比较三种基因编辑技术
一、基因编辑的概念
基因编辑就是指对基因组进行定点修饰的一项新技术。利用该技术,可以精确地定位到基因组的某一位点上, 在这位点上剪断靶标 DNA 片段并插入新的基因片段。此过程既模拟了基因的自然突变, 又修改并编辑了原有的基因组, 真正达成了“编辑基因” 。目前主要有 3 种基因编辑技术, 分别为: a)人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc- finger nucleases,ZFN)技术;b) 转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator- like effector nucleases,TALEN)技术;c) RNA 引导的 CRISPR- Cas 核酸酶技术(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat /Cas-based RNA-guided DNA endonucleases,CRISPR/Cas )。
二、三种基因编辑技术的介绍
1、ZFN基因编辑技术
ZFN 技术就是第一代基因组编辑技术,其功能的实现就是基于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白发展起来的。ZFN 由特异性识别序列的锌指蛋白(ZFP)与 FokⅠ核酸内切酶组成。其中,由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合,而由FokⅠ构成的切割域能执行剪切功能,两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂(DSB)。于就是, 细胞可以通过同源重组(HR)修复机制与非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰,而 NHEJ 修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变,因此达到基因敲除的目的。
2、TALEN基因编辑技术
TALE(Transcription activator -like effectors):一种源于植物致病菌Xanthomonas sp、的靶向基因操作技术。 TALENs 包含两个 TALEN 蛋白, 每个 TALEN 都就是由TALE array 与 FokⅠ融合而成、其中一个 TALEN 靶向正义链上靶标位点, 另一个则靶向反义链上的靶标位点、然后 FokⅠ形成二聚体, 在靶向序列中间的 spacer 处切割DNA, 造成双链 DNA 断裂, 随后细胞启动 DNA 损伤修复机制、针对不同的TALEN 骨架, 其最适宜的spacer长度不同, 其长度范围一般为12~20 bp、实验结果表明, TALENs在靶向DNA时, 第一个碱基为 T 时其结合效果更佳。
3、 CRISPR /Cas9 基因组编辑技术
CRISPR/Cas 系统由 Cas9 核酸内切酶与sgRNA构成、转录的 sgRNA 折叠成特定的三维结构后与 Cas9 蛋白形成复合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点, 在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并启动 DNA 损伤修复机制、从不同菌种中分离的 CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者就是人工构建的sgRNA)靶向序列的长度不同, PAM 序列也可能不同。最新报道,CRISPR-C2c2系统能够根据靶向序列特异地编辑单链RNA。
三、三种编辑技术的比较
1、共同点
结构的相似性:无论就是ZFN、TALEN还就是CRISPR /Cas9,都就是由DNA识别域与核酸内切酶两部分组成。其中ZFN技术具有锌指结构域能够识别靶点DNA,而TALEN的DNA识别区域就是重复可变双残基的重复,DNA剪切区域都就是一种名为Fokl的核酸内切酶结构域。CRISPR的DNA识别区域就是crRNA或向导RNA,Cas9蛋白负责DNA的剪切。当DNA结合域识别靶点DNA序列后,核酸内切酶或Cas9蛋白将DNA剪切,靶DNA双链断裂,再启动DNA损伤修复机制,实现基因敲除、插入等。
作用过程的相似性:通过ＤＮＡ识别模块对特异性的ＤＮＡ位点识别并结合,然后在相关核酸内切酶的作用下完成特定位点的剪切,从而借助于细胞内固有的HDR(同源定向修复)或NHEJ(非同源末端连接)途径修复过程完成特定序列的插入、删除及基因融合。
2、不同点
