色素安全性高。例如从红辣椒中提取的辣椒红，由红曲霉菌通过微生物发酵制备的红曲红、由动物胭脂虫体提取制备的胭脂虫红等食用天然色素。天然色素产品来源于生物材料。特别是来源于生物可食部分，一般来说是安全性较高的。但是也要经过严格的毒理学试验和评价，也要进行严格的质量和卫生指标的评估。当确实证明这个产品品种是安全的和有效的，经过全国食品添加剂标准化技术委员会的审评，通过后才能被列入GB2760－1996的名单中，即成为我国允许生产和使用的食用天然色素。这样，生产某种食用天然色素的企业必须按照国家的质量标准生产，产品经检测合格后才能销售和使用。使用食用天然色素的食品加工企业必须执行GB2760－1996中规定的使用范围和最大使用限量。
因此，只要是我国批准允许使用的天然色素品种，按照质量要求生产、执行GB2760－1996中的使
用范围和最大使用限量，就是安全和有效的。例如东莞市天益生物工程有限公司生产的红曲红色素、红曲红（TH型）色素、酱用色素以及绿、蓝、棕、橙等系列油溶性和水溶性天然色素，被广泛应用于肉制品、糖果、调味品、面制品、冰淇淋、饮料、乳制品等，产品安全有效。
我国批准允许使用的食用天然色素品种均已列入到GB2760－1996名单中，总共47种。它们是β
－胡萝卜素（发酵法）、甜菜红、姜黄、红花黄、虫胶红、越橘红、辣椒红、辣椒橙、焦糖色（不加氨生产）、焦糖色（亚硫酸铵法）、焦糖色（加氨生产）、红米红、栀子黄、菊花黄浸膏、黑豆红、高粱红、玉米黄、萝卜红、可可壳色、红曲米、红曲红、落葵红、黑加仑红、栀子蓝、沙棘黄、玫瑰茄红、橡子壳棕、NP红、多穗柯棕、桑葚红、天然苋菜红、金樱子棕、姜黄素、酸枣色、花生衣红、葡萄皮红、蓝锭果红、藻蓝、（淡、海水）、植物炭黑、蜜蒙黄、紫草红、茶黄素、茶绿素、柑橘黄、胭脂树橙（红木素／降红木素）、胭脂虫红、氧化铁红（黑）。这47种已批准允许使用的食用天然色素中，已有15个品种制订了国家标准，它们是虫胶红、红曲米、红花黄、越橘红、萝卜红、栀子黄、甜菜红、焦糖色、可可壳色、β－胡萝卜素（发酵法）、菊花黄浸膏、黑豆红、高粱红、辣椒红、红曲红。
我国地域辽阔，地形和气候多样，植物、微生物、动物品种资源十分丰富，生产各种食用天然色素的资源雄厚。改革开放以来，我国的食用天然色素由科研、开发起步，进而投入中试，迅速产业化。现在，我国已经成为食用天然色素的品种和产量大国。已经形成了一个粗具规模的产业化行业。2004年我国食用天然色素总产销量约为21．013万吨。绝大部分产品用于国内，有约17个食用天然色素品种有出口，出口金额约2．8亿元。出口品种为红曲米、功能红曲、红曲红、辣椒红、高粱红、叶黄素、萝卜红、甜菜红、可可壳色、虫胶红、姜黄素及姜黄油树脂、红花黄、叶绿素及叶绿素铜钠盐、栀子黄、紫甘薯色素、甘蓝红、紫苏红。我国食用天然色素科研、新产品开发、产业化发展迅速。
近几年来，在GB2760－1996名单以外，又已经投入生产和销售的新品种有甘蓝红、万寿菊色素（叶黄素）、紫甘薯色素、紫苏色素、番茄红、功能红曲、洋葱色素、红曲黄等。这些天然色素急需制订使用卫生标准和质量标准。此外，我国科技人员正在研究开发新的天然色素，它们是紫玉米色素、沙雷氏菌红色素、马蹄皮棕色素、枸杞红色素、红毛藻藻蓝蛋白、低聚木糖液色素、大麦麦绿素、大黄色素、石榴皮黄色素、大蒜皮色素、小檗叶红色素、苏木色素、草莓色素、阳荷色素、仙桃红色素、菰红色素、红菜苔色素、亚麻籽色素、山竹果壳红色素、凤仙花红色素、木菠萝黄色素、甘蔗皮红色素、紫穗槐花色素、碱蓬红色素、血红素、山楂红色素、鸡冠花色素、映山红色素、牵牛花色素、柿子皮色素、仙人掌果红色素、女贞果红色素、灰白毛霉红色素、虾青素、商路红色素、五味子红色素、美人蕉色素、茄子皮色素、板栗壳棕色素、丹参色素、黑芝麻色素等。这说明，我国食用天然色素有进一步发展的很大潜力。
微生物发酵法生产透明质酸 郭学平透明质酸（hyaluronic acid, HA）,又名玻璃酸，是一种酸性黏多糖，广泛存在于脊椎动物的各种组织细胞间质中，如皮肤、脐带、关节滑液、软骨、眼玻璃体、鸡冠、鸡胚、卵细胞、血管壁等，其中以人脐带、公鸡冠、关节滑液和眼玻璃体含量较高。透明质酸价格昂贵，在日本有“白金”之称，目前的生产方法有发酵法和提取法两种。 1 透明质酸的发展 1934年美国Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。20世纪70年代，Balazs等从鸡冠和人脐带提取HA，并配制成眼科手术用黏弹性辅助剂—NIF-HA,开创了HA医学应用的先河。 由于HA优良的保湿和润滑性能，20世纪80年代初开始用于高档护肤化妆品，其需求量大幅度增加。受原料限制，从人脐带和鸡冠提取的HA产量低、成本高，不能满足市场需求。为了寻找HA的新来源，降低生产成本，研究了发酵法生产HA。 工业化发酵生产HA是日本资生堂最早开始研究的，他们借鉴前人对某些链球菌产生HA这一重要发现，利用现代发酵技术和设备，以提高HA产率为目的，对发酵生产HA进行了较全面地研究。80年代中期，日本已有发酵生产的HA上市，价格大大低于从动物原料提取的产品。提取法和发酵法生产HA的比较见表1。 表1 提取法和发酵法生产HA的比较
项目提取法发酵法 存在状态在原料中与蛋白质和其它多糖 形成复合体，分离精制复杂在发酵液中游离存在，分离精制容易 分子量与保湿性小于1.0×106,保湿性差大于1.5×106，保湿性强品质与产量取决于动物原料的品质与数量品质稳定，产量大 价格（化妆品用） 2.2万元/kg 1.6万元/kg 应用价格昂贵，化妆品中的添加量 受到制约 能增加化妆品中的添加量 发酵法生产HA方面的研究主要集中在日本、英国和美国也有少量报道。国内从1980年开始研究从鸡冠和人脐带提取纯化HA，在1990年前后 化妆品用HA和医药用HA先后研制成功并生产。山东省生物药物研究院（原 山东省商业科技研究所）是国内最早从事HA研究开发的单位之一，1990 年该院郭学平等在国内首先开始HA的发酵生产研究，先后完成了小试和中 试实验。发酵法生产HA的研究成功改变了我国HA生产技术的落后局面， 使我国HA的生产进入了新的发展时期。 2 化学结构及理化性质 HA是由（1→3）-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖-(1→4)-O-β-D-葡糖醛 酸双糖重复单位所组成的直链多聚糖，见图1。
