文章编号:100025404(2002)0720855203论著
双标记流式细胞术定量分析52FU诱导胃癌细胞早期凋亡
雷 晓,余佩武 (第三军医大学附属西南医院普通外科,重庆400038)
提 要:目的 以Annexin V2FIT C/PI双标记流式细胞术检测52FU诱导胃癌细胞株SCG7901早期凋亡。方法 250、125、50以及25mg/L不同浓度52FU处理SCG7901胃癌细胞0、6、12、18、24、30h,Annexin V2FIT C/PI双标记流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡。结果 早期(0～24h)瘤细胞凋亡比例随5-FU作用剂量增加和时间延长而显著提高(P<0101);后期(24～30h)瘤细胞以坏死增加为主(P<0101)而凋亡比例反而降低。结论 52FU诱导细胞凋亡呈时间以及剂量依赖关系。Annexin V/PI双标记法可以清楚区分正常、坏死、机械损伤以及凋亡细胞群落,是定量分析早期细胞凋亡的准确方法。
关键词:胃癌;凋亡;52氟尿嘧啶;Annexin V;流式细胞术
中图法分类号:R329.28;R446.113;R735.2 文献标识码:A
Q uantitative analysis of early apoptosis of gastric tumor cells induced by52FU with An2 nexin V2FITC/PI double2labeled flow cytometry
LEI X iao,Y U Pei2wu(Department of G eneral Surgery,S outhwest H ospital,Third M ilitary M edical University,Chongqing400038,China)
Abstract:Objective T o quantify the early apoptosis of gastric cancer cell line SCG7901induced by52FU flow cytometry with Annexin V2 FIT C and PI double labeling.Methods The tum or cells were treated with52FU at concentration of250,125,50,and25mg/L.The apoptosis was detected0,6,12,18,24,30h after the treatment by using flow cytometry with Annexin V2FIT C and PI double labeling method.Re sults Early apoptosis percentage of tum or cells(0-24h)was increased significantly with the affected time and the content of52FU.But it was decreased during 24-30h after the treatment,while m ore necrotic cells were seen at same time.Conclusion 52FU can induce early apoptosis of tum or cells in a time and dosage2depended manner.Annexin V2FIT C/PI double labeling flow cytometry can distinguish dead cells from early apoptotic cells and be of great use in tum or cell apoptosis quantitative analysis.
K ey w ords:gastric cancer;apoptosis;52FU;Annexin V;flow cytometry
化疗药物可以通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑制、杀灭肿瘤。但通常的肿瘤细胞凋亡研究方法包括凋亡小体形态学观察、DNA凝胶电泳看Ladder、DNA断裂末端标记(T UNE L)等均存在灵敏性与特异性的矛盾,尤其是不易将坏死细胞与凋亡细胞区分开。细胞凋亡的早期细胞膜变化有磷脂酰丝氨酸(Phosphatidy serine,PS)暴露,这一改变早于细胞形态改变及DNA断裂。An2 nexin V是一种Ca2+依赖磷酸脂结合蛋白,对PS有高度亲和性,可以用作检测PS暴露的特异性探针检测细胞早期凋亡[1]。本研究利用Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测52FU诱导胃癌细胞株凋亡,探讨该方法在早期细胞凋亡检测中的作用。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 胃癌细胞株及其培养 人胃腺癌细胞株SCG7901购自上海细胞生物所。细胞在含10%小牛血清的DME M(GI BC O)培养基37℃、5%C O2、饱和湿度下培养,取对数生长期细胞。
1.1.2 主要试剂与仪器 Annexin V Flous S taining K it (R oche)、52FU;流式细胞仪(Beckman C oulter,E pics X L型)
作者简介:雷 晓(1970-),重庆市人,主治医师,主要从事胃肠道肿瘤生物治疗方面的研究。电话(023)68755991
收稿日期:2001208222;修回日期:20012102201.2 方法
1.2.1 肿瘤细胞处理 收集对数生长期细胞,调浓度为1×106个/ml,接种于24孔培养板,每孔1ml。细胞培养箱培养48h 后用新鲜培养基换液,同时分250、125、50、25mg/L终浓度加入52FU。在药物处理6、12、18、24、30、36h后以0125%胰酶消化、吹打收集,P BS离心洗涤2次后备用。
