NAT实验一．实验拓扑结构图
二．IP地址规划
PC0——192.168.10.10 默认网关——192.168.10.254
PC1——202.20.20.10 默认网关——202.20.20.254
Router0：Fa0/0——192.168.10.254 S1/0——202.10.10.10 Router1：Fa0/0——202.20.20.254 S1/0——202.10.10.20
地址池：202.30.30.1——202.30.30.30 name changsha 三．配置过程
1.Router0的配置：
Router>en
Router#conf t
Enter configuration commands, one per line. End with CNTL/Z. Router(config)#int fa0/0
Router(config-if)#ip address 192.168.10.254 255.255.255.0 Router(config-if)#no shutdown
Router(config-if)#int s1/0
Router(config-if)#ip address 202.10.10.10 255.255.255.0
Router(config-if)#clock rate 9600
Router(config-if)#no shut
2．Router1的配置
Router(config)#int fa0/0
Router(config-if)#ip add 202.20.20.254 255.255.255.0
Router(config-if)#no shut
Router(config-if)#int s1/0
Router(config-if)#ip add 202.10.10.20 255.255.255.0
Router(config-if)#no shut
3．Router0配置NA T转换
Router(config)#access-list 1 permit 192.168.10.0 0.0.0.255
Router(config)#ip nat pool network 202.30.30.1 202.30.30.30 netmask 255.255.255.0 Router(config)#ip nat inside source list 1 pool network
Router(config)#int fa0/0
Router(config-if)#ip nat inside
Router(config-if)#int s1/0
Router(config-if)#ip nat outside
4．Router0配置静态路由
Router(config)#ip route 202.20.20.0 255.255.255.0 202.10.10.20
5．Router1配置静态路由
Router(config)#ip route 202.30.30.0 255.255.255.0 202.10.10.10
6．实验测试
（1）在PC0上输入ping指令
PC>ping 202.20.20.10
Pinging 202.20.20.10 with 32 bytes of data:
Reply from 202.20.20.10: bytes=32 time=156ms TTL=126
Reply from 202.20.20.10: bytes=32 time=156ms TTL=126
Reply from 202.20.20.10: bytes=32 time=156ms TTL=126
Reply from 202.20.20.10: bytes=32 time=156ms TTL=126 （2）在Router0中输入测试指令
Router#debug ip nat
IP NAT debugging is on
Router#
NA T: s=192.168.10.10->202.30.30.1, d=202.20.20.10 [13] NA T*: s=202.20.20.10, d=202.30.30.1->192.168.10.10 [4] NA T: s=192.168.10.10->202.30.30.1, d=202.20.20.10 [14] NA T*: s=202.20.20.10, d=202.30.30.1->192.168.10.10 [5] NA T: s=192.168.10.10->202.30.30.1, d=202.20.20.10 [15] NA T*: s=202.20.20.10, d=202.30.30.1->192.168.10.10 [6] NA T: s=192.168.10.10->202.30.30.1, d=202.20.20.10 [16] NA T*: s=202.20.20.10, d=202.30.30.1->192.168.10.10 [7]
软件开发的几种模式 2015-05-27彭波模模搭 模模搭开发日志057软件开发的几种模式归类 1.边做边改模型（Build-and-Fix Model） 好吧，其实现在许多产品实际都是使用的“边做边改”模型来开发的，特别是很多小公司产品周期压缩的太短。在这种模型中，既没有规格说明，也没有经过设计，软件随着客户的需要一次又一次地不断被修改。 在这个模型中，开发人员拿到项目立即根据需求编写程序，调试通过后生成软件的第一个版本。在提供给用户使用后，如果程序出现错误，或者用户提出新的要求，开发人员重新修改代码，直到用户和测试等等满意为止。 这是一种类似作坊的开发方式，边做边改模型的优点毫无疑问就是前期出成效快。 对编写逻辑不需要太严谨的小程序来说还可以对付得过去，但这种方法对任何规模的开发来说都是不能令人满意的，其主要问题在于： 1）缺少规划和设计环节，软件的结构随着不断的修改越来越糟，导致无法继续修改； 2）忽略需求环节，给软件开发带来很大的风险； 3）没有考虑测试和程序的可维护性，也没有任何文档，软件的维护十分困难。 2. 瀑布模型（Waterfall Model） 瀑布模型是一种比较老旧的软件开发模型，1970年温斯顿·罗伊斯提出了著名的“瀑布模型”，直到80年代都还是一直被广泛采用的模型。
