细胞培养技术
细胞培养发展史及其应用
（一）前言
20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。
所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。
由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。
（二）细胞培养技术及其历史
细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。
1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。
1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。
1903年，Jolly将蝾螈的白细胞保存在悬滴并维持了十个月。
1906年，Beebe和Ewing在动物的血液中尝试培养了传染性巴肉
瘤的细胞。
可是，由于当时的培养基并不理想，因此实验难以重复，并且也
难以证明这些先躯者所培养的是否是真正存活的健康的组织和细胞。
结果都和Welhelm ，一样只能维持离体细胞的短期存活,而没有细胞
的生长和增殖。
直到1907年，美国胚胎学家Ross Harrison的实验才被公认为组
织培养真正开始的标志，因为该实验但提供了可重复的技术，而且证
明了生物组织的功能可以在体外十分明确地延续下去。Ross Harrison
将蛙胚神经管区的一片组织移植到蛙的淋巴液凝块中，这片组织在体
外不但存活了若干星期，而且居然还从细胞中长出了轴突(神经纤维)，解决了当时关于轴突起源的争论，并表明了利用体外存活的组织进行
实验研究的可能性。他所采用的把培养物放在盖玻分上并倒置于凹玻
片腔中的方法还一直沿用至今，称为盖片复盖凹窝玻璃悬滴培养法。
在此基础上，1912年Carrel 则更加丰富和完善了此项技术，他
将无菌操作技术引入动物细胞培养，在没有使用抗菌素的条件下使鸡
胚心脏细胞在人工培养条件下生存了34年，并且先后传代3400次。
并发现动物体液中存在着对动物细胞生长有强烈促进作用的生长因子。这一结论早已被现在的研究所证实，并成为无血清培养基研究的基础。由于这两个人的卓越成就，细胞培养从此开始了迅猛的发展，并成为
生物工程特别是细胞工程中一项重要的基础技术.
1912年，当时的Carrel是外科医生，在实验中特别注意无菌操作。他用血浆包埋组织块外加胎汁的培养法，并采用了更新培养基和分离
组织的传代措施，从而完善了经典的悬滴培养法（Suspension Cultur e）。Carrel用这种方法，曾培养一鸡胚心肌组织长达数年之久。这
些创造性的工作充分揭示：离体的动物组织在培养条件下，具有近于
无限的生长和繁殖能力；并充分证明组织培养的确是研究活组织和细
胞的极好方法。
1924年Maximow又把Carrel的悬滴培养法改良为双盖片培养，使之更易于传代和减少污染。Carrel又设计了用卡氏瓶培养法，扩大了
组织的生存空间。自悬滴培养问世后的30年中，以Harrlson和Carr
el为首的科学家们，用这些方法对各种组织在体外生长的规律和细胞
形态进行了深入的研究，发表了大量论文，为组织培养的进一步发展奠定了巩固的基础。
（三）动物细胞的培养方法
（1）贴壁培养法
大多数动物细胞在离体培养条件下都需要附着在带有适量正电荷的固体或半固体的表面上才能正常生长，并最终在附着表面扩展成单层。其基本操作过程是：先将采集到的活体动物组织在无菌条件下采用物理(机械分散法) 或化学(酶消化法) 的方法分散成细胞悬液，经过滤、离心、纯化、漂洗后接种到加有适宜培养液的培养皿(瓶、板) 中，再放入二氧化碳培养箱进行培养。用此法培养的细胞生长良好且易于观察，适于实验室研究。但贴壁生长的细胞有接触抑制的特性，一旦细胞形成单层,生长就会受到抑制，细胞产量有限。如要继续培养还需将已形成单层的细胞再分散，稀释后重新接种，然后进行传代培养。
（2）悬浮培养
少数动物细胞属于悬浮生长型，这些细胞在离体培养时不需要附着物，悬浮于培养液中即可良好生长，如淋巴细胞和肿瘤细胞。悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便。培养时只需将采集到的活体动物组织经分散、过滤、纯化、漂洗后，按一定密度接种于适宜培养液中，置于特定的培养条件下即可良好生长。传代时不需要再分散，只需按比例稀释后即可继续培养。此法细胞增殖快、产量高、培养过程简单，是大规模培养动物细胞的理想模式。但在动物体中只有少数种类的细胞适于悬浮培养。
③大规模培养法
动物细胞大规模培养技术是在贴壁培养和悬浮培养的基础上融合了固定化细胞、流式细胞术、填充床、生物反应罐技术以及人工灌流和温和搅拌系统等技术后发展起来的。始于20 世纪60 年代初Capst ick及其同事为生产FMD 疫苗而对BHK 细胞的研究。其后，随着生物技术产品倍受世人亲睐，动物细胞大规模培养技术也随之得到了迅猛发展，并形成了几种比较成熟且有应用价值的大规模培养方法。
①空心纤维法：空心纤维培养法是Richard kncazek等在1972 年
创建的。最初使用的空心纤维是一种由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合
组成的可透性滤膜，外径约为1/3～3/4mm ，表面具有海绵状多孔结构，既能使水分子、营养物质和气体透过，也能使细胞在上面贴附生长。这种培养系统的核心部分是由3～6层这样的空心纤维组成的，培
养时将待培养细胞接种于空心纤维的外腔，培养一段时间后，当细胞
密度达到107-107个/ml时逐渐用无血清培养液代替含血清培养液。
此时细胞虽不再增殖，但能正常生活并继续分泌所需的蛋白质或其他
生物制品。由于这种培养方法在分离和纯化分泌物时很方便，因而在
生产激素和单抗时被广泛应用。并相继开发出了由硅胶、聚砜、聚丙
烯等材料构建的新的空心纤维培养系统。
②微载体法：微栽体法是Wezel在1967 年首先创建的。所采用的
微栽体是由天然葡聚糖聚合物或其他聚合物制成的固体小珠，其直径
约在50 微米到数百微米之间。培养动物细胞时先将微载体在血清中
浸泡一下(可加快细胞与微载体的贴附速度) ，然后将制备好的细胞悬
液和微载体混合孵育一段时间，待细胞贴附于微载体上后再转移至培
养液中培养，并借助温和搅拌系统使细胞随载体均匀悬浮于培养液中。这样细胞就能够在微载体表面迅速生长、增殖，细胞浓度可高达107
个/ml 。微载体法是一种完全将贴壁培养和悬浮培养融为一体的培养
方法。因而不但能使细胞均匀分布，提高了对培养液和培养空间的利用，而且适于各种细胞的大规模培养，收获过程简单，放大生产也很
容易。因而是一种比较理想的大规模培养方法。只是此法对微载体的
要求较高。
③微囊法:微囊法是美国Damon Biotech 公司创建的一种比较理想
的大规模动物细胞培养法。其基本技术是：先将欲培养的动物细胞悬
浮于海藻酸钠溶液中，之后使其通过一种成滴装置(微囊发生器) 而逐
滴滴入CaCl2 溶液中，海藻酸钠一旦进入CaCl2 溶液后即形成半透膜
微囊，从而将细胞封闭在其内。然后再将这种包含有细胞的微囊悬浮
于培养液中培养。这样培养液中的水和营养物质可透过半透膜进入微
囊供应给细胞,细胞的代谢物也可透过半透膜被排出,而细胞分泌的大