1.2.2 流式细胞仪检测 按1∶1∶50比例将Annexin V2FIT C、PI、HEPES缓冲液配成Annexin V-FIT C/PI染液。每100μl染液重悬1×106个瘤细胞,室温下孵育15min后加入1ml HEPES缓冲液混匀上机。以488nm波长激发525、620nm带通滤片分别检测FIT C和PI荧光。每样本收集20000个细胞荧光信号。1.2.3 数据分析 Annexin V2FIT C/PI双标记流式细胞术可以将实验样本中正常、坏死、凋亡细胞区分开。以FIT C和PI荧光作双参数点图,可见肿瘤细胞分为四个亚群:A:Annexin V2 FIT C-、PI-,代表活细胞。B:Annexin V2FIT C-、PI+,代表机械损伤细胞。C:Annexin V2FIT C+、PI-,为早期凋亡细胞。D:An2 nxin V2FIT C+、PI+为坏死细胞。分别计数四群细胞比例并在不同52FU浓度组和处理时间长短间进行t检验。
2 结果
2.1 流式细胞检测
Annexin V2FIT C/PI双参数图上可见初期细胞主要分布于第三象限(Annexin V-PI-)。52F U处理后肿瘤细胞分布出现明显改变,第四象限细胞(Annexin V+PI-)增加并随时间进程比例提高。后期第二象限细胞(Annexin V+PI+)分布也明显增加,见图1。
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第 三 军 医 大 学 学 报
ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AE
V ol.24,N o.7
Jul.2002
图1 125mg/L 52FU 作用24h 后流式细胞术检测凋亡
Fig 1 R esults of flow cytometry w ith A nnexin V 2FITC/PI double
labeling on the apoptosis of cancer cells induced by 52FU
2.2 数据分析
分析表明,SCG 7901细胞在52FU 处理6h 后其细胞凋亡在各浓度组间无明显变化(1152%～4115%,P >0105);药物作用12h 后,光镜观察未发现各组间有明显变化,细胞依旧贴壁生长,但流式细胞术在各药物处理组均可以检测到明显细胞凋亡,12～24h 间细胞凋亡随时间进程逐步提高。并且,各组间细胞凋亡比例在药物浓度间差异有显著性意义(P <0101)。其中高浓度组(250mg/L )在24h 点肿瘤细胞凋亡比例达6112%。 肿瘤细胞坏死也逐渐增加并呈明显时间依赖关系但坏死比例对药物浓度的依赖关系远不如细胞凋亡明显。药物作用24～30h 以后,50～250mg/L 浓度组肿瘤细胞凋亡不增反降。光镜观察培养细胞,可见药物处理24～30h 后瘤细胞出现大片脱落、悬浮。同时流式细胞仪检测发现:无药物处理组瘤细胞的凋亡与坏死比例也有增加(1416%和6121%)。这可能与培养板孔中肿瘤细胞大量增殖、培养基营养消耗有关,见图2,3
。
图2 SCG 7901肿瘤细胞凋亡的时间、剂量关系曲线Fig 2 Curve of apoptosis percentage of 52FU induced SCG 7901cells
under treated time and drug
contents
图3 SCG 7901肿瘤细胞坏死的时间、剂量关系曲线
Fig 3 Curve of necrotic percentage of 52FU induced SCG 7901cells
under treated time and drug contents
3 讨论
细胞凋亡事件发生时间顺序一般依次为受体激活、
线粒体功能减低、Caspase 家族激活、PS 暴露、DNA 断裂、形态改变等。传统的凋亡检测方法如观察凋亡小体、T UNE L 法标记DNA 断裂实际是检测凋亡晚期甚至是已经死亡细胞的改变。检测凋亡早期细胞膜PS 暴露的方法,比检测DNA 断裂或形态改变更能反映凋亡的启动。因此,使用能特异性结合细胞膜PS 的Annexin V 作为探针,可以检测细胞早期凋亡。并且,利用碘化丙啶(PI )不能透过完整细胞膜的特点,可以使用Annexin V/PI 双标记法将凋亡细胞、坏死细胞、损伤细胞与正常细胞区别开[2]:其中Annexin 2V 单阳性细胞为凋亡细胞,Annex 2in 2V 与PI 双阳性细胞为坏死细胞,双阴性细胞为活细胞。利用此方法定量分析常规化疗药物52FU 对于胃癌细胞株SCG 7901的凋亡诱导作用也看到:经52FU 作用后,光镜下各组细胞形态在12h 点并无明显改变,无法与对照组相区别。而使用双标记流式细胞术检测发现:50～250mg/L 浓度组肿瘤细胞的Annexin 2V 2FIT C 单阳性细胞比例较其6h 点时已经有明显增加,说明其细胞已有早期凋亡。52FU 作用24h 后光镜下才可见显著细胞生长状态改变,而此时细胞凋亡比例已达到高峰。因此,Annexin V/PI 双标记法可以在细胞形态尚未出现改变时检测到细胞凋亡。此后,由于使用24孔板培养细胞,加入其中的52FU 没有洗出,持续作用于肿瘤细胞,使其完全失去增殖能力,而培养孔中的Annexin 2V 单阳性细胞会进一步转化为Annexin 2V/PI 双阳性细胞,造成后期30h 点检测发现50～250mg/L 浓度组细胞凋亡比例下降。不是凋亡减少,而是凋亡细胞转化为死亡细胞的原因。同样,由于培养孔没有换液,空白组在培养一定时间后,由于细胞快速增殖、营养物质消耗,其凋亡和死亡也有增加的趋向。 本研究表明,Annexin 2V/PI 双标记流式细胞术在细胞形态尚未明显改变时可检测出早期凋亡增加,快速准确得到时间、浓度与凋亡的关系曲线,并且能将凋亡细胞与坏死细胞区分开。说明该方法在检测细胞早
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期凋亡中有特异性、准确性高的特点,为探讨化疗药物对肿瘤细胞的作用机制及效果分析提供理想手段;并为临床早期凋亡检测提供新手段。
参考文献:
[1]Vermes I,Hannen C,S teffens2Nakken H,et al.A novel assay for apopto2
sis.Flow cytometric detection of phasphatidylserine expression early apop2 totic cells using flourescein labeled Annexin V.J.Immunol[J].M ethods, 1995,184(1):39-51.
[2]郑骏年,谢叔良,陈家成等.流式细胞术定量检测细胞凋亡3种方
法的比较研究.中国免疫学杂志[J].1999,15(10):467-469.
