实验一酶的提取及活力测定
实验目的
掌握酶提取的一般方法
了解不同因素对酶活力的影响
掌握测定酶活力的方法
实验原理
多酚氧化酶是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，是组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以伤口醌类物质出现是植物防止伤口感染的愈伤反应，因而受伤组织一般这种酶的活性就会提高。多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。
PPO的存在是水果、蔬菜褐变及营养丧失的主要原因之一。PPO氧化内源的酚类物质生成邻醌，邻醌再相互聚合成醌或蛋白质、氨基酸等作用生成高分子络合物而导致褐色素的生成，色素分子量愈高，颜色愈暗。多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。
本实验将采用苹果为主要材料，通过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、有机溶剂沉淀等步骤获得PPO的粗酶液，并对酶活力进行测定。
实验步骤
1.苹果洗净后，在4℃保温，去皮取果肉200g，立即加入冷冻丙酮500ml，用高速组织捣
碎机匀浆2min，用布氏漏斗抽滤，滤饼用200ml冷冻丙酮再次提取抽滤，白色粉末冷冻真空干燥，即得PPO丙酮粉。
2.称取丙酮粉0.5g，溶于250ml 0.05M、pH6.8的预冷（4℃）磷酸盐缓冲液，用磁力搅拌
器搅拌20min，5000rpm离心10min，上清液过滤，即得PPO粗酶液。
3.酶活性测定：
取酶液1ml，加入3ml反应混合液（2.0ml 0.1MpH6.5磷酸缓冲液、0.6ml 1%邻苯二酚溶液、0.4ml 0.1%脯氨酸溶液），在37℃恒温水浴10min，立即加入6M尿素3ml终止反应，4000rpm 10min 取上清液。在460nm处于1-2min内测吸光值，空白对照中用缓冲液代替反应液中的邻苯二酚。
4.计算以每克样品每分钟内A460吸光值增加0.1为1U
酶活力=A460*酶提取液总量（ml）/（0.1*反应时间*样品重量*测定用酶液量ml）(按齐莹组的数据进行计算)
思考题：
除了用有机溶剂沉淀酶外，还可以用什么样的方法沉淀酶？
实验二酶提取液中蛋白质含量测定
实验目的
学习紫外分光光度计的使用方法
掌握紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理和方法
实验原理
由于蛋白质中存在含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm处。在此波长范围内，蛋白质溶液的吸光度与其浓度成正比关系，可作定量测定。
实验操作
1.标准曲线的绘制，取四支试管，按表编号并加入试剂
加完后混匀，用紫外分光光度计测A280，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图，绘出标准曲线
2，取酶提取液1.0ml，加蒸馏水3ml，混匀，测A280nm，利用标准曲线算出蛋白质浓度。思考题
本法与其他蛋白质定量法相比，有哪些优缺点？
实验三酶的固定化及固定化酶测定
实验目的
掌握酶固定化方法
熟悉酶固定化效率的衡量指标
实验原理
凝胶包埋法是将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定性状的固定化酶或固定化菌体。常用的凝胶有琼脂、海藻酸钙、明胶、聚丙烯酰胺等。本实验把脲酶用聚丙烯酰胺凝胶包埋起来制成固定化脲酶。
固定化酶活力回收率是指固定化酶的活力与用于固定化的溶液酶的活力之百分比。固定化酶活力测定方法，有振荡测定法、酶柱测定法和连续测定法等多种。常用的振荡测定法，是将一定质量的固定化酶，放在一定形状、一定大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在固定化酶最适反应条件下，振荡或搅拌反应系统，反应一定时间，取出一定量的反应液，进行活力测定。
脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH7.0。氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，可用于测定酶活力大小。
实验用具（自己写）
实验步骤
1.称取丙烯酰胺
2.5g，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺0.5g，溶于30mlpH=7.0的磷酸盐缓冲液中。
2.取上述溶液10ml于烧杯中，冰水浴下加入100mg脲酶，搅拌均匀，加入0.5ml10%过硫
酸钾溶液和0.5ml10%亚硫酸氢钠溶液，待聚合反应完成后，即得含酶凝胶。
3.待凝胶充分固化后，切成2mm-3mm见方的小块，反复水洗后，用干滤纸吸干水，称重。
4.将所得凝胶包埋脲酶重新称重（m1）。取固定化脲酶0.3g，切碎。
5.取两支比色管（3号样品管、1号空白管），分别称取固定化酶100mg（m2）置于两管中，
各加蒸馏水9.0ml，磷酸缓冲液1.0ml，塞好管塞，于30℃保温5min
6.向3号管中加入30℃预保温的3%尿素溶液1.0ml，并准确开始计时，向1号管中加蒸
馏水1.0ml，塞好管塞。在30℃的恒温水浴中反应20min，并不断振摇。
7.酶反应管反应20min后准时加入1.0ml 1MH2SO4终止反应，空白管同样操作
8.取3支干净干燥试管编号（2号为标准氨溶液，1号、3号与上对应）。3号管：吸取酶
反应液0.1ml，加蒸馏水4.40ml，纳氏试剂0.5ml，摇匀。2号管：吸取空白反应（1号）
液0.1ml，加水4.30ml，加水0.1ml，纳氏试剂0.5ml，摇匀。1号管：吸取1号管反应液0.1ml，加入标准氨溶液0.1ml，纳氏试剂0.5ml，摇匀。30min内，在480nm波长下比色测试吸光度，分别即为A1(空白)、A2(标准)和A3(样品)。
定义脲酶在30℃，中性条件下，每分钟水解底物产生1umol氨的酶量为1U。
2.溶液酶活力测定
称取脲酶100mg溶于10ml磷酸缓冲液中，加入3%尿素1ml，反应后从中取出反应液
0.2ml，加入蒸馏水4.30ml，加入纳氏试剂0.5ml，混匀在30Min内测定吸光值。（也需
要样品、空白及标准管）
3.计算
100mg脲酶粉所得固定化酶的总活力（U1）
U1=（A3-A1）*m1*V1*NH3的微摩尔数*n/{(A2-A1)*m2*V2*t}