分子物质则被阻留而积累与囊内。当培养一段时间后，在细胞密度达
到107/ml时即可分离收集微囊，最后破开微囊就能获得高度纯化的大
分子产物。
细胞培养工作中，以下几个方面来预防支原体的污染：
①控制环境污染；
②严格实验操作；
③细胞培养基和器材要保证无菌；
④在细胞培养基中加入适量的抗生素。
清除支原体，常用方法有：抗生素处理、抗血清处理、抗生素加
抗血清和补体联合处理。支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治
疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮；其他类抗生素
如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用，所以常不用来作为
支原体感染的化学治疗剂。InvivoGen公司研究开发的新一代支原体
抗生素M-Plasmocin能有效地杀灭支原体，不影响细胞本身的代谢，
并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞，不会重新感染支原体。
（四）应用
（1）在生物学基础研究中的应用
离体培养的动物细胞具有培养条件可人为控制且便于观察检测的
特点，因而可广泛应用于生物学领域的基础研究中。在细胞生物学上，动物细胞培养可用于研究动物的正常或病理细胞的形态、生长发育、
细胞营养、代谢以及病变等微观过程。如神经细胞的增殖、突起生长、相互识别、刺激传递等机理就是通过进行各种神经细胞的培养才弄清
楚的。在遗传学研究中，除可用培养的动物细胞进行染色体分析外，
还可结合细胞融合技术建立细胞遗传学进行遗传分析和杂交育种；在
胚胎工程中通过体外培养卵母细胞并进行体外受精、胚胎分割和移植
已发展成了一种较成熟的技术而应用于家畜的繁殖生产中。另外，分
离和培养具有多潜能性的胚胎干细胞，还可用于动物克隆、细胞诱导
分化、动物育种的研究，并可作为基因转移的高效表达载体；在病毒
学研究中用培养的动物细胞代替试验动物做斑点分析，不仅方法简便、准确、而且重复性好。
（2）在临床医学上的应用
首先，动物细胞培养技术可用于遗传疾病和先天畸型的产前诊断。目前，人们已经能够用羊膜穿刺技术获得脱落于羊水中的胎儿细胞经
培养后进行染色体分析或甲胎蛋白检测即可诊断出胎儿是否患有遗传
性疾病或先天畸型，以此可避免先天残疾儿的诞生。现在用这种方法
已能检测出几十种代谢性遗传缺陷疾病和先天畸型疾病。其次，现在
的一些科学研究已能通过染色体对比分析检测出易患癌症的病人，以
便进行及早的预防和治疗。在这方面我国的科学工作者有较突出的研
究成果：他们改进了淋巴细胞的培养方法，从而使带有癌基因的人的
染色体表现出明显高于常人的畸变率，这就从细胞分子水平揭示了癌
症的病理、病因，并为癌症的早期诊断和预防提供了科学依据。再次，细胞培养还可用于临床治疗。目前已有将正常骨髓细胞经大量培养后
植入患造血障碍症患者体内进行治疗的报道。另外，动物细胞培养生
产的生物大分子制品也可用于治疗某些代谢缺陷疾病。
（3）在动物育种上的应用
目前，由于细胞培养技术、细胞融合技术、细胞杂交技术以及转
基因技术的创建与相互结合，使得人们能够在细胞水平操作并改变动
物的基因进行遗传物质的重组。这样就可以按照人类的需要大幅度地
改变生物的遗传组成，从而使新品种的培育在实验室中即可完成，可
大大缩短育种进程，且使育种工作更加经济有效。胚胎干细胞的研究
成果和克隆羊多莉的问世可以说已为动物遗传育种开辟了一条新途径。（4）可用于生产大分子生物制品
利用动物细胞大规模培养技术生产大分子生物制品始于上世纪60
年代,当时是为了满足生产FMD 疫苗的需要。后来随着大规模培养技
术的逐渐成熟和转基因技术的发展与应用,人们发现利用动物细胞大规
模培养技术来生产大分子药用蛋白比原核细胞表达系统更有优越性。
随着大量永久性细胞株的创建,在商业利益的刺激下,动物细胞大规模
培养技术也迅速发展起来,并被付之于应用。目前，用动物细胞可生产
的生物制品有各类疫苗、干扰素、激素、酶、生长因子、病毒杀虫剂、单克隆抗体等，其销售收入已占到世界生物技术产品的一半以上。我
们相信，随着动物细胞培养技术的发展，以后还会有更多的生物制品
被开发并用于造福人类。
动物细胞培养基的发展及应用
（一）引言
近年来，动物细胞培养技术已从单纯的实验操作扩展到生物学研究和
商业利用的许多方面，成为广泛采用的技术手段。许多生物技术科学研究
和产品的生产都离不开细胞培养。在细胞培养发展史中，细胞培养
基的发展占有很重要的位置。动物细胞培养基是体外细胞培养的重要因素。根据培养基的来源及成分的明确程度，动物细胞培养基的发展大致可分为3
个阶段：天然培养基阶段、合成培养基阶段、无血清培养基阶段。
（二）动物细胞培养基发展及其应用
（1）天然培养基阶段
这一阶段是动物细胞培养基的最初及摸索阶段。此阶段早期机械模拟
细胞的体内生存环境，直接采用某些组织凝块，生物性液体和组织提取液
等作为组织细胞的培养基为特征。如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液等。据记载，最早进行组织培养的是Roux采用温生理盐水培育鸡胚组织，
使之存活了数月之久。随之，美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋
巴液为培养基成功的在试管中培养了蛙胚神经组织达数周，创立体外培养
方法。后期便开始了对维持细胞生长的营养成分的研究，并为合成培养基
阶段的到来打下了基础。但当时由于条件所限始终没有稳定的发展起来。
（2）合成培养基阶段
合成培养基是根据已知细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。
研究表明合成培养基由于成分清楚，故可通过改变或调节各种成分的种类、数量和比例，观察细胞生物特有的反应性变化，测知细胞与外界环境的关系，了解细胞生存条件并可诱导细胞定向分化等。自从发现鸡胚组织能在
辅加各种氨基酸和多肽Locke溶液中存活一段时间，在含有葡萄糖和麦芽
糖的培养液中能存活持久些以来，在随后时间里人们设计了许多添加各种
辅助成分的培养基。常用合成培养基的种类和特点一般是依据条件、经验
和培养基的特点选用。目前常用的是MEMEagle、RPMI1640培养液等。绝大
多数细胞的体外培养需要在合成培养基中补充一定量的成分不明确的生物
性液体或组织提取液才能支持细胞的生长增殖，其中血清因来源丰富且易
于保存而成为被最广泛采用的培养基添加物，最常用的为小牛血清。小牛
血清是由很多大小不同生物分子组成的极为复杂的混合物，对促进细胞生
长与抑制生长活性是生理平衡的，它不是一种简单的液体，它含有各种血
浆蛋白质、脂肪、碳水化合物、无机物质等。血清的营养作用是极大的补
充营养液配方的成分，但是血清中所含的成分复杂。就蛋白质而言，血清
中所含的蛋白成分不少于150种。这就给动物细胞培养造成了诸多不利的
因素：①血清非常昂贵，血清的费用占到培养基费用的50％，致使生产成
本大幅度提高。②血清中含有某些不利于细胞生长的毒性物质或抑制物质，对某些细胞的体外培养有去分化作用。③血清中大量成分复杂的蛋白质给
疫苗、细胞因子、单克隆抗体等下游培养产物的分离纯化带来很大的困难。