(编辑 汪勤俭)
文章编号:100025404(2002)0720857201个案与短篇急性脑卒中并发高渗性非酮症糖尿病昏迷的治疗体会
Experiences in the treatment of acute cerebral paralysis complicated with nonketogenic hyperosmolar hyperglycermic coma
汪 毅 (合川市人民医院急救中心内科,合川401520)
例1,男,54岁。患者入院前1年患“脑梗死”后遗留左侧肢体轻瘫,入院前1d出现右侧肢体活动不灵伴言语不清入院治疗。否认高血压、糖尿病、冠心病史。人院查体:体温36℃,血压146/98mmHg。心、肺、腹未见异常。意识清楚,不完全运用性失语。左眼裂小,左侧瞳孔(215cm)<右侧瞳孔(411mm),左眼球略内陷,眼球各方向运动自如。左面部汗少。右侧鼻唇沟浅,伸舌右偏。左侧肢体肌力Ⅱ级,右侧肢体肌力Ⅱ级。双侧病理征呈阳性。入院当日头颅CT提示:双侧基底核区脑梗死。心电图:冠状动脉供血不足。血常规、血钾、钠、氯、血尿素氮、二氧化碳结合力、血脂均正常,血糖1515mm ol/L,尿糖(+),尿酮体(-)。给予20%甘露醇125ml加速尿20mg,每日3次,静滴,同时给予丹参针,ATP、辅酶A,5%G S+胰岛素等治疗,同时注意保持出入量及电解质的平衡。入院第2天,病情加重,出现嗜睡状态,入院第3天,呈昏迷状态。急查血糖4410mm ol/L。血钾511mm ol/L,钠150mm ol/L,氯96mm ol/L,血尿素氮10 mm ol/L,二氧化碳结合力19198mm ol/L,尿糖(++++),尿酮体(+),血浆渗透压力36410mOsm/L。考虑并发高渗性昏迷,停用脱水剂,给予大量补液,小剂量胰岛素静脉滴注(6U/h),同时加强对症处理。病情一度好转,但于入院第4天死亡。
例2,男,60岁。患者于入院前1天,看电视中突然出现左侧肢体活动不灵,伴头痛、呕吐,以“脑出血”收入院。高血压病史10年。否认糖尿病、冠心病史。入院查体:温度36℃,血压173/113mmHg。心、肺、腹未见异常。嗜睡状态,脑膜刺激呈阴性。两眼球向右凝视,左侧肢体肌力0级,右侧病理呈阳性。入院当日头颅CT提示:右侧基底核区脑出血,心电图、血常规、血脂正常,血糖1116mm ol/L,尿糖(-),尿酮体(-)。给予20%甘露醇125ml加速尿20mg,每日4次静脉滴注,同时给予止血、预防感染、纠正水电解质平衡等处理。入院第7天,病情突然加重,呈浅昏迷状态。复查头颅CT提示为右侧基底核区脑出血吸收期,无新出血灶,复查血糖5010mm ol/L,血钾515 mm ol/L,钠140mm ol/L,氯92mm ol/L,血尿素氮2416mm ol/L,二氧化碳结合力19160mm ol/L,尿糖(+++),尿酮体(+),计算渗透压为36516mOsm/L。考虑并发高渗性昏迷,停用脱水剂,增大补液量,同时小剂量静脉滴注胰岛素(6U/h)及对症治疗。入院第9天死亡。
作者简介:汪 毅(1962-),男,重庆市人,主治医师,主要从事神经内科、急救医学方面的研究。电话:(023)42720953
收稿日期:2002204227;修回日期:2002206220
例3,女,52岁。患者于入院前3d无诱因出现右侧肢体无力伴言语不清,以“脑梗死”收入院。高血压病史20年,糖尿病病史10年。入院查体:体温3618℃,血压195/105mmHg。心、肺、腹未见异常。意识清楚,不完全运动性失语,同时有命名性失语,失读,计算不能,不能识别手指,左右侧认识不能,书写不能,右侧鼻唇沟浅,伸舌右偏。右侧肢体肌力Ⅱ级,右侧病理呈阳性。入院次日头颅CT提示:左侧基底核区及顶枕叶区多发性脑梗死。心电图、血常规正常。血糖518mm ol/L,尿糖(-),尿酮体(-)。给予甘露醇、低分子右旋糖酐、ATP、辅酶A等治疗,同时注意水电解质平衡。入院第3天出现烦躁、口渴、呕吐,当晚出现昏迷。急查血糖为3718mm ol/L,尿糖(+++),尿酮体(+),血钾512mm ol/L,血钠140mm ol/L,血氯110mm ol/ L,血尿素氮20mm ol/L,二氧化碳结合力19160mm ol/L,计算渗透压为89719kPa(34812mOsml/L)。考虑并发高渗性昏迷,给予小剂量胰岛素(6U/h)静脉滴注,同时给予增大补液量及对症治疗。入院第4天死亡。
2 讨论
急性脑血管病并发高渗性昏迷,病死率极高[1]。在治疗急性脑血管病的过程中,首先应预防高渗性昏迷的发生,需注意:①脱水剂用量及使用时期,对有糖尿病或血糖高的患者应慎重。②慎用激素治疗,尤其在血糖增高时。③在血糖增高时,应适量应用胰岛素治疗。其次是早发现及时治疗。出现意识障碍时,下列情况要考虑到合并高渗性昏迷的可能,并及时查血糖、尿糖等化验。①临床症状难以用急性脑血管病解释或相应治疗无效者;②重度脱水或休克,而尿量并无明显减少甚至增多者,③出现原因不明的进行性意识障碍,尤其静脉滴注大量脱水剂、葡萄糖、激素或合并感染时。治疗高渗性昏迷需大量补液,而大量补液又可致颅压升高,使病性恶化。故补液要适量,速度以迅速纠正血浆的高渗状态和脱水、恢复血容量为宜。同时用胰岛素治疗,使血糖缓慢稳定地下降至理想水平。还要加强对症处理及注意监测水电解质及酸碱平衡。
关键词:脑血管疾病;糖尿病;高渗性昏迷
中图法分类号:R743.306;R587.2 文献标识码:B
参考文献:
[1]黄耀忠.脑卒中并发高血糖高渗性非酮症综合征11例报告[J].新
医学,2000,31(6):348.