瀑布模型将软件生命周期划分为制定计划、需求分析、软件设计、程序编写、软件测试和运行维护等六个基本活动，并且规定了它们自上而下、相互衔接的固定次序，如同瀑布流水，逐级下落。 在瀑布模型中，软件开发的各项活动严格按照线性方式进行，当前活动接受上一项活动的工作结果，实施完成所需的工作内容。当前活动的工作结果需要进行验证，如验证通过，则该结果作为下一项活动的输入，继续进行下一项活动，否则返回修改。 瀑布模型优点是严格遵循预先计划的步骤顺序进行，一切按部就班比较严谨。 瀑布模型强调文档的作用，并要求每个阶段都要仔细验证。但是，这种模型的线性过程太理想化，已不再适合现代的软件开发模式，其主要问题在于： 1）各个阶段的划分完全固定，阶段之间产生大量的文档，极大地增加了工作量； 2）由于开发模型是线性的，用户只有等到整个过程的末期才能见到开发成果，从而增加了开发的风险； 3）早期的错误可能要等到开发后期的测试阶段才能发现，进而带来严重的后果。 4）各个软件生命周期衔接花费时间较长，团队人员交流成本大。 5）瀑布式方法在需求不明并且在项目进行过程中可能变化的情况下基本是不可行的。 3. 迭代模型（stagewise model）（也被称作迭代增量式开发或迭代进化式开发） 是一种与传统的瀑布式开发相反的软件开发过程，它弥补了传统开发方式中的一些弱点，具有更高的成功率和生产率。 在迭代式开发方法中，整个开发工作被组织为一系列的短小的、固定长度（如3周）的小项目，被称为一系列的迭代。每一次迭代都包括了需求分析、设计、实现与测试。采用这种方法，开发工作可以在需求被完整地确定之前启动，并在一次迭代中完成系统的一部分功能或业务逻辑的开发工作。再通过客户的反馈来细化需求，并开始新一轮的迭代。
一、BOT融资模式 1、概念： BOT（build-operate-transfer）即建设-经营-转让，是私营企业参与基础设施建设，向社会提供公共服务的一种方式。中国一般称之为“特许权”，是指政府部门就某个基础设施项目与私人企业（项目公司）签订特许权协议，授予签约方的私人企业（包括外国企业）来承担该项目的投资、融资、建设和维护，在协议规定的特许期限内，许可其融资建设和经营特定的公用基础设施，并准许其通过向用户收取费用或出售产品以清偿贷款，回收投资并赚取利润。政府对这一基础设施有监督权，调控权，特许期满，签约方的私人企业将该基础设施无偿或有偿移交给政府部门。 2、解析： 这种方式最大的特点就是将基础设施的经营权有期限的抵押以获得项目融资，或者说是基础设施国有项目民营化。在这种模式下，首先由项目发起人通过投标从委托人手中获取对某个项目的特许权，随后组成项目公司并负责进行项目的融资，组织项目的建设，管理项目的运营，在特许期内通过对项目的开发运营以及当地政府给予的其他优惠来回收资金以还贷，并取得合理的利润。特许期结束后，应将项目无偿地移交给政府。在BOT模式下，投资者一般要求政府保证其最低收益率，一旦在特许期内无法达到该标准，政府应给予特别补偿。 3、图示： 4、关键点： （1）政府与私人企业（项目公司）签订协议 （2）私人企业承担项目的投资、融资、建设、维护并取得合理利润 （3）政府拥有监督权，调控权 （4）最终私人企业将项目交由政府
二、BT融资模式 1、概念： BT（Build——Transfer），意即“建设--移交”，是政府利用非政府资金来进行非经营性基础设施建设项目的一种融资模式。BT模式是BOT模式的一种变换形式，指一个项目的运作通过项目公司总承包，融资、建设验收合格后移交给业主，业主向投资方支付项目总投资加上合理回报的过程。 2、解析： 是基础设施项目建设领域中采用的一种投资建设模式，系指根据项目发起人通过与投资者签订合同，由投资者负责项目的融资、建设，并在规定时限内将竣工后的项目移交项目发起人，项目发起人根据事先签订的回购协议分期向投资者支付项目总投资及确定的回报。3、图示： 4、关键点： （1）政府与私人单位（包括外国企业）签订协议 （2）私人单位负责融资、建设 （3）私人单位将竣工项目交由政府 （4）政府依据回购协议向私人单位支付项目总投资及回报 三、TOT融资模式 1、概念： TOT（transfer-operate-transfer），即移交-----经营------移交。指政府部门将建设好的项目的一定期限的产权和经营权，有偿转让给投资人，由其进行运营管理；投资人在一个约定的时间内通过经营收回全部投资和得到合理的回报，并在合约期满之后，再交回给政府部门或原单位的一种融资方式。 2、解析： 是一种通过出售现有资产以获得增量资金进行新建项目融资的一种新型融资方式，在这种模式下，首先私营企业用私人资本或资金购买某项资产的全部或部分产权或经营权，然后，购买者对项目进行开发和建设，在约定的时间内通过对项目经营收回全部投资并取得合理的
