（生物科技行业）土壤酶活性及土壤微生物计数测定
方法
土壤酶活性及微生物测定
土壤酶活性测定
取样工具及取样方法
在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。土样在自然条件下烘干装入袋中备用。
所需试剂：
酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、硫酸铵[(NH4)2SO4]、甲苯、苯磷酸二钠、NaAc.3H2O、HAc、酚、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、碘化钾、氯化汞、氢氧化钾、、
配置方法：
铵态氮标准溶液：称取0.4717g(精确至0.0001g)干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4]溶于水中，再加水稀释至1000mL，此溶液1mL含100μgN。往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度，制备成的溶液在490nm下比色，并绘制标准曲线。
醋酸缓冲液：PH5.0，NaAc.3H2O50g，溶于适量水中，加6mol/LHAc34ml，稀释至500ml。
硼酸缓冲液：PH9.0，80毫升0.05mol/l硼砂（Na2B4O7.10H2O）和0.2mol/l的硼酸混合。
纳氏试剂：将碘化钾10g溶于10ml水中，边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱和水溶液，直至生成的红色沉淀不再溶解为止。加入氢氧化钾30g并溶解之，再加入氯化汞饱和溶液1ml，加水至200ml。静置，取上层清液，贮于棕色瓶中
酚的标准溶液：（1）原液—1克酚溶于蒸馏水中定容至1升，溶液在暗色中稳定，（2）
工作液—取50ml原液稀释至1升（1ml含0.05mg酚）；分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容（分别相当于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35毫克酚），待颜色稳定后，570nm比色绘制标准曲线。
测定方法
磷酸酶活性测定
一、试验原理
土壤中的磷，很大部分以有机磷化合物的形式存在。磷酸酶能促进有机磷化合物的水解。实验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物质的矿化起着主要作用；土壤的磷酸酶活性，在很大程度上取决于土壤的腐殖质含量，活性磷量，能矿化有机磷化合物的微生物数量，植物类型等因素，土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况。
二、实验仪器
恒温箱、分光光度计、
三、实验药品
甲苯、苯磷酸二钠、酚、醋酸缓冲液、硼酸缓冲液、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、
四、实验步骤
取5克过20目筛的风干土样于50毫升容量瓶中，用0.8(16滴)毫升甲苯处理，15分钟后，加入5毫升苯磷酸二钠溶液（6.75克苯磷酸二钠溶于水，并稀释至1升）和5毫升相应的缓冲液（碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液，中性磷酸酶用pH7.0的柠檬酸缓冲液，酸性磷酸酶用pH5.0的醋酸缓冲液）。仔细混合后，将反应物置于37摄氏度恒温箱中培养12小时，然后用蒸馏水定容至刻度，摇匀过滤，用5毫升水代替基质以设置对照。为了测定反应混合物中的酚量，取1毫升滤液于100毫升容量瓶中，加5毫升硼酸缓冲液（pH9.0），再加入3毫升2.5%的铁氰化钾和3毫升0.5%的4-氨基安替吡啉，摇动，溶液呈粉红色，
然后再加水定容，待颜色褪到稳定时（约需20~30分钟），在分光光度计上于波长570纳米处测定溶液的光密度，根据用酚制备的标准曲线查出供试滤液中酚的含量。磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克数表示。
脲酶活性测定
一、试验原理
土壤的脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关。根基土壤可测得最大的脲酶活性，人们常用土壤的脲酶活性表征土壤的氮素状况。
二、实验仪器
锥形瓶、定性滤纸、震荡器、分光光度计、1mm筛、
三、实验药品
酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、铵态氮标准溶液、双蒸水
四、实验步骤
1、准确称取10.00g过1mm筛的风干土样，置于150mL锥形瓶中，注入50mL20%
的NaCl溶液，将瓶塞紧，在振荡30min(120r/min)后，用定性滤纸过滤。
2、取20mL滤液于50mL容量瓶中，加双蒸水稀释至40mL左右，加2mL25%酒石酸
钠，充分摇动静置5min，使其与Cd，Mg离子络合；
3、再加入10滴1%阿拉伯胶，摇动后加2mL纳氏试剂，边加边摇，定容至刻度，5min
后用490nm比色，配制铵态氮标准溶液，绘制标准曲线，比色后求算土壤脲酶活性。
4、结果分析
滴定法测定过氧化氢酶活性
一、试验原理
土壤的过氧化物酶活性，与土壤的呼吸强度和土壤微生物活动相关，在一定程度上反映土壤微生物过程的强度。根际土壤的过氧化物酶活性，远较根际外土壤为高。有机质含量高的土壤，过氧化氢酶活性较强。因此，土壤过氧化物酶的活性可以表征土壤总的生物学活性和肥力状况。
本试验采用滴定法测定过氧化氢酶活性，即通过定量滴定酶促反应后剩余的过氧化氢量。
二、实验仪器
致密滤纸、酸式滴定管、1mm筛
三、实验药品
双蒸馏水、H2SO4、过氧化氢、KMnO4、
四、实验步骤