基因编辑技术一、概念 基因编辑是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术，可完成基因定点InDel突变、敲入、多位点同时突变和小片段的删失等，可在基因组水平上进行精确的基因编辑。 二、应用 1.在科研领域，该技术可以快速构建模式动物，节约大量科研时 间和经费； 2.在农业领域，该技术可以人为改造基因序列，使之符合人们的 要求，如改良水稻等粮食作物； 3.在医疗领域，基因编辑技术可以更加准确、深入地了解疾病发 病机理和探究基因功能，可以改造人的基因，达到基因治疗的 目的等。 三、作用机理 基因编辑技术本质上均是利用非同源末端链接途径（NHEJ）修复和同源重组（HR）修复，联合特异性DNA的靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变。 注： 非同源末端连接（Non-homologous End Joining-NHEJ)是细胞在不依赖同源性的情况下，而为了避免DNA或染色体断裂（Breaks)的滞留，避免因此造成的DNA降解或对生命力的影响，强行将两个DNA 断端彼此连接在一起的一种特殊的DNA双链断裂修复机制。
同源重组（HR）修复即双链DNA中的一条链发生损伤，在DNA 进行复制时，由于该损伤部位不能成为模板，不能合成互补的DNA 链，所以产生缺口，而从原来DNA的对应部位切出相应的部分将缺口填满，从而产生完整无损的子代DNA的这种修复现象。 四、类别 ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9是三大基因编辑技术，这三种编辑工具的共同点是：含有靶点DNA序列的识别区域及DNA剪切功能区域。 1.ZFN技术具有锌指结构域能够识别靶点DNA 2.TALEN的DNA识别区域是重复可变双残基的重复，DNA剪切 区域都是一种名为Fokl的核酸内切酶结构域 3.CRISPR的DNA识别区域是crRNA或向导RNA，Cas9蛋白负责 DNA的剪切 四、传统技术的优缺点 1.ZFN?的基因打靶效率能够达到30%左右，已经可以做到针对某 些特定的序列来设计ZFN实现靶基因的修饰，但也有其发展的 局限性，ZFN?的识别结构域中存在上下文依赖效应，使得?ZFN 设计和筛选效率大大降低，所以目前尚无法实现对任意一段序 列均可设计出满足要求的?ZFN，也无法实现在每一个基因或其 他功能性染色体区段都能够顺利找到适合的?ZFN作用位点，并 且在已经成功运用的?ZFN的报道中，大多数研究者并不公布 其?ZF?序列。所以，在?ZFN的筛选和设计方面还存在较大技术
基因敲除技术研究新进展 黄薇,严放北京大学医学部心血管研究所 gene knockout）技术是20世纪80年代发展起来的一门新技术。应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚em cells，ES cells）以取代目的基因，再筛选出已靶向灭活的细胞，微注射入小鼠囊胚。该细胞参与胚胎发育形成可得到纯合基因敲除小鼠。基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明，使现代生物学进展。基于基因敲除技术对医学生物学研究做出的重大贡献，在该领域取得重大进展的三位科学家，70岁的美国人chi）、82岁的美国人奥利弗?史密西斯（Oliver Smithies）和66岁的英国人马丁?埃文斯（Martin Evans）分享了2 80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。关于第二代区域和组织于1993年。Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除oxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。 imizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术，其同样以Cre/LoxP系统re的表达。该技术使目的基因的敲除在时间上可人为控制，避免了死胎或动物出生后不久即死亡等现象的出现。 实验室Cui[3]等又报道了第四代基因工程技术，即可诱导的区域性蛋白质敲除技术，用这一技术构建的模式动物可在定蛋白质的功能，从根本上改变了前三代基因敲除技术对蛋白质代谢速度的内在依赖性，达到空前的时间精度，成组研究最先进的工具之一。 以来上述基因敲除技术只能在小鼠上完成，因为只有小鼠的ES细胞能在体外培养中无限增殖并同时保持多分化潜能以及猴等大动物模型在疾病研究中更接近于人类，大动物更有益于某些繁琐的手术操作，同时血浆及组织样本量较大家介绍近两年来基因敲除技术在大动物模型上的突破及进展。 一、大鼠ES细胞基因打靶技术 ，大鼠的生理和药理特性与人类更相近，是研究人类疾病的一种重要动物模型，在心血管疾病和糖尿病等领域的作S细胞在体外难以长期维持自我更新，用传统培养方法无法获得具有生殖传代能力的大鼠ES细胞[5]。因此在过去二物模型远不及小鼠发展迅速。2010年Tong等[6]于《Nature》报道了p53基因敲除大鼠，这在基因敲除技术上又是