毕 业 论 文 课题名称 米曲霉的制备 姓 名 学 号 所在系 制药与生物工程系 专业年级P09生物制药 指导教师 职 称 讲师 指导教师 职 称 二O 一二年六月八日
摘要 微生物在酱油生产制曲工艺和发酵过程中起着至关重要的作用，在高盐稀态发酵工艺过程中，培养良好的米曲霉菌种不仅可以提高酱油中总氮、氨基酸态氮含量和酱油风味,而且还可以提高原料利用率。因此米曲霉种曲培养是生产优质酱油的有效保证。本论文主要介绍米曲霉在不同阶段的扩大培养方法，包括试管菌种、锥形瓶菌种、种曲罐菌种、种曲等方面的培养方法及注意事项。米曲霉培养温度为28～32℃,培养时间为72h,米曲霉生长最旺盛作用,此时,曲料的曲酶孢子数大于8×109个/g,蛋白酶活力可达1000mg/100g以上。 关键词米曲霉；温度；时间；试管菌种；三角瓶菌种；扩大培养
目录 引言 (1) 1 菌种的种类 (1) 1.1 米曲霉 (1) 1.2 黑曲霉 (1) 2 菌种的选择条件 (1) 2.1 不产生黄曲霉毒素及其他真菌毒素 (1) 2.2 酶系全、酶活力高 (2) 2.3 对环境适应能力强，生长繁殖快 (2) 2.4 酿制的酱油风味好 (2) 3试管实验 (2) 3.1 灭菌 (2) 3.2 培养基的制备 (2) 3.3 培养基的鉴别 (2) 3.4 接种培养 (3) 3.5 菌种的留选 (3) 4 锥形瓶培养 (3) 4.1 原料配比 (3) 4.2 接种培养 (3) 5种曲制备 (3) 5.1 种曲原料要求 (3) 5.2 做料前检查事项 (4) 5.3 做料 (4) 5.4 蒸料 (4) 5.5 抽真空 (4) 5.6 降温 (4) 5.7 接种 (5) 5.8 自动培养 (5)
开题报告 红曲霉培养培养条件的研究 1背景及其研究意义 红曲霉以其产生红曲色素而得名。红曲自古以来在我国一直用于食品的着色，红曲色素具有稳定性很好，蛋白着色力强，色调柔和，酸碱稳定等优点。随着人们对合成色素具有诱发癌症等毒副作用的认识，天然食用色素日益受到重视。 红曲色素是由红曲霉丝状真菌经发酵而合成的天然色素，由黄色及红色等6种色素组成。红曲霉属真菌门，子囊菌纲，真子囊菌亚纲，曲霉科，菌丝体呈紫红色，菌丝体生长过程中会产生大量胞外色素和胞内色素。可用传统的固体发酵法生产，也可用液体发酵的现代技术生产红曲霉素红曲霉主要用于食品添加剂而具有安全保健的功能。 目前，红曲霉的生产工艺已由传统的固体发酵转向液体深层通气发酵，大大提高了色素的产量和纯度。本课题采取液体深层发酵的方式生产红曲霉素，并研究红曲色素的提取及在食品中的应用：同传统工艺相比，具有更适应大规模，自动化生产的特点。 本课题主要开展液体深层发酵条件的研究，找出红曲霉培养的最佳环境条件，包括温度、酸度、装量纱布层数、转速、发酵时间等。 2实验方法 2.1菌种选择 选取易于培养、产色能力强的红曲霉。 2.2培养基 一级培养基：饴糖5%蛋白胨1.5%琼脂3%PH自然 121℃高压灭菌30分钟
二级培养基：麦芽糖5%豆饼粉2%K2HPO4.3H2O0.5%MgSO4.7H2O 0.25%H2O1000ml PH自然121℃灭菌30分钟 2.3工艺流程 菌种→斜面培养→摇瓶培养→发酵罐培养→测量色价 2.4具体方案 选择出最佳培养条件，设计正交实验进行实验 因素温度(℃)发酵时间(h)转速（r/min）酸度纱布层数(层)装量（ml）12048100 5.5230 22360120 6.0440 ******** 6.6650 427841607.0860 530961807.51070 采用上述培养基配方，根据表格设计安排实验。 2.5测定色价 取发酵液离心后，分别对上清液和沉淀进行了处理，测定胞内色素和胞外色素的OD值，然后把OD值转换为色价，则总色价=胞外因素色价+胞内因素色价。 3预期达到的目标 通过实验，比较总色价，找出最价的正交组合，得出红曲霉的适应培养条件。
黑曲霉发酵生产α-淀粉酶 前言： α-淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，所得产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为α构型，同时该酶能使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶。耐酸性α-淀粉酶是在酸性条件下水解淀粉的酶类，其最适pH在4.0左右。自从日本研究者Y asujiMinoda等人用黑曲霉生产耐酸性α-淀粉酶以来，各国都对耐酸性α-淀粉酶进行了研究。 通过黑曲霉发酵生产α-淀粉酶的实验过程，熟悉发酵罐的构造和使用方法。初步了解发酵生产的原理和常规发酵参数的检测方法。整个实验按照“菌种的培养空消实消接种发酵放罐”的发酵过程进行。在整个发酵的过程中，每隔6h取一次发酵液样品检测其pH值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标。最后将所测数据进行整理、分析，可以得出整个发酵过程各物质的生成和消耗的变化规律以及如何调整培养条件来提高发酵生产的效率，对大工业生产具有重要的指导意义。 正文： 一、实验目的 1．了解发酵罐的几大系统组成，即空气系统、蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。 2．掌握发酵罐空消的具体方法及步骤 3．掌握发酵罐进料及实消的具体方法及步骤 4．掌握发酵罐各系统的控制操作方法 二、实验原理 1.蒸汽系统： 蒸汽发生器：主要用于灭菌，分为自动加水和手动加水两种方式。 2.温度系统： (1) 夹套升温：蒸汽通入夹套。 (2) 夹套降温：冷水通入夹套，下进水，上出水。 (3) 发酵过程自动控温系统 3.空气系统： 空气除菌设备：空压机贮气罐油水分离器空气流量计空气过滤器发酵罐 4.补料系统：补加培养基、消泡剂、酸碱等。 5.在线控制系统