准确称取5.00g过1mm筛的风干土样，置于150mL锥形瓶中，注入40mL双蒸馏水和5mL0.3%过氧化氢，另设对照，塞紧瓶盖，振荡30min(120r/min)后，注入5mL1.5mol/LH2SO4终止反应，用致密滤纸过滤，取滤液25mL，用0.1mol/LKMnO4滴定至微红色。土壤的过氧化氢酶活性，用100g土重的0.1mol/LKMnO4毫升数表示。
土壤微生物检测
一、取样工具
无菌刮铲、土样采集器、镊子、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。
二、采土方式：
在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品立即进行处理或放在4℃冰箱中暂存。
三、所需培养基及配置方法
1、牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用）
牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15～20g，水1000ml，pH7.0～7.2，121℃灭菌20min。
2、高氏（Gause）1号培养基（培养放线菌用）
可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO40.5g，MgSO4.7H2O0.5g，FeSO40.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其它成分，溶化后，补足水分至1000ml。121℃灭菌20min。
3、无氮培养基（自身固氮菌、钾细菌）
甘露醇（或葡萄糖）10g，KH2PO40.2g，MgSO4·7H2O0.2g，NaCl0.2g，CaSO4·2H2O0.2g，CaCO35g，蒸馏水1000ml，pH7.0～7.2，113℃灭菌30min。
4、马丁氏（Martin）琼脂培养基（分离真菌用）
葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，1/3000孟加拉红（rosebengal，玫瑰红水溶液）100ml，琼脂15～20g，pH自然，蒸馏水800ml，121度灭菌30min。临用前加入0.03%链霉稀释液10ml，使每毫升培养基中含链霉素30μg。
5、蛋白胨琼脂培养基
蛋白胨5克、KH2PO40.5g，NaCl0.25g，琼脂18克，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO40.01克，
水1000毫升，pH7.2，一气压灭菌20分钟灭菌。
四、所需药品
牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、MgSO4、FeSO4、甘露醇（或葡萄糖）、CaSO4·2H2O、CaCO3、孟加拉红、链霉素
五、检测方法
土壤中放线菌的检测
一、试验原理
应用稀释平板法从土壤中检测放线菌
二、实验仪器及试剂
7个土样，3个重复，共需252个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶
高氏一号培养基
可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其它成分，溶化后，补足水分至1000ml。121℃灭菌20min。
三、实验步骤
1、在超净工作台中，无菌称取所取土样10g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中，
于摇床震荡30分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。如此操作，一直到10-10。稀释。(另外，要知道所称土样的含水量)
2、倒人45℃恒温水浴的灭菌高氏l号培养基，水平放置，凝固待用；分别无菌吸取各样品
10-4、10-5、10-6、10-7稀释液，加入灭菌平皿中(每稀释度3皿，每皿lml)，用玻璃涂布棒涂抹均匀，将平皿倒置于28℃恒温培养箱中培养。放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多
3、培养48h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿
上的菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行计算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。
每克土壤中菌落形成单位＝同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数。
土壤中细菌的检测
一、试验原理
应用稀释平板法从土壤中分离细菌
二、实验仪器及试剂
7个土样，3个重复，共需252个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶
牛肉膏蛋白胨培养基
牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15～20g，水1000ml，pH7.0～7.2，121℃灭菌20min。
三、实验步骤
1、在超净工作台中，无菌称取所取土样10g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶
中，于摇床震荡30分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。如此操作，一直到10-10。稀释。(另外，要知道所称土样的含水量)
2、分别无菌吸取各样品10-5、10-6、10-7、10-8稀释液，加入灭菌平皿中(每稀释度3皿，每皿lml)，倒人45℃恒温水浴的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基，混匀。（稀释倍数是情况而定）
3、待培养基凝固后，将平皿倒置于37℃恒温培养箱中培养。