第23卷武 夷 科 学V o.l23 2007年12月WUY I SCIENCE J OURNA L D ec.2007 文章编号:1001 4276 (2007)01 0187 04 几种常用的基因敲除技术 李今煜,陈健铭,彭振坤 (福建农林大学生命科学学院,福建福州350002) 摘要: 摘要:随着功能基因组学研究的深入发展,基因敲除技术逐渐成为基因功能研究的重要手段,本文就常用的三种基因敲除技术,即同源重组、插入突变、RNA干扰各自的原理、适用的范围和优缺点作简要介绍。关键词: 基因敲除;同源重组;插入突变;RNA干扰 中图分类号: Q343.1 文献标识码: A 随着越来越多生物的全基因组被测序,功能基因组学成为时下研究的热点。研究基因功能的方法主要有两种思路,一是通过增强其表达,取得表达产物进行研究,二是减弱或者终止其表达,观察整体功能的变化,进而推测相应的基因功能。前者因为不能反映基因产物的真实表达情况,而逐渐被抛弃。后者将基因与生物的整体功能联系起来考察,并能为基因的功能提供直接证据,因而其技术不断得到发展和完善,其中最常用的就是基因敲除(gene knockou t)技术。 基因敲除技术除最早的同源重组技术外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和RNA,i它们同样可以达到基因敲除的目的。下面就这几种基因敲除技术简要进行介绍。 1 利用同源重组进行基因敲除 基因敲除是在同源重组技术及胚胎干细胞(e mbryon i c ste m cel,l ES细胞)技术的基础上逐步完善发展起来,主要是利用DNA转化技术,将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞,通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组,将外源基因整合入内源基因组内,使外源基因得以表达。通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变,达到研究基因功能的目的[1]。 基因敲除技术已从最初简单的完全敲除发展到条件敲除阶段,现正朝着特定组织基因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方向发展。完全基因敲除是通过同源重组直接将靶基因在细胞或者动物个体中的活性完全消除;而条件基因敲除则是将某个基因的修饰限制于特定类型的细胞或个体发育特定的阶段,即通过位点特异的重组系统实现特定基因敲除[2],现阶段以噬菌体的C re/Loxp系统和酿酒质粒的FLP/FRT系统应用得最为广泛[3]。 虽然基因敲除技术的广泛使用使其成为研究基因功能重要的技术手段,但目前仍然存在 收稿日期:2007-09-26 基金项目:福建省自然科学基金计划资助项目(项目编号:2006J0052)。 作者简介:李金煜(1976-),女,硕士,研究方向:主要从事生物化学与分子生物学领域的研究。
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兰州交通大学化学与生物工程学院综合能力训练Ⅰ——文献综述 题目：基因敲除技术研究进展 作者：王振宇 学号：201207744 指导教师：谢放 完成日期：2014-7-16
基因敲除技术研究进展 摘要基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。在总结已有研究成果的基础上，本文对基因敲除技术的概况、原理方法应用以及近年来基因敲除技术的研究进展作一个简单的综述。 关键词基因敲除 RNA i生物模型基因置换基因打靶同源重组1. 基因敲除技术简介 基因敲除(Gene knockout)是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。 它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。基因敲除借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,使特定基因失活,以研究该基因的功能；或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分,以便测定它们是否具有相同的功能，或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展,除了基因打靶技术外,近年来新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有RNA干扰技术,同样也可以达到基因敲除的目的。简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、
前言 转录激活样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease, TALEN）技术与锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease, ZFN）技术组成了一大类强有力的基因组编辑工具，这一大类技术的发展重新划定了生物学研究的边界。这些嵌合核酸酶由两部分组成——一个可编码的序列特异性DNA结合模块与一个非特异性的DNA切割结构域。通过诱导DNA双链断裂（DNA double-strand break）来刺激容易出错的非同源末端连接或在特定基因所在的位置进行的同源定向修复，TALEN和ZFN能够完成一系列遗传学编辑修饰操作。 