④批次与批次之间血清质量的差异会影响细胞生长，最终影响产品质量。
血清易被支原体和杂质污染。也正是由于血清的应用存在上述问题才促使
人们对无血清培养基的研究和应用日益重视。为了多种理由除去血清中的
不确定成分，创造一种完全化学成分明确的培养液将是一个具有巨大进展
意义的工作。
（3）无血清培养基阶段
无血清培养基就是在合成培养基的基础上，引入成分完全明确的或部
分明确的血清替代成分，使培养基能满足动物细胞培养的要求，又可有效
的克服因使用血清所引发的问题。由于无血清培养基可以是完全采用已知
分子结构和构型组分的低蛋白或无蛋白培养基，因而它不仅为研究和阐明
细胞生长、增殖和分化的调节机制提供了有力的工具，而且为现代生物技
术尤其是细胞工程的应用准备了更好的条件。1975年，Hayashi等在培养
基中用激素代替血清使垂体细胞株Gh3在无血清介质中生长获得成功，预
示着无血清培养基的诱人前景。进入2O世纪80年代后，新的无血清培养
基不断问世，人们经过研究发现，只要在培养基中增加某些适于细胞生长
的成分，如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素和表皮生长因子等砌，不少细胞
即能在无血清供应的情况下生长口”。尤其是CHO、杂交瘤、骨髓瘤细胞以
及BHK细胞等f 51。某些细胞在无血清的条件下，其生长和抗体的产量甚
至较有血清培养时高出数倍。另外，动物细胞培养应用无血清培养基的成功，还将为某些疫苗的生产降低成本。这些都足以说明动物细胞无血清培
养基的研究和应用进入了新的时期。
无血清培养基的优势：
采用无血清培养基培养动物细胞大致有如下好处：①可避免血清批次
间的质量变动，提高细胞培养和试验结果的重复性；②避免血清对细胞的
毒性作用和血清源性污染；③避免血清组分对试验研究的影响；④有利于
体外培养细胞的分化；⑤可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。
虽然有上述这些好处存在，但无血清培养基也并非完美无缺。其不足之处主要表现为细胞的适用谱极窄，细胞在无血清培养基中更易受某些机械因素和化学因素的影响以及培养基难以保存等，皆不如传统的添加小牛血清。
无血清培养基的分代：
目前，无血清培养基已进入第3代，第l代无血清培养基虽然不合血清，但含有大量的动物和植物蛋白如牛血清白蛋白BSA和动物的刺激激素等，虽然其总蛋白量明显低于有血清培养基，但蛋白含量依然很高。因此厂商致力于发展第2代无血清培养基，其主要特点是完全不用动物来源蛋白，称之为无血清，无动物衍生蛋白。它的优点是既可降低生产成本，又能加快报批的速度，因为政府药品监管部门对产品是否用含无血清培养基生产相当关注。由于生物工程的要求，第3代无血清培养基近年已出现，即完全没有蛋白或含量极低，称之为双无培养基，即Serum—free，Protei n—free培养基。这带来下述几个方面的好处：首先是因为培养基全为化学已知物，因此细胞培养与生产很容易做到恒定；其次是细胞分泌的目标蛋白的分离纯化更为容易；最后是细胞培养基的成本(指原材料成本，不包括研究开发费用)大为下降，生产中品质管理更加容易。早期的无血清培养基其两个主要指标即细胞生长速率和细胞密度都低于有血清培养基，现在的无血清培养基在上述两个指标包括蛋白分泌量都不亚于血清培养基，甚至更好。目前预测第4代无血清培养基将会进入研究与开发，这将是一种无血清、无蛋白、又可以高温消毒的适合于许多种不同细胞生长的全能型培养基。
无血清培养基的应用:
近年的实践证明，使用无血清培养基在细胞的生长速率和细胞密度及蛋白的表达水平都不亚于血清培养，甚至在某些方面超过血清培养，而这正是评价细胞培养基的几个重要指标。无血清培养基尚存在不足的方面，但其显著的优势将使无血清培养技术逐步取代含血清细胞培养。无血清培养基已广泛的应用于细胞生物学、药理学、肿瘤学和细胞工程领域。无血清培养基的应用主要表现在以下几个方面：①研究细胞的分化条件：目前已有许多在含血清的培养基中不能保持原代细胞分化现象的细胞系，在无血清培养基中成功地保留着分化能力和分化现象。如人结肠癌细胞LIMI186 3在无血清培养基的培养下保持着肾脏的转运功能；②用于激素、生长因子和药物等与细胞相互作用的研究；③用于从多种细胞混杂的培养中选择目的细胞，通过对无血清培养基中的某些成分的取舍，可抑制原代组织培养物中非目的细胞的过度生长，达到选择目的细胞的目的；④肿瘤病理学和
病因学的研究：如用于研究致癌因子对细胞的影响，研究肿瘤细胞对可能
触发正常细胞终末分化的外周信号的反应能力，或用于研究正常细胞与肿
瘤细胞的生长和移行与基底膜信号的关系等；⑤用于生产疫苗、单克隆抗
体和生物活性蛋白等生物制品。这可以说是无血清培养基最重要的同时也
是最有发展前景的应用领域。一方面是由于无血清培养基的成分明确、质
量一致、蛋白含量低，因而有利于提高细胞产品生产的稳定性并使细胞产
品易于纯化；另一方面是可通过对培养基成分的优化，使不同的细胞能各
自在最有利其生长或最有利于表达目的产物的环境中持续高密度培养。
(三)展望
经过几十年来的研究与实践应用，大规模动物细胞培养技术已日趋完善。随着这一技术的进一步发展，人们还将不断努力设计理想的生物反应
器以获得高密度、高活力的细胞开发新的无血清培养基，使生物制品更安全，建立细胞培养与产物分离的耦合系统，充分利用培养液以降低生产成
本等，动物细胞培养技术将在生物制备和基因工程等领域得到更广泛的应
用圈。
尤其是无血清培养基的发展更为迅速。无血清培养基具有许多传统的
含血清培养基无法比拟的优势，但还有许多不足之处有待改善。首先，无
血清培养基只能用于一种或少数几种细胞高密度生长或高水平表达目的产物，缺少通用性，有待于研究具有广泛适应性的无血清培养基。其次，将
无血清培养基与发酵罐培养技术相结合成为一个新的研究热点，如何将其
应用于发酵工程进行大规模生产目的产物将有待于继续研究与关注。另外，无血清培养基目前还存在成本高的问题，因而降低其成本的方法值得探索。
实验一动物细胞培养 细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。 细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。 细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等 为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。 本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。 Ⅰ清洗与灭菌 一、实验目的 能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。 二、实验原理 清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。 三、实验材料、用品