发酵法生产透明质酸 透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是一种大分子的粘多糖,是一种由-D-N -乙酰氨基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸为结构单元,β-1，4-糖苷键连接成的一种链状高分子粘多糖。其分子量在几十万到几百万之间，又称糖醛酸，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，为目前所公认的最佳保湿成分，在化妆品工业、医学研究、临床治疗等领域有广泛的应用。 透明质酸的提炼的方法有三种：组织提取，微生物发酵和化学合成。组织提取法和化学合成法的成本高，产量低，受原料资源限制，不能满足市场需求。而微生物发酵法生产透明质酸具有不受原料资源限制、成本低、产量高、有较高的相对分子量、分离纯化工艺简便、易于大规模生产等特点成为透明质酸生产的发展方向，因此开发先进的微生物发酵法生产HA的技术十分必要。目前HA产业前景广阔，发酵法己成为HA生产的主流工艺，而发酵法生产HA的工艺仍需进一步完善。 微生物产HA的研究可以追溯到上个世纪30年代，1937年，Kendall发现链球菌可以产生HA，后来发现主要是一些A群和C群链球菌，它们具有合成与代谢以HA为主要成分的荚膜的能力。随后很多人进行了大量的研究。研究结果证明某些种属链球菌在一定的环境条件下，能同化吸收葡萄糖或其他碳源，以代谢物形式产生HA。随后经过不断地选育菌种和优化工艺，借助现代深层发酵技术与设备，HA的微生物发酵法被建立和应用起来。目前多选用链球菌、乳酸球菌类等（因此以下均以链球菌举例说明）。日本用发酵法生产了HA制剂．并对该产品做了大量的药效、毒理、药代动力学等非临床实验和临床实验。结果表明，发酵法生产的HA无局部及全身毒副作用、安全性高、疗效确切。 发酵法生产透明质酸主要包括两部分：发酵部分和下游提取工艺部分。发酵法生产HA的质量主要取决于菌种、培养基和分离提纯工艺的选择。 一.发酵部分： 经过阅读与分析文献，我个人将发酵部分划分为以下几个模块： 1.菌种的筛选 2.菌种的诱变 3.培养基配方的优化 4.菌株的最佳培养条件 首先以链球菌制备HA的过程为例简单介绍一下发酵法生产透明质酸的基本流程：链球菌复苏培养后，用诱变剂诱变，挑出不溶血、不含HA酶的高产率菌株。进行稳定传代后增菌培养，所得的菌种即可作为生产菌株。放入发酵培养液后，在通风搅拌的情况下发酵40小时，对粘稠的发酵醪进行提纯分离等处理后得到分子量高、粘度大的HA。
1.菌种特点： 米曲霉( 属于真菌菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。分生孢子梗2mm左右。近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。顶囊近球形或烧瓶形，通常40~50μm。上覆小梗，小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形或近球形，一般μm，粗糙或近于光滑。（半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种）。菌落生长较快，质地疏松。初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。会引起粮食等工农业产品霉变。米曲霉(Aspergillus oryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶,其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。 米曲霉 米曲霉是一类产的，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、、、等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链降解为糊精及各种低分子糖类，如、等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为、及各种，而且可以使辅料中、等难吸收的物质，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于、、生产曲酸、等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。米曲霉是理想的生产不能表达的真核生物活性蛋白的。米曲霉所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵的条件，这将有助于提高食品酿造业的生产效率和产品质量。米曲霉基因组的破译，也为研究由曲霉属真菌引起的曲霉病