成簇规律间隔短回文重复（clustered regulatoryinterspaced short palindromic repeat, CRISPR）技术是最新出现的一种基因组编辑工具，它能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。与其它基因组编辑工具相比，CRISPR技术更易于操作，具有更强的可扩展性。 本文将以上述三种技术为例，介绍并探讨新一代位点特异性基因组工程技术的生物学原理、未来发展趋势，及其在遗传学研究领域的作用和潜在的医学应用前景。 一、TALEN技术 TAL效应因子（TAL effector, TALE）最初是在一种名为黄单胞菌（Xanthomonas sp.）的植物病原体中作为一种细菌感染植物的侵袭策略而被发现的。这些TALE 通过细菌 III类分泌系统（bacterial type III secretion system）被注入植物细胞中，通过靶定效应因子特异性的基因启动子来调节转录，来促进细菌的集落形成。由于TALE具有序列特异性结合能力，研究者通过将FokI核酸酶与一段人造TALE连接起来，形成了一类具有特异性基因组编辑功能的强大工具，即TALEN。 近年来， TALEN已广泛应用于酵母、动植物细胞等细胞水平基因组改造，以及拟南芥、果蝇、斑马鱼及小鼠等各类模式研究系统。2011年《自然·方法》（Nature Methods）将其列为年度技术，而2012年的《科学》（Science）则将TALEN技术列入了年度十大科技突破，针对该文的评论更是给予它基因组的巡航导弹技术的美誉。 1. TALEN结构及技术原理 1.1 TALEN的典型结构 如前文所述，典型的 TALEN由一个包含核定位信号（Nuclear localization signal, NLS）的N端结构域、一个包含可识别特定 DNA序列的典型串联TALE 重复序列的中央结构域，以及一个具有FokI核酸内切酶功能的C端结构域组成。不同类型的TALEN元件识别的特异性DNA 序列长度有很大区别。一般来说，天然的TALEN元件识别的特异性DNA序列长度一般为17-18bp；而人工TALEN元件识别的特异性DNA序列长度则一般为14-20bp。
.. 一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout） 常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。 二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout） 条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。 条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。 三、基因敲入小鼠（Knockin） 基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。 此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。 获得嵌合体及之后品系纯化详细流程： 基因敲除其他方法： 一、ZFN技术制作基因敲除鼠 ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。 这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。 二、TALEN技术制作基因敲除鼠 TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。 ;.
第五章第1节基因突变和基因重组 (45分钟100分) 一、选择题(包括10小题,每小题5分,共50分) 1.下列关于基因突变的叙述中,正确的是( ) A.基因突变一定能引起性状改变 B.亲代的突变基因一定能传递给子代 C.等位基因的产生是基因突变的结果 D.DNA分子结构的改变都属于基因突变 2.谷胱甘肽(GSH)是普遍存在于生物体内的一种重要化合物。下表为GSH的密码子和氨基酸序列及控制合成GSH的DNA突变后所对应的密码子和氨基酸序列,则下列有关突变原因的叙述正确的是( ) A.增添 B.缺失 C.改变 D.易位 3.(2013·泰安模拟)某个婴儿不能消化乳类,经检查发现他的乳糖酶分子有一个氨基酸改换而导致乳糖酶失活,发生这种现象的根本原因是( ) A.缺乏吸收某种氨基酸的能力 B.不能摄取足够的乳糖酶 C.乳糖酶基因有一个碱基改换了 D.乳糖酶基因有一个碱基缺失了 4.如图为某二倍体生物精原细胞分裂过程中,细胞内的同源染色体对数的变化曲线。基因重组最可能发生在( )
A.AB段 B.CD段 C.FG段 D.HI段 5.据报道,加拿大科学家研究发现选择特定的外源DNA(脱氧核糖核酸)片段并将其嵌入到细菌基因组的特定区域,这些片段便可作为一种免疫因子,抵抗DNA裂解酶入侵,此项技术有望解决某些细菌对抗生素产生抗药性的难题。这种技术所依据的原理是( ) A.基因突变 B.基因重组 C.染色体变异 D.DNA分子杂交 6.(能力挑战题)(2013·长沙模拟)如图为雌性果蝇体内部分染色体的行为及细胞分裂图像,其中能够体现基因重组的是( ) A.①③ B.①④ C.②③ D.②④ 7.农业技术人员在大田中发现一株矮壮穗大的水稻,将这株水稻所收获的种子再种植下去,发育成的植株之间总会有差异,这种差异主要来自( ) A.基因突变 B.染色体变异 C.基因重组 D.细胞质遗传 8.(2013·温州模拟)已知家鸡的无尾(A)对有尾(a)是显性。现用有尾鸡(甲群体)