(编辑 张大春)
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ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AE
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流式细胞仪检测技术与质量 控制 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
流式细胞仪检测技术与质量控制 【摘要】流式细胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。 【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制 流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。
1 材料与方法 1.1 标本收集 收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。 2 检测方法 2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。 2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。 3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，在
精品文档，放心下载，放心阅读 流式细胞仪常用的几种检测方法（转载） 一、测定用乙醇固定的DNA的含量 1、培养细胞的DNA含量的测定精品文档，超值下载 制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中； 加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存； 附:细胞固定的一般步骤 1) 取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中； 2) 300g离心5分钟，弃上清，反复两次； 3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中； 4) 将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分 钟。在4℃条件下可保存2~3周。 注意： 2根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛； 2将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃； 2细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。 2 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中； 2显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤； 2加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟； 2上机检测。 2、新鲜组织的DNA含量的测定 1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液； 2) 500g离心5分钟； 3) 弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中； 4) 再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤； 5) 上机检测。 3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定 1) 从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液； 2) 用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清； 3) 加入PI液1ml室温避光30分钟； 4) 调整细胞浓度为1×106/ml； 5) 上机检测。
流式细胞仪检测细胞凋亡——Annexin V/PI 双染色法 基本原理 细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目早期识别仍有困难些细胞膜表面的改变之是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。 试剂与仪器 l孵育缓冲液：10mmol/L HEPES/NaOH，PH 7.4，140mmol/L NaCl，5mmol/L CaCl2 l标记液：将FITC- Annexin V（宝灵曼公司产品）和PI加入到孵育缓冲液中，终浓度均为1ug/ml l流式细胞仪 实验步骤 1. 细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞为（1~5）×106，/mL 500~1000r/min离心5min，弃去培养液。 2. 用孵育缓冲液洗涤1次，500~1000r/min离心5min。 3. 用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15min。 4. 500~1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。 5. 加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。 6. 流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长于560nm的滤器检测PI。 7. 结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在
胃癌细胞凋亡基因 西安国医肿瘤医院研究人员通过大量的研究分析发现，胃癌细胞凋亡是有相关基因控制的，目前发现的有以下三个基因：bcl-2基因、Bax和Fas/FasL。下面来详细介绍： 1.bcl-2基因 bcl-2基因编码26kD的膜蛋白，是第一个被确认有抑制凋亡作用的基因。bcl-2基因激活、过表达可抑制细胞凋亡，从而使细胞增殖和凋亡不平衡，而且会使具有遗传改变又得不到修复的细胞免于死亡而进入细胞循环，多种遗传成分改变可导致肿瘤的发生。因此，bcl-2在肿瘤发生发展中起着重要的作用。 乳腺癌中，高表达的Bcl-2与乳腺癌细胞凋亡指数呈负相关，而且与有丝分裂指数呈正相关，提示在细胞增殖活跃期，Hcl-2阳性细胞凋亡减少，即Bcl-2过表达影响了细胞凋亡。Nakamum检测了肠型胃癌、胃腺瘤、肠化生及非化生胃黏膜，发现在肠化生中Bcl-2蛋白表达量最高(77.1%)，胃腺瘤(37.5%)和肠型胃癌(10.8%)中较低。 因而认为，Bcl-2蛋白的过表达主要是在胃癌的早期阶段起作用，使转化细胞逃避凋亡，以进一步积累其他基因的异常。Lauwers采用单克隆抗体124检测正常、伴有肠化生的萎缩性胃炎及异型增生胃黏膜，发现正常胃黏膜仅在胃小凹与腺体交接处增生的干细胞中有Bcl-2蛋白的微表达，而在肠化生黏膜的过增生区域及胃小凹表面分化不良的细胞中均可检测到Bcl-2，这些分化不良的细胞正是胃癌癌前病变的一个特征。 因此推测，胃黏膜受损后增生加快，导致一些分化不良的细胞出现，这些分化不良的细胞又因Bcl-2蛋白的过表达而逃避凋亡，呈现生长优势，细胞寿命延长，基因变异积累的机会增加，为进一步向恶性细胞转化提供了条件。 2.Bax Bax是第一个被分离到的Bcl-2家族成员之一，与Bcl-2的同源区主要集中在BH1和BH2区。Bax的功能与Bcl-2相对，可促进细胞的凋亡。Bax与Bcl-2在体内的表达呈部位互补形式。Bcl-2倾向于分布在生长细胞、增殖细胞，而Bax倾向于分布在终末分化细胞、退化细胞，在凋亡旺盛的细胞中表达更强。 国外Komatauin报道，在胃黏膜癌变的早期阶段，即已发生Bax的表达异常。