实验原理 蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。 电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h或过夜可完成。固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。 蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。 主要溶液 10%分离胶 水 3.3mL、30% 丙烯酰胺混合液 4.0mL、1.0mol/L Tris（pH8.8）2.5mL、10% SDS 0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED 0.004mL 5%浓缩胶 水 2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/L Tris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL 1×Tris –甘氨酸电泳缓冲液 Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS 1g，用去离子水定容至1L 2×SDS凝胶加样缓冲液 Tris-HCl（pH6.8） 100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS 转移缓冲液 Tris 2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1L TBST Tris 1.21g NaCl 8.77g，Tween-20 1 mL，加去离子水至1L Stripping 1.3mL Tris （pH 6.8），4mL10%SDS，140μlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL 实验步骤 1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
Western实验步骤 1. 电泳(Electrophoresis) （1）SDS-PAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶进行配制，配方试剂去离子水，Arc-HCL(29:1)，10%APS，SDS,TEMED。 一般按分子大小配胶，现实验分离胶配12%-15%的胶，浓缩胶10%的胶。 配胶步骤： 1.清洗玻璃板，装好（注意不要漏即玻璃板要对齐）。 2.按比例配分离胶（8ml-10ml） 3.加水压胶，待分离胶凝固后（可见有分离胶与水有分隔线，一般凝固时间30分钟-1小时左右），吸走上层水面 4.按比例配浓缩胶（3ml-4ml），加入分离胶上层，插入梳子，（注意别有气泡），待凝。（如果今日不上样可以放入4°C冰箱） 注意：玻璃板要洗得干净；玻璃板要装好，不要漏；制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡；（2）样品处理 1.准备无菌EP管，向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液（5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，现样品加 3.5ul），之后加入相应蛋白样品（要制冰，蛋白质样品要放置在冰上），充分吹打混匀 2.100℃水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。 3.12000r离心5分钟。 （3）上样与电泳 1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右 2.蛋白质样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质Maker(6ul)（注意上样蛋白质顺序，一定不要弄错）。 3.通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为100分钟（一般为90-120分钟）。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。（为了避免电泳过头，最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳） 注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要时记录在本子上。 3.转膜(Transfer) 1.物品准备，甲醇，转膜缓冲液，滤纸，转膜槽，玻璃皿3个，制冰。 2.取下胶板，用专门的板将玻璃板分离（务必不要将胶弄破，动作轻些，从下面和上面分离玻璃板），切适合大小的胶（不要切掉MAKER）。 3.用专门的板将胶转入事先放有转膜缓冲液的皿中，记录胶的顺序，剪与胶同等大小的滤纸和转膜纸PVDF膜，PVDF膜要放入甲醇中浸15秒（一般1-2分钟），胶要切角做标记（不要切到maker）,一般一个切三个角，一个切一个角，记录顺序 4.铺膜，PVDF膜铺在胶上，在PVDF膜上铺三层滤纸，然后胶的对侧面铺三层滤纸即可（滤纸要大于等PVDF膜，PVDF膜要大于等胶），赶尽气饱。 5.再将铺好的膜胶滤纸，转入转膜夹中，有PVDF膜这面放在正极侧（即无色透明夹这面），再将夹子放入转膜槽里（电极不要放错，蛋白质带负电的）
软件开发管理新模式 传统的软件开发模式是以技术为主、以管理为辅，项目经理多数来自于技术开发人员，既要负责整个项目的推进，又要负责技术研发工作。尽管他是项目组中的技术权威，但他的管理能力不一定行，这样往往会使项目在管理方面陷入泥潭。 在实践了多个软件开发项目后，我们采用了一种新的软件项目开发管理模式—在项目组同时设立了项目经理和技术经理。 项目经理负责总控，管理项目日常事务，包括客户需求调研、项目组内部（公司部门之间）的组织与协调、人员管理、项目计划、风险管理、文档管理及评审等。 技术经理（也有的称之为构架设计师）则专职负责技术研发的管理和指导，包括需求分析、设计、编码和测试等工作。 采用这种模式，软件项目组按照既定的规范进行开发，不仅确保了产品的技术质量，还保证了项目组文档的完整性。 本篇文章将展示一个软件开发的部分流程，并通过这一流程，说明项目经理和技术经理如何在项目开发过程中相互配合。该流程是一个比较通用和规范的开发流程。 一个基本的软件开发流程，通常包括项目立项、计划、需求获取与分系、概要设计、详细设计、编码、测试、软件发布和软件维护阶段，如图所示。 在实际开发过程中，许多活动是并行或迭代的，在某一个时间段可能同时进行多项活动，或者是某一活动可能会要求返回到上一个阶段再次进行（精化）。 基于以上流程，项目经理和技术经理在各个开发阶段的具体活动（本过程覆盖大多数而非全部的软件生命周期，且不包括维护阶段）的职责各有不同，需要相互协调和相互补充。 1、项目立项