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基因敲除技术的原理、方法和应用 2010-01-24 17:03:43 来源：易生物实验浏览次数：6302 网友评论 0 条 1．基因敲除概述 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2.1.利用基因同源重组进行基因敲除 2.2利用随机插入突变进行基因敲 除。 2.3.RNAi引起的基因敲除。 3．基因敲除技术的应用及前景 4．基因敲除技术的缺陷 关键词：基因敲除 1．基因敲除概述： 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985 年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型 [1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)： a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
医学分子生物学杂志,2007,4(1):862 90 J Med Mol B i ol,2007,4(1):86290 通讯作者:汤华(电话:022*********,E 2mail:htang2002@yahoo 1 co m ) Corres ponding author:T ANG Hua (Tel:86222223542603, E 2mail: htang2002@yahoo 1co m ) 基因敲除技术现状及应用 万海英 综述 汤华 审阅 天津医科大学天津市生命科学中心实验室 天津市,300070 【摘要】 功能基因组学的研究进展使基因敲除技术显得尤为重要。基因敲除技术从载体构建到细胞的筛选到动物模型的建立各方面都得到了发展。其中C re 2LoxP 系统可以有效的控制打靶的发育阶段和组织类型,实现特定基因在特定时间和(或)空间的功能研究;转座子系统易于操作,所需时间短,具有高通量的特点,可以携带多种抗性标记,方便了同时进行多基因功能研究;基因捕获技术提供了获得基因敲除小鼠的高效方法,方便了进行小鼠基因组文库的研究。此外,进退策略、双置换法、标记和交换法、重组酶介导的盒子交换法也从不同方向发展了基因敲除技术。 【关键词】 基因敲除;C re 2LoxP 系统;转座子;基因捕获【中图分类号】 R34918 St a tus Quo and Appli ca ti on of Gene Knockout WAN Haiying,T ANG Hua Tianjin M edical U niversity,Tianjin L ife Science Center ,Tianjin,300070,China 【Abstract 】 Gene knockout is i m portant f or functi onal genom ics 1Great p r ogress has been made in the vect or constructi on of gene knockout,screening of ai m ed cells and ani m al models and the devel op 2ments in these fields hel p t o s olve the p r oble m s in the study of genom ic functi ons 1Cre 2LoxP syste m can effectively contr ol the devel opment stage and hist ol ogy of gene knockout,thereby making it possi 2ble t o study gene functi on in a given ti m e and /or s pace 1Trans pos on syste m is easy t o mani pulate,quick and can achieve high thr oughput,carry multi p le resistance marker gene,which makes si m ulta 2neous study of multi p le genes possible 1Gene trapp ing p r ovides a highly efficient method of obtain knockout m ice and can facilitate the research of m ice geno m ic library 1I n additi on,the techniques such as “hit and run ”,“double rep lace ment ”,“tag and exchange ”and “recombinase 2mediated cas 2sette exchange ”all contribute t o the devel opment of gene knockout technol ogy 1【Key words 】 gene knockout,Cre 2LoxP syste m,trans pos on;gene trapp ing 基因敲除又称为基因打靶,是指从分子水平上将一个基因去除或替代,然后从整体观察实验动物,推测相应基因功能的实验方法。