基因工程练习题
1．(10分)目前基因工程所用的质粒载
体主要是以天然细菌质粒的各种元
件为基础重新组建的人工质粒，
pBR322质粒是较早构建的质粒载体，
其主要结构如图一所示。
(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于_ 。
(2)pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识别序列—GAA TTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。
(3)pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复_________键，成功地获得了重组质粒，说明_____________________________。
(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无ampR和tetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是____________，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是________________。
4．下图表示科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中与棉花的DNA分子结合起来而发挥作用的过程示意图。请据图回答下列有关问题：
(1)图中科学家在进行①操作时，要用同一种___________ 分别切割目的基因和运载体，
运载体的黏性末端与目的基因DNA片段的黏性末端就可通过__________（键名）而结合，
遵循原则。
(2)在获得目的基因的过程中，PCR技术相当重要。PCR扩增反应需要在一定的缓冲溶液
中加入DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种、四种脱氧核苷酸和
的DNA聚合酶。
(3)图中的III是导入了目的基因的受体细胞，经培养、筛选最终获得一株有抗虫特性的
转基因植株。经分析，该植株含有一个携带目的基因的DNA片段，因此可以把它看作是
杂合子。理论上，在该转基因植株自交产生的F1中，仍具有抗虫特性的植株占总数
的，原因是
_
(4)上述抗虫棉植株的后代种子种植下去后，往往有很多植株不再具有抗虫性，原因是_
，要想获得纯合体，常采用的方法是________ __。
(5)科学家最初在做抗虫实验时，虽然用一定的方法已检测出棉花的植株中含有抗虫基
因，但让棉铃虫食用棉的叶片时，棉铃虫并没有被杀死，这说明______ _。科学家在
研究的基础上又一次对棉花植株中的抗性基因进行了修饰，然后在让棉铃虫食用棉的叶
片，结果食用的第二天棉铃虫就死亡了
5．为扩大可耕地面积，增加粮食产量．黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国
科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。
（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA 分子所用的限制性内切酶作用于图中的处，
D NA 连接酶作用于处。（填“a”或“b ” ）
（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有基因枪法和法。
（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用技术，该技
术的核心是
___________和。
（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的作探针进行分子杂交检测，又要用方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。
（5）我国科学家利用基因工程还培育出了能抗玉米螟的抗虫玉米，生态效益显著，有人认为抗虫玉米就是无虫玉米，不必防治害虫。你是否赞成这种说法?说明理由。
6．天然酿酒酵母菌通常缺乏分解淀粉的酶类，用作发酵原料的淀粉需经一系列复杂的转化过程才能被利用。研究者从某丝状真菌中获取淀粉酶基因并转入酿酒酵母菌，获得的酿酒酵母工程菌可直接利用淀粉产生酒精。请回答下列问题：（11分）
（1）若要鉴定淀粉酶基因是否插入酿酒酵母菌，可采用的检测方法是_______________，该项方法要用____________________作探针进行检测。
（2）采用PCR技术可对目的基因进行体外扩增。该反应体系的主要成分应包含：扩增缓冲液(含Mg2+)、水、4种脱氧核苷酸、引物、__________和____________。假如引物都用3H标记，从理论上计算循环4次，所得DNA分子中含有3H标记的DNA占__ __。
（3）已知BamHⅠ与BglⅡ的识别序列及切割位点如下图所示，用这两种酶和DNA连接酶对一段含有数个BamHⅠ和BglⅡ识别序列的DNA分子进行反复的切割、连接操作，若干循环后__________序列明显增多。
（4）基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质，_______________却能生产自然界不存在的新的蛋白质，但最终还须通过改造基因来实现，原因是________ _________。
7. (13分）棉铃虫是一种严重危害棉花的害虫。我国科学家发现一种生活在棉铃虫消化道内的苏云金芽孢杆菌能分泌一种毒蛋白使棉铃虫致死，而此毒蛋白对人畜无害。通过基因工程的方法，我国已将该毒蛋白基因移人棉株细胞内并实现成功表达。由于棉铃虫吃了这种转基因棉花的植株后就会死亡，所以该棉花新品种在1998年推广后，已取得了很好的经济效益。请根据上述材料回答下列问题：
（1）进行基因操作“四步曲”是：提取目的基因构建基因表达载体
将目的基因导入受体细胞。
(2)害虫在喷洒农药进行化学防治后抗药性增强是_______________________ ______ 的结果。
(3)“转基因抗虫棉”抵抗害虫的遗传信息表达过程可以表示为____________________。
(4)“转基因抗虫棉”的抗虫变异，属于可遗传变异类型中的_____________________。
(5)该项科学成果在环境保护上的重要作用是_________________________________。
(6)题中“毒蛋白基因转人棉花植株内并实现成功表达中的“成功表达”含义是指______
__ _。(7）与杂交育种、诱变育种相比，通过基因工程培育新品种的主要优点是__________
_ _。（8）现代农业防治害虫的新理念是：将害虫数量控制在不危害农作物的较低水平，而不是消灭害虫。其依据是
。(9）转基因技术有利有弊，请各举一例加以说明：
有利方面：____________________________________ ______________。
有害方面：___________________________________ _______________。11．（11分）干扰素是能够抑制多种病毒复制的抗病毒物质。科学家利用基因工程技术从人的T淋巴细胞中提取干扰素基因转入羊的DNA中，培育出羊乳腺生物发生器，使羊乳汁中含有人体干扰素。请回答：
（1）科学家将人的干扰素基因与乳腺蛋白基因的___________等调控组件重组在一起，通过显微注射等方法，导入哺乳动物的__________细胞中，然后，将该细胞送入母体内，使其生长发育成为动物。