100mg脲酶溶液的总活力（Us）
Us=（A3-A1）*m1*V1′*NH3的微摩尔数*n/{(A2-A1)*m2*V2′*t}
固定化酶的活力回收率=U1/Us*100%
实验四酶的纯度检测
实验一酶的底物专一性 一、实验目的 了解酶的专一性，掌握检查酶的专一性的原理和方法，学会排除干扰因素，设计酶学实验 二、实验原理 （1）酶的专一性。 酶的专一性是指一种酶只能对一种底物或一类底物起催化作用，对其他底物无催化作用。如淀粉酶只能催化淀粉水解，对蔗糖的水解无催化作用。按照酶的专一性程度分为： 键专一性（只要求作用于一定类型的键，对键两端的基团无严格的要求，如脂酶，核酶）。 基团专一性(又叫族专一性，只对键两端的其中一个基团要求严格，如α-、β-葡萄糖苷酶，转移酶)。 绝对专一性（只作用于一种底物，如某些核酸工具酶）。 立体异构专一性（旋光异构专一性和几何异构专一性）。 （2）淀粉和蔗糖的结构 淀粉有2种：直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉是由200～300个α-葡萄糖以α-1,4糖苷键相连成一直链，支链淀粉不仅有α-1,4糖苷键，还有α-1,6糖苷键，从而在直链淀粉的基础上形成分支。 蔗糖是双糖，由α-葡萄糖和β-果糖以α-1,2糖苷键相连而成。 （3）Benedict反应 Benedict试剂是碱性硫酸铜溶液，具有一定的氧化能力，能与还原性糖的半缩醛羟基发生氧化还原反应，生成氧化亚铜（Cu2O）砖红色沉淀。淀粉和蔗糖都不能反应，而它们的水解产物葡萄糖能够发生Benedict反应，所以，以颜色反应来观察淀粉酶、蔗糖酶对淀粉及蔗糖的水解作用。本实验分别以唾液淀粉酶（内含淀粉酶及少量麦芽糖酶）、蔗糖酶对淀粉及蔗糖的催化作用，观察淀粉酶、蔗糖酶的底物专一性 三、试剂 （1）干酵母、可溶性淀粉或食用淀粉、蔗糖、NaCL、柠檬酸钠、无水碳酸钠、硫酸铜。 （2）新鲜淀粉酶溶液：唾液1ml 倒入10ml量筒中（不包括泡沫），用蒸馏水稀释到70ml，静置10分钟后，去掉上层泡沫和下层的沉淀。 （3）蔗糖酶溶液：干酵母2.5g置研钵中，加半勺石英沙及蒸馏水少许（约4ml），用力研磨10分钟，转移到50ml离心管中，另用25ml蒸馏水洗涤研钵，并将洗涤液一起转移到离心管中，摇匀，静置5分钟，4000r/min离心5分钟，小心取出上清液（含
酶工程实验(2010)
实验一植物体内过氧化物酶活性的测定 一、目的 过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控IAA水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的H2O2的毒害作用。故在科研上常加以测定。 二、原理 在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色4－邻甲氧基苯酚，在470nm 波长处测定生成物的吸光度（A）值，即可求出该酶活性。 三、材料、仪器设备及试剂 1. 材料：植物叶片 2. 仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管；试管架；洗耳球。 3. 试剂及配制： 0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH7）。
反应液（100ml 0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH6）中加入0.5ml 愈创木酚、1ml 30﹪H2O2，充分摇匀）。 四、实验步骤 1. 酶液提取 称取植物叶片1g，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为10ml pH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在8000 r / min离心15min，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。 2. 酶活性测定 吸取反应液3ml 于试管中，加入酶提取液0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径1cm的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在470nm波长处，以时间扫描方式，测定3min内吸光度值变化，取线性变化部分，计算每分钟吸光度变化值（△A470）。 五、酶活性计算 按下式计算酶的相对活性 △A470 ×酶提取液总量（ml）
酶活性（△A470·g－1Fw·min－1）= ------------------- 样品鲜重（g）×测定时酶液用量（ml） 实验二尿液淀粉酶活力测定(Winslow氏法) 原理】 临床上通常用Winslow氏法测定尿或血清中淀粉酶活力.该法对 淀粉酶活性单位的规定是:在37℃,30分钟,恰好能将0,1%淀粉 溶液1ml水解(指加入碘液后不再呈蓝色或红色)的酶量定为一个活 力单位. 试剂和器材】 1,0.9%氯化钠 2,0.1%淀粉 3,碘化钾-碘溶液(20克碘化钾和10克碘溶于100毫升水中,使 用前稀释10倍)
生物化学实验示范报告: 实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化 实验目的: 1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法； 2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理； 3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法； 4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。 实验原理： 蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。酶分离 提纯的原理与蛋白质的相同。但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。 有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉 淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶 蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。 蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质 的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。 蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。在本实验条件下，每3min释放lmg还原糖所需的酶量定义为一个活力单位；通过Folin法测定酶蛋白的含量，计算蔗糖酶的比活。单位质量的酶蛋白中所含酶的活力称为酶的比活。 主要实验器材： 1. 试管、血糖管； 2. 秒表； 3. 冰盐浴； 4. 恒温水浴； 5.离心机； 6. 721- 型分光光度计； 7. 柱层析装置； 8. 梯度洗脱装置； 9. 部分收集器；10. 电磁搅拌器；11. 冰箱；12. DEAE—纤维素。