此阶段工作以项目经理为主，技术经理为辅。 项目经理：全面规划项目工作的内容，确定目标市场、技术指标和应用要求，划定项目工作范围和交付成果，明确项目实现的总体设想和实施方案；明确项目需要用到的各种资源，与技术经理共同预估项目的工作量和成本；提交《项目任务书》，报公司上级领导审批，进行立项评审。 技术经理：负责确定项目中的新技术的可行性；协助项目经理明确项目需要用到的各种资源，协助预估项目的工作量和成本。 2、项目计划 立项通过的项目才能进入正式的开发工作，此阶段工作同样以项目经理为主，技术经理为辅。 项目经理：召集关键技术人员（可以是其他项目组的成员），详细估算项目的工作量和成本；明确各阶段的活动内容，以及各阶段需要完成的软件工作产品，制定《工作拆分表（WBS）》，作为项目开展工作和详细计划的基础；对项目进行一系列的风险评估，进行详细进度计划安排，落实时间进度、资源（人员、设备）、技术、资金等，完成《软件开发计划》及进度表；组织项目组成员和高层对此阶段完成的文档进行评审。 技术经理：参与详细估算项目的工作量和成本；协助项目经理完成《软件开发计划》及《进度表》；参与评审本阶段提交的文档。 3、需求获取与分析 从这一阶段开始，项目开发管理的重心开始转移，一直到测试任务完成以前，项目开发的工作都是以技术经理为主导，项目经理只是辅助监督技术经理按照流程的标准和要求完成任务。 需求的获取是一个不断反复、不断深化的过程，可能需要多次，并一直到软件开发活动结束为止。为使需求调研更有效果、针对性更强，此阶段开始前，建议由项目经理和技术经理共同准备一份《需求调研问卷》，将需要调研的问题详细罗列在问卷中，并根据问卷展开调研。问卷中的问题最初以客户的高层需求为主，随着设计与开发的深入，问题逐渐细化为系统实现的技术细节。 技术经理：与项目经理共同准备《需求调研问卷》，审核问卷中的问题；参与需求调研；调研结束后，根据项目需求报告界定的工作范围和应用方案的设计思路，进一步深入细化应用方案，描述将要开发的系统中包含的业务流程、约定、数据源、报表格式等，整理成《软件需求规格说明书》或《软件用例说明书》；指导测试组完成《系统测试用例》；参与评审本阶段提交的需求文档。 项目经理：参与准备《需求调研问卷》，审核问卷中的问题；参与需求调研；协助技术经理整理《软件需求规格说明书》；指导测试组完成《软件测试计划》；组织项目组成员对完
说说工程项目承包中的几种模 式:BT,BOT,BOO,EPC,EPCM, PPP,FEED 等，供交流: 令狐文艳 “ＢＴ”是英文“Build”和“Transfer”的缩写，中文的解释是建设、移交，指政府或其授权的单位经过法定程序选择拟建的基础设施或公用事业项目的投资人，并由投资人在工程建设期内组建BT项目公司进行投资、融资和建设；在工程竣工建成后按约定进行工程移交并从政府或其授权的单位的支付中收回投资。 BOT（Build-Operation-Transfer的缩写）即建设-经营-移交，指一国政府或其授权的政府部门经过一定程序并签订特许协议将专属国家的特定的基础设施、公用事业或工业项目的筹资、投资、建设、营运、管理和使用的权利在一定时期内赋予给本国或/和外国民民间企业，政府保留该项目、设施以及其相关的自然资源永久所有权；由民间企业建立项目公司并按照政府与项目公司签订的特许协议投资、开发、建设、营运和管理特许项目，以营运所得清偿项目债务、收回投资、获得利润，在特许权期限届满时将该项目、设施无偿移交给政
府。有时,BOT模式被称为“暂时私有化”过程(Tempo- rary Privatization)。 BOO (Build - Own - Operate)即建设一一拥有一一经营,承包商根据政府赋予的特许权,建设并经营某项产业项目,但是并不将此项基础产业项目移交给公共部门。 BOOT( Build - Own Operate - Transfer)建设一一拥有一一经营一一转让,则是私人合伙或某国际财团融资建设基础产业项目,项目建成后,在规定的期限内拥有所有权并进行经营,期满后将项目移交给政府。 EPC是英文Engineering(设计)、Procurement(采购)、Construction(施工)的缩写。该模式是指一个总承包商或者承包商联营体与业主签订承揽合同，并按合同约定对整个工程项目的设计、采购、施工、试运行(试车)等工作进行承包，实现各阶段工作合理交叉与紧密融合，并对工程的安全、质量、进度、造价全面负责，工程验收合格后向业主移交，业主或业主代表管理工程实施。EPC工程项目多集中在石油化工、制造业、交通运输和电力工业等领域。这些领域的工程项目具有以设计为主导、投资额巨大、技术复杂、管理难度大等特点。 EPCM模式(EPCM：Engineering procurement Construcion management)即指设计采购与施工管理的总承包模式。EPCM模式是国际建筑市场较为通行的项目支付模式之一，也是我国目前推行总承包模式的一种。EPCM承包