胃癌临床治疗概况整理 目录 1. 概况 (1) 2.胃癌靶向治疗 (2) 2.1. HER2靶点与曲妥珠单抗 (2) 2. 2 VEGF 靶点与相关靶向药物 (3) 2. 3 EGFR 靶点与西妥昔单抗 (3) 2. 5 mTOR靶点与依维莫司 (4) 2.3 胃癌靶向治疗小结 (5) 3. 胃癌化疗 (5) 3.1 胃癌的化疗 (5) 3.2 胃癌化疗小结 (6) 参考文献 (7) 1.概况 胃癌是世界第四大常见类型的癌症(934 000 例新病例，占所有新发癌症病例的8．6%)，是全球第二大癌症死亡原因( 每年死亡人数达70 万)1。而包括中国在内的亚洲地区发病率最高。根据世界卫生组织(WHO) 2012 年数据统计，世界上每年有一百万新发的胃癌病例，超过40% 的病例就发生在中国2。目前由于筛查手段的限制，我国大部分胃癌患者初次诊
断就已经处于进展期。因此，胃癌的研究与治疗显得尤为重要。 2.胃癌靶向治疗 目前化疗是晚期/转移胃癌患者的主要治疗手段，但是患者的中位生存时间仍较短(8～11 个月)，因此，寻找更有效的联合化疗方案是胃癌的重要研究方向。尽管胃癌的发病机制尚不完全清楚，但是通过对胃癌发生、发展、复发和转移过程中分子生物机制的研究，胃癌相关的分子靶点就产生了。目前主要研究靶点有HER2、VEGF、EGFR和C-MET 等。 2009年ToGA研究的成功宣告胃癌治疗进入分子靶向时代，ToGA试验是一个在胃癌的靶向治疗中具有里程碑式意义的III期临床试验，首次将患者延长至1年以上，大大提高了进展期胃癌患者生活质量3。目前已经完成胃癌靶向药物Ⅲ期临床研究的药物有曲妥珠单抗、雷莫卢单抗、阿帕替尼。 2.1. HER2靶点与曲妥珠单抗 HER-2 是目前临床意义最明确、应用最广泛的靶点。HER2 属于酪氨酸激酶受体，具有酪氨酸激酶活性但缺乏特异性配体，是一种原癌基因通过17 号染色体ERBB2 编码4。HER2 在许多组织中，包括乳腺癌、胃肠道、肾脏和心脏中表达。它通过与肿瘤细胞增殖，凋亡，粘附，迁移而导致肿瘤发生的关键驱动因素。 曲妥珠单抗(trastuzumab)是针对HER-2 的完全人源化单克隆抗体抗体5，美国FDA 批准用于HER-2 阳性乳腺癌的治疗。曲妥珠单抗为首个被推荐应用于胃癌临床的靶向治疗药物，通过结合HER2 受体的胞外域，使受体裂解而产生堵塞，抑制二聚化，同时诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC) 而发挥作用，还可增加受体的内吞作用并通过抗血管生成而产生影响。 ToGA 研究3是奠定曲妥珠单抗在HER-2 高表达胃癌人群治疗地位的里程碑式的研究。该研究发现，相对于XP 方案（5-FU/卡培他滨+ 顺铂）的11.2 个月，联用曲妥珠单抗后患者的OS 延长到13.8 个月，患者生存期首次超过了1 年。尤其是IHC3+或IHC2+/FISH+亚组，化疗联合曲妥珠单抗组的mOS 长达16.0 个月，mPFS 提高到7.6 个月，客观缓解率提高到51.3%，均较单纯化疗组显著提高。曲妥珠单抗是首个在胃癌治疗中获得阳性结果的单抗，但遗憾的是，HER-2 扩增在胃癌中的比例仅占10%~15%；在预后最差的弥漫性胃癌中只占2%~10%6，临床实用价值有限。另外，针对HER-1 和HER-2 两个靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI）拉帕替尼却未能复制曲妥珠单抗的成功7。在一项纳入HER-2 阳性的晚期胃癌一线治疗的Ⅲ期临床LOGIC 研究中，XELOX 方案（奥沙利铂+卡培他滨）联合拉帕替尼后mOS 为12.2 个月，与单纯化疗组的10.5个月比较差异无统计学意义（P＞0.05）。可见，对于HER-2 靶点及其靶向治疗的研究尚需进一步探索。
流式细胞仪常用的几种检测方法（转载） 一、测定用乙醇固定的DNA的含量 1、培养细胞的DNA含量的测定 制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中； 加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存； 附:细胞固定的一般步骤 1) 取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中； 2) 300g离心5分钟，弃上清，反复两次； 3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中； 4) 将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分 钟。在4℃条件下可保存2~3周。 注意： 2根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛； 2将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃； 2细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。 2 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中； 2显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤； 2加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟； 2上机检测。 2、新鲜组织的DNA含量的测定 1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液； 2) 500g离心5分钟； 3) 弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中； 4) 再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤； 5) 上机检测。 3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定 1) 从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液； 2) 用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清； 3) 加入PI液1ml室温避光30分钟； 4) 调整细胞浓度为1×106/ml； 5) 上机检测。 二、细胞凋亡检测及相关分子检测 1、细胞DNA含量分布（由细胞DNA降解方式检测细胞凋亡）
流式检测细胞凋亡 Annexin V检测细胞凋亡 Annexin V (2) 实验原理 (2) 实验用品 (2) 操作步骤 (3) Annexin V Blocking (5) 凋亡细胞的断裂片段分析 (7) DNA 实验原理 (7) 实验用品 (8) 操作步骤 (9) BrdU Flow Kits检测细胞增殖 BrdU Flow (12) 实验原理 (12) BrdU Flow Kits试剂盒 (12) 结果分析 (17) 流式仪器设置指南 (18) 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22) 实验原理 (22) 实验用品 (22) 样本制备 (23) 结果分析 (24) 注意事项 (24) Active Caspase-3检测细胞凋亡 Active (26) 实验原理 (26) 实验步骤 (27) 结果分析 (28)
A n n e x i n V检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12×75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8°C保存。 3. 微量加样器和加样头。