（2）人体干扰素基因之所以能“插入”到羊的DNA内，原因是。（3）请在下框中画出某DNA片段被切割形成黏性末端的过程示意图。
（4）如何检测和鉴定人的干扰素基因已在羊体内稳定遗传？请写出两种方法：
、。（5）干扰素在应用上遇到的困难是体外难以保存，可以通过加以改造。
（6）为了使T淋巴细胞在体外产生大量的干扰素，有人进行了实验，可是当将T淋巴细胞在体外培养繁殖了几代后，细胞分裂就停止了。请你用细胞工程的方法，以小鼠为实验对象，提出一个既能使T淋巴细胞在体外培养繁殖，又能获得大量小鼠干扰素的实验设计简单思
路: 。
12．转基因草莓中有能表达乙肝病毒表面抗原的基因，由此可获得用来预防乙肝的一种新型疫苗，其培育过程如图所示（①至④代表过程，A至C代表结构或细胞）：
（1）图中①过程用到的酶是，所形成的B叫做，B是由、、目的基因和标记基因等部分构成。
（2）②过程常用处理农杆菌，使之成为细胞，利于完成转化过程。（3）图中③过程叫做，④过程叫做，将叶盘培养成草莓幼苗的技术是。
（4）在分子水平上，可采用的方法来检测转基因草莓果实提取液中有无相应的抗原。
13．人们发现小型猪的器官可用来替代人体器官进行移植，但小型猪器官表面的抗原可引起免疫排斥反应。如图为科学家将小型猪器官表面抗原基因(Anti)“反向处理”，并人工合成reAnti基因，转入猪成纤维细胞，培育成转基因克隆猪的过程示意图，请据图回答问题。
(1) Anti基因的表达产物定位在上，可被识别，引起免疫反应。（2）若使reAnti基因和Anti基因在转基因克隆猪的同一细胞内表达，应在人工合成的reAnti基因的首段连接________。
(3)Anti基因的mRNA为…AUCGCCCG…—OH。将Anti基因“反向处理”后，人工合
成的reAnti基因的模板链为…ATCGCCCG…—OH，分析可知，Anti基因与reAnti基因的mRNA可发生碱基互补配对形成____ __，从而抑制了Anti基因表达的_______过程。
(4) 培养猪胎儿成纤维细胞，要将培养瓶置于含________的混合气体培养箱中进行培养。
(5) 过程③表示通过显微操作法吸出卵母细胞中的细胞核，此时的卵母细胞处于减数分裂的时期。微型吸管除了将细胞核吸出外，往往还要将________一并吸出。14．图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回
答下列问题：
（1）图1的一条脱氧核苷酸链中，相邻两个脱氧核苷酸之间由键连接。（2）若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是＿＿＿＿末端，其产物长度分别为＿＿＿。
（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子体细胞内分离出图1所示的DNA片段及其同源片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有＿＿＿＿＿种不同DNA片段。
（4）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是＿＿＿＿＿。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加＿＿＿＿＿的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
16．人们应用生物工程技术可以获得所需要的生物新品种或新产品。请据图回答下列问题：
（1）获得抗虫基因的常用方法是，然后利用进行大量扩增。
（2）转基因牛可通过分泌乳汁来生产人生长激素，在基因表达载体中，人生长激素基因的首端必须含有。③过程培养到桑椹胚或囊胚阶段，可以用技术，培育出多头相同的转基因牛犊。
（3）PrG基因的产物能激发细胞不断分裂，一般采用技术将无限增殖基因导入细胞中。
（4）在抗虫棉培育过程中，将目的基因导入棉花受体细胞采用最多的方法是法。
⑤过程采用的技术是。
1．
4．（1）限制性内切酶氢键碱基互补配对原则（2）引物耐高温（3） 3/4 雌雄配子各有1/2含抗虫基因且受精时雌雄配子随机结合（2分）（4）发生性状分离（2分）连续自交（2分）
（5）抗虫基因没有在植株细胞中得到表达（2分）
5．
6．11分（除说明外，每空1分）
（1）DNA分子杂交技术；用放射性同位素标记的目的基因（2分，答对一个点1分）（2）Taq酶(耐高温的或热稳定的DNA聚合酶)；模板DNA； 100%
（3）（2分，答对一个1分）
（4）蛋白质工程；①基因控制蛋白质的合成，改造基因即改造了蛋白质；②改造的基因可以遗传，直接改造的蛋白质不能遗传；③目前对大多数蛋白质复杂的高级结构还不清楚，所以改造基因比直接改造蛋白质容易(2分，答对其中一点,答案合理即可)
7. (13分）
（1）目的基因的检测与鉴定
(2)农药对害虫的变异类型进行选择
(3）抗虫基因RNA 蛋白质（2分）
转录翻译
(4）基因重组(5)减少了农药对环境的污染，保护了生态环境
(6)毒蛋白基因在棉花细胞内经转录和翻译合成了毒蛋白
(7)目的性强，育种周期短，克服了远源杂交不亲和的障碍，能定向改变生物的遗传性状（2分）
（8）保护生物多样性，维持生态系统的稳定性（2分）
(9）用于疾病的诊断和治疗；用于培育优良动、植物新品种，不利于环境保护；可能引起环境问题、食物安全性问题、生物安全性问题等（2分）
11．（11分）
（1）启动子 受精卵 转基因
（2）用相同的限制酶催化反应后形成了互补碱基序列（或不同生物DNA 的结构具有统一
性）
（3）（补充出DNA 的互补链给1分，写出两个黏性末端各给1分）（2分）
（4）DNA 分子杂交；DNA 与mRNA 分子杂交；或抗原抗体杂交；从羊的乳汁中提取出干扰素（以上任意任出两点即可）（2分）
（5）蛋白质工程
（6）将人的T 淋巴细胞与小鼠的瘤细胞在体外融合．．，筛选．．
出既能产生干扰素又能无限增殖的杂交瘤细胞，然后在适宜条件下进行细胞培养．．
(2分)。 12．⑴DNA 连接酶 基因表达载体（重组质粒） 启动子 终止子
⑵CaCl 2溶液（或Ca 2+） 感受态
⑶脱分化（去分化） 再分化 组织培养
⑷抗原—抗体杂交
13．（1）细胞膜 免疫细胞（或淋巴细胞）
(2)启动子(或Anti 基因的启动子)（2分）
(3)双链（或双链RNA ）（2分） 翻译
(4) 95%空气和5% CO2（2分）
(5) 第二次分裂（或M Ⅱ）时期 第一极体（2分）
14．(1)3，5磷酸二酯（键）
(2)平 537 bp 、790 bp 、661 bp （3分）
(3)4
(4)BamH Ⅰ 抗生素 B 同种限制酶切割形成的末端相同,部分目的基因 D 与质粒反向连接
16．（1）从基因文库中获取 PCR 技术
用限制酶切割 —C CTAG ↑G — —G GATCC — —CCTAG G —
（2）启动子胚胎分割移植（3）显微注射浆
（4）农杆菌转化植物组织培养