动物细胞培养和核移植技术 备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课 教学目标 知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。 过程与方法 情感态度 与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激 发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯 物主义观念。 教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景 教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。 教学用具多媒体课件 课时安排1课时 教学内容设计与反思 板书设计:
教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。 （1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养 植物体细胞杂交 （2）植物体细胞杂交的结果是产生了？ （3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？ 二、讲授新课: （一）动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段 动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 （二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形 成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问 题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的 脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神 经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验 不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后， 在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物 细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关 的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的 培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程： 引导学生阅读课文44--46面相关内容。
动物细胞培养及无血清培养研究进展 摘要：细胞培养是生物学中一项重要技术，应用较为广泛，目前已渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等多个领域。其中动物细胞培养是动物细胞工程中最常用的技术手段，而且动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。本文主要介绍了动物细胞培养和其中发展较快的无血清培养技术的研究应用进展。为未来实际的研究和生产作一些总结和展望。 关键词：动物细胞；细胞培养；无血清培养基 1 引言 组织培养技术创建于18世纪末，之后于1907 年美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基在试管中培养蛙胚神经组织宣告成功后，才逐渐发展成为一种从机体获取细胞，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的实验技术。这种技术为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。近年来生命科学迅速发展，各种在分子水平的实验如核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移等，都是借助细胞培养技术而得以实现的。然而各领域的动物细胞培养技术发展并不平衡，存在许多的局限性，使用范围有限，还未出现适合整个生命科学研究领域的培养体系。因此本文对细胞培养及大规模培养、无血清培养做一些总结。 2动物细胞培养 动物细胞培养方式包括原代和传代培养。培养方式有贴壁、悬浮以及固定化培养等方式。 2.1动物细胞培养的基本概念 细胞培养指的是从体内组织取出细胞，并为其提供一个无菌、具有适当温度及酸碱度的环境，给予充分营养，使其生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。从体内取出的细胞进行的首次培养式细胞培养最初的阶段，也称为原代培养。原代培养式细胞培养当中重要的必经环节。原代培养细胞生长到一定时候后，由于受群体环境影响，需要转移到另一个容器，这种培养称为传代培养。传代后的动物细胞与原代培物形状一致的话，则表示传代成功，这些细胞称为细胞系或细胞株。 2.2动物细胞培养技术的内容
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果 器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。 你认为精确配制各种溶液？ 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。
细胞培养技术
细胞培养发展史及其应用 （一）前言 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。 由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。 （二）细胞培养技术及其历史 细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。 1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。
动物细胞培养总结 一．实验准备 1.实验器械、器皿的清洗和消毒 （1）清洗和包装 离心管，2ml,15ml)若干，冻存管若干放进铝饭盒，用牛皮纸包裹，系紧棉绳，用笔在饭盒上和牛皮纸上标记盒内所装物品名称、数量、日期和所属人名称。 蓝枪头两盒，黄枪头白枪头各一盒用牛皮纸包裹，用棉绳扎紧。 取适量蒸馏水于4L玻璃瓶，瓶盖拧松半圈。 过滤器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自来水毛刷洗涤剂刷洗，蒸馏水润洗，烘干。 过滤器两部分分别包裹，先将瓶口部位用锡纸包裹后，再罩以牛皮纸，再用棉布密包起来，用棉绳扎紧。 玻璃瓶拧下瓶盖，瓶身浸酸。浸酸时应注意安全，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁以便浸酸结束后清洗耐酸手套，防止走动时酸液滴到地板上不好清洗。瓶口慢慢沉入液面下，注意缓慢降低瓶身，使液体慢慢浸入瓶内，以免产生气泡溅出酸液，发生危险。浸酸时器皿要充满酸液，勿留气泡，浸泡过夜。取出瓶身时，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁，取出后将瓶身放入盆内水中在转移至水池边清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。换水洗几次，待水澄清后开始冲洗，每瓶都用自来水灌满，倒掉，重复15次，再用