Western Blot 原理和操作方法（全） Western Blot 工作原理 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol 的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广旱挠τ? SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. 重要参数 ①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算: T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100% 其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml) ②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度: 蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%) <104 20-30
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤 发布日期:2008-8-25 热门指数:4360 Western Blot(免疫印迹法) 主要包括以下4个基本步骤： n 样品制备 n 电泳分离 n 蛋白的膜转移 n 免疫杂交与显色――蛋白检测 溶液和试剂 n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM n 1X SDS 样品缓冲液 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 n 转移缓冲液 25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3) n 10X Tris缓冲盐(TBS) 准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6 n 脱脂奶粉或BSA n 甲醇 n TBS/T缓冲液 1X TBS, 0.1% Tween-20 n 封闭缓冲液（TBS/T）
1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA n 一抗的稀释 1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗) Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率 样品制备 原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。 1．培养细胞或药物处理。 2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。 3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或75 cm2plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。 4．超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。 5．煮沸样品5 minutes。 6．离心12000g, 5 min，取上清。 7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至SDS-PAGE 胶(10 cm x 10 cm)电泳。 如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107cells/100 mm dish/150 cm2flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用B radford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。 注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。 电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法） 转膜 杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被
说说工程项目承包中的几种模式:BT,BOT,BOO,EPC,EPCM, PPP,FEED等，供交流: “ＢＴ”是英文“Build”和“Transfer”的缩写，中文的解释是建设、移交，指政府或其授权的单位经过法定程序选择拟建的基础设施或公用事业项目的投资人，并由投资人在工程建设期内组建BT项目公司进行投资、融资和建设；在工程竣工建成后按约定进行工程移交并从政府或其授权的单位的支付中收回投资。 BOT（Build-Operation-Transfer的缩写）即建设-经营-移交，指一国政府或其授权的政府部门经过一定程序并签订特许协议将专属国家的特定的基础设施、公用事业或工业项目的筹资、投资、建设、营运、管理和使用的权利在一定时期内赋予给本国或/和外国民民间企业，政府保留该项目、设施以及其相关的自然资源永久所有权；由民间企业建立项目公司并按照政府与项目公司签订的特许协议投资、开发、建设、营运和管理特许项目，以营运所得清偿项目债务、收回投资、获得利润，在特许权期限届满时将该项目、设施无偿移交给政府。有时 ,BOT 模式被称为“暂时私有化”过程 (Tempo- rary Privatization)。 BOO (Build - Own - Operate) 即建设一一拥有一一经营 , 承包商根据政府赋予的特许权 , 建设并经营某项产业项目 , 但是并不将此项基础产业项目移交给公共部门。 BOOT( Build - Own Operate - Transfer) 建设一一拥有一一经营一一转让 , 则是私人合伙或某国际财团融资建设基础产业项目 , 项目建成后 , 在规定的期限内拥有所有权并进行经营 , 期满后将项目移交给政府。 EPC是英文Engineering(设计)、Procurement(采购)、Construction(施工)的缩写。该模式是指一个总承包商或者承包商联营体与业主签订承揽合同，并按合同约定对整个工程项目的设计、采购、施工、试运行(试车)等工作进行承包，实现各阶段工作合理交叉与紧密融合，并对工程的安全、质量、进度、造价全面负责，工程验收合格后向业主移交，业主或业主代表管理工程实施。EPC工程项