术前化疗对进展期胃癌细胞凋亡的影响 梁 辉1,陈国玉1,俞学明1,冯振卿 2 (1.南京医科大学第一附属医院,江苏南京210029;2.南京医科大学病理教研室,江苏南京210029) 摘要:[目的]研究术前化疗对进展期胃癌细胞凋亡的影响。[方法]21例胃癌患者术前静脉滴注52氟尿嘧啶150m g /k g ?d ,术中取胃癌组织标本,应用3′2OH 末端标记法(T UNE L )检测细胞的凋亡率(AI ),与非化疗组比较。[结果]术前应用52Fu 组总的T UNE L 指数为(8.6±3.8)%,对照组总的标记指数为(5.4±2.6)%,差异有显著性(P <0.05);52Fu 诱导作用与细胞分化有关。52Fu 诱导胃癌细胞凋亡有剂量依赖性。[结论]术前应用52Fu 辅助化疗可明显诱导进展期胃癌细胞凋亡,具有一定的临床应用价值。 关键词:胃肿瘤;细胞凋亡;药物疗法;氟尿嘧啶中图分类号:R735.2文献标识码:A 文章编号:1671-170X (2001)04-0231-02 T he E ffect of Preo p erative Chem othera py on Cell A p o p tosis in Advanced G astric Carcinoma LIANG Hui ,CHEN G uo 2y u ,Y U Xue 2m in g ,et al. (The Fir st A ff iliated H os p ital o f Nan j in g M edical Univ er sit y ,Nan j in g 210029,China ) 收稿日期:2001-03-27 目前临床胃癌仍以中晚期为主,为提高胃癌的 切除率,改善预后,临床上倡导以手术为基础的综合治疗,其中术前化疗受到广泛关注,术前化疗主要用于中晚期胃癌,而化疗药物对于肿瘤细胞的作用主要是通过诱导癌细胞凋亡的途径。体外细胞培养验证了多种药物和理化因素可诱导胃癌细胞凋亡,术前应用52氟尿嘧啶(52Fu )诱导进展期胃癌细胞凋亡国内未见报道。本研究探讨其诱导凋亡的规律,报道如下。 1 材料与方法 1.1 一般资料 2000年1月～2000年12月收治的胃癌患者,随机进入术前化疗组(术前化疗+根治术)21例。化疗组中男性15例,女性6例,平均年龄54.6岁。对于肝肾功能异常,恶液质,未能根治以及重度贫血,年龄>70岁的患者不入组。 所有病人术前均经病理确诊,术后有病理诊断, 临床资料完整,均为腺癌。 52Fu 应用方法:按150m g /k g ?d 计算用量,以0.25g 为最小剂量单位,静脉滴注至术前一天,病人最长滴注5天。 1.2DNA 原位末端标记法(T UNE L ) [1] 术中标本切下后即取癌组织,以10%中性甲醛固定,石蜡包埋,切片厚度4μm 。试剂盒购自博士德公司,严格按说明操作。1.3凋亡指数计算(AI ) 随机记数5个高倍镜的肿瘤细胞共500个,计算每100个细胞中阳性细胞数即凋亡指数(AI )。1.4统计学方法 各组数值以均数±标准差(x ±s )表示,显著性检验采用t 检验。 2 结果 2.1 胃癌组织细胞凋亡的观察 HE 染色下,凋亡细胞散在分布于胃腺上皮内,表现核固缩、碎裂。末端标记后,凋亡细胞核呈棕色或棕褐色,多位于核膜上,或形成凋亡小体,部分胞 Abstract :[Pur p ose ]T o stud y the effect of p reo p erative chem othera py on cell a p o p tosis in advanced g astric carcinom a.[M ethods]52Fu 150m g /k g ?d w as adm inistered intravenoul y p reo p eration 21p atients.T he a p o p tosis index of g astric carcinom a cells w as evaluated b y in situ T UNE L and com p ared betw een p re -and non 2chem othera py g rou p .[Results]T he AI w as (8.6±3.8)%in p re 2chem othera py g rou p and (5.4±2.6)%in control g rou p .T here w as si g nificant difference betw een tw o g rou p s (P <0.05).T he induction of a p o p tosis b y 52Fu w as associated w ith dosa g e and g rade.[C onclusions]T his stud y su gg ests that the a p o p tosis m a y be induced b y p reo p erative adm inistration 5 2Fu in advanced g astric carcinom a which has the value of clinical a pp lication. K e y w ords :g astric neo p lasms ;a p o p tosis ;dru g thera py ;fluorouracil
流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1．标本制备： 2．最小化非特异性结合： 二、凋亡 1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法 三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA 四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板 五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞 六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病
第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或
A n n e x i n V检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12?75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8?C保存。 3. 微量加样器和加样头。
4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为 10?，使用时，用稀释为1?浓度的应用液。 5. Annexin V试剂与核酸染料： Annexin V 核酸染料 Annexin V-Biotin（Cat. No. 65872X）Streptavidin-FITC（Cat. No. 13024D） PI（Cat. No. 66211E）或7-AAD（Cat. No. 34321X） Annexin V-FITC（Cat. No. 65874X）PI（Cat. No. 66211E）Annexin V-PE（Cat. No. 65875X）7-AAD（Cat. No. 34321X） 6. FACS流式细胞仪：上样检测。 7. CELLQuest软件：获取和分析试验数据。 8. Annexin V检测对照管： Annexin V A-阴性对照B-补偿1 C-补偿2 Biotin SAv-FITC Annexin V-Biotin 和SAv-FITC PI 和SAv-FITC PE 未染色细胞Annexin V-PE 7-AAD FITC 未染色细胞Annexin V-FITC PI 操作步骤 1.取Falcon 试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。 2.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1?Binding Buffer缓冲液制成1?106 细胞/ml的悬液。 3.Falcon试管中加入100 μl细胞悬液。 4.按以下体积加入Annexin V与核酸染料： 1阴性对照-- 2单阳1 AV-FITC - 4样本AV-FITC PI 5.轻轻混匀，室温（20?C ~25?C）避光处放置15分钟。