蒸馏水漂洗5次，去离子水漂洗3次，烘干备用。 （2）消毒灭菌 1>全自动高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，放入物品，瓶类物体须拧松盖子后放最上面一筐，盖上灭菌锅盖，拧紧盖子至温度显示栏的左上角有一红点亮灯，按start开始升温。若灭有无菌水或玻璃瓶待降温至常温再打开，打开后立即拧紧，无菌水瓶口封上封口膜。若没灭瓶类物品，降温至80度左右即可打开灭菌锅，须戴上线手套取出。 2>手提式高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，检查设定是否为121度20分钟，放入物品，盖上灭菌锅盖，注意导气管一定插到锅底并不能堵塞，用手对称地拧紧锅盖螺栓，再用扳手继续拧紧。加温升压之前，先打开排气阀门，加温约半小时后见排气阀处开始排残留在锅内的冷空气，排气五分钟，关闭排气阀，继而开始升压。灭菌后不要立即打开气阀放气以免水汽喷出。待自然降温至常压才能打开气阀。 玻璃瓶须拧紧，饭盒，枪头灭菌后放入烘箱烘干备用。 2.无菌间消毒及设备检查 用84消毒液拖地，用原液按照1：29的比例兑水，抹布、拖把擦洗。配400ml 75%酒精于盆中，用酒精棉仔细擦拭CO2培养箱，超净台，超净台内物品，显微镜，桌面，若培养箱内未培养细胞可以再打开高温灭菌模式将培养箱灭菌一次。 用蒸馏水擦拭清洗水浴锅内壁，注意底座不要沾水。
?一、半连续式培养 1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系 统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。 2.半连续式特点： ·培养物的体积逐步增加； ·可进行多次收获； ·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。 二、连续式培养 1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模 式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。
一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G1期（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G1期为起点，那么细胞增殖周期的各时期应循着G1-S-G2-M的顺序进行，G1、S、G2三期合称为细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞
增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度等有关。接种细胞数量大，细胞基数大。相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快（实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快）；连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增值快；；培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。以上情况都会缩短传代时间。 所谓细胞“一代”一词，仅指从细胞接种到分离培养时的一段时间，这已成
动物细胞培养·心得 在学习动物细胞培养的过程中，我了解到是动物细胞工程中最常用的技术手段，而且动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础点，细胞培养是生物医学中一项重要技术，应用较为广泛，目前已渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等多个领域。在这次PPT 制作中，我对无脊椎动物和脊椎动物两大领域细胞培养取得的进展及应用作了较为详细的了解，并在此基础上探讨了动物细胞培养存在的问题以及未来的发展方向。为相关领域研究者探讨其他种类细胞系的建立及筛选合适的细胞系培养方法作为理论的参考依据 我了解到历史上组织培养技术创建于 18 世纪末，之后于 1907 年美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基在试管中培养蛙胚神经组织宣告成功后，才逐渐发展成为一种从体内组织取出细胞，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的实验技术。这种技术为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。特别是随着近年来现代生物科学领域的迅速拓展，各种分子生物学实验诸如核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移等，都是借助细胞培养技术而得以实现的。然而，在种类繁多的动物世界里，细胞培养实验技术的发展并不均衡，构建动物细胞培养体系的研究效率和效果上也存在较大的局限性。而动物细胞培养，在1907年，哈里森（Harrison）在无菌条件下用淋巴液作培养基，培养蛙胚神经组织存活数周，并观察到神经细胞突起的生长过程，由此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，奠定了动物组织体外培养的基础。之后，又有人将悬滴培养法改良为双盖片培养，提高了传代效率并减少了污染；1923年，卡雷尔（Carrel）设计了卡氏瓶培养法，扩大了组织生存空间。 1951年，厄尔（Earle）发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基。1951年，波米拉（Pomerat）设计了灌流小室，使细胞生活在不断更新的培养液中，便于作显微摄影和细胞代谢的研究。1957年，格拉夫（Graff）用灌流技术进一步提高了细胞悬浮培养的效率。1957年，杜尔贝科（Dulbecco）等人采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法，获得了单层细胞培养。单层培养法的出现，对组织培养的发展起了很大的推动作用。此后单层培养成为组织培养普遍应用的技术。20世纪60年代后，动物细胞大规模培养技术开始起步，并逐步发展。20世纪80年代后，随着基因工程和其他细胞工程技术的发展，细胞培养技术已成为转基因技术、生物制药及其他许多技术的基础，在现代生物技术中发挥着重要的作用 我从资料查得根据细胞种类：原代细胞培养，传代细胞培养。原代细胞：将动物各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA) 或机械方法处理，分散成单细胞，在合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。培养的细胞为正常的动物细胞，一般培养10代后不再增殖，死亡。传代细胞：传代培养是细胞培养常规保种方法之一，也是所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长，这一过程就叫传代。传代培养可获得大量供实验所需细胞。细胞传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细地无菌操作。培