4、培养24h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行计算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。
每克土壤中菌落形成单位＝同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数。
土壤中真菌的检测
一、试验原理
应用稀释平板法从土壤中检测真菌
二、实验仪器及试剂
7个土样，3个重复，共需252个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶、灭菌水
马丁氏（Martin）琼脂培养基（分离真菌用）
葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，1/3000孟加拉红（rosebengal，玫瑰红水溶液）100ml，琼脂15～20g，pH自然，蒸馏水800ml，121度灭菌30min。临用前加入0.03%链霉稀释液10ml，使每毫升培养基中含链霉素30μg。（链霉素在培养基融化并冷却至50摄氏度时加入，用剩的链霉素在冰箱可保存4个月，但每过一月，在1升培养基中需多加0.1ml）。
三、实验步骤
1、在超净工作台中，无菌称取所取土样10g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶
中，于摇床震荡30分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。如此操作，一直到10-10。稀释。(另外，要知道所称土样的含水量)
皿lml)，倒人45℃恒温水浴的灭菌马丁氏（Martin）琼脂培养基，混匀。（稀释倍数是情况而定）
3、待培养基凝固后，将平皿倒置于28℃恒温培养箱中培养。
4、培养48h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行计算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。
每克土壤中菌落形成单位＝同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数。
土壤中自身固氮菌的检测
一、试验原理
应用稀释平板法从土壤中检测自身固氮菌。
二、实验仪器及试剂
7个土样，3个重复，共需252个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶、灭菌水
无氮培养基
甘露醇（或葡萄糖）10g，KH2PO40.2g，MgSO4·7H2O0.2g，NaCl0.2g，CaSO4·2H2O5g，CaCO31000ml，蒸馏水1000ml，pH7.0～7.2，113℃灭菌30min。
三、实验步骤
1、在超净工作台中，无菌称取所取土样10g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶
中，于摇床震荡30分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。如此操作，一直到10-10。稀释。(另外，要知道所称土样的含水量)
皿lml)，倒人45℃恒温水浴的灭菌无氮培养基，混匀。（稀释倍数视情况而定）
3、待培养基凝固后，将平皿倒置于28℃恒温培养箱中培养。
4、培养48h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行计算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。
每克土壤中菌落形成单位＝同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数。
土壤中氨化细菌的检测
一、试验原理
应用稀释平板法从土壤中检测自身固氮菌。
二、实验仪器及试剂
7个土样，3个重复，共需252个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶、灭菌水
蛋白胨琼脂培养基
蛋白胨5克、KH2PO40.5g，NaCl0.25g，琼脂18克，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO40.01克，水1000毫升，pH7.2，一气压灭菌20分钟灭菌。
三、实验步骤
1、在超净工作台中，无菌称取所取土样10g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶
中，于摇床震荡30分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。如此操作，一直到10-10。稀释。(另外，要知道所称土样的含水量)
2、分别无菌吸取各样品10-6、10-7、10-8、10-9稀释液，加入灭菌平皿中(每稀释度3皿，每
皿lml)，倒人45℃恒温水浴的灭菌蛋白胨琼脂培养基，混匀。（稀释倍数视情况而定）
3、待培养基凝固后，将平皿倒置于28℃恒温培养箱中培养。
4、培养48h-72h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行计算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。
每克土壤中菌落形成单位＝同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数。
试剂购买