第一章 习题: 1、根据分子中起催化作用得主要组分得不同,酶可以分为_______与_______两大类别。 2、核酸类酶分子中起催化作用得主要组分就是________,蛋白类酶分子中起催化作用得主要组分就是___________。 3、进行分子内催化得核酸类酶可以分为_______,_______。 4、酶活力就是_____得量度指标;酶得比活力就是__________得量度指标;酶转换数就是________得量度指标。 5、某酶得分类编号就是EC2、2、1、10,其中EC就是指_______。此酶属于_______类型。 6、醇脱氢酶参与得反应表明无氧气参与( ) 7、酶工程就是_____________得技术过程。 8、酶得转换数就是指 A、酶催化底物转化为产物得数量 B、每个酶分子催化底物转化为产物得分子数 C、每个酶分子每分钟催化底物转化为产物得分子数 D、每摩尔酶催化底物转化为产物得分子数 9、酶得改性就是指____________________________、 第二章 1、名词解释 转录、组成型酶、酶得反馈阻遏、分解代谢物阻遏、生长偶联型 2、微生物产酶模式可以分为同步合成型________、中期合成型、________。 3、可以通过添加( )使分解代谢物阻遏作用解除。 A、诱导物 B 激活剂C、cAMP D、ATP 4、在酶发酵过程中添加表面活性剂可以 A、诱导酶得生物合成 B、阻遏酶得生物合成 C、提高酶活力 D、提高细胞通透性 5、为什么滞后合成型得酶要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成？ 6、操纵子就是由_________、_______与启动基因组成得。 7______________与______就是影响酶生物合成模式得主要因素。 8、RNA前体得加工就是指____________ ?6、从如下实验方法与结果分析酶生物合成得调节作用。 实验方法:将大肠杆菌细胞接种于营养肉汤培养基中,于37°C振荡培养,当OD550为0、3时,经培养液分装到4个小三角瓶中,每瓶17ml培养液。于4个三角瓶分别添加 (A)3ml无菌水 (B)1ml乳糖溶液(0、1mol/L)与2ml无菌水 (C)1ml乳糖溶液(0、1mol/L)、1ml葡萄糖溶液(0、1mol/L)与1ml无菌水 (D) 1ml乳糖溶液(0、1mol/L)、1ml葡萄糖溶液(0、1mol/L)与1mlcAMP钠盐溶液 ?然后在相同得条件下于37°C振荡培养2h,分别取样测定β半乳糖苷酶得活力。 ?实验结果(A)与(C)瓶得β半乳糖苷酶得活力为0,(B)瓶与(D)瓶β半乳糖苷
《探究酶的专一性》的说课稿 江西省玉山县樟村中学童长春 各位评委老师、各位同仁大家早上好，今天我说课的实验题目是《探究酶的专一性》，下面我将从教材分析、学情分析、实验教学方法、实验教学过程、实验教学反思及自我评价这六个方面进行我的说课。 一、说教材分析 （一）、课程的地位和作用：“酶的专一性”是人教版《（必修1）》分子与细胞第五单元第一节的内容。本节内容是在“酶的作用和本质”的基础上，进一步理解酶的特性，理解实验探究方案设计原则及变量的控制，。同时参阅江西省生物教学课程标准和考纲要求，设定本课的重点是建构酶的特性知识体系，进一步探究酶的专一性；难点是如何进行酶的专一性的实验创新设计与实施。 （二）、实验教学目标。依据新课标要求,本着体现提高学生的科学素养、提倡合作探究的理念，培养学生实验探索的能力,提高学生发现问题、分析问题、解决问题的能力，确定以下目标： 1、知识与能力 概述酶的特性的知识体系。通过学生主动参与科学探究的实验活动，掌握科学探究的程序和方法，理解探究性实验设计的基本原则，培养学生创造性思维的能力和动手实践的能力。 2、过程与方法目标 本课设计的基本模式就是：教师引导——合作交流——创新方案——实验探究——精讲点拨——拓展延伸。 3、情感态度和价值观目标 通过对酶的专一性的探究性实验，培养学生崇尚科学的态度和实事求是的精神。培养学生敢于质疑，科学严谨的意志品质和勇于创新的精神。 二、学情分析 高一学生已具备了以下与本节学习相关的知识和技能：①在初中阶段学习了多种消化酶在食物消化中的作用，并且做了“观察唾液淀粉酶对淀粉有消化作用”的实验。②通过上节课对“酶的高效性”的学习，初步掌握了对照实验的设计与操作方法、自变量和无关变量的分析与控制方法。然而，学生对于课本实验进行进一步改进的实验方案设计以及具体实验操作细节上，还有较大的不足。
实验3 酵母蔗糖酶的制备 一、实验目的 1、学习、掌握提取啤酒酵母中的蔗糖酶 2、学习用紫外分光光度法测定蛋白质含量 二、实验原理 酵母中得到，特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。 啤酒酵母中含有大量的蔗糖酶，通过研磨破细胞壁，使酶游离出来，用水萃取酶，然后用有机溶剂沉淀酶蛋白得到粗制品，还可用柱层折进一步纯化得到精制品。 三、实验器材 1、试剂：二氧化硅、去离子水(使用前冷至4℃左右)、冰块、食盐、1mol/L乙酸、95％乙醇。 2、材料：啤酒酵母、 3、仪器：研体、恒温水浴锅、高速冷冻离心机。 四、实验步骤 1 研磨水提取 (1)准备一个冰浴，将研钵稳妥地放入冰浴中。 (2)称取1g啤酒醉母和适量(约5mg)二氧化硅一起放入研钵中，二氧化硅要预先研细。 (3)缓慢加入预冷的30m1去离子水．每次加2m1左右，边加边研磨．至少用30分钟，至酵母细胞大部分研碎，将蔗糖酶充分转入水相。 (4) 将混合物转入离心管中，平衡后．用高速冷冻离心机离心，4℃，10000r／min，离心15min。 (5) 用滴管小心地取出水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000r／min，离心15min。 (6) 将上清液转入量筒，量出体积。用广泛pH试纸检查上清液PH，用lmol/L乙酸将pH调至5.0，称为“级分I”。（级分I总共量了28ml）留出5m1测定酶活力及蛋白含量，剩余部分转入清洁离心管中。 2 热处理和乙醇沉淀 (1)预先将恒温水浴调到50℃，将盛有级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30min,在保温过程中不断轻摇离心管。 (2)取出离心管，于冰浴中迅速冷却，4℃．10000r／min，离心10min 。