红曲红色素简介： 【制法】 (1)将红曲红曲霉接种于发酵培养液中,其发酵温度为32～34℃,调节pH值为6～8,发酵时间为60～90h。 在上述发酵过程中,pH值是变化的,发酵开始调节pH在7.3～7.8,最佳7.5；至发酵22～26h后,pH降为6.8～7.2,最佳7；至发酵46～50h,pH为6～6.5,最佳6.5；保持该pH至发酵结束。 (2)过滤发酵液(1),酸洗含上述菌丝和不溶水的红曲红色素滤饼,之后将滤饼溶入有机溶剂中,同时再向溶剂中加入适量的谷氨酸,调节pH值为9～11,搅拌,过滤,滤液通过可除去剩余谷氨酸的离子交换树脂,接着除去其中的金属杂质,过滤,得到猩红色含可溶水的红曲红色素滤液。 (3)喷雾干燥滤液(2),得到紫黑色改性红曲红色素粉状物。 【用途】本品适用于肉类、奶类制品,糖果,饮料,化妆品,医药等。 红曲色素是一种由红曲霉属的丝状真菌经发酵而成的优质的天然食用色素，是红曲霉的次级代谢产物。红曲色素，商品名叫红曲红，是以大米、大豆为主要原料，经红曲霉菌液体发酵培养、提取、浓缩、精制而成及以红曲米为原料，经萃取、浓缩、精制而成的天然红色色素。 红曲色素合成： 红曲色素是由红曲霉经固体或液体培养生产的一种天然食用色素。故红曲色素的合成，关键在于红曲酶的培养，下面介绍红曲酶的几种常见的培养方法。 固体培养方案：其工艺流程可简化为安卡红曲浅盘培养→曲公槽→曲种→曲种槽→红曲。 现在红曲霉的培养, 以通风式自动制曲机进行固体培养为主体。用面包粉为培养基比用米做培养基的色素生成量增加5~ 6 倍, 而且培养日期缩短到7 天。( 用米培养需9 天) 。此外, 用面包粉培养的红曲比用米培养红曲易提取色素, 且原料价格低廉。 液体培养方案：由液体深层培养生产红曲色素, sp2号红曲霉是最好的色素生产菌。其最适条件: 培养基的pH 6.6 , 温度25 ℃ , 碳源是葡萄糖或乙醇; 氮源是多脉酵母膏, 谷氨酸单钠或酪酰氨基酸, 甘氨酸,L 一苏氨酸, L 一精氨酸, L 一丙氨酸和L 一酪氨酸。这些是促进色素生成的最佳物质。在深层培养中, 菌丝体形状与色素的生产量密切相关。如果菌丝体球形, 色素的生成量最高。 色素组成： 红曲色素是多种色素的混合物，主要有红色系和黄色系2 大类，这些色素都是聚酮类化合物。经元素定性、紫外线、红外线和可见光吸收光谱分析以及核磁共振谱分析，结果认为红曲色素是由化学结构不同、性质相近的红、橙、黄3 类色素组成，已知结构的有10 种。应用价值主要集中在6 种醇溶性的色素：红色的红斑红曲胺、红曲玉红胺，橙色的红斑红曲素、红曲玉红素，黄色的安卡红曲黄素、红曲素。另有2 种新的黄色素Xanthomonascin A 和YellowⅡ已被探明。红曲色素中的黄色成分约占5%，其性质比较稳定，但因其含量低，所以红曲色素呈现红色。 色素性质；
第42卷第5期2008年9月 生 物 质 化 学 工 程B iomass Che m ical Eng i n eering V o.l 42N o .5Sep .2008 黑曲霉液体发酵制备B -葡萄糖苷酶的研究 收稿日期:2008-02-20 基金项目:国家自然科学基金(30471361),江苏省高校自然科学重大基础研究项目(06KJ A22015) 作者简介:刘敏(1981-),女,江苏徐州人,硕士生,主要从事生物质资源生物降解与转化的研究 *通讯作者:勇强,教授,博士生导师,主要从事生物质资源生物降解与转化和制浆造纸生物技术研究。 刘敏,欧阳嘉,勇强* ,余世袁 (南京林业大学化学工程学院,江苏南京210037) 摘 要:研究了培养条件对黑曲霉液体发酵制备B -葡萄糖苷酶的影响及B -葡萄糖苷酶的表观酶学性质。麸皮是黑曲霉B -葡萄糖苷酶的较适诱导物。黑曲霉NL02以40g /L 麸皮为碳源,在250mL 三角瓶中装液40mL,接种量8%,初始p H 值5.5,30e 、170r /m in 下培养10d ,B -葡萄糖苷酶活力为19.12I U /mL 。B -葡萄糖苷酶最适温度为65e ,40e 时稳定性较好;最适p H 值为4.8,在p H 值3.0~5.0之间稳定性较好。关键词:黑曲霉;B -葡萄糖苷酶;麸皮 中图分类号:TQ91;Q 55 文献标识码:A 文章编号:1673-5854(2008)05-0005-04 Preparati on of B -G l ucosi dase by A s p er gillus ni ger i n Sub merged Fer m entati on L IU M i n ,OUYANG-Jia ,YONG Q iang ,YU Sh-i yuan (Co ll ege of Chem ical Eng i neeri ng ,N anji ng F orestry U niversity ,N anji ng 210037,Ch i na) Abstrac t :The effects o f culture cond iti on on B -g lucosidase prepara ti on by A sp ergillus ni ger i n sub m erged fer m en tati on and the apparen t enzym ati c properties of B -g l ucosi dase we re i nvestigated .W heat bran w as the opti m a l i nducer o f B -g l ucosi dase a m ong tested carbon sources .T he opti m al culture cond iti on o f B -g l ucosi dase preparati on by A.n i ger i n subme rged fer m entati on w as 40mL m edi u m i n 250mL shake fl ask ,the i nocu lati on w as 8%,the i nitial p H value w as 5.5,t he culture te m perature and rota -ti on speed of Incuba t o r Shaker w ere 30e and 170r /m in ,respecti ve l y ,and the h i ghest B -g lucosidase acti v ity of 19.12I U /mL w as ob tained for 10days culti v ati on .The opti m a l te m perature and p H va l ue o f B -g l uco si dase reac ti on w as 65e and 4.8,respec -ti ve l y .The B -g l ucos i dase was stab l e unde r 40e and i n t he env iron m ent p H value o f 3.0-5.0. K ey word s :A spergilli us ni ger ;B -g lucosidase ;wheat bran B -葡萄糖苷酶(E C 3.2.1.21)是纤维素酶系的主要组分,其在纤维素水解过程中的作用是将纤维素经内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)和外切葡聚糖酶(EC 3.2.1.91)作用产生的纤维低聚糖和 纤维二糖水解成葡萄糖[1] 。