基因敲除技术是功能基因组学研究的重要研究工具。 基因敲除技术是在20世纪80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。胚胎干细胞(e m 2bry onic ste m cell ,ES 细胞)分离和体外培养的成功及哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除 的技术基础和理论基础[1] 。基因敲除主要包括下列技术:①构建重组载体;②重组DNA 转入受体细 胞核内;③筛选目的细胞;④转基因动物。 基因敲除传统的重组载体主要有插入性载体系统和替换性载体系统。插入性载体系统构建载体时主要包括要插入的基因片段(目的基因)、同源序列片段、标志基因片段等成分,替换性载体系统主要包括同源序列片段、替换基因的启动子、报道基因等成分。基于正负双向筛选(positive and negative selecti on,P NS )策略的传统方法的基因敲除需要满足:对基因组提取处理用于构建载体;需要位于打靶区两翼的具有特异性和足够长度的同源片段,并便于用其作为探针用Southern 印迹证实;neo 基因(新霉素磷酸转移酶基因)的整合;同源重组区域外侧tk 基因(胸苷激酶基因)在随机重组时的活性;打靶结构外特异的基因探针;合适的酶切位点,
基因敲除技术 点击次数: 2605 发布日期: -5-25 来源: 本站仅供参考, 谢 绝转载, 否则责任自负 1．概述: 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术, 是经过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。一般意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理, 用设计的同源片段替代靶基因片段, 从而达到基因敲除的 目的。随着基因敲除技术的发展, 除了同源重组外, 新的原理和技术也逐渐被应用, 比较成功的有基因的插入突变和iRNA, 它们同样能够达到基因敲除的目的。2．实现基因敲除的多种原理和方法: 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初, 胚胎干细胞( ES细胞) 分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年, 首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到 1987年, Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在, 运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的 使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1):
图1.基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤 a．基因载体的构建: 把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子 都重组到带有标记基因(如neo 基因, TK 基因等)的载体上, 成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能, 因此一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得: 现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞, 最常见的是鼠, 而兔, 猪, 鸡等的胚胎干细胞也有使用。常见的鼠的种系是１２９及其杂合体, 因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向, 是基因敲除的理想实验动物。而其它遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2, 3] ｃ．同源重组: 将重组载体经过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中, 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组, 将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中, 从而得以表示。一般地, 显微注射命中率较高, 但技术难度较大, 电穿孔命中率比显微注射低, 但便于使用。[4,5] ｄ．选择筛选已击中的细胞: 由于基因转移的同源重组自然发生率极低, 动物的重组概率为10－2～10-5, 植物的概率为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。当前常见的方法是正负筛选法( PNS法) , 标记基因的特异位点表示法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。[6]