湖北大学 酶工程实验 （0818800193）实验教学大纲 （第2版） 生命科学学院 生化教研室 2014年7月
前言 课程名称：酶工程实验实验学时：16学时 适用专业：生物工程课程性质：必修 一、实验课程简介 酶工程是生物工程的主要内容之一，是现代酶学和生物工程学相互结合而发展起来的一门新的技术学科。它将酶学、微生物学的基本原理与化工、发酵等工程技术有机结合起来，并随着酶学研究的迅速发展，特别是酶的广泛应用而在国民生产生活中日益发挥着越来越重要的作用。酶工程实验课是生物工程等本科实验教学的一个重要组成部分，通过实验教学可以加强学生对酶工程基本知识和基本理论的理解，掌握现代酶学与相关技术的有关的基本的实验原理与技能。在实验过程中要求学生自己动手，分析思考并完成实验报告。酶工程实验性质有基础性、综合性、设计（创新）性三层次。 二、课程目的 本实验课程主要根据酶工程的三大块内容即酶的生产、酶的改性与酶的应用来设计安排实验，通过这些实验内容，使学生深入理解酶工程课程的基本知识；巩固和加深所学的基本理论；掌握酶工程中基本的操作技能。同时，通过实验培养学生独立观察、思考和分析问题、解决问题和提出问题的能力，养成实事求是、严肃认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；并在实验中进一步提高学生的科学素养。 三、考核方式及成绩评定标准 考核内容包括实验过程中的操作情况，实验记录及结果的准确性，实验报告的书写及结果分析，思考题的回答情况，仪器设备的使用情况及遵守实验室规章制度的情况等，根据这些方面进行成绩评判和记录，综合给出实验总成绩。 四、实验指导书及主要参考书 1．魏群：生物工程技术实验指导，高等教育出版社，2002年8月。 2．禹邦超：酶工程（附实验），华中师范大学出版社，2007年8月 五、实验项目
Lecture1 酶学与酶工程 1、酶的概念，命名、酶的活性中心 1）酶是由活细胞产生的，具有催化活性和高度转移性的特殊蛋白质，是一类生物催化剂。 酶工程：将酶学理论与化工技术相结合，研究酶的产生和应用的一门新的技术性学科，包括了酶制剂的制备、酶的固定化、酶的修饰与改造及酶反应器等方面。 主要:酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化和酶生物反应器。 化学酶工程：用化学手段修饰、改造、模拟天然酶，使其更适合人们的需要，主要包括天然酶、化学修饰酶、固定化酶以及化学人工合成酶的研究与应用。 生物酶工程：用生物学的方法，特别是基因工程、蛋白质工程和组合库筛选法改造天然酶，创造性能优异的新酶，主要是抗体酶、杂合酶、进化酶和核酸酶的研究与应用。 2）命名：系统命名法！！ 催化下列反应酶的命名：ATP+D—葡萄糖→ADP+D—葡萄糖-6-磷酸 该酶的正式系统命名是：ATP：葡萄糖磷酸转移酶，表示该酶催化从ATP中转移一个磷酸到葡萄糖分子上的反应。 它的分类数字是：E.C.2.7.1.1 E.C代表按国际酶学委员会规定的命名 第1个数字(2)代表酶的分类名称(转移酶类) 第2个数字(7)代表亚类(磷酸转移酶类) 第3个数字(1)代表亚亚类(以羟基作为受体的磷酸转移酶类) 第4个数字(1)代表该酶在亚-亚类中的排号(D葡萄糖作为磷酸基的受体） 3）活性中心 必需基团：酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的基因 酶的活性中心：必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。 2、酶的分类、组成、结构特点和作用机制 分类：按酶促反应的性质分类（六大类）：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶类、异构酶类、合成酶类 全酶=酶蛋白+辅因子 辅因子包括：有机辅因子（辅酶非共价结合/辅基非共价结合或共价结合）和金属辅因子（金属酶/金属激活酶） 3、酶作为催化剂的显著特点 强大的催化能力：可以加快至1017倍； 没有副反应，酶在较温和的条件下催化反应的进行； 高度的专一性，各种酶都有专一性但是专一程度的严格性上有所差别； 可调节性，包括了抑制剂和激活剂的调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等；
实验目的：①、了解掌握双酶法制备淀粉糖。 ②、掌握用3,5-二硝基水杨酸法测定葡萄糖含量的方法。 目前国内外淀粉糖的生产大都采用双酶法。双酶法生产淀粉糖是以淀粉为原料，先经α-淀粉酶液化成糊精，再用糖化酶催化生成淀粉糖浆。α-淀粉酶又称为液化型淀粉酶，它作用于淀粉时，随机地从淀粉分子内部切开α-1，4葡萄糖苷键，使淀粉水解成糊精和一些还原糖。糖化酶又称为葡萄糖淀粉酶，它作用于淀粉时，从淀粉分子的非还原端开始逐个地水解α-1，4葡萄糖苷键，生成葡萄糖和一些低聚糖。且糖化酶还有一定的水解α-1，6葡萄糖苷键和α-1，3葡萄糖苷键的能力。 1．仪器：恒温水浴器、烧杯、玻璃棒、天平、量筒及其他常规仪器用具。 2．试剂：生粉、α-淀粉酶、糖化酶、0。1mol/L HCI、无水CaCl2、。碘液、活性炭。1．液化： 取12g生粉，加150mL水配制成淀粉浆，加入0.1gCaCl2，2gα-淀粉酶，在75℃温度下保温45min，使淀粉液化成糊精。液化中可每隔3分钟搅拌一下, 每隔15分钟用碘反应检测，观察颜色变为褐色或棕色的情况，记录观察结果。45min后升温至100℃并保温10min。 2．糖化： 将液化淀粉液冷却至55℃～60℃，用0.1m1/LHCl调pH至4.5～5.0，加入0.5g糖化酶，将水浴槽温度升至60℃，保温糖化过夜，使糊精转变为葡萄糖和低聚糖(淀粉糖浆)。 3．脱色： 淀粉糖浆中加入1g活性炭，在80℃下搅拌15min后，抽滤，得浅黄色透明糖液。 4. 所得糖液中葡萄糖含量的测定。取1 m1滤液，加水稀释到10ml，用3,5-二硝基水杨酸法测定葡萄糖含量。