除了纤维素糖化外,B -葡萄糖苷酶还广泛应用于食品、酿造、饲料、纺织、造纸和农业等领域[2] 。虽然自然界中大多数能够分泌纤维素酶的微生物也能合成B -葡萄糖苷酶,但不同的微生物合成B -葡萄糖苷酶的能力有差异。黑曲霉(A s pergillus niger )是较好的B -葡萄糖苷酶生产菌株,本文作者研究了培养条件对黑曲霉NL02液体发酵制备B -葡萄糖苷酶的影响及B -葡萄糖苷酶的表观酶学性质。 1 实验 1.1 菌种 黑曲霉(A s p ergillus ni g er )NL02,由南京林业 大学生物化工研究所保藏。1.2 材料 麸皮,收集于江苏省徐州市,粉碎至0.20~0.28mm;玉米芯、玉米秸秆,收集于江苏省盐城市,粉碎至0.20~0.28mm;硫酸盐纸浆,南京林业大学制浆造纸工程研究所提供;羧甲基纤维素,由上海国药集团提供。1.3 培养基 斜面培养基:PDA 培养基。种子培养基:
透明质酸的生产工艺 透明质酸（HA ）的生产工艺主要分为二大类,以动物组织为原料的提取法和细菌发酵法。透明质酸在动物组织中的分布较为广泛，几乎所有 的动物组织中均含有透明质酸，只是含量 不同。已从下列组织中分离出了透明质酸：结缔组织、脐带、皮肤、人血清、鸡冠、关节滑液、脑、软骨、眼玻璃体、人尿、鸡胚、兔卵细胞、动脉和静脉等，但考虑到原料透明质酸含量的高低、数量的多少和易于取得的程度等成本因素，能够用于生产的原料主要为鸡冠、人脐带和动物眼球。细菌发酵法是利用某些种属的链球菌，在生长繁殖过程中，向胞外分泌以透明质酸为主要成分的荚膜。细菌发酵法与动物组织提法相比，具有生产规模不受动物原料限制，发酵液中透明质酸以游离状态存在,易于分离纯化，成本低，易于形成规模化工业生产，无动物来源的致病病毒污染的危险等优点。透明质酸无种属差异，不同动物组织提取的及不同菌种发酵生产的透明质酸，在化学本质和分子结构上是一致的，只是相对分子质量（Ｍr ）有差别。 一、以雄鸡冠（roostercomb）为原料的生产工艺 （一）、工艺路线： （二）、工艺流程 1．提取冻鸡冠解冻后，用绞肉机绞碎，加适量水用胶体磨磨成糊状，按每1kg 鸡冠加水8L ，加氯化钠80g，搅拌加热至90℃，保温 10min ，冷却至50℃，用1mol/L 氢氧化钠液调pH8.5~9.0, 加入适量胰酶,45~50 ℃保温酶解5~7h ，酶解过程中维持 pH8.5~9.0 。 2．过滤将酶解提取液用滤布加硅藻土加压过滤，得澄清滤液3.乙醇沉淀和粗品干燥取滤液,调pH6.0~6.5, 将滤液加到3 倍体积的95%乙醇中,反复倾倒3 次,待纤维状沉淀充分上浮后,取出沉淀,用适量乙醇脱水3~5 次,放入有五氧化二磷的真空干燥器内干燥,得透明质酸中间品。 4．氯仿处理将透明质酸中间品溶于0.1mol/L 氯化钠溶液中,溶解浓度为0.3%, 溶解过程中加少量氯仿防腐。溶解后，调pH4.5~5.0,加入等体积的氯仿搅拌处理2 次,静置分出水相。5．酶解将水相用稀氢氧化钠溶液调 pH7.5, 加入适量链霉蛋白 酶,37℃酶解24h。 6．络合沉淀酶解结束后，向酶解液中加入同体积的1%氯化十 六烷基吡啶（CPC）溶液，静置，收集HA-CPC 络合沉淀。7．解离将
1.菌种特点： 米曲霉( Asp.oryzae) 属于真菌菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。分生孢子梗2mm左右。近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。顶囊近球形或烧瓶形，通常40~50μm。上覆小梗，小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。（半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种）。菌落生长较快，质地疏松。初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。会引起粮食等工农业产品霉变。米曲霉(Aspergillus oryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶,其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。米曲霉 米曲霉 米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真核生物活性蛋白的载体。米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵
燕山大学 课程设计说明书微生物发酵法生产透明质酸的研究 学院（系）：环境与化学工程学院 年级专业：10生物化工 学号：100110050050 学生姓名：王伟伟 指导教师：张晓宇 教师职称：副教授
燕山大学课程设计（论文）任务书 院（系）：环境与化学工学院基层教学单位：生物工程系
燕山大学课程设计成绩评定表
2013 秋季学期 生物工程专业课程设计 结题论文 微生物发酵法生产透明质酸的研究 学院（系）：环境与化学工程 年级专业：10 生物化工 学号：100110050050 学生姓名：王伟伟 指导教师：张晓宇 教师职称：副教授