第二章 1. 名词解释 （1）顺反子(cistron)：基因所对应的一段核苷酸序列被称为顺反子（cistron），一个顺反子编码一种完整的多肽链。它是遗传的功能单位。 （3）转位因子（transposable elements）：是指可以从染色体基因组上的位置转移到另一个位置，甚至在不同的染色体之间跃迁的基因成分。 （4）基因组（genome）：细胞中，一套完整单倍体的遗传物质的总合。 （5）启动子（promoter）：是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始转录的序列，其大小不等，具有转录目标基因的mRNA的功能。启动子是基因表达不可缺少的重要元件。（6）基因（gene），基因是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 （7）顺反子(cistron)：基因所对应的一段核苷酸序列被称为顺反子（cistron），一个顺反子编码一种完整的多肽链。它是遗传的功能单位。 （8）终止子（terminator），在基因3 端下游外侧与终止密码子相邻的一段非编码的核苷酸短序列，具有终止转录的功能，叫做终止子（terminator）。 （9）断裂基因（split gene），真核生物的结构基因是不连续的，编码氨基酸的序列被非编码序列所打断，因而被称为断裂基因（split gene）。在编码序列之间的序列称为内含子（intron），被分隔开的编码序列称为外显子（exon）。 （10）顺式作用元件（cis-acting elements），指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的DNA序列。包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。 （11）反式作用因子（trans-acting elements），可结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子称为反式作用因子（trans-acting elements）。 （13）反应元件（response elements），是一类能介导基因对细胞外的某种信号产生反应的DNA序列，被称为反应元件（response elements）。 （14）增强子（enhancer），是一段DNA序列，其中含有多个能被反式作用因子识别与结合的顺式作用元件，反应作用因子与这些元件结合后能够调控（通常为增强）邻近基因的转录。（15）转位因子（transposable elements）：是指可以从染色体基因组上的位置转移到另一个位置，甚至在不同的染色体之间跃迁的基因成分。 （16）转座子（transposon，Tn），是一类较大的可移动成分，它是由几个基因组成的特定的DNA片段，除有关转座的基因外，至少带有一个与转座作用无关并决定宿主性状的基因（如抗药性基因）。 （17）假基因（pseudogene），假基因是多基因家族中的成员，因其碱基顺序发生某些突变而失去功能，不能表达或表达异常，生成无生物活性的多肽。 （18）重叠基因（overlapping genes），或嵌套基因（nested genes），是指基因的核苷酸序列（或阅读框）是彼此重叠的基因，称为重叠基因或嵌套基因。 （19）基因家族（gene family），就是指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的一组基因。 （20）反向重复序列，是指两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列。有两种形式，一种形式是两个反向排列的拷贝之间隔着一段间隔序列；另一种形式是两个拷贝反向串联在一起，中间没有间隔序列，这种结构亦称回文结构（palindrome）。 （21）看家基因（housekeeping gene），在几乎所有细胞中或发育过程中持续表达的基因，被称为看家基因。 （22）锌指（zinc fingers）结构，由约30个氨基酸残基组成的一段多肽序列，其中4个氨
一、大肠杆菌质粒DNA的提取 质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法。此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养 基。 2、37℃振荡培养过夜。 3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3 min，弃上清液。 4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-H Cl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，p H4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另 一新Ep管 8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置1 0min。 9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。 10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有 液体。 11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中 二、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。 (1)琼脂糖凝胶电泳装置
由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去15年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。使用最普遍的装置是Walt er Schaffner发明的水平板凝胶。 水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。 （2）琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。通贯凝胶的电场接通后，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。 （3）琼脂糖凝胶的染色 电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含EB的染液中，染色10分钟，取出紫外灯下观察。 三、质粒DNA热激法转化大肠杆菌 感受态的细胞可以摄入外部溶液中的DNA，而常态的细胞却不能，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。 1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培 养基的试管中，37℃振荡培养过夜 2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培 养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0. 3 3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴1 0min。 4、在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液 5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液 中，置冰上30min 6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去 上清液