工具软件文本编辑软件 文本编辑软件是在日常工作和生活中使用相当频繁的应用软件之一。其主要包括两大类，即文本编辑器和文字处理器。 1．文本编辑器 几乎所有的操作系统和软件开发包都会提供文本编辑器，用于修改配置文件和代码。狭义的文本编辑器只提供一些基本的文本编辑功能，例如查找、替换、剪切、复制、粘贴等，例如，Windows系统自带的记事本软件等。 广义的文本编辑器，主要包括一些功能强大的文本编辑器，则会更多的功能。例如，多行折叠、自动行首缩进、行号排版、注释排版等，甚至针对某些编程语言或标记语言的语法校对，例如，UltraEdit等。 早期的文本编辑器在撤销更改和恢复更改方面的功能并不强大，大多只支持一级的编辑历史，只能撤销或恢复上一步的更改操作。随着软件技术的发展，现在新的文本编辑器往往可以支持多级的编辑历史，甚至可以恢复到任意一步操作。 2．文字处理器 文字处理器的作用是为桌面出版提供排版支持。多数文字处理器并非作用于各种普通文字，而是按照特定的格式处理文档，帮助无程序编制经验的人员完成文稿的创建、修改、印发工作。文字处理器通常会具备以下几种功能。 ●定义字体类型和大小 文字处理器往往可以指定文档中各种文本所使用的字体类型，例如宋体、微软雅黑等；也可以指定字体的大小。 ●定义字体颜色、斜体、粗体和下划线等样式 大多数文字处理器都允许用户为字体设置前景色（字体本身的颜色）和背景色，同时可以对字体进行加粗、倾斜、上标、下标并添加下划线和删除线。甚至还可以对英文中的字母进行处理，切换字母的大小写。 ●定义对齐方式、缩进和文字方向 在日常书写中，经常需要将根据纸张和文字的段落类型，以左、右和居中等方式和横排、竖排等方式书写。同时在段落的首行还需要缩进两个字的距离。多数文字处理器也都会提供这些功能。 ●定义列表和表格 早期的文字处理器往往只提供文字处理功能。随着技术的发展，越来越多的文字处理器允许在文字中插入各种列表和表格，并支持多种列表的项目符号。 ●插入图像和简单图像编辑 一些功能强大的文字处理器往往还会提供在文档中插入图像的功能，以及图文混排方式的选择和简单的图像编辑功能。 ●页面设置 为了面向打印输出，多数文字处理器都会提供设置各种纸张、页边距的功能，以帮助用户预览打印的效果。 3．文本编辑器与文字处理器的区别 由于文本编辑器和文字处理器等两类文本编辑软件在用途上的不同，其功能上也有较大的区别。 文本编辑器编辑的各种文档往往是未编译的文本文档或16进制文档，因此不支持各种文本样式的设置，只支持换行、制表符等简单的排版方式。使用文本编辑器打开文档，将显
生物学研究最具影响力技术：“基因编辑技术”大盘点 2014年10月29日，Nature杂志上发布了名为”Promoterless gene targeting without nucleases ameliorates haemophilia B in mice”的研究论文，据悉，该文章发布了一种超越CRISPR 的基因组编辑新技术，而CRISPR技术在今年被《Nature Methods》评为在过去十年中对生物学研究影响最深的十大技术之一。 新方法不需要内切酶在特异位点剪切DNA，也不需要使用启动子，大大降低了新基因自身插入到基因组中随机位置而引起癌症的机会。该技术使用一种常用的病毒——改良的腺相关病毒（AAV）。改良的病毒载体中，所有的病毒基因被删除，只保留了治疗基因。再利用同源重组，将目标基因插入，达到基因编辑的目的。 在了解这项新技术有点之后，有必要了解什么是基因编辑技术及基因编辑的三大利器：ZFN（锌指核酸酶）、TALEN（转录激活样效应因子核酸酶）和CRISPR/Cas9（成簇规律间隔短回文重复技术）。 基因编辑是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术，可完成基因定点InDel突变、敲入、多位点同时突变和小片段的删失等，可在基因组水平上进行精确的基因编辑。在科研领域，该技术可以快速构建模式动物，节约大量科研时间和经费；在农业领域，该技术可以人为改造基因序列，使之符合人们的要求，如改良水稻等粮食作物；在医辽领域，基因编辑技术可以更加准确、深入地了解疾病发病机理和探究基因功能，可以改造人的基因，达到基因治疗的目的等。因此，基因组编辑具有极其广泛的发展前景和应用价值。 ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9是三大基因编辑技术，基因编辑技术本质上均是利用非同源末端链接途径（NHEJ）修复和同源重组（HR）修复，联合特异性DNA的靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变。因此，这三种编辑工具的共同点是：含有靶点DNA序列的识别区域及DNA剪切功能区域，其中ZFN技术具有锌指结构域能够识别靶点DNA，而TALEN的DNA识别区域是重复可变双残基的重复，DNA剪切区域都是一种名为Fokl的核酸内切酶结构域。CRISPR的DNA识别区域是crRNA或向导RNA，Cas9蛋白负责DNA的剪切。当DNA 结合域识别靶点DNA序列后，核酸内切酶或Cas9蛋白将DNA剪切，靶DNA双链断裂，再启动DNA损伤修复机制，实现基因敲除、插入等。 基因编辑技术优缺点： 1）ZFN 的基因打靶效率能够达到30%左右，已经可以做到针对某些特定的序列来设计