a=(0.406-0.0648)/0.5341=0.64 b=(0.395-0.0648)/0.5341=0.62 实验现象观察 1 6 7 思考题： 1液化时加入0.1gCaCl2的目的是什么？ 答：钙离子有提高热稳定性的作用。 2液化后冷却和调pH的目的是什么? 答：盐酸容易挥发，所以要冷却。 调ph是为了提供酶催化的环境。
酶工程的知识点总结 课题3 探讨加酶洗衣粉的洗剂效果 一、实验原理 1．加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉，目前常用的酶制剂有四类：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶，其中，应用最广泛、效果最明显的是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。b5E2RGbCAP 2．碱性蛋白酶能将血渍、奶渍等含有的大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或小分子的肽， 使污迹从衣物上脱落。脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶也能分别将大分子的脂肪、淀粉和纤维素水解为小分子物质，使洗衣粉具有更好的去污能力。p1EanqFDPw 3．在本课题中，我们主要探究有关加酶洗衣粉的三个问题：一是普通洗衣粉和加酶洗衣粉 对衣物污渍的洗涤效果有什么不同；二是在什么温度下使用加酶洗衣粉效果最好，三是添加不同种类的酶的的洗衣粉，其洗剂效果有哪些区别。DXDiTa9E3d 二、实验步骤 1探究用加酶洗衣粉与普通洗衣粉洗涤的效果的不同 ①在2个编号的烧杯里，分别注入500mL清水。②取2块大小相等的白棉布，用滴管在每 块白布上分别滴上等量的墨水，分别放入烧杯里，用玻璃棒搅拌。③将2个烧杯分别放入同等温度的温水中，保温5分钟。④称取5克加酶洗衣粉和5克普通洗衣粉2份，分别放入2个烧杯中，用玻璃棒均匀搅拌。保温10分钟。⑤观察并记录2个烧杯中的洗涤效果RTCrpUDGiT 2探究用加酶洗衣粉洗涤的最佳温度条件 ①在3个编号的烧杯里，分别注入500mL清水。②取3块大小相等的白棉布，用滴管在每 块白布上分别滴上一滴食用油、鸡血、牛奶，分别放入烧杯里，用玻璃棒搅拌。③将3个烧杯分别放入50摄氏度的热水、沸水和冰块中，保温5分钟。④称取5克加酶洗衣粉3份，分别放入3个烧杯中，用玻璃棒均匀搅拌。保温10分钟。⑤观察并记录3个烧杯中的洗涤效果。3探究不同种类的加酶洗衣粉洗涤的效果5PCzVD7HxA 污染物蛋白酶洗衣粉脂肪酶洗衣粉复合酶洗衣粉普通洗衣粉 油渍 汗渍 血渍 观察并记录四种洗衣粉分别洗涤三种污染的洗涤效果。三、注意事项 1．变量的分析和控制 影响加酶洗衣粉洗涤效果的因素有水温、水量、水质、洗衣粉的用量，衣物的质料、大 小及浸泡时间和洗涤的时间等。在这些因素中，水温是我们要研究的对象，而其他因素应在实验中保持不变。选择什么样的水温进行实验需要实验者根据当地一年中的实际气温变化来 确定水温，通常情况下，冬季、春季、秋季和夏季可分别选取 5 ℃、15 ℃、25 ℃和35 ℃的水温，因为这4个水温是比较符合实际情况的，对现实也有指导意义。jLBHrnAILg 2．洗涤方式和材料的选择。 在洗涤方式中有机洗和手洗两种方式，应考虑其中哪一种比较科学？哪一种更有利于控 制变量？再有，洗衣机又可以分为半自动和全自动两种，相比之下，采用全自动洗衣机比较好，并且应该尽量使用同一型号小容量的洗衣机，其机械搅拌作用相同。关于洗涤材料的选择也有一些讲究。用衣物作实验材料并不理想，这是因为作为实验材料的衣物，其大小、颜 色、洁净程度等应该完全一致，而这并不容易做到；此外，人为地在衣物上增加污物，如血 渍、油渍等，也令人难以接受。因此，选用布料作为实验材料比较可行。在作对照实验时，
1、酶的固定化方法：吸附法、包埋法、共价结合法、热处理法 2、提取酶的有机溶剂有：甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、异丙醇、 3、酶生产的主要方式：固体发酵、液体深层通气发酵、固定化细胞或固定化原生质体发酵 4、酶的抽提剂有：稀酸、稀碱、稀盐、稀有机溶剂等 5、测定酶蛋白含量的方法： 凯氏定氮法、双缩尿法、Folin 酚法、紫外法、色素结合法、BCA法、胶体金测定法 6、影响酶活力的主要因素：温度、PH、底物浓度、酶浓度、抑制剂、激活剂 7、包埋固定化酶的凝胶有：聚丙烯酰胺、聚丙烯醇、光敏树脂、琼脂、明胶、海藻酸钙 8、酶的回收率：是指直接测定的固定化酶的活力占固定化之前的活力的百分比。 9、纯化倍数：就是经过纯化后得到的比活力与纯化前比活力之间的比值。 10、盐析的原理：蛋白质溶液在一定浓度范围内，加入无机盐，随着盐浓度增大，蛋白质的溶解度增大，但当盐浓度增到一定限度后，蛋白质将从溶液中析出。 11、在酶的反应过程中如何确保酶的最适反应温度和最适pH值。 保证最适温度的方法：通过发酵罐的热交换设施，控制冷源或热源流量；通过曲室的通风和加热设备控制。保证最适pH的方法：加酸或加碱，加碳源或氮源物质。 12、在发酵产酶过程中的准备工作： 收集筛选菌种，菌种保藏，细胞活化，扩大培养，培养基的配置，对发酵条件的控制。 13、为什么在测酶活实验中要连续不断的测酶活和酶蛋白含量 因为酶的活性会受温度和PH值的影响 14、终止酶反应的方法： 1、迅速升高温度； 2、加入强酸、强碱、尿素、乙醇等变性剂； 3、加入酶抑制剂； 4、调节反应液pH值。 15、固定化的优点： 1、可反复使用，稳定性高； 2、易与底物和产物分开，便于分离纯化； 3、可实现连续生产，提高效率。 16、培养基的成分：碳源、氮源、无机盐、生长因素、水。 17、菌种保藏方法： 1、斜面低温保藏法 2、液体石蜡油保藏法 3、砂土管保藏法 4、真空冷冻干燥法 5、液氮超低温保藏法。 18、发酵产酶的操作过程：配置培养基、分装、灭菌（112℃—115℃，20min）、孢子悬液（将无菌水加入斜面培养基）、接种、培养（32℃，180r/min，培养72h） 19、测定酶活的方法： 1、在一定时间内，让适量的底物与酶在最适合条件下； 2、加入酶抑制剂或升高温度等方法快速终止酶反应； 3、加一定量的显色剂与底物反应，测定液体的吸光度； 4、根据吸光度值计算出酶活 20、壳聚糖酶如何筛选：采用透明圈法，透明圈法直观、方便、根据壳聚糖不溶于水，以壳聚糖为唯一碳源，培养基浑浊。