为提高微生物发酵生产透明质酸的质量，本设计选用经过突变后的高产兽疫链球菌株做为发酵用的菌种，并且在发酵前经过了严格的灭菌操作。设计内容主要分为三部分：摇瓶培养基组成对透明质酸发酵的影响；培养条件对发酵结果的影响；通过发酵过程中各种参数的变化优化发酵条件。第一部分设计拟采用正交设计法确定最合适的种子培养基；第二部分设计拟单因素分析法确定外界最适发酵条件；第三部分通过测定发酵过程的各种参数绘制参数变化曲线，为发酵条件的优化提供科学依据。通过本次设计，制定出兽疫链球菌生产透明质酸的合适工艺流程。 关键词：透明质酸；兽疫链球菌；正交设计；单因素分析
第一部分文献综述 1 透明质酸 (1) 1.1 概述 (1) 1.2 结构 (1) 1.3 HA理化性质 (2) 1.4 HA的合成和代谢 (3) 1.4.1 HA的合成 (3) 1.4.2 HA的代谢 (4) 1.5 HA的生理功能 (5) 1.5.1 构成多种基质 (5) 1.5.2 保水、润滑、渗透压调节及分子排阻效应 (6) 1.5.3 对细胞的作用 (6) 1.5.4 与蛋白质的结合及其作用 (6) 1.6 HA的应用 (7) 1.6.1 HA在化妆品领域的应用 (7) 1.6.2 HA在医学领域的应用 (8) 1.6.3 HA在食品领域的应用 (8) 2 HA的制备 (9) 2.1 从动物组织中提取 (9) 2.2 微生物发酵法 (10) 3 国内外发展概况及其市场发展前景 (11) 第二部分课程设计 1.材料 (14) 1.1 试验用的仪器 (14) 1.2 试验药品 (14) 2. 方法 (15) 2.1 细菌发酵法生产透明质酸的工艺路线 (15) 2.2 兽疫链球菌发酵生产透明质酸的工艺流程 (15) 2.2.1 摇瓶种子液的培养 (15) 2.2.2 种子罐种子液的培养 (16) 2.2.3 发酵 (16) 2.2.4 下游分离纯化 (16) 2.3 检测方法 (16) 2.3.1 HA 含量的检测方法（Bitter-Muir 咔唑法） (16) 2.3.2 还原糖的测定方法—DNS法 (17)
1.米曲霉是一种好气性真菌,菌丝一般呈黄绿色,米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业。 米曲霉在工业上的应用：用于发酵生产豆豉、豆酱；与黑曲霉、绿色木霉复合发酵用于酱油生产；用于饲料工业；用于酿酒制曲、生产低醇乳糖饮料。 2.葡萄糖淀粉酶又称γ一淀粉酶, 简称糖化酶，糖化酶是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白,在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得,从细菌中也分离到热稳定的糖化酶, 人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶生产方法： a.黑曲霉固体发酵法 工艺流程:试管菌种→三角瓶款曲扩大培养→帘子曲种→通风制曲→成品。 b.液体深层发酵法. 工艺流程:试管斜面种子→种子扩大培养→发酵→过滤→浓缩→干燥→粗酶制剂。
糖化酶成品提取工艺 成品糖化酶可分为液体酶和固体酶2 种, 而固体酶的制备方法又可 分为盐析法、有机溶剂沉淀法和附吸法等, 采用一条合理的提取工艺, 可制备系列酶产品以满足不同行业的需求及降低成品的成本. 目前国外糖化酶生产一般采用液体深层培养, 发酵罐最大可达200m , 罐体都采用不锈钢制造, 冷却系统采用罐外冷却盘管关键阀门都采 用隔膜阀, 培养基可在罐内灭菌, 也可用薄板冷却器作连续灭菌, 并装有节能器, 发酵过程中的控制参数有搅拌功率、溶解氧、空气 中的二氧化碳与氧气量以及温度、P H 等。 糖化酶处理技术： 糖化酶的处理工艺过程分为预处理、固液分离、液体浓缩、酶的沉淀干燥四个工序。国外采用的无机絮凝剂有硫酸铝、碱式氯化铝、氯化铁、锌盐等能在水中形成各种氢氧化物凝胶;采用的有机高分子絮凝剂有聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸(或钠盐) 、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酞胺等。国内外最普遍采用的固液分离设备是板框压滤机, 除此以外, 国外还有管式、多室式、碟式及篮式离心机, 国内主要采用篮式离心机, 也有少数管式离心机的厂家。国内外糖化酶的浓缩方式已从蒸发浓缩发展到超滤浓缩。目前采用的超滤装置有搅拌室式、浅道式系统、套筒膜式和中空纤维。沉淀酶方式, 国内外仍普遍用硫酸钱或硫酸钠等中性盐类盐析糖化酶。 3.植酸提高米曲霉产糖化酶能力:
红曲霉 叶静 （西南民族大学，成都610225） 摘要：红曲霉（Monascus）是我国最早应用于食品加工的有益真菌之一，主要集中应用在传统酒曲、制醋、着色、防腐等领域，国外红曲霉主要应用于肉品加工及其他食品着色方面，其药理活性物质可抑制胆固醇活性、降血压物质和麦角固醇，利用红曲霉可生产纯红曲及添加红曲提取物的胶囊、红曲口服液以及酒、醋、酱油及食品添加剂和饲料等。 1.古代人对红曲霉的认识 红曲是红曲霉在蒸熟的稻米上生长发酵而形成的红色米粒。由于颜色鲜红宛如朱砂，亦称丹曲。红曲是我国古代人的伟大发明。明代李时珍引《丹溪补遗》中的记载是说“以白米饭受湿热蒸变而为红，即成真色，久亦不渝，此乃人窥造化之巧者也。”从雪白的稻米变成紫红色的红米，在没有微生物知识的古代确实给人以神奇、奥秘的感觉，所以有人说红曲是中国古代先人巧夺天工的发明。 2．红曲霉的形态特征 红曲也称红曲霉、红糟、红大米，学名Van Tieghem，是1884年法国人van Tieghem分离鉴定命名的，属于不整子囊菌纲散囊菌目(Eurotiales)红曲科红曲属。 红曲霉在麦芽汁琼脂培养基上生长良好，菌落初为白色，老熟后变为淡粉色、紫红色或灰黑色等，因种而异。菌落呈绒毡状或呈皮膜状，呈皮膜状的菌落少褶皱或具有辐射纹。红曲霉多能形成红曲色素，可分泌到培养基中，使培养基着色。菌丝具有横隔，多核，分枝繁且不规则。细胞幼时含有颗粒，老后含空泡及油滴。分生孢子着生在菌丝及其分枝的顶端，单生或以向基式生出，2~6个成链。闭囊壳呈球形，有柄，柄长短不一。闭囊壳内散生十多个子囊，子囊呈球形，含8个子囊孢子，成熟子囊壁