《基因突变和基因重组》习题精选 1．培育青霉素高产菌株的方法是（） （A）杂交育种（B）单倍体育种 （C）诱变育种（D）多倍体育种 2．自然界中生物变异的主要来源是（） （A）基因突变（B）基因重组 （C）环境影响（D）染色体变异 3．产生镰刀型细胞贫血症的根本原因是（） （A）红细胞易变形破裂 （B）血红蛋白中的一个氨基酸不正常 （C）信使RNA中的一个密码发生了变化 （D）基因中的一个碱基发生了变化 4．人工诱变区别于自然突变的突出特点是（） （A）产生的有利变异多（B）使变异的频率提高 （C）可人工控制变异方向（D）产生的不利变异多 5．下面列举了几种可能诱发基因突变的原因，其中哪项是不正确的（） （A）射线的辐射作用（B）杂交 （C）激光照射（D）秋水仙素处理 6．人类的基因突变常发生在（） （A）减数分裂的间期（B）减数第一次分裂 （C）减数第二次分裂（D）有丝分裂末期 7．人工诱变是创造生物新类型的重要方法，这是因为人工诱变（） （A）易得大量有利突变体 （B）可按计划定向改良 （C）变异频率高，有利变异较易稳定 （D）以上都对 8．一种植物只开红花，但在红花中偶尔出现一朵白花，将白花所给种子种下，后代仍为白花。出现这种现象的原因可能是（） （A）基因突变（B）基因重组 （C）染色体变异（D）基因互换 9．下列属于基因突变的是（） （A）外祖母正常，母亲正常，儿子色盲 （B）杂种高茎豌豆自交，后代中出现矮茎豌豆 （C）纯种红眼果蝇后代中出现白眼果蝇 （D）肥水充足时农作物出现穗大粒多 10．一对夫妇所生子女中，性状差别甚多，这种变异主要来自于（） （A）基因重组（B）基因突变 （C）染色体变异（D）环境的影响 11．如果基因中四种脱氧核苷酸的排列顺序发生了变化，则这种变化叫（） （A）遗传性变化（B）遗传信息变化 （C）遗传密码变化（D）遗传规律变化
1Editplus编辑器 我的网站：IT经验网(https://www.doczj.com/doc/6c12397278.html,)最开始是模仿Hao123做网址站，只是专门做计算机编程学习网站的收集，所以在初期全部使用Editplus进行Html编辑和网页设计；后来还使用Editplus进行dedecms模板的修改，以及平时的网页效果调整和维护，堪称是我做站的第一工具 2SuperTextReplace.exe超级批量文本替换 字如其名，这个工具就是用来批量修改文本。有人可能会说：editplus也可以批量替换。但是如果使用editplus批量替换的话，有两个缺点： （1）editplus同时打开很多网页会变得很慢甚至导致editplus出错； （2）editplus修改的时候必须把网页先打开，这时如果网页在很多个目录，必须一个目录一个目录打开，很是麻烦； （3）editplus无法进行特征字符串之间的替换。关于这点，下面有一个例子可以说明： 我曾经在ChinaUnix抓取了很多网页（使用Wget），里面有类似如下的一段：
微生物基因敲除技术分析 牟福朋 20071401105 山东大学生命科学学院 摘要：基因敲除技术是上个世纪80年代出现的新型分子生物学实验技术。到现在经过近30年的发展，已经出现了很多前沿技术。微生物由于它本身特有的性质一直成为基因敲除的热点。本文主要考察基因敲除技术的现状及其发展方向，并对基因敲除的应用提出自己的观点。关键词：基因敲除微生物前沿进展 一常规基因敲除 1 常规基因敲除的步骤 基因敲除的一般流程见图1。用引物扩增目的基因之后，使用内切酶切开基因，连入有相同粘性末端的抗生素基因如四环素抗性基因或者报告基因例如lacZ等；将载体转化入目的菌内，通过筛选，筛选出含有标记基因的菌株，然后要通过PCR等进行复证。 使用双标记法可以判断发生交换的次数。如果只发生第一次重组，则两个标记都会被插入宿主DNA中；而若发生了两次重组，则阴性标记会被丢失，细菌要么是野生型的，要么能检测到阳性标记。 图1 常规基因敲除的主要流程和机理 2 常规基因敲除的成功率分析 首先，DNA的同源重组频率不是很高。况且，此处要求发生两次同源重组，这使得重组概率大大下降。加长两端的同源序列有助于重组，但这样一来内切酶效率就得不到保证。这一问题解决的方法，主要是进行大量的培养，实验中，往往可以得到较多的敲除子。 第二，图中可以看出，在第一次重组和第二次重组之间，由于敲出基因载体的整个插入，基因仍然有一部分是完好的（载体的一段和宿主的另一端融合而成）。解决这一问题的方法已如前述：即引入两个标记。 3 常规基因敲除的主要缺点 ①速度慢，效率低。基因敲除需要一般的基因工程方法来进行转化和表达，周期较长，在这个过程中载体是关键；