如果有该酶存在，即可降解壳聚糖为壳寡糖，壳寡糖容易被分解吸收，所以形成透明圈，从而可筛选出产生壳聚糖酶的菌株21、产壳聚糖酶初筛平板有什么现象，为什么 会出现透明圈，其原因是根据壳聚糖不溶于水，以壳聚糖为唯一碳源，培养基浑浊。如果有该酶存在，即可降解壳聚糖为壳寡糖，壳寡糖容易被分解吸收，所以形成透明圈 22、酶反应器： 分批式搅拌罐反应器、连续流搅拌罐反应器、填充床反应器、流化床反应器、模型反应器、鼓泡塔反应器 23、对产酶的菌种的要求是： 1、产酶量高；2、繁殖快，发酵周期短；3、产酶稳定性好，不易退化，不易被感染；4、能够利用廉价的原料，容易培养和管理；5、安全可靠，非致病菌。 24、在使用离心机时应注意事项 25、尿酶提取过程中为什么要在冰浴中进行 在冰浴中进行可以使尿酶处于低温条件下，低温能降低酶的活性，但不破坏酶的活性，在适合的温度下可恢复酶的活力 26、填充床的制备及应用的要点 装柱——平衡——应用——检测 装柱：均匀、无裂缝、无气泡、平整；平衡：1—2倍柱床体积缓冲液；应用：3%尿素溶液； 检测：定性：纳氏试剂（黄色或棕红色沉淀）——定量：取20ml流出液，用0.05mol/L标准HCL滴定（加2—3滴混合指示剂）
《酶工程》复习 一、名词解释…………………………………………… 1 酶工程：又称酶技术，是酶制剂的大规模生产和应用的技术，包括化学酶工程和生物酶工程。 2酶的诱导：由于加进某种物质，使酶的生物合成开始或者加速进行，称为酶的生物合成的诱导作用。 3 微滤：以压力差为推动力，截留水中粒径在0.02~ 10m之间的颗粒物的膜分离技术。 4固定化酶：通过物理的或化学的方法，将酶固定在载体上，能使酶发挥催化作用的酶。 5酶的非水相催化：通过改变反应介质，影响酶的表面结构和活性中心，从而改变酶的催化特性。 6 原生质体：脱去细胞壁的植物、真菌或细菌细胞。 7超滤：超滤是采用中空纤维过滤新技术，配合三级预处理过滤清除自来水中杂质；超滤微孔小于0.01微米，能彻底滤除水中的细菌、铁锈、胶体等有害物质，保留水中原有的微量元素和矿物质。 8 固体发酵：固态发酵是指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水下溶性固态基质中，用一种或多种微生物的一个生物反应过程。 二、填空题………………………………………………. 1酶的分类（氧化还原酶）、（转移酶）、（水解酶）、（裂合酶）、（异构酶）、（合成酶）。 2酶活力是（酶催化速度）的量度指标，酶的比活力是（酶纯度）的量度指标，酶转换数是（酶催化效率）的量度指标。 3微生物产酶模式可以分为同步合成型，（延续合成型），中期合成型，（滞后合成型）四种。 4动物细胞培养主要用于生产疫苗、激素、单克隆抗体、多肽因子、酶等（功能性蛋白质）。 5细胞破碎的主要方法有机械破碎法、物理破碎法、（化学破碎法）、（酶促破碎法）。 6有机溶剂的极性系数lgP越小，表明其极性（越强），对酶活性的影响（越大）。 7通常酶的固定化方法有：吸附法、包埋法、结合法、交联法、热处理法。
Chapter1酶与酶工程 第一节酶的差不多概念与进展史 （一）酶与酶工程 酶（enzyme）：由活细胞产生的具有生物催化功能的生物大分子。 酶工程(enzyme engineering)：酶的生产、应用的技术过程。 ★酶工程已在工业、农业、医药、食品等方面有广泛应用，并在资源、能源、环保等方面起着举足轻重的作用。 （二）酶的进展史 1、酶在古代的应用 ★早在4000年前的周朝，我国人们就不自觉地将酶的催化作用应用于酿酒、制酱工业。 ★一种古老的酶技术（酒曲）从远古时代被用于豆制品调味料(豆面酱) 和发酵饮料(米酒、酒精) 的生产，同时一直沿用到今天。 ★蒸过的米加入霉菌混合物就能得到酒曲，这项技术世代相传。 2、酶学研究的历史 ★最早的酶学实验：1783年，意大利科学家Spallanzani发觉鸟的胃液能分解消化肉类。斯帕兰扎尼（Spallanzani）他用自己饲养的山鹰做了一个十分耐人寻味的实验。他将一块生肉塞进一个上面布满许多孔眼的金属小管子里，管子两端盖紧，不使肉掉下来，然后迫使山鹰吞下小管。过一段时刻再设法取出小管。小管依旧完好无损，盖子仍牢牢地固定在小管上，然而管中的肉不见了，只留下一些淡黄色的液体，这使斯巴兰沙尼惊奇不已。这可能要算最早的酶学实验。尽管他未说明此物为酶，但后来有人依旧把他看作是酶的最早发觉者。 ★酶水解作用的发觉：1814年，德国物理学家Kirchhoff研究了酶的水解现象。基尔霍夫（Kirchhoff）发觉淀粉经稀酸加热后可水解为葡萄糖，而某些谷物种子在发酵时也能生成还原糖。若把种子发芽时的水提取物加到泡在水里的谷物中，也能发生相同的水解反应，专门明显，活的谷物种子的水解能力取决于包含在其中的水溶性物质，这种水溶性物质脱离了生物体后仍能发挥作用。 ★最早的酶制剂：1833年，法国化学家Payen和Persoz得到了diastase。佩恩（Payen）和帕索兹(Persoz) 他们从麦芽的水抽提物中，用酒精沉淀得到一种可使淀粉水解成可溶性糖的物质，称之为淀粉酶（diastase['dai?steis]）。并指出了它的热不稳固性，初步触及了酶的一些本质问题。 ★首次证明催化：1835年，瑞典化学家Berzelius证有用麦芽提取物能够比硫酸更有效地降解淀粉，并将这一过程称为催化。 人们从19世纪30年代开始才真正认识酶的存在和作用 ● 19世纪中叶，法国微生物学家Pasteur指出酵母中存在使葡萄糖转化为酒精的物质。 ● 1878年，德国科学家Kunne 给酶起名叫enzyme。Kunne 给酶起名叫enzyme['enzaim]源于希腊文，由“En（在）”和“Zyme（酵母）”二字组合，表示酶包含在酵母中。当时用于区别那些有机酵素(Organized Ferments，指整个微生物细胞)和非有机酵素(Unorganized Ferments，指从有机体得到的抽提物)。 ● 1898年，Duelaux提出引用“ase”作为酶命名的词根。Duelaux提出引用diastase 的最后三个字母“ase”作为酶命名的词根。例如：oxide→oxidase['?ksideis]（氧化酶），pectin→pectinase（果胶酶）