动物细胞培养在药物领域的应用 摘要：动物细胞培养开始于本世纪初 1962 年, 其规模开始扩大, 发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法, 利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单克隆抗体等, 已成为医药生物高技术产业的重要部分。本论文主要介绍动物细胞培养在药物领域的应用。 关键词：现代生物技术、动物细胞工程、动物细胞培养、药物领域、单克隆抗体 现代生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切的关系，特别是在生物医药领域，细胞培养更具有特殊的作用。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多都是通过细胞培养来实现的，基因工程乙肝疫苗大多是以CHO细胞作为载体；基因工程抗体药物的制备也离不开细胞培养。细胞工程领域更离不开细胞培养技术，杂交瘤单克隆抗体的研究制备完全是通过细胞培养来实现的，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。 一、首先介绍下动物细胞特点及其培养的基本要求和技术 1、动物细胞特点 动物细胞没有细胞壁，只有细胞膜，细胞质，细胞核，而且大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或者半固体的表面才能生长。 体外培养的动物细胞可分为原代细胞和传代细胞。原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞。适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞称为传代细胞。通常体外大量培养的动物细胞有哺乳动物细胞、昆虫细胞、禽类细胞和鱼类细胞等。 2、动物细胞培养的要求 动物细胞培养的条件：无菌、无毒的环境；营养物质（合成培养基）；温度和pH （36.5±0.5℃，7.2~7.4）；气体环境（氧气和二氧化碳）等。 其中动物细胞对营养要求更加苛刻，包括有氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或者半乳糖，除此之外还要有血清，因为由于动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，此外动物血清中也包含了一些动物的激素和酶，可以促进细胞的发育。这些都是组成培养基的重要成分。 动物细胞培养还需要防止污染问题，细菌、真菌、病毒均可以导致动物细胞在培养过程中受到感染而死亡。而生物的组织材料、操作者自身、培养基、各种器皿以及环境均会引起污染。显著的污染标志是培养基的pH迅速改变，细胞外形模糊，甚至出现漂浮的集落。 3、动物细胞培养的步骤 ①无菌操作取出目的细胞所在组织，以培养液漂洗干净； ②以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块； ③将小组织块置解离液离散细胞（解离液含有蛋白酶类）； ④低速离心洗涤细胞后，讲目的细胞吸移至培养瓶内培养。注意，哺乳动物细胞的大量培养需要提供较大的支持界面，原因前面已经说过，那是因为哺乳动物细胞只有附着在固体或者半固体的表面才能生长。 4、动物细胞培养的方法
动物细胞培养和核移植技术 【教学目标】 1．简述动物细胞培养的过程、条件及应用。 2．简述通过动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景。 3．举例说出动物细胞融合与单克隆抗体的原理和应用。 【教学重难点】 1．动物细胞培养的过程及条件。 2．用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程。 3．单克隆抗体的制备和应用。 【教学方法】 诱思法、分析法、归纳法。 【教学过程】 一、引入新课 利用植物细胞可以培育成植物体，那么，你利用动物细胞能不能大量繁殖动物体，以提高繁殖率呢？这节课我们来学习动物细胞工程。 二、进行新课 动物细胞工程的常用技术手段有哪些？最基础的技术手段是什么？ 动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体等。最基础的技术手段是动物细胞培养。 1．动物细胞培养 概念：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。 （1）需分散成单个细胞；（2）需要在培养基上培养；（3）动物细胞培养的实质是细胞增殖。 2．动物细胞培养的过程：（学生自学总结） 取动物组织块 ↓剪碎、胰蛋白酶处理 分散成单个细胞 ↓
细胞悬液 ↓转入培养液 原代培养 ↓胰蛋白酶处理 传代培养 问题：什么是细胞贴壁？什么是接触抑制？ 悬液中分散的细胞很快就贴附在有丝分裂，称为细胞贴壁。当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。 问题：如何打破接触抑制？ 需要重新用胰蛋白酶等处理，然后分别继续培养，让细胞继续增殖。 问题：细胞传代培养代数有什么特点？ 传代培养的细胞一般传至10代后就不易传下去了，一般来说，细胞在传至10～50代左右时，增殖会逐渐缓慢，以至于完全停止，这时部分细胞的细胞核型可能发生变化，当继续传代培养时，少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性。所以目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型。 3．动物细胞培养的条件 （1）无菌、无毒的环境。 （2）营养：合成培养基成分包括糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，通常还需加入血清、血浆等一些天然成分。 （3）温度和pH：适宜温度一般与动物的体温相近；pH为7.2～7.4。 （4）气体环境：95％空气和5％CO 混合气体。 2 问题：如何保证无菌、无毒环境？ （1）对培养液和所有培养用具进行无菌处理；（2）通常还需要在细胞培养液中添加一定量的抗生素；（3）应定期更换培养液，以便清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。 4．动物细胞培养技术的应用 （1）可大规模生产一些有重要价值的生物制品。 （2）培养的动物细胞可作为基因工程中常用的受体细胞。 （3）培养的动物细胞可用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性（根据变异率）。 （4）培养正常或病变细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究。