蛋白印迹——Western blot 实验流程及注意事项 各种凝胶电泳方法可以直接了解蛋白的某些性质如迁移率、电荷、大小、丰度以至蛋白的亲疏水性等。此外，特异染色方法可用于识别不同种类的蛋白质。Western blot技术大大扩展了凝胶电泳后识别和鉴定蛋白的可能性。这一技术首先将电泳分离后的蛋白质条带或斑点从凝胶介质转移到固相支持膜上，然后用特异性配体进行检测。特异性抗体和凝集素等已被广泛应用检测印迹膜上的蛋白。印迹技术还常常作为电泳分离后用化学方法（如蛋白氨基端序列分析等）鉴定蛋白的一个重要步骤。 一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE或SDS-PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCL。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCL。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 实验步骤 1.配制分离胶5ml（配方见图1）； 2.将液体用1ml移液器加入玻璃板（从玻璃板的边缘加入，速度适中，尽量不 要产生气泡）； 3.用去离子水压胶（利用重力作用把胶压平，否则如果有气泡，胶就不平了， 影响电泳效果。注意上面盖一保鲜膜，防止液体挥发）； 4.大约1第二天一早配制堆积胶）， 5.倒掉玻璃板上面的水并用滤纸吸干，加入堆积胶，并插入梳子； 6.约1小时后堆积胶凝固，把玻璃板转移到电泳装置并加紧（防止漏液）； 7.将电泳装置内加入电泳缓冲液并观察是否漏液； 8.拔掉梳子，用微量注射器冲洗上样孔，加入和上样缓冲buffer混合变性的蛋 白；①蛋白上样量：20-50μg；②上样缓冲液：加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×；③上样最大体积：根据梳子孔径和玻璃板的距离而定，一般我们用的上样最大体积在30ul左右；④蛋白变性：上样前要将样品于沸水中煮5-10min 使蛋白变性。可以使用PCR仪进行变性，99℃5分钟，加快速度，这样就不用将水煮沸了，同时在水中煮蛋白样品有下面弊端：a. EP 管容易炸开，样品丢失；b. 容易进水，使样品体积增加，超过电泳最大上样量； 9.在电泳槽中加入电泳缓冲液； 10.恒压80V 30分钟，100V 2小时左右，溴酚蓝跑到底即可（电泳时间可以根 据自己目的蛋白的具体条件设置，一般4～5 h，电压为40V 较好，也可用60V。）；
几种常用软件开发工具比较(2008-10-27 10:11:59) 标签：职场it [转]近日和公司的系统分析员探讨了几种开发工具的特性，由其总结了下面的内容。 文章客观评价了各种开发工具的优缺点，本人把文章拿来和大家一起讨论一下，欢迎专业人事补充和指正。 一、跨平台特性 VB：无★ PB：WINDOWS家族, Solaris,Macintosh ★★★ C++ Builder/Dephi：WINDOWS家族，Linux ★★★ VC：无★ JAVA：所有能够运行JAVA虚拟机的操作系统★★★★ 二、组件技术支持 VB：COM,ActiveX ★★★ PB：COM,JavaBean,Jaguar,UserObject使用：CORBA+Acti veX ★★★ C++ Builder/Dephi：COM, ActiveX CORBA（本身自带CORBA中间件VisiBroker，有丰富向导）★★★★★ VC：COM,ActiveX，CORBA(没有任何IDE支持，是所有C编译器的功能,需要CORBA中间件支持) ★★★ JAVA：JavaBean,CORBA;ActiveX ★★★★ 三、数据库支持级别 数据访问对象： VB：DAO,ADO,RDO功能相仿；★ PB：Transaction,DwControl，可绑定任何SQL语句和存储过程，数据访问具有无与比拟的灵活性★★★★ C++ Builder/Dephi：具有包括DataSource,Table,Query,Midas,ADO在内的二十多个组件和类完成数据访问★★★ VC：同VB，但有不少类库可供使用，但极不方便，开发效率很低★★ JAVA：JAVA JDBC API,不同的IDE具有不同的组件★★ 数据表现对象： VB：DBGriD，与数据库相关的数据表现控件只有此一种，只能表现简单表格数据，表现手段单一★ PB：DataWindow对象（功能异常强大，其资源描述语句构成类似HTML的另外一种语言，可在其中插入任何对象，具有包括DBGrid在内的数百种数据表现方法），只此一项功能就注定了PB在数据库的功能从诞生的那 一天起就远远超过了某些开发工具今天的水平★★★★★ C++ Builder/Dephi：具有包括DBGrid,DBNavigator,DBEdit,DBLookupListBox在内的15 个数据感知组件，DecisionCube,DecisionQuery在内的6个数据仓库组件和包括QRChart, QRExpr在内的20多个报表组建，可灵活表现数据★★★