解体，孢子留在薄壁的闭囊壳内。呈卵球形，光滑，无色或淡红色。红曲霉的生活史 见图： 3.红曲霉的生理生化性质 红曲霉能在15~45℃，最适温度为32~35℃，最适PH为3.5~5.0，有良好的耐酸和耐乙醇能力。能利用淀粉、糊精、麦芽糖、蜜二糖、纤维二糖、葡萄糖、甘油、乙醇、乳酸、苹果酸、柠檬酸等多种糖类和酸类作为碳源，能利用硝基氮、氨基氮和有机氮，而以有机氮为最好的氮源。红曲霉能自身合成生物素、硫胺素、核黄素、麦角固醇等多种维生素。红曲霉可代谢生成多种酶类，有葡萄糖淀粉酶、葡萄糖苷酶、蛋白水解酶、酯化酶等。 4．红曲霉的应用 （1）防腐剂《天工开物》中首次明确提到红曲防止食物腐败的作用：“凡丹曲一种，法出近代。其义臭腐神奇，其法气精变化。世间鱼肉最朽腐物，而此物薄施涂抹，能固其质于炎暑之中，经历旬月蛆蝇不敢近，色味不离初，盖其药也。” 红曲中的抑菌物质红曲色素是红、橙、黄、三种色素的混合物，红曲霉的抑菌作用是有橙色素引起的。红曲色素对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用，对大肠杆菌、灰色链霉菌抑菌作用较弱，而对啤酒酵母、黄曲霉、青霉、黑曲霉无抑制作用。红曲色素灭菌溶液能抑制肉毒梭状芽孢杆菌的生长，对发酵菌株的生长和产酸均无显著影响，因此将其应用于发酵香肠的生产，替代亚硝酸盐应用到肉制品行业是可行的。 （2）色素日本学者对其进行毒性试验证明：红曲色素安全无毒。我国毛宁等对色素提取液进行分析，证明提取液中，不含黄曲霉毒素，可用于糕点、肉罐头、糖果、药片染色。中国食品发酵工业研究所王柏琴等人将红曲色素用在发酵香肠中，代替亚硝酸盐发色，用1．6mg／g红曲色素制作的颜色，更接近于用0．15mg／gNaNO2，取得很好的效果。中国古代人民很早就认识到它的食用价值。红曲用途极
食品安全国家标准 食品中红曲色素的测定 1 范围 本标准规定了食品中红曲红素、红曲素、红曲红胺的测定方法。 本标准适用于果蔬菜汁饮料、碳酸饮料、风味发酵乳、果酱、腐乳、方便米面制品、糕点、饼干、固体饮料、果冻、熟肉制品、烘焙食品馅料等食品中3种红曲色素的测定。 2 原理 试样用无水乙醇或80%乙醇提取后，经填料为N-乙烯吡咯烷酮和二乙烯基苯聚合物（HLB）的固相萃取柱净化，通过反相色谱柱分离，以保留时间定性，外标法定量。 3 试剂和材料 注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 3.1 试剂 3.1.1 甲醇（CH3OH）：色谱纯。 3.1.2无水乙醇（CH3CH2OH）：色谱纯。 3.1.3甲酸（HCOOH ）：色谱纯。 3.2 试剂配制 3.2.1 甲酸溶液（0.1%）：吸取甲酸（3.1.3）1 mL，加水稀释并定容至1 L，混匀。 3.2.2甲醇溶液（20%）：量取甲醇（3.1.1）20 mL，加水稀释并定容至100 mL，混匀。 3.2.3甲醇溶液（40%）：量取甲醇（3.1.1）40 mL，加水稀释并定容至100 mL，混匀。 3.2.4乙醇溶液（80%）：量取乙醇（3.1.2）800 mL，加水稀释并定容至1 L，混匀。 3.3 标准品 3.3.1 红曲红素标准品（C23H26O5），纯度≥99.0%。 3.3.2 红曲素标准品（C21H26O5），纯度≥97.0%。 3.3.3 红曲红胺标准品（C23H27NO4），纯度≥99.0%。 3.4 标准溶液配制 3.4.1 红曲红素、红曲素、红曲红胺混合标准储备溶液：分别准确（精确至0.01 mg）称取红曲红素0.25 g、红曲素5.0 mg、红曲红胺5.0 mg于50mL小烧杯中，加甲醇溶解，用甲醇转移到50 mL容量瓶中，定容，混匀，于4 ℃保存，其中红曲红素质量浓度为5000 μg/mL、红曲素100 μg/mL、红曲红胺100 μg/mL。 3.4.2 红曲红素、红曲素、红曲红胺混合标准曲线工作液：分别吸取混合标准储备溶液0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、5.00 mL、10.00 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，混匀，于4 ℃保存。 3.5 材料
两种曲酶糖化性质的比较研究在国内传统的制酒行业中，由于黑曲霉含有丰富的酶系如液化酶、糖化酶、纤维素酶和蛋白酶等，自70年代大多都由米曲霉改为黑曲霉作糖化用菌种。但在日本迄今仍在采用米曲霉做糖化菌，说明其中必有原因。鉴于此，本实验以黑曲霉和米曲霉为研究对象，研究比较它们的液化酶和糖化酶（葡萄糖淀粉酶）生产性质。 黑曲霉是一种常见的真菌, 属于半知菌类曲霉属。黑曲霉对营养要求较低, 只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好。黑曲霉可以产生许多种酶, 现已成为工业应用常见的菌种之一。根据bigelis1989年的统计, 25种主要商品酶制剂中就有15种来源于黑曲霉仁, 。它们分别是α-淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、半纤维素酶、橙皮昔酶、脂肪酶、果胶酶、蛋白酶、单宁酶。美国准许使用的食品工业用酶生产菌种只有黑曲霉、酵母、枯草杆菌等约20种, 其中以黑曲霉所产酶类最多。我国酶制剂工业生产用菌种中, 黑曲霉占了17种中3种, 即黑曲霉变异株和,它们分别用于糖化酶、果胶酶和酸性蛋白酶的生产[1]。黑曲霉酶类在工业上具有重要的作用, 例如, 柠檬酸等有机酸的发酵生产、食品及饮料加工以及用于轻化工业、纺织工业、饲料加工和废物的处理等等。总之, 黑曲霉生产的酶制剂具有用量大、应用范围广、安全性好的特点, 已愈来愈受到人们的重视。 米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业。 1 材料与方法 1．1材料 菌种：黑曲霉UV-48；米曲霉-4 1．2培养基 种子培养基（土豆汁培养基；察式培养基）；发酵培养基（麸皮培养基；液