高三生物—— 活动：探究酶的专一性 实验解读 1．实验原理 淀粉(非还原糖)――→水解 麦芽糖(还原糖)； 蔗糖(非还原糖)――→水解葡萄糖(还原糖)＋果糖(还原糖)； 还原糖＋本尼迪特试剂―――→沸水浴 加热红黄色沉淀。 2．实验步骤 试管 1 2 3 4 5 6 1%淀粉溶液 3 mL － 3 mL － 3 mL － 2%蔗糖溶液 － 3 mL － 3 mL － 3 mL 新鲜唾液 － － 1 mL 1 mL － － 蔗糖酶溶液 － － － － 1 mL 1 mL 温度处理 37 ℃恒温水浴保温15 min 本尼迪特试剂 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 水浴加热 沸水浴2～3 min 实验结果 不出现 红黄色沉淀 不出现红黄色沉淀 出现红黄色沉淀 不出现红黄色沉淀 不出现红黄色沉淀 出现红黄色沉淀 3.结论：酶具有专一性。 1．酶的专一性的实验探究方法——对比法 (1)设计思路：常见的方案有两种，即底物相同但酶不同或底物不同但酶相同，最后通过观察酶促反应能否进行得出结论。 (2)设计方案 项目 方案一 方案二 实验组 对照组 实验组 对照组 材料 同一种底物(等量) 与酶相对应的底物 另外一种底物 试剂 与底物相对应的酶 另外一种酶 同一种酶(等量)
现象发生反应不发生反应发生反应不发生反应 结论酶具有专一性酶具有专一性 2.变量分析 (1)自变量：不同底物或不同酶液。 (2)因变量：底物是否被分解或有无产物生成。 (3)无关变量：试剂量、反应温度、pH等。 命题点一实验原理、步骤和现象 1．(2019·浙江稽阳联考)下表为“探究酶的专一性”的实验数据，下列相关叙述正确的是() 试管123456 本尼迪特试剂/mL222222 1%淀粉溶液/mL3\3\3\ 2%蔗糖溶液/mL\3\3\3 新鲜唾液/mL\\11\\ 蔗糖酶溶液/mL\\\\11 实验结果 A.1%淀粉溶液中含有一定量的氯化钠 B．按表格将各种溶液分别加入6只试管后，再共同保温一段时间 C．试管3有红黄色沉淀产生，说明有葡萄糖生成 D．若5号试管出现轻度阳性反应，不可能是淀粉溶液中有杂质 答案A 解析氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，所以1%淀粉溶液中含有一定量的氯化钠，A正确；本尼迪特试剂需要在酶促反应完成后加入，过早加入可能会对酶活性造成影响，从而影响实验结果，B错误；利用本尼迪特试剂能检测出试管3有还原糖生成，但不能确定就是葡萄糖，C错误；5号试管出现红黄色沉淀的原因，可能是淀粉溶液中有还原糖类杂质，D错误。2．现有3支试管甲、乙、丙，先向各试管内加入2 mL可溶性淀粉溶液，再按图中所示步骤操作，然后分别用本尼迪特试剂检验。下列说法中不正确的是()
一、什么是生物工程？简述现代生物工程的体系组成。生物工程（B i oe n g i n e e ri ng ）又称生物技术或生物工艺学，是20 世纪70 年代发展起来的一门新的综合性应用科学,是基于分子生物学和细胞生物学的新兴技术领域。通常把生物技术分为发酵工程、酶工程、基因工程、细胞工程四个分科，它们相互依存，相互促进。其中，酶工程是生物工程的重要组成成分。 二、什么是酶工程？研究酶与酶工程的意义？ 酶工程是随着酶学研究迅速发展，特别是酶的应用推广使酶学与工程学相互渗透结合，发展而成的新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学技术。 酶与酶工程研究的重要意义: 1研究酶的理化性质及其作用机理，尤其是从酶分子水平去探讨酶与生命活动、代谢调节、疾病、生长发育的关系，具有重大科学意义。 2酶是分子生物学研究的重要工具，限制性内切酶H in d Ⅱ的发现使核酸序列测定有了突破，促进了DN A 重组技术的诞生，推动了基因工程的发展。 3酶的高效率、专一性及不需要高温高压或强酸强碱的反应条件，对普通的化学催化反应产生了决定性的飞跃。它丰富充实了现代化学中的催化理论。 4酶在工、农、医各方面都应用已久。现在，从与人们生活休戚相关的衣食住行到各行各业的高技术革命，几乎都与酶有 关。 作为生物催化剂的显著特点是什么？影响酶活性的因素有哪些？
催化效率高；高专一性；易失活；可调节性。 酶活性受多种方式调节： 1．酶浓度的调节 2. 激素调节 3. 共 价修饰调节 4. 限制性蛋白水解作用与酶活力调控 5. 抑制剂的 调节 6. 反馈调节 7. 金属离子和其他小分子化合物的调节 除[E]、[S]外，外界因素：温度、pH、激活剂、抑制剂 四、简要说明酶的作用机理。 关于酶的作用机理有两种模型：锁和钥匙模型和诱导契合模型。锁钥学说强调底物S与酶E结构的相互吻合（刚性模板）；诱导契合学说认为E蛋白受S分子诱导，其构想发生有利于S结合的变化，Ｅ与Ｓ在此基础上互补契合、进行反应。 五、什么是酶活力？酶活力的表示方法与测量方法分别有 哪些？ 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。 表示酶活力的方法： 1酶活力单位（IU）：特定条件下，在1分钟内能转化1微摩底物所需酶量； 2 kat：在最适条件下每秒钟催化1摩尔底物转化为产物所需酶量；3酶的比活力：指每mg酶蛋白所具有的酶活力; 4用反应初速度（v）来表示。 测酶活力的方法：用分光光度计法、荧光法、同位素法；也可用化学滴定法、旋光法和气体法。 六、解释典型的（米氏）酶动力学曲线，K m、K s、V max 和k cat的定义是什么？说明这些常数之间的关系？ K m：反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。 Ks：底物亲和常数,表示酶对底物的亲和力。 Vmax:指酶的催化反应速率随底物浓度增加所能达到的最大的值；
酵母蔗糖酶的提取及性质测定 引论及原理 酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究中有重要意义。本实验属综合性实验，接近研究性实验，包括八个连续的实验内容，通过对蔗糖酶的提纯和性质测定，了解酶的基本研究过程；同时掌握各种生化技术的实验原理、基本操作方法。本实验技术多样化，并且多个知识点互相联系，实验内容逐步加深，构成了一个综合性整体，为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。 蔗糖酶（invertase ）（β—D —呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol 蔗糖，就生成2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson 比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。 在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 （一）实验目的 学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。 （二）实验原理（略） （三）实验仪器、材料及试剂 仪器 1. 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱 2. 电子天平、研钵（＞200ml ）、制冰机、50ml 烧杯 3. 离心管（2ml ，10ml ，30ml 或50ml ）、移液器（1000ul ）或滴管、量筒 材料及试剂 1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存） ＋ H 2O 蔗糖酶 O H H O