Western blot实验步骤 一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取） 1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS 后将细胞培养瓶置于冰上。 2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。 3.裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中. 4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续实验（-80保存） 常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再加入1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中，12000rpm，离心5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充分混匀，冰上裂解20min，4度离心，5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的ep管中。 二、蛋白浓度测定(BCA法) BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。 标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存),完全溶解蛋白标准品，取10ul 稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。蛋白样品在什么溶液中，
标准品也宜用什么溶液稀释。但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl 或PBS稀释标准品。 1.配置BCA工作液 A液： B液= 50 :1 ，混匀 A液+B液=200ul (每个样本) 样本数量： 7个标准品 + N 个待测蛋白样本 2.先将每孔加入200ul BCA工作液，再加入蛋白样本。（96孔板）, 总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。 3.37度，温箱中孵育30min。562nm波长，测OD值。待测蛋白样品浓度在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。 4.根据所测样品的OD值，绘制标准曲线。根据标准曲线即可计算样本相应的蛋白含量，除以样本稀释液总体积（10ul）,再乘以样本稀释倍数，即为样本的实际浓度（ug/ul） 5.蛋白定量后，以最小蛋白浓度为标准，将各组蛋白样本调至相同浓度（ddH2O补齐） 绘制标准曲线：X轴为蛋白质量，Y为OD值 插入—XY散点图,选中图上一点，右键，添加趋势线—选项（显
软件开发模式有哪些? 快速原型模型：（需要迅速造一个可以运行的软件原型，以便理解和澄清问题） 快速原型模型允许在需求分析阶段对软件的需求进行初步的非完全的分析和定义，快速设计开发出软件系统的原型（展示待开发软件的全部或部分功能和性能 （过程：用户对该原型进行测试评定，给出具体改善的意见以及丰富的细化软件需求，开发人员进行修改完善） 优点： 克服瀑布模型的缺点，减少由于软件需求不明确带来的开发风险 缺点： A、所选用的开发技术和工具不一定符合主流的发展 B、快速建立起来的系统加上连续的修改可能会造成产品质量底下 增量模型：（采用随着日程时间的进展而交错的线性序列，每一个线性徐磊产生软件的一个可发布的“增量”，第一个增量往往就是核心的产品） 与其他模型共同之处：它与原型实现模型和其他演化方法一样，本质都是迭代 与原型实现模型不同之处：它强调每一个增量均发布一个可操作产品，（它不需要等到所有需求都出来，只要摸个需求的增量包出来即可进行开发） 优点： 1、人员分配灵活，一开始不需要投入大量人力资源 2、当配备人员不能在限定的时间内完成产品时，它可以提供一种先推出核心产品的途径，可现发布部分功能给用户（对用户起镇静作用） 3、增量能够有计划的管理技术风险 缺点： 1、如果增量包之间存在相交的情况且未很好处理，则必须做全盘系统分析 注： 这种模型将功能细化后分别开发的方法较适应于需求经常改变的软件开发过程 原型模型：（样品模型，采用逐步求精的方法完善原型） 主要思想： 先借用已有系统作为原型模型，通过“样品”不断改进，使得最后的产品就是用户所需要的。原型模型通过向用户提供原型获取用户的反馈，使开发出的软件能够真正反映用户的需求， 采用方法： 原型模型采用逐步求精的方法完善原型，使得原型能够“快速”开发，避免了像瀑布模型一样在冗长的开发过程中难以对用户的反馈作出快速的响应 优点：
项目的运营模式 我们会收取顾客带来的较新的一些工艺品、小摆设等闲置物品，现将其以较低的价格用购物券收回，再以相对较高的价格让顾客用购物券将我们的商品买走，其中的价差将会是我们的利润。（可以上网注册相应的网站，通过网络提高企业的知名度，同时挖掘潜在的消费者，真正做到可以和网络同步发展，减少广告费用。） 我们会建立自己的网站，进行网上交换，吸收一些好的商品进行收购，增加商店内商品的多样性与流行性。定期举行一些活动来吸引顾客。 我店还会经营一些额外的业务，在店中会卖一些咖啡、饮料、点心，让顾客能坐下来慢慢浏览，放松心情，感受小店的独特风味。小店还有独特的慢递服务，让随着社会发展压力变大的顾客能慢下来，给未来的自己或朋友写封信，记住现在的心情。 治理结构：指按照《中华人民共和国合伙企业法》或《私营企业暂行条例》的规定，由两个以上自然人按照协议共同投资，共同经营，共负盈亏，以雇佣劳动为基础，对债务承担无限责任的企业。 独立董事制度的引入，独立董事加强了对私营企业的外部监督；独立董事的引入可使董事会这一内部机构适当的外部化。鉴于让董事会发挥出应有的监督作用，这里可以尝试通过相关部门先采用部门规章的形式加以规范，之后再在相关法律法规中明确独立董事的定义及相关要求，只有通过立法的形式才能保证独立董事在企业特别是私营企业中的法律地位，才能真正发挥独立董事对企业治理监督的有效作用。