土壤微生物的分离鉴定及数量测定 （一）培养基的制备 Ⅰ测定微生物总量培养基： 1. 细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基） 牛肉膏Beefextract 5.0g 蛋白胨Peptone 10.0g NaCI 5.0g 蒸馏水H20 1000m1 琼脂15～20g PH 7.2~7.4 制备步骤： ⑴在100 mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，加50 mL蒸馏水，置电炉搅拌加热至牛肉膏，蛋白胨完全溶解. ⑵向小铝锅中加入500 mL蒸馏水，将溶解的牛肉膏，蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2～3次.加入 5.0gNaC1，在电炉上边加热边搅拌. ⑶加入洗净的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000 mL. ⑷用NaOH或HC1调至pH7.0. 用酸度计或用玻棒沾少许液体用精密pH试纸测定其pH值，并用10％NaOH 调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。 ⑸根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。，塞好棉塞，装入小铁丝筐，然后用旧报纸将棉塞部分包好. 标签表明培养基的名称、配制日期等。 ⑹高压蒸汽灭菌，用0.1Mpa（15lb/in2）121℃灭菌（15-20）30min. 2. 放线菌培养基（改良高氏1号琼脂培养基） 可溶性淀粉20g KNO3 1g K2HPO40.5g MgSO4? 7H2O 0.5g NaCl 0.5g原0.05g FeSO4? 7H2O 0.01g pH 7.2-7.4 制备步骤： （1）计算根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。 （2）称量准确称量各种成分。 （3）溶化配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入少许沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调PH（可不调）。 （4）分装、包扎、灭菌。
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法） 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生 物生物量碳，用一定体积的LK 2SO 4 溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微 生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。 实验试剂 1）无乙醇氯仿（CHCL 3 ）； 2）L硫酸钾溶液：称取87g K 2SO 4 溶于1L蒸馏水中 3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下， 仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 操作步骤 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 熏蒸 称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO 2 ，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 抽真空处理 熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完
全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※ 浸提过滤 从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个的滤头，一个才1元）。 TOC仪器测定 吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（Shimadzu Model TOC---500,JAPAN）为例。 计算 SMBC=(E C CHCL3—E C CK)*TOC仪器的稀释倍数*原来的水土比/ 2 土壤微生物生物量氮（茚三酮比色法） 土壤微生物生物氮一般占土壤全氮的2%—7%，是土壤中有机—无机态氮转化的一个重要环节，关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测定法，另一个是茚三酮比色法，如下 基本原理（茚三酮比色法）
土壤微生物量碳测定方法及应用 土壤微生物量碳（Soil microbial biomass）不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。近40年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc)来表示土壤微生物生物量的大小。测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigation-incubation, FI）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE）。 熏蒸提取法（FE法） 由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加 入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。Voroney (1983)发现熏蒸土壤用·L-1K 2SO 4 提取液提取 的碳量与生物微生物量有很好的相关性。Vance等(1987)建立了熏蒸提取法测定土壤微生物 碳的基本方法：该方法用·L-1K 2SO 4 提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取 液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换 系数K EC (取值来计算土壤微生物碳。 