第一章 习题： 1、根据分子中起催化作用的主要组分的不同，酶可以分为_______和_______两大类别。 2、核酸类酶分子中起催化作用的主要组分是________，蛋白类酶分子中起催化作用的主要组分是___________。 3、进行分子内催化的核酸类酶可以分为_______，_______。 4、酶活力是_____的量度指标；酶的比活力是__________的量度指标；酶转换数是________的量度指标。 5、某酶的分类编号是EC2.2.1.10，其中EC是指_______。此酶属于_______类型。 6、醇脱氢酶参与的反应表明无氧气参与（） 7、酶工程是_____________的技术过程。 8、酶的转换数是指（） A、酶催化底物转化为产物的数量 B、每个酶分子催化底物转化为产物的分子数 C、每个酶分子每分钟催化底物转化为产物的分子数 D、每摩尔酶催化底物转化为产物的分子数 9、酶的改性是指____________________________. 第二章 1、名词解释 转录、组成型酶、酶的反馈阻遏、分解代谢物阻遏、生长偶联型
2、微生物产酶模式可以分为同步合成型________、中期合成型、________。 3、可以通过添加（）使分解代谢物阻遏作用解除。 A、诱导物 B 激活剂 C、cAMP D、ATP 4、在酶发酵过程中添加表面活性剂可以 A、诱导酶的生物合成 B、阻遏酶的生物合成 C、提高酶活力 D、提高细胞通透性 5、为什么滞后合成型的酶要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成？ 6、操纵子是由_________、_______和启动基因组成的。 7______________和______是影响酶生物合成模式的主要因素。 8、RNA前体的加工是指____________ 6、从如下实验方法和结果分析酶生物合成的调节作用。 实验方法：将大肠杆菌细胞接种于营养肉汤培养基中，于37°C振荡培养，当OD550为0.3时，经培养液分装到4个小三角瓶中，每瓶17ml培养液。于4个三角瓶分别添加 （A）3ml无菌水 （B）1ml乳糖溶液（0.1mol/L）和2ml无菌水 （C）1ml乳糖溶液（0.1mol/L）、1ml葡萄糖溶液（0.1mol/L）和1ml无菌水 （D） 1ml乳糖溶液（0.1mol/L）、1ml葡萄糖溶液（0.1mol/L）和1mlcAMP 钠盐溶液 然后在相同的条件下于37°C振荡培养2h，分别取样测定β-
实验一过氧化氢酶米氏常数的测定 一、目的 了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。 二、实验原理 H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性 环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。 本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km 三、实验器材 1.锥形瓶100～150ml（×6）。 2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。 3.温度计（0～100℃）。 4.微量滴定管5ml（×1）。 5.容量瓶1000ml（×1）。 四、实验试剂 1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0） 取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。 2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。 3、0.02mol/L KMnO4：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min， 2d后过滤，棕色瓶保存。 4、0.004mol/L KMnO4：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml 浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加 热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确 浓度稀释成0.004mol/L即可。 5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O2 23ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻
度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释 成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色）。 6、25% H2SO4 五、操作 取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂： 表一过氧化氢酶米氏常数的测定 先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。各瓶时间达5min时立即加 2.0ml25%硫酸终止反应，充分混匀。用 0.004mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积。 六、计算 分别求出各瓶的底物浓度[S]和反应速度v。 [S]=c1V1/10 式中[S]：底物物质的量浓度（mol/L）； c1：H2O2物质的量浓度（mol/L）； V1：H2O2体积（ml）； 10：反应的总体积（ml）； υ：反应速度（m mol/min）； c2：KMnO4物质的量浓度（mol/L）； V2：KMnO4体积（ml）； 以1/υ对1/[S]作图求出Km。