1．cDNA克隆与基因组克隆有何不同? 2．怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoRI限制位点中去? 3．在Cohen构建有生物功能重组体的第一步实验中，用EcoRI切割了R6-5质粒，然后转化E．coli C600，在卡那霉素抗性子板上筛选到了pSCl01，它是由R6-5的三个EcoRI片段组成，请推测这个质粒具有什么遗传特性? 4．某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因? 5．在序列5’—CGAACATATGGAGT-3’中含有一个6bp的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么? 6．用连接酶将Sau 3AI('GATC)切割的DNA 与经BamHI(G 'GATCC)切割的DNA连接起来后，能够被BamHI切割的机率有多大(用百分比表示)? 7．用Klenow酶填补的办法可使5’黏性末端转变成平末端。这种方法常使DNA 上的某些限制酶的识别位点消失。请 问，对于下列限制酶，用这种方法处
理会不会使它们的识别序列都消失? Sau 3AI('GATC)；Taq I(T 'CGA)， BssHⅡ(G 'CGCGC)。 8.以大肠杆菌质粒DNA为载体克隆一个编码动物激素的基因，并使之在大肠杆菌中进行表达，简要说明实验中可能遇到的问题及可能的解决办法。 9．假定你分离到一个E．coli的Thr-突变体，并推测有可能是ThrA基因突变。 请设计一个方案用PCR从染色体DNA 扩增突变的ThrA基因，测定突变的序 列。(注：E．coli野生型的ThrA基因 的序列是已知的) 10．酵母人工染色体要在酵母细胞中稳定存在，必须有哪些基本的结构? 11．用EcoRI和HindⅢ分别切割同一来源的染色体DNA，并进行克隆，在前者的克隆中筛选到A基因，但在后者的克隆中未筛选到A基因，请说明原因。 12．一个携带有氨苄和卡那霉素抗性基因的质粒被仅在卡那霉素基因中有识别位点的EcoRI消化。消化物与酵母DNA连接后转
《基因工程》思考题 第一章绪论 1. 简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。 2. 为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？ 3. 简述基因的结构组成对基因操作的影响。 4. 谈谈你对gene的认识，并简要说说gene概念的演变过程. 5. 如何理解gene及其产物的共线性和非共线性？ 6. 试从理论和技术两个方面谈Gene Engineering诞生的基础. 第二章基因工程的基本原理与支撑技术 1. 试比较原核基因组与真核基因组的结构和功能特点 2. 试比较原核基因和真核基因表达调控的主要方式和特点 3. 分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？ 4. 琼脂糖凝胶电泳中，简述影响DNA在凝胶中迁移速率的因素. 5. 小量制备质粒DNA，用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因及克服方法？ 6. 在基因操作实践中有哪些检测核酸和蛋白质分子量的常规方法？ 7. 印迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下需要使用这些方法。 8. 核酸分子的标记有哪些方法，各有何特点？ 9. 由mRNA反转录成cDNA和DNA的PCR扩增是两个完全不同的酶催化反应过程，如何将两个过程联系在一起，实现由mRNA起始扩增出DNA？ 10. Primer是PCR反应体系的四大要素之一，PCR的许多应用都是通过primer设计来实现的，请问primer设计的一般原则是什么？ 11. 在PCR反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateau effect），请问什么叫Plateau effect？产生Plateau effect的原因有哪些？ 12. 在对PCR产物进行电泳检测时，有时会出现拖带或非特异性扩增条带，请分析其原因？如果检测结果是看不到DNA带或DNA带很弱，那又是为什么？ 13. 通过双向蛋白质电泳发现某蛋白质与某植物的一种表型密切相关，若要利用编码该蛋白质的基因来转基因植物，试问如何分离得到该基因？ 14. 现有一序列已知的DNA片段和一序列未知的DNA片段，你分别如何设计测序策略？ 15. 设想一下在什么情况下你希望知道一个基因或一段DNA的序列？ 16. 什么叫有性PCR？有性PCR导致DNA重组的分子机制跟体内重组有何异同？ 17. Explain the PCR. List the steps in carrying it out; include all the components and special conditions, explaining why each one is used. Illustrate the process with appropriate labels. Use the correct scientific terminology in your explanation. 第三章基因工程操作的基本条件 1. 试指出影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素. 2. 在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？ 3. 何谓Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法. 4. 某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？
基因工程实验报告 、
小麦GAPDH截短体的重组与表达 摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。 关键字：小麦基因；载体；感受态 前言 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 （一）实验过程
1.实验部分流程：
2．小麦总RNA提取（Trizol法） 2.1 材料 小麦幼苗 2.2 试剂配制及器具处理 ① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） ②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在 0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。 ③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 ④Trizol ⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 ⑥氯仿(最好用新的)。 ⑦异丙醇(最好用新的)。 2.3 操作步骤： ①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 ②室温放置5min，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm 离心10min。 ④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤重复步骤④。 ⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 3. RT-PCR扩增目的基因cDNA 3.1 试剂 ① RNA模板 ②Olig（dT）18 ③反转录缓冲液 ④dNTP ⑤ M-MULV反转录酶 ⑥ RNA抑制剂（RNasin） ⑦Premix EX Taq DNA聚合酶 ⑧ PCR特异引物 3.2操作步骤： 3.2.1 RNA的反转录 采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6μL（需加入RNA约1μg） OligodT primer 1μL H2O（nuclease-free）5μL 12μL 65℃ 5min，补加下列试剂： 5× Reaction buffer 4μL RibolockRNase Inhibitor 1μL 10mM dNTP Mix 2μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL 20μL 42℃ 60min 70℃，5min，﹣20℃保存