·论著·2012年12月第9卷第34期 中国医药导报CHINA MEDICAL HERALD 胃癌在我国是最常见的恶性肿瘤之一，手术是其最有效 的治疗方法，对于术后复发失去再次手术机会的及晚期胃癌 患者，化疗仍是最有效的手段之一，但其疗效不尽人意，因为在消灭肿瘤细胞的同时，受其毒副作用影响而表现出较差的预后。因而寻求一种新的治疗方案迫在眉睫。肿瘤的靶向治疗基于分子水平，通过抑制相关蛋白或基因在信号转导通路、血管生成等途径发挥较强的抗肿瘤作用，且细胞毒性作莪术醇对人胃癌细胞凋亡、ＭＭＰ２、ＮＯ影响的初步探讨 徐立春陈海燕文洁陶亚玲 扬州大学医学院肿瘤防治研究中心，江苏扬州225001 [摘要]目的初步探讨莪术醇（Curcumol ）对人胃腺癌细胞（SGC-7901细胞）凋亡、基质金属蛋白酶（MMP2）、一氧化氮（NO ）的影响。方法将莪术醇溶于无水乙醇中，初始浓度为9mg/mL ，设实验1、2、3、4、5组，莪术醇的浓度分别是 7.5、15、30、60、120μg/mL ，并以含1%无水乙醇的培养液为对照组。采用台盼蓝（Trypan blue ）、噻唑蓝（MTT ）法检测SGC-7901细胞的活性及莪术醇对SGC-7901细胞抑制增殖的影响；用流式细胞仪（FACSCalibur ）检测莪术醇对SGC-7901细胞的凋亡率；用蛋白质印迹法检测莪术醇作用于SGC-7901细胞后，其MMP2的表达情况；NO 试剂盒检测莪术醇作用SGC-7901细胞后的细胞培养液上清的NO 含量。结果30μg/mL 的莪术醇在药物浓度与抑制肿瘤生长方面效果较佳，与对照组比较，其抑制肿瘤细胞增殖差异有统计学意义（P <0.05）；莪术醇实验组能促进细胞凋亡，与对照组比较差异有统计学意义（P <0.05）；莪术醇实验组作用细胞后，其MMP2蛋白表达明显下降，与对照组比较差异有统计学意义（P <0.05）；实验研究表明，随着莪术醇实验组浓度的增加，其细胞培养液上清中的NO 含量逐渐降低，与对照组比较差异有统计学意义（P <0.05）。结论30μg/mL 的莪术醇浓度是最佳药效组，它能显著抑制SGC-7901细胞的增殖，明显促进肿瘤的细胞凋亡，显著抑制MMP2的表达，降低细胞培养液上清中的NO 含量，从而发挥系列抗肿瘤作用。本研究从细胞分子水平探讨莪术醇治疗胃癌可能存在的部分机制，为临床应用莪术醇及其衍生物或结构类似物治疗胃癌提供理论与试验依据。 [关键词]莪术醇；SGC-7901；凋亡；基质金属蛋白酶；一氧化氮 [中图分类号]R000[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2012）12（a ）-0018-04 Preliminary discussion on effect of curcumol in apoptosis,MMP2and NO in SGC-7901cells XU Lichun CHEN Haiyan WEN Jie TAO Yaling Cancer Prevention Research Center,Medical College of Yangzhou University,Jiangsu Province,Yangzhou 225001,China [Abstract]Objective To discuss the effects of Curcumol on the apoptosis,MMP2and NO of human gastric cancer cells (SGC-7901cells).Methods Curcumol was dissolved in dehydrate alcohol and the initial concentration of Curcumol was 9mg/mL.Group 1,group 2,group 3,group 4and group 5were set up as experimental groups.The Curcumol concentrations were set as follows:7.5,15,30,60,120μg/mL,control group contained 1%dehydrate alcohol (dissolvent compare).The Trypan blueand method was used to analyze the cytoactive of SGC-7901;MTT assay was performed to study the inhibitory rate of SGC -7901cells proliferation;the metastasis of SGC -7901was described through the scratches experiment;the apoptosis rate were detected by FACSCalibur and the expression of Matrix metalloproteinase 2(MMP2)were detected by Western Blot.The content of NO in cell culture medium was detected by NO kit.Results Curcumol had a good effect on drug concentration and restrain the tumor growth in 30μg/mL,and compared with controls,it had significant difference in restrain the proliferation of tumor cell (P <0.05);Curcumol could promote the apoptosis,it showed significant difference when compared with controls (P <0.05);Curcumol could make the expression of MMP2protein descend to varying de -grees,it had significant difference when compared with controls (P <0.05);this research showed with the increasing of the concentration of curcumol,the content of the NO in the supernate gradually reduced,it had significant difference when compared with controls (P <0.05).Conclusion Curcumol in 30μg/mL is the best efficacy group,it can significantly inhib -it the proliferation of SGC-7901cell,significantly promote the tumor cell apoptosis,significantly inhibit the expression of MMP2,reduce the content of NO in supernate,and express the series antitumor function.This study discusses the possible mechanism of curcumol cure the stomach cancer from cell and molecular level;provide the basis in theory and experiment for clinical application that Curcumol and its derivatives or structure analogues treat stomach cancer. [Key words]Curcumol;SGC-7901;Apoptosis;MMP2;NO [基金项目]江苏省医学卫生重点基金资助项目（编号：K200511）。 [作者简介]徐立春，研究员，教授，主要从事肿瘤防治基础与临床方面的 研究。18