动物细胞培养 【教学目标】 1.简述动物细胞培养的过程 2.了解动物细胞培养的条件 3.知道动物细胞培养的的应用 【重点、难点】动物细胞培养的过程 【自主学习】阅读教材P44-46内容----动物细胞的培养 1.动物细胞培养的概念：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成______________，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞______ __和_____ ______。 2.动物细胞培养的过程：P45图2—16 3.动物细胞培养的条件： （1）无菌无毒的环境：对和进行无菌处理，还可以在培养液中添加一定量的。此外，应定期。 （2）营养：合成培养基中有、、、、等，通常需加入等天然成分。（3）温度和PH ：哺乳动物适宜温度为，多数细胞生存的适宜PH为。（4）气体环境：主要是和。_________________是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是。 4.举例说出动物细胞培养技术的应用： ①大规模生产有重要价值的生物制品。如：、、等。 ②动物细胞是基因工程技术中常用的细胞，因此，也离不开动物细胞的培养。 ③培养的动物细胞还可以用于，判断某种物质的毒性。 ④科学家培养正常或各种病变的细胞，用于、、等方面的研究。如：。 【合作探究】 【探究一】动物细胞培养的过程 1.动物细胞培养的选材有什么要求？取出动物组织后，怎样制备细胞悬液？ 2.动物细胞培养用到什么酶？它的作用什么？ 3.什么是“原代培养”和“传代培养”？为什么要进行“传代培养”
4.什么是“细胞贴壁”和“接触抑制” 5.动物细胞能无限制的传代下去吗？ 6.目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常为几代以内的细胞？为什么？ 7.通过动物细胞培养能获得动物个体吗？为什么？ 归纳总结：根据以上的探究并结合教材44-45页动物细胞培养过程，构建动物细胞培养流程图。 【探究二】动物细胞培养的条件 1.怎样保证被培养的细胞处于无菌无毒的环境中？ 2.为什么培养动物细胞时通常要加入动物血清？ 3.动物细胞培养所需的气体主要有哪些？主要作用分别是什么？ 【探究三】动物细胞培养技术的应用 如何用动物细胞培养技术来检测有毒物质的毒性？ 【小结】:植物组织培养和动物细胞培养的比较
动物细胞培养在药物上的应用 摘要我国药物市场正迅速发展，药物生产技术不断地进行技术革新。动物细胞培养技术不仅提高我国药物生产工艺水平和药物质量，更推动了动物细胞培养技术在我国药物行业中的研发应用和技术发展。本文从动物细胞培养技术的发展、趋势、应用及前景等方面进行了综述，分析并探讨了动物细胞培养技术在我国药物生产中的应用前景。 关键词：动物细胞培养药物应用前景 1.动物细胞培养技术的发展及趋势 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 50年代末，随着生物科学和技术科学的相互渗透，遗传学和生物化学的相互结合，出现了分子遗传学、分子生物学、细胞工程等新兴科学，这些新科学的形成和发展都与细胞培养有密切关系。当前细胞培养技术已广泛用于生物学和医学研究的各个领域，出现了用各种理化措施诱发出遗传缺欠细胞株、应用细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体、用培养细胞检测环境中可疑致癌物质、癌基因转染和细胞转化等。动物细胞培养将在药物上有着广泛的应用。 2.动物细胞培养技术的应用 2.1.动物细胞培养技术在临床医学上的应用 动物细胞培养技术可用于遗传疾病和先天畸型的产前诊断。目前，人们已经能够用羊膜穿刺技术获得脱落于羊水中的胎儿细胞，经培养后进行染色体分析或甲胎蛋白检测即可诊断出胎儿是否患有遗传性疾病或先天畸型。以此可避免先天残疾儿的诞生。现在用这种方法已能检测出几十种代谢性遗传缺陷疾病和先天畸型疾病。其次，现在的一些科学研究已能通过染色体对比分析检测出易患癌症的病人，以便进行及早的预防和治疗。在这方面，我国的科学工作者有较突出的研究成果，他们改进了淋巴细胞的培养方法，从而使带有癌基因的人的染色体表现出明显高于常人的畸变率，这就从细胞分子水平揭示了癌症的病理、病因，并为癌症的早期诊断和预防提供了科学依据。再次，细胞培养还可用于临床治疗。目前已有将正常骨髓细胞经大量培养后植入患造血障碍症患者体内进行治疗的报道。另外，动物细胞培养生产
细胞培养技术原理及应用研究进展 姓名：赵鹏学号：158033038 专业：流行病与卫生统计学 摘要：细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术，已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法。文章对细胞培养技术的应用作一综述。关键词：细胞培养；应用；研究进展 细胞是构成机体的基本单位，是生命活动的基本单位。一切有机体（除病毒）都是由细胞组成的。细胞具有独立的、有序的自控代谢体系。因此，对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、征服疾病的关键。细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术。细胞培养技术的优点是可以直接观察活细胞的形态结构、生命活动及其变化；提供大量生物性状相似的试验对象，特别是研究大型动物（奶牛）时具有耗资少的优点。但模拟体内环境仍与实际有很大的差异，因此利用细胞培养技术的试验结果不可以轻易做出与体内等同的结论。 动物组织（细胞）培养开始于20世纪初，现已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法[1 ]。随着细胞培养技术的不断发展，现在也广泛应用于动物生产研究。 20 世纪 60 年代，该技术应用于水产动物的病毒分离和纯化，对于鱼类疾病的防治具有重要作用。近年来研究发现单一种子细胞难以完成构建复杂组织的需要，因此产生了联合培养细胞技术。联合培养下的细胞之间存在着精细的相互调控关系，因而更符合仿生学的原理且更有利于种子细胞的增殖与分化，为复杂的细胞诱导分化以及体外组织构建提供了新思路、新方法[2 ]。 1 细胞培养 细胞培养是将活体组织或细胞从试验动物体内取出，放在模拟体内生存环境的体外环境（无菌、适温、营养丰富）中，使高体细胞生长、发育的一种方法。按照培养的结构成分不同，将其分为组织培养、细胞培养及器官培养等。根据细胞是否在支持物上生长，将其分为贴壁型和悬浮型。一般来说，圆形细胞如淋巴细胞属于悬浮型，而胞体梭型（成纤维型细胞）、扁平不规则（上皮型细胞）等属于贴壁型，贴壁型细胞必需贴附在支持物表面生长。细胞培养开始于 1906 年，Harrison 用蛙新鲜淋巴液培养蛙胚神经组织 4 周，首次成功地利用体外培养液培养神经元，标志着组织细胞的体外培养模