基因工程 一名词解释 DNA，1、限制与修饰系统：限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主细胞不受外源DNA的感染，可讲解外 来 从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说，与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或者说是甲基化酶，能保护 自身的 DNA不被讲解。限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。 2、各种限制与修饰系统的比较 Ⅱ型Ⅰ型Ⅲ型 识别位点4~6bp，大多为回文序列二分非对称5~7bp 非对称 切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外100bp 识别位点下游 24~26bp 简答 1. 何谓 Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法？ 答：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。 pH 引起星星活性的的因素：①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（ >100U/μl ）；③低离子强度（ <25mmol/L）；④高(> ；⑤有机溶剂如DMSO （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；⑥用其它二价阳离子 星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；③提高离子强度到100 ～ 150mM（在不抑制酶活性的前提下）；④降低反应pH至；⑤使用Mg2+作为二价阳离子。 2. 试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素？（影响酶活性的因素？） 答：外因：反应条件、底物纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当，反应体系的选择、反应时间的长短 内因：星星活性、底物甲基化、底物的构象 3、 DNA末端长度对酶切割的影响 答：限制酶切割 DNA 时，对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的 核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切 割扩增的 PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。一般需加 3 ～4 个碱基对。 4、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？ 答：将外源 DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：①在宿主细胞内必须能够自主复制（具 备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA 片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于 筛选；④其它：有一定的拷贝数，便于制备。 5 抗性基因（ Resistant gene）是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？ 答：氨苄青霉素抗性基因（ ampr）、四环素抗性基因（tetr ）、氯霉素抗性基因（ Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（ kanr , neor ）以及琥珀突变抑制基因supF 。 ⑴青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。氨苄青霉素抗性Ampr 编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化β - 内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。 ⑵四环素与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。 Tetr 编码一个由 399 个氨基酸组成的膜 结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 6. 何为α - 互补？如何利用α - 互补来筛选插入了外源DNA 的重组质粒？ 答：α - 互补指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β - 半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。α - 互补是基于在两个不同的缺陷β－半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。实现α- 互补主要有两部分组成：LacZ △ M15 ，放在 F 质粒或染色体上，随宿主传代；LacZ' ，放在载体上，作为筛选标记，当在 LacZ' 中插入一个片断后，将不可避免地导致产生无α- 互补能力的β－半乳糖苷酶片断。在诱导物IPTG 和底物 X-gal （同时可作为生色剂）的作用下，含重组质粒的菌落不能产生有活性的β－半乳糖苷酶，不能分解 X-gal ，呈现白色，而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。以此达到筛选的目的。 7、试简述λ噬菌体的裂解生长状态Lytic growth 和溶原状态 Lysogenic state 两种循环的分化及其调节过程？ 答：裂解生长状态是λ噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代λ噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂 解。溶原状态为λ噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主染色体DNA 中随宿主的繁殖传到子代细胞。调节过程：由感染复数