Wu等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。 林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。 对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数K EC 的取值，有很多研究进行了大量的 研究。测定K EC 值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用14C底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较）。提取液中有机碳的 测定方法不同（如氧化法和仪器法），那么转换系数K EC 取值也不同，如采用氧化法和一起法 K EC 值分别为（Vance等，1987）和（Wu等，1990）。不同类型土壤（表层）的K EC 值有较大不 同，其值变化为（Sparling等，1988，1990；Bremer等，1990）。Dictor等（1998）研究表 明同一土壤剖面中不同浓度土层土壤的转换系数K EC 有较大的差异，从表层0-20cm土壤的K EC 为，逐步降低到180-220cm土壤的K EC 为。 一、基本原理 熏蒸提取法测定微生物碳的基本原理是：氯仿熏蒸土壤时由于微生物的细胞膜被氯仿破 坏而杀死，微生物中部分组分成分特别是细胞质在酶的作用下自溶和转化为K 2SO 4 溶液可提取 成分（Joergensen,1996）。采用重铬酸钾氧化法或碳-自动分析仪器法测定提取液中的碳含量，以熏蒸与不熏蒸土壤中提取碳增量除以转换系数K EC 来估计土壤微生物碳。 二、试剂配制 （1）硫酸钾提取剂（·L-1）：取分析纯硫酸钾溶解于蒸馏水中，定溶至10L。由于硫酸钾较难溶解，配制时可用20L塑料桶密闭后置于苗床上（60-100rev·min-1）12小时即可完全溶解。 （2） mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：称取130℃烘2-3小时的K 2 Cr 2 O 7 （分析纯）9.806g 于1L大烧杯中，加去离子水使其溶解，定溶至1L。K 2Cr 2 O 7 较难溶解，可加热加快其溶 解。 （3） mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：取经130℃烘2-3小时的分析纯重铬酸钾4.903g， 用蒸馏水溶解并定溶至1L。
土壤微生物计数法 土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。 1.1培养计数法 1.1.1概要 在自然条件下，土壤中的大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。因此，根据在培养基上所生长的微生物数量，可以估算土壤中微生物的数量。这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法，主要包括稀释平板计数法（简称稀释平板法）和最大或然计数法。 稀释平板计数法的基本原理：土壤微生物经分散处理成为单个细胞后，在特殊的培养基上生长并形成一个菌落，根据形成的菌落数来计算微生物的数量。 最大或然计数法的基本原理：假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管或平板上全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物菌落。根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度，再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。 1.1.2稀释平板法 一、试剂配制
常用的培养基各类很多（见附录一），可根据需要测定的微生物种类选择培养基。按配方配制培养基后，先在121℃下灭菌15min，冷却至45～50℃使用。凝固后的培养基可加热溶解后使用。 二、仪器设备 广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞，移液管（1ml、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌）培养皿（9㎝，用牛皮纸包好后灭菌）和显微镜等。 三、操作步骤 （1）土壤系列稀释液制备 取新鲜土壤（＜2㎜）10.00g，放入经灭菌的装有70ml水的广口瓶中，塞上经灭菌的橡皮塞，在振荡机上振荡10min，此为10-1土壤稀释液。迅速用灭菌的移液管吸取10-1土壤稀释液10ml，放入灭菌的装有90ml水的广口瓶中，塞上橡皮塞，混合均匀，此为10-2土壤稀释液。再如此依次配制10-3、10-4、10-5和10-6系列土壤稀释液。上述操作均在无菌条件下进行，以避免污染。 （2）平板制备和培养 从两个稀释倍数的土壤稀释液中（细菌和放线菌通常用10-5和10-6土壤稀释液，真菌用10-2和10-3稀释液）吸取1.00ml（吸前摇匀），分别放入五套培养皿中（注意每变换一次浓度，须更换一支移液管）；再向培养皿内注入45～50℃的培养基10ml，立即混合均匀，静置凝固后，倒置放于培养箱中培养。细菌和放线菌在28℃下培养7～10d，真菌在25℃下培养3～5d。 （3）镜检计数