2.2.2.5 流式细胞术检测细胞周期 2.2.2.5.1 实验原理 用流式细胞仪检测细胞周期，通常用碘化丙啶（propidium iodide，PI）染细胞核。PI在一定波长的光下发出荧光，其强度与DNA含量成正比。通过流式细胞仪分析各时期的细胞百分数，可检测细胞的增殖、凋亡。 2.2.2.5.2流式细胞仪检测A549细胞周期步骤 收集对数生长期细胞，计数，以(1~5)×105/孔接种于6孔板，置37℃，5％CO2条件下培养过夜，使细胞贴壁。次日更换培养液，各孔分别加入含有0、80、400、2000、10000 mg/L不同浓度茶氨酸的细胞培养液2 mL/孔，继续常规培养；每24 h同法换液一次。每个浓度设3个重复。 48 h后，中止培养，胰酶消化后，收集细胞于流式管1000 r/min离心5min，弃上，冷PBS洗涤细胞3次，离心去上清； 一边震荡一边向细胞沉淀中加入70%预冷乙醇混匀，4℃固定18 h以上；离心，弃去乙醇上清，加入预冷的PBS洗沉淀1次，离心去上清； 加入RNA酶（50 mg/L）10 μL/孔和PI（50 mg/L）300 μL/孔，震荡混匀。室温、避光反应30 min； 流式细胞仪进行DNA检测，用Modifit软件分析各时相细胞周期的比例。 2.2.2.6流式细胞仪检测A549细胞凋亡 2.2.2.6.1实验原理 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV 是一种分子量为35～36 kD的Ca2＋依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。 碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。 2.2.2.6.2 结果判断 凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI 有抗染性，坏死细胞则不能。 细胞膜有损伤的细胞的DNA 可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI 不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象
细胞凋亡的几种检测方 法 Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】
细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 （1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 （2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 （4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、 DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规
律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。 正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物，测光吸收制。 用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，
Bc1-2与胃癌细胞凋亡的关系 王 强,张凤蕴,郭 涛,逯晓辉,刘 晨,王丽群 (哈尔滨医科大学免疫学教研室,黑龙江哈尔滨150086) 摘要:目的 探讨癌基因Bc1-2与胃癌细胞凋亡的关系,进一步研究胃癌发生的分子机制。方法 用免疫组化法检测30例胃癌患者的癌组织中Bc1-2的表达,并在光镜下对受检组织HE 染色切片进行凋亡细胞计数。结果 Bc1-2阳性胃癌的细胞凋亡指数明显低于Bc1-2阴性胃癌。结论 Bc1-2有抑制胃癌细胞凋亡的作用。 关键词:肿瘤学;Bc1-2;细胞凋亡;胃癌学科分类代码:320167 中图分类号:R73512 文献标识码:A 文章编号:1004-5775(2003)02-0104-02 作者简介:王 强(1970-),男,汉族,硕士研究生。 R elationship betw een B cl -2and G astric C arcinoma Cell Apoptosis W ANG Qiang ,ZH ANG Feng -yun ,G UO T ao ,et al. (Department of Immunology ,Harbin Medical University ,Harbin 150086,China ) Abstract :Objective T o discuss the relationship between Bcl -2and apoptosis of gastric carcinoma cell s o that to study the m olecular mecha 2nism of gastric carcinoma oncogenesis.Methods The expression of Bcl -2in gastric cancerous tissue of 30patients was detected with immuno 2histochemical method.The apoptosis cell number were accounted under microscope for HE stained slides.Results The cell apoptosis index of Bcl -2positive expression in gastric carcinoma was obviously lower than that of Bcl -2negative expression.C onclusion Bcl -2might inhibit the gastric carcinoma cell apoptosis. K ey w ords :Oncology ;Bcl -2;Cell apoptosis ;G astric carcinoma 随着对细胞凋亡研究的不断深入,人们逐步认识到凋亡具有重要的生物学意义,不仅维持细胞群体数量的自身稳定、胚胎发育和免疫克隆的选择,而且在肿瘤发生、清除转化细胞、细胞损伤反应、抗肿瘤药物治疗等方面,均具有十分重要的作用。因此,凋亡的分子机制作为生命科学中一个研究热点引起越来越广泛的注意。目前的研究普遍认为,肿瘤的发生不仅由于细胞过度增殖,同时存在细胞凋亡的减少。Bc1-2属原癌基因,位于18号染色体短臂,它是从滤泡状淋巴瘤细胞中发现的凋亡相关基因。本文探讨Bc1-2与胃癌组织细胞凋亡的关系,现报告如下。1 材料与方法111 取材 标本选自哈尔滨市第四医院病理科1995～2001年胃癌手术切除标本及部分存档蜡块。其中,男性18例,女性12例。年龄为39～68岁。手术切除组织均新鲜取材,福尔马林固定,石蜡包埋,连续切片。切片组织部分作HE 染色、常规组织病理学诊断及凋亡细胞计数,另一部分作免疫组织化学染色。112 免疫组化染色 鼠抗人Bc1-2抗体、PV9000、显色剂DAB 等购自中山生物技术有限公司。采取免疫组化(一步法)检测。简言之,石蜡切片脱蜡水化,经3%H 2O 2处理,P BS 浸泡后滴加1∶50鼠抗人Bc1-2抗体(1抗),37℃孵育2h ,冲洗后加PV9000(2抗与 酶的聚合物),37℃孵育30min ,冲洗后加DAB 显色,封片镜检。实验过程中,以省略第1抗体作空白对照,以已知的阳性组织切片作阳性对照。113 凋亡细胞计数 选择切片平展,细胞形态和组织清晰的HE 染色组织片, 在40倍光镜下计数每张切片上凋亡细胞总数,根据Wang 〔1〕 等的形态测量和面积计算方法,计算出单位面积的凋亡细胞数(凋亡指数)。114 结果判断 棕黄色染色为阳性信号,Bc1-2免疫反应定位于胞浆和胞膜。115 统计学处理 采用2样本均数比较的t 检验,以P <0105为差异具显著性。2 结果 Bc1-2阳性胃癌的细胞凋亡指数明显低于阴性胃癌,见表1。 表1 Bc1-2表达与细胞凋亡的关系( x ±s ) 组别n 凋亡指数 Bc1-2阳性170147±01213Bc1-2阴性 13 0183±0119 注3与Bc1-2阴性组比较,P <0105