管理手段：可以有相应的负责人负责网络广告的传播，以及颁布相关的企业信息。 风险： 10 风险分析及对策错误！未定义书签。 10.1 政策风险错误！未定义书签。 10.1.1 风险错误！未定义书签。关于租门面政策风险，国家其它相关法律、法规的颁布与修订税收政策等方面的调整都可能会给公司的运营带来一定的风险。 10.1.2 对策错误！未定义书签。未来公司的运作一如既往的严格遵守国家的法令、法规和政策，并加强对有关政策、法规的研究，掌握国家法规政策的最新动态，及时调整公司的发展目标和经营战略。 10.2 市场风险错误！未定义书签。新开店之初，广告投入力度相对比较薄弱，不能做到大幅度的宣传，被人们普遍接受需要一定的时间，而被人们接受的期间的经营状况不确定。比较难确定运营盈利。而且企业所需要的商品种类比较多 10.2.1 风险错误！未定义书签。 10.2.2 对策错误！未定义书签。通过网络进行宣传，建立自己的网站，将在小店中发生的故事发到网络上，通过博客、微博进行宣传，将小店最新的信息、故事告诉大家。通过一些介绍特色小店的杂志、报刊等媒体来宣传我们的小店，以小店爱、缘分、环保的主题来进行宣传。这样一来不仅小店的知名度会提高，渐渐的会有人来光顾小店，东西慢慢就“换”出去了。 对商品系统的进行分类，然后真正做到将普通的交易与消费者的心理相联系，满足消费者的心理，增加创意。 10.3 行业风险错误！未定义书签。 10.3.1 风险错误！未定义书签。以物易物的交易方式可能会使现金流量变少 对于交换回的物品可能会慢慢堆积，无人问津 10.3.2 对策错误！未定义书签。本店在以物换物的同时开展了其他业务，如慢递和饮品及寻物等的服务会以现金进行交易，从这些中赚取利润。 对于交换回的物品可能会慢慢堆积，无人问津 在进行交换时会严格的对交换物品进行挑选，根据我们的经验来选择，尽量避免此问题的出现。在挑选顾客所要交换的物品时，尽量选择一些能提起人们兴趣，让人们产生兴趣好推销的物品。 10.4 不可抗力风险错误！未定义书签。主要是店内人员流通问题，本店主要针对18-25岁的青年，相对而言人员流通范围较少，单一。 10.4.1 风险错误！未定义书签。
WB的原理、操作及注意事项 原理： 通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1?5ng （最低可到10- 100pg）中等大小的靶蛋白。 一、抗原的选择和制备 A：样品的制备 1 组织： 组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS0C研磨，加入5X STOFbuffer , 180W6mins , 0C 超声波破碎，5000rpm,5mins 离心，取上清。加入B -ME（9.5ml 加入0.5ml）, 溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml ）煮沸10min，分装后于-20 C保存，用时取出，直接溶解上样。 2 细胞： 细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入 5 x STOPbuffer，收集， 180W6mins , 0C超声波破碎，5000rpm,5mins 离心，取上清。加入B -ME（9.5ml 加入0.5ml）, 溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml ）煮沸10min，分装后于-20 C保存，用时取出，直接溶解上样。3 分泌蛋白的提取（特例）： 直接收集分泌液，加入B -ME、溴酚蓝制样。 B:蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因 1. 双缩脲法： 双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L ?10g/L 含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%^的三 氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1mNaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量 测定。 2. Lowry 法： 此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性 溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深 蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L?400mg/L 含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上 述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液 中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络 合物所还原。 3. 紫外吸收法： 大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1?0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算： M 白虜浓皮（m”/mi）—1 ” 55A”? - 0.76 \ m 280 260