Chapter I Introduction 1)什么是基因？基因有哪些主要特点？ 基因是一段可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列。 ①不同基因具有相同的物质基础.②基因是可以切割的。③基因是可以转移的。④多肽与基因之间存在 对应关系。⑤遗传密码是通用的。⑥基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。 2)翻译并解释下列名词 genetic engineering遗传工程 gene engineering基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物获得新的遗传性状的操作。 gene manipulation基因操作：对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。 recombinant DNA technique重组DNA技术 gene cloning基因克隆：是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节。 molecular cloning分子克隆 3)什么是基因工程？简述基因工程的基本过程？p2 p4 4)简述基因工程研究的主要内容？p5 5)简述基因工程诞生理论基础p2和技术准备有哪些p3？ 6)基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 否，密码子简并性 7)举例说明基因工程技术在医学、农业、工业等领域的应用。 医学:人胰岛素和疫苗 农业:抗虫BT农药 工业:工程酿酒酵母
Chapter ⅡThe tools of trade 1)什么是限制性核酸内切酶？简述其主要类型和特点？ 是一种核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。类型特点p11 2)II型核酸内切酶的基本特点有哪些p12-14？简述影响核酸内切酶活性的因素有哪些 p14？ 3)解释限制酶的信号活性？抑制星号活性的方法有哪些？ 4)什么是DNA连接酶p15？有哪几类p16？有何不同p16？ 5)什么叫同尾酶、同裂酶p12？在基因工程中有何应用价值？ 同裂酶：识别位点、切割位点均相同，来源不同。在载体构建方面往往可以取得巧妙的应用。应用较多的同裂酶比如Sma1和Xma1，它们均识别CCCGGG，但前者切后产生钝末 同尾酶：来源各异，识别序列各不相同，但切割后产生相同的粘性末端。由同尾酶(isocaudomer)产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。 6)什么是DNA聚合酶？根据DNA聚合酶使用的模板不同，可将其分为哪两类？各有什么活 性？p17-18 聚合酶：在引物和模板的存在下，把脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3‘-OH 末端，催化核苷酸的聚合作用。 ①依赖于DNA的DNA聚合酶 ②依赖于RNA的DNA聚合酶 7)Taq DNA聚合酶：是一种从水生嗜热菌中分离得到的一种耐热的dna聚合酶，具有5-3聚 合酶活性和3-5外切酶活性，在分子中主要用于PCR。 逆转录酶：RNA指导的DNA聚合酶， 8)Klenow片段的特性和用途有哪些？举例说明。p17 9)名词解释：S1核酸酶、核酸外切酶、磷酸化酶激酶、 甲基化酶
1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？ 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？ 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。 答：①取0.5g琼脂糖置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂糖溶解；②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线； ④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇、冷的异丙醇、终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq DNA聚合酶）。 答:(1)利用半保留复制的原理，以待扩增的DNA为模板，通过一系列酶在体外引物介导下，
——凯1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？（实验题目的总结） 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？（自己写的） 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。（题目有歧义） 答：①取0.5g琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解； ②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇，冷的异丙醇，终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq
基因工程练习题 1、在基因工程中使用的限制性核酸内切酶，其作用是( ) A、将目的基因从染色体上切割出来 B、识别并切割特定的DNA核苷酸序列 C、将目的基因与运载体结合 D、将目的基因导入受体细胞 2、基因工程中常用细菌等原核生物作受体细胞的原因不包括( ) A、繁殖速度快 B、遗传物质相对较少 C、多为单细胞，操作简便 D、DNA为单链，变异少 3、基因工程是DNA分子水平的操作，下列有关基因工程的叙述中，错误的是( ) A、限制酶只用于切割获取目的基因 B、载体与目的基因可以用同一种限制酶处理 C、基因工程所用的工具酶是限制酶，DNA连接酶 D、带有目的基因的载体是否进入受体细胞需检测 4、运用现代生物技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因整合到棉花细胞中，为检测实验是否成功，最方便的方法是检测棉花植株是否有( ) A、抗虫基因 B、抗虫基因产物 C、新的细胞核 D、相应性状 5、转基因动物转基因时的受体细胞是( ) A、受精卵 B、精细胞 C、卵细胞 D、体细胞 6、基因工程中常见的载体是( ) A、质体 B、染色体 C、质粒 D、线粒体 7、水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中Asp、Gly、Ser构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技术中，这种蛋白质的作用是( ) A、促使目的基因导入宿主细胞中B、促使目的基因在宿主细胞中复制 C、使目的基因容易被检测出来 D、使目的基因容易成功表达 8、运用现代生物技术的育种方法，将抗菜青虫的Bt基因转移到优质油菜中，培育出转基因抗虫的油菜品种，这一品种在生长过程中能产生特异的杀虫蛋白质，对菜青虫有显著抗性，能大大减轻菜青虫对油菜的危害，提高油菜产量，减少农药使用，据以上信息，下列叙述正确的是( ) A、Bt基因的化学成分是蛋白质 B、Bt基因中有菜青虫的遗传物质 C、转基因抗虫油菜能产生杀虫蛋白是由于具有Bt基因 D、转基因抗虫油菜产生的杀虫蛋白是无机物 9、人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工合成，通过转基因技术，可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是( ) A、大肠杆菌 B、酵母菌 C、T 噬菌体 D、质粒DNA 4 10、不属于质粒被选为基因运载体的理由是（） A．能复制 B.有多个限制酶切点C．具有标记基因D．它是环状DNA