动物细胞培养技术研究进展 （张云生西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌 712100） [摘要]:动物细胞培养是生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，可分为原代和传代培养，有贴壁、悬浮和固定化培养等培养方式。细胞生长具有特殊的生物学性质，需要无菌、恒温和充分的营养环境。动物细胞培养技术在拥有广阔的发展空间和光明前景的同时也面临着诸多问题和挑战。 [关键词]:细胞培养；微载体；中空纤维；微囊；生物反应器 1885年，W Roux尝试使组织离体培养,被认为是组织细胞培养技术的萌芽； 1907年Harrison和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法,用于研究离体动物细胞的培养，标志着细胞培养技术(Cell culture technology)的诞生。此后,随着抗生素、培养基、培养装置以及工艺方法的不断改进，动物细胞培养(Animal cell culture)的研究和应用逐步增多和深入，发展至今已成为在生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法。利用细胞培养开展体外试验，成为了阐释生命现象、发病机理和筛选药物的重要手段；利用细胞培养技术结合细胞融合(Cell fusion) 、细胞杂交(Cell hybridization)以及转基因(Transgene)技术进行基因重组、组织构建是遗传和组织工程的重要工具；利用细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物技术产业的重要部分[1]。 1 基本概念[1, 2 ] 细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的一种培养技术。从体内取出细胞首次培养即为原代培养( Primary Culture)，这是细胞培养的最初和必经阶段。当原代培养细胞生长到一定时期，受到群体环境限制，就需要转移到另一容器才能继续生长，称为传代或继代培养( Subculture)。根据原代培物性状的一致性与否，传代成功后称为细胞系( Cell line)或细胞株(Cell Strain)。这些细胞一般可顺利传40～50代次，并保持染色体二倍体数量和接触抑制，传至50代左右时则出现生长停滞，大部分衰老死亡，此类称为有限细胞系/株；在细胞传代的过程中，有些因发生遗传突变获得了持久性增殖能力的细胞称为无限细胞系/株。 2 体外培养动物细胞的生物学特性 动物细胞无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染；对生长环境和培养环境要求苛刻[3]。 2. 1 细胞生命周期性变化[1] 体外培养的细胞从适应环境、旺盛生长到由于自身和环境限制缓慢或停滞生长经历一个周期变化。 1. 潜伏期(Latent phase) 细胞从接种到适应新环境生长繁殖的一段时间，此间细胞胞质回缩，代谢缓慢。 2. 指数生长期(Logarthmic growth phase)指数生长期是细胞活力最好的时期，细胞增殖旺盛。在接种细胞数量适宜的情况下。指数生长期持续3～5 d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少,营养环境恶化，呈现接触抑制(Contact inhibition)。恶性细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑
细胞生物学在生物制药方面的应用及实例 —————动物细胞培养技术 【摘要】现代生物制药产业中有着众多核心技术，其中哺乳动物细胞培养技术作为生物制药产业的下游通用性核心技术之一，发挥着重要作用。动物细胞培养开始于本世纪初，到1962 年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。 【关键词】生物制药动物细胞技术发展历史应用前景 动物细胞技术用于生物制药的历史 早期疫苗产业: 往往利用动物来生产疫苗，譬如用奶牛来生产天花疫苗。 天花是继瘟疫之后世界上传播最广、最可怕的疾病。1555年，墨西哥天花大流行，全国1500万人口中，死了200万人。16-18世纪，欧洲每年死于天花病的人数为50万，亚洲达80万人。有人估计，18世纪内有1.5亿人死于天花。 18世纪后期，一位英国乡村医生E. Jenner发现，一种挤奶女工容易得的、比较温和的疾病的人，对天花也有免疫力。在1798年发表自己的发现 . 到1975年，天花全世界范围内初步消灭了。 1920～1950，开发了多种病毒或细菌疫苗，如伤寒疫苗、肺结核疫苗、破伤风疫苗、霍乱疫苗、百日咳疫苗、流感疫苗等。 1950 ～ 1985期间，细胞工程及其他技术的进步，利用细胞培养技术，生产多种人用疫苗：预防脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、风疹、乙肝和带状疱疹等，并用于生产多种兽用疫苗。用类似的细胞培养技术还可生产酶、细胞因子、抗体等生物制品。而先决条件是能够获得可分泌目的蛋白的细胞系。但这在基因工程技术出现之前，细胞表达蛋白的水平很低，成本高。
大规模动物细胞培养 动物细胞培养开始于本世纪初，到1962年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。由于动物细胞体外培养的生物学特性、相关产品结构的复杂性和质量以及一致性要求，动物细胞大规模培养技术仍难于满足具有重要医用价值生物制品的规模生产的需求，迫切需要进一步研究和发展细胞培养工艺。目前，世界众多研究领域集中在优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率并保证其质量和一致性上。 1.细胞培养环境 细胞培养环境中抑制因素的积聚是提高细胞密度的主要限制因素。体外动物细胞培养中氨离子的积累是抑制细胞生长的主要因素之一。氨的积聚使细胞内UDP氨基己糖(UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺)增加，影响细胞的生长及蛋白的糖基化过程。氨抑制Gln代谢途径，使Asp和Glu消耗增加。细胞消耗Asp增加，可能是细胞线粒体膜上苹果酸－天冬氨酸泵转运NADH加快，使细胞维持糖酵解途径的需要。Asp消耗增加可能会从Gln代谢多经天冬氨酸转氨酶途径而不是丙氨酸转氨酶或谷氨酸脱氢酶途径得以补偿。氨来源于两方面：一是直接来源于培养基，一是细胞代谢所产生。但两者都涉及谷氨酰胺，因此需要防止培养基中Gln自然分解，限制Gln用量，并尽量去除培养基中的氨。 乳酸是细胞糖代谢的产物。高浓度乳酸会抑制乳酸脱氢酶(LDH），从而减少乳酸产生。LDH受抑制后阻止了NADH向NAD的再生及其偶联的丙酮酸/乳酸转换，从而导致NADH增加。NADH增加，部分抑制糖酵解。乳酸抑制糖酵解也导致低浓度丙酮酸，从而导致Gln消耗减少。由于糖酵解和Gln的分解速度降低，能量产生减少，更多的能量用于维持离子浓度梯度，因此高乳酸浓度必将抑制细胞生长。氨和乳酸对细胞的毒性作用已在多种不同的细胞系有大量报道，不同细胞系对于这两种代谢产物的耐受性差别很大，原因可能是不同细胞系葡萄糖和谷氨酰胺代谢过程中关键酶的敏感性不同，或者在不良生长环境下，细胞转换