WOIRD格式 1.菌种特点： 米曲霉(Asp.oryzae)属于真菌菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色， 后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为 疏松柱状。分生孢子梗2mm左右。近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。顶囊近球 形或烧瓶形，通常40~50μm。上覆小梗，小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也 有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形 或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。（半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真 菌中的一个常见种）。菌落生长较快，质地疏松。初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色， 背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食 品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。会引起粮食等工农业 产品霉变。米曲霉(Aspergillusoryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶, 其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。 米曲霉 米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、 植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子 糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为 蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解， 提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵 工业，并已被安全地应用了1000多年。米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真 核生物活性蛋白的载体。米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵 专业资料整理
第２７卷第６期路秀玲等：红曲霉固态发酵中生物量的测定方法４５ 红曲霉固态发酵中生物量的测定方法 路秀玲赵树欣刘忠华 （天津轻工业学院食品工程系，天津，３００２２２） 摘要探讨了红曲霉固态发酵中生物量的测定方法。红曲霉固患发酵的生物量基本可以 通过测定红曲霉酋体细胞中的麦角固谆和氨基葡糖含量来推断．对于幸文中红曲霉固态发肆 采用氨基葡糖法相对较好，可以估测出固志发酵物中的茁体量。底物于重减重与苗体量存在 一定的正向关系，通过测定底物减重可以推断出红曲霉生长代谢状况，并且方法筒便易行，易 于实现在线监测。 关■调红曲ｌ生物量固态发酵 目前对红曲霉发酵的研究多集中于液态发酵，但固态发酵与液态发酵相比具有产量较高、后处理简单、对环境污染小、产品更安全等优点。固态发酵中生物量的测定方法国内报道很少，国外多集中为以下４大类：（１）直接从固态培养基中分离测定，如除去基质、直接计效等；（２）通过检测代谢活动推断生物量，如测定０２和ｃ０２的代谢量、胞外酶量、ＡＴＰ等；（３）测出生物体中某些特殊物质（如蛋白质、总糖、核酸、氨基葡糖、麦角固醇等）的含量推测生物量；（４）利用与茵体生长有关的某些现象（如压降、底物减重等）估测生物量［２］。红曲霉菌丝发达，与培养基结合紧密，故无法直接测定。从报道的结果中可以看出各种间接测定方法均有一定的局限性，如产生单位菌体量所需的ｑ量或排放的ｃ０２量会随菌龄变化［３１；细胞的特殊生物组分含量会因不同菌种、培养条件和培养时间而不同【３ｏ；检测时间长、过程繁复影响测定的精确性，因此很难判定哪种检测方法最好。有关红曲霉固态发酵生物量测定方法尚未见报道。综合对固态发酵生物量问题的研究结果，本文选用较为准确且易行的几种方法：测定细胞中的特殊物质如麦角固醇、氨基葡糖等组分含量推测生物量（核酸提取过程复杂，故不采用）；研究由于生物体代谢释放ｃＱ 第一俸者：萌士研究生。造成的底物减重与生物量的关系。力求确定一种操作简便。能快速准确测定生物量或反映生物生长状态的方法。 １材料与方法 １．１菌种 烟灰色红曲霉（Ｍｊｎ口”ｍ彬培ｉ”ｎ”“５）。１．２测定方法 １．２．１地菌体的制备 采用膜培养法：在麦芽汁平板上铺一层无菌的玻璃纸，吸取由斜面制得的孢子悬浮液Ｏ．５ｍＬ铺于膜上。３０℃保温培养７ｄ＇再降到２５℃培养到１４ｄ，然后将菌膜从玻璃纸上剥下，８０℃烘干即为纯菌体。 １．２．２固态发酵样品的制备 将大米浸泡１０ｈ．洗净沥干，称４０９装入２５０ｍＬ三角瓶１２ｌ℃高压蒸米３０ｍｉｎ。冷却后接人孢子悬浮液１ｍＬ（含孢子约１０７个），调初始水含量为５０％。３０℃保温培养７ｄ，再降到２５℃培养１５ｄ．成品于８０℃烘干，磨成粉即为待测样。 １．２．３发酵底物减重的测定 每次取３个２５０ｍＬ三角瓶，将其中的固态发酵物于８０℃烘干，准确称其干重，计算其与初始发酵底物干重的差值即为底物减重。