1. 名词解释 ( 1)顺反子 (cistron) ：基因所对应的一段核苷酸序列被称为顺反子( cistron )，一个顺反子 编码一种完整的多肽链。它是遗传的功能单位。 (3) 转位因子(transposable elements )：是指可以从染色体基因组上的位置转移到另一个 位置，甚至在不同的染色体之间跃迁的基因成分。 (4) 基因组(genome ):细胞中，一套完整单倍体的遗传物质的总合。 (5) 启动子(promoter )：是DNA 链上一段能与 RNA 聚合酶结合并能起始转录的序列，其 大小不等，具有转录目标基因的 mRNA 的功能。启动子是基因表达不可缺少的重要元件。 (6) 基因(gene ),基因是DNA 分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质 的最小功能单位。 (7) 顺反子(cistron):基因所对应的一段核苷酸序列被称为顺反子( cistron )，一个顺反子 编码一种完整的多肽链。它是遗传的功能单位。 (8) 终止子(terminator )，在基因3端下游外侧与终止密码子相邻的一段非编码的核苷酸 短序列，具有终止转录的功能，叫做终止子( terminator )。 (9) 断裂基因( split gene ) ，真核生物的结构基因是不连续的，编码氨基酸的序列被非编码 序列所打断， 因而被称为断裂基因 (split gene ) 。在编码序列之间的序列称为内含子 (intron )， 被分隔开的编码序列称为外显子( exon )。 (10) 顺式作用元件(cis-acting elements )，指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因 调控蛋白特异性识别和结合的 DNA 序列。包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信 号和一些反应元件等。 (11) 反式作用因子(trans-acting elements )，可结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋 白质因子称为反式作用因子( trans-acting elements )。 (13) 反应元件(response elements )，是一类能介导基因对细胞外的某种信号产生反应的 DNA 序列，被称为反应元件( response elements )。 (14) 增强子(enhancer )，是一段DNA 序列，其中含有多个能被反式作用因子识别与结合 的顺式作用元件， 反应作用因子与这些元件结合后能够调控 (通常为增强) 邻近基因的转录。 (15) 转位因子(transposable elements )：是指可以从染色体基因组上的位置转移到另一 个位置，甚至在不同的染色体之间跃迁的基因成分。 (16) 转座子(transposon ，Tn )，是一类较大的可移动成分，它是由几个基因组成的特定的 DNA 片段，除有关转座的基因外， 至少带有一个与转座作用无关并决定宿主性状的基因 (如 抗药性基因) 。 (17) 假基因(pseudogene )，假基因是多基因家族中的成员，因其碱基顺序发生某些突变 而失去功能，不能表达或表达异常，生成无生物活性的多肽。 (18) 重叠基因(overlapping genes )，或嵌套基因(nested genes )，是指基因的核苷酸序列 (或阅读框)是彼此重叠的基因，称为重叠基因或嵌套基因。 (19) 基因家族( gene family )，就是指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性 的一组基因。 ( 20 )反向重复序列，是指两个顺序相同的拷贝在 种形式是两个反向排列的拷贝之间隔着一段间隔序列； 起，中间没有间隔序列，这种结构亦称回文结构( (21)看家基因(housekeeping gene )，在几乎所有细胞中或发育过程中持续表达的基因, 被称为看家基因。 22)锌指( zinc fingers )结构，由约 30个氨基酸残基组成的一段多肽序列，其中 4个氨 基酸残基(两个是半脱氨酸两个是组氨酸，或 4个都是半脱氨酸)以配位键与 Zn 2+相互结 合，形成指状结构，常存在于真核转录因子的 DNA 结合结构域中。 (23) 亮氨酸拉链(leucine zippers )，是 DNA 链上呈反向排列。有两种形式，一 另一种形式是两个拷贝反向串联在一 palindrome )。
基因工程测试题 一、选择题： 1.人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工合成。通过转基因技术可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是( ) A.大肠杆菌 B.酵母菌 C.肺炎双球菌 D.乳酸菌 2.下列有关基因工程的叙述，正确的是( ) A．DNA连接酶将碱基对之间的氢键连接起来 B．目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变 C．限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的几率就越大 D．常用的载体有大肠杆菌、噬菌体和动植物病毒等 3.我国科学家运用基因工程技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达，培育出了抗虫棉。下列叙述不正确的是( ) A.抗虫基因的提取和运输需要专用的工具酶和载体 B.重组DNA分子中替换一个碱基对，不一定导致毒蛋白的毒性丧失 C.抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递到近缘作物，从而造成基因污染 D.转基因抗虫棉是否具有抗虫特性是通过检测棉花对抗生素抗性来确定的 4.如图是获得抗虫棉的技术流程示意图。卡那霉素抗性基因(kan r)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养
基上生长。下列叙述正确的是( ) A.构建重组质粒过程中需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶 B.愈伤组织的分化产生了不同基因型的植株 C.卡那霉素抗性基因(kan r)中有该过程所利用的限制性核酸内切酶 的识别位点 D.抗虫棉有性生殖后代能保持抗虫性状的稳定遗传 5.上海医学研究所成功培育出第一头携带人白蛋白基因的转基因牛。他们还研究出一种可大大提高基因表达水平的新方法，使转基因动物乳汁中的药物蛋白含量提高30多倍，以下与此有关的叙述中正确的是( ) A.“转基因动物”是指体细胞中出现了新基因的动物 B.“提高基因表达水平”是指设法使牛的乳腺细胞中含有更多的人白蛋白基因 C.只有从转基因牛乳汁中才能获取人白蛋白，是因为人白蛋白基因只在牛乳腺细胞中含有 D.转基因牛的肌肉细胞中也有人白蛋白基因，但不发生转录、翻译，不能合成人白蛋白 6.下列关于蛋白质工程和基因工程的比较，不合理的是( )
基因工程原理练习题及其答案 一、填空题 1．基因工程是_________年代发展起来的遗传学的一个分支学科。 2．基因工程的两个基本特点是：(1)____________，(2)___________。 3．基因克隆中三个基本要点是：___________；_________和__________。 4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的___________。 5．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自_______，第二、三两个字母取自_________，第四个字母则用___________表示。 6．部分酶切可采取的措施有：(1)____________(2)___________ (3)___________等。 7．第一个分离的限制性内切核酸酶是___________；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是_____________。8．限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是_________，它们属于_____________。 9．DNA聚合酶I的Klenow大片段是用_____________切割DNA聚合酶I得到的分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性：(1)____________；(2)________________的活性。 10．为了防止DNA的自身环化，可用_____________去双链DNA__________________。 11．EDTA是____________离子螯合剂。 12．测序酶是修饰了的T7 DNA聚合酶，它只有_____________酶的活性，而没有_______酶的活性。 13．切口移位(nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用_________的_______和______的作用。 14．欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采用_________或_______________。15．反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有____________的作用，可以将DNA- RNA杂种双链中的___________水解掉。 16．基因工程中有3种主要类型的载体：_______________、_____________、______________。 17．就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：_______________、_____________、______________。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 18．一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测 不出质粒，这种现象叫。 19．pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来自于，它的氨苄青霉素抗性基因来自于。 20．Y AC的最大容载能力是，BAC载体的最大容载能力是。 21．pSCl01是一种复制的质粒。 22．pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过 和两种质粒改造而来。它的复制子来自，Amp 抗性基因则是来自。 23．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。 24．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是 和。 25．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS位点序列来自，最大的克隆片段达到kb。 26．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。 27．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。 28．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，总的长度应在噬菌体基 因组的的范围内。 29．在分离DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是 。 30．用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加人单价的阳离子，如NaCl和NaAc， 其目的是。 31．引物在基因工程中至少有4个方面的用途：(1) (2) (3) (4) 。 32．Clark发现用Taq DNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出 碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆PCR产物的。 33．在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在 。 34．乙醇沉淀DNA的原理是。 35．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：
《基因工程》实验指导 湖南师范大学生命科学学院 遗传与发育生物学系 2009年5月
基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建 一、实验目的 本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。 二、实验原理 转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。 三、材料
限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品； 3. 2菌株及细胞系 DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃； 3. 3 质粒与表达载体系统 3. 3.1 pEGFP-N1载体 pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。含有人类巨细胞病毒（CMV）启 图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒 动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。异源性蛋白与EGFP阅读框一致地克隆入pEGFP-N1，形成的表达重组体在CMV启动子启动下，表达EGFP和目标蛋白的融合蛋白。该融合蛋白保持了EGFP的荧光特性，可对融合蛋白进行活细胞内