土壤微生物测定 土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。 测定指标： 1、土壤微生物量(MierobialBiomass，MB) 能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。 目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。 因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。 此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施 用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。 熏蒸提取-容量分析法 操作步骤： （1）土壤前处理和熏蒸 （2）提取 -1K2SO 4（图将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol·L 水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min -1），用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol·L -1K2SO4提取；另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。 （3）测定 吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018 mol·L -1K2Cr2O7—12mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃ 磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。冷却后无损地转移至150mL三角瓶中，用去离子水洗涤消化管3~5次使溶液体积约为80mL， 加入一滴邻菲罗啉指示剂，用0.05mol·L -1硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色 变 为蓝色，再变为红棕色，即为滴定终点。 （4）结果计算
土壤微生物量氮的测定方法 1.试剂配制： (1)混合催化剂：按照硫酸钾：五水硫酸铜：硒粉=100：10：1，称取硫酸钾100g、 五水硫酸铜10g、硒粉1g。均匀混合后研细,贮于瓶中。 (2)密度为1.84浓硫酸。 (3)40%氢氧化钠：称400g氢氧化钠于烧杯中，加蒸馏水600ml，搅拌使之全部溶 解定容至1L。 (4)2%硼酸溶液：称20g硼酸溶于1000ml水中，再加入20ml混合指示剂。（按体 积比100:2加入混合指示剂） (5)混合指示剂：称取溴甲酚绿0.5g和甲基红0.1克,溶解在100ml95%的乙醇中, 用稀氢氧化钠或盐酸调节使之呈淡紫色，此溶液pH应为4.5。 (6)0.01mol的盐酸标准溶液：取比重1.19的浓盐酸0.84ml，用蒸馏水稀释至 1000ml，用基准物质标定之。 (7)0.5M K2SO4溶液：称取K2SO4 87.165g溶解于蒸馏水中，搅拌溶解，（可加 热）定容至1L。 (8)去乙醇氯仿的配制：在通风柜中，量取100毫升氯仿至500毫升的分液漏斗 中，加入200毫升的蒸馏水，加塞，上下振荡10下，打开塞子放气，而后加塞再振荡10下，反复3次，将分液漏斗置于铁架台上，静止溶液分层，打开分液漏斗下端的阀，将下层溶液（氯仿）放入200毫升的烧杯中，将剩余的溶液倒入水槽，用自来水冲洗。再将烧杯中的氯仿倒入分液漏斗中，反复3次。将精制后的氯仿倒入棕色瓶中，加入无水分析纯的CaCl2 10g，置于暗处保存。 2.试验步骤：。 （1）制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%水在25℃下培养7~15d。取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，静置5分钟，再抽滤5分钟，同样操作三次。干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。按照土：0.5M K2SO4=1:4(烘干土算，一般就是湿土：0.5M K2SO4=1：2)，加入0.5M K2SO4溶液（空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。 （2）测定：滤液要是不及时测定，需立即在-15℃以下保存，此滤液可用于微生物碳氮的测定。微生物碳测定只吸取2ml，采用重铬酸钾-硫酸亚铁滴定法测定。微生物氮吸取滤液10ml于消化管中，加入2g催化剂，在再加5ml浓硫酸，管口放一弯颈小漏斗，将消化管置于通风橱内远红外消煮炉的加热孔中。打开消煮炉上的所有加热开关进行消化，加热至微沸，关闭高档开关，继续加热。消煮至
土壤微生物量测定方法 一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法） 1、试剂 （1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 ? 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。 （2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。 （3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h 即可。 （4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH ]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH ，用高纯度去离子水定容至1 L。要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。 ) （5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。 （6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。 （7）邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（）= 1000 mg C L-1]）：取2.1254 g经105℃烘2～3 h的分析纯邻苯二甲酸氢钾，溶于高纯度去离子水，定容至1 L。 2、仪器设备 碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100 ml）、振荡器（300 r min-1）、可调加液器（50 ml）、可调移液器（5 ml）、烧杯（盛滤液用）（50~100 ml）、聚乙烯提取瓶（100，150 ml），聚乙烯塑料桶（20 L，带螺旋盖），三角瓶（150 ml）、其它常规仪器。 3、操作步骤 ; （1）土样前处理 新鲜土壤应立即处理或保存于4℃冰箱中，测定前先仔细除去土样中可见植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径< 2 mm），彻底混匀。如果土壤过湿，应在室内适当风干，以手感湿润疏松但不结块为宜（约为饱和持水量的40%）。如果土壤过于干燥，用蒸馏水调节至饱和持水量的40%。将土壤置于密封的大塑料桶内在25℃条件下预培养7～15 d，桶内有适量水以保持相对湿度为100%，并在桶内放一小杯1 mol L-1 NaOH 溶液以吸收土壤呼吸产生的CO2。经过预培养的土壤应立即分析。如需保留，应放置于4℃
土壤微生物研究规范——II. 土壤样品的运输和贮存 1. 土壤微生物样品的运输 土样从采集点到实验室往往需要经历一定时间的运输，土样运输过程中难免影响土壤的温度、水分、氧气等环境条件，所以要尽快置于黑暗、低温（4℃）的密闭环境，尽量维持土壤含水量稳定不变，黑暗环境是为了避免光照下藻类在土壤表明的生长，低温是为了减少细菌繁殖，维持微生物区系稳定。一般装于聚乙烯袋子，并松扎。另外，储存时尽可能避免物理压实，样品袋不要堆叠过多，以免破坏土壤原有的团粒结构，并导致底层样品处于厌氧环境。 微生物取样的土壤样品需要在0-4℃的条件下保存，所以土壤样品应及时保存在保温箱或冰箱中（设置0-4℃），并最好在一周内完成前期处理。 如果采集地有冰箱、熏蒸所需的真空干燥器和通风橱等设施，建议将微生物土壤样品熏蒸浸提后，以冷冻的浸提液保存在塑料小瓶中，以方便运送。 如果采集地没有通风橱等设施，建议将所取的土壤样品过筛后冷藏在保温箱中，以方便运送。具体的流程如下： （1）提前准备好保温箱及冷冻好的冰板。冰板需要提前1-2 d冷冻，可以再用自封袋装一定量水分放平冷冻为规则的冰块备用。 （2）按照微生物取样规范进行取样，及时过筛去除根系、土壤动物等杂质，放置在0-4℃保鲜冰箱中保存。用于DNA或RNA分析的土壤样品应用干冰速冻。用于RNA分析的土壤样品在运输过程中应用干冰保持低温。用于DNA分析的土壤样品应用冰盒运输，也可用干冰。 （3）运输当天将土壤样品密封好，放入保温箱中，保温箱底部、四周及顶部均放置冰板和用自封袋密封的冰块，保证样品四周均可接触冰板或冰块。注意保证土壤样品和冰块分别密封，以防路途中融化的水分进入土壤样品造成污染。 （4）到达目的地后，迅速将样品放入保鲜冰箱（0-4℃）保存待测。 如果采样地条件允许，可以根据规范上的实验方法，将样品熏蒸、浸提后保存在塑料小方瓶中，-20℃冷冻，然后再按照上述流程放置保温箱中运送到目的地，迅速放置在冷冻冰箱中（-20℃）保存待测。 如果购买不到保温箱，可以选用运输水果、蔬菜等的白色泡沫箱，密封严实后亦可。由于泡沫箱保温效果可能不及保温箱，路途较远时应多放置冰板及冰块，途中尽量不要打开，放入及取出都要及时，且需要提前确认样品采集地和目的地
农田土壤中微生物的检测01 农田土壤中微生物的检测及探究；摘要：土壤微生物是土壤的重要组成部分，其群落结构；土壤的质量，是土壤生态系统稳定性的重要指示因子；Microbiologyinthesoilisa；关键词：农田土壤微生物检测展望；土壤微生物是生态系统的重要组成部分,其数量和种类；材料和方法1）材料；1.1仪器和其他用品三角烧瓶培养皿，吸管试管涂布；1.2培养基牛肉膏蛋白胨培养基农田土壤中微生物的检测及探究 摘要：土壤微生物是土壤的重要组成部分，其群落结构多样性及变化在一定程度上反映了 土壤的质量，是土壤生态系统稳定性的重要指示因子。通过对农田土壤中微生物的检测，了解农田中微生物的多样性，并从生态功能方面阐述了土壤微生物多样性的作用，并探讨其发展前景。 Microbiology in the soil is a important part of the soil . The diversity and chang eable of its community reflect the quality of the soil to some extend .It is the import ant factor of the soil’steady .we can know the diversity of soil by detect the farmlan d’soil .and account the function of the microbiology from the aspect of ecology. Final ly ,we researched the future of microbiology. 关键词：农田土壤微生物检测展望 土壤微生物是生态系统的重要组成部分, 其数量和种类受耕作制度、地理位置、土壤层次、植被、土壤肥力、气候变化及土壤类型等诸多因素的影响, 在土壤环境中起着重要作用。微生物在土壤中的数量、分布与活动情况, 反应了土壤肥力的高低。不同的土地利用方式导致土壤环境不同。农田中含有着许许多多的微生物，千百年来，微生物在默默的为人类服务而不为人知。了解农田土壤中微生物的种类，从而能够更好的为人类做贡献。通过不同的培养基对土壤中的微生物进行测定，从未得
第26卷第10期 2006年10月生 态 学 报ACT A EC O LOGIC A SI NIC A V ol.26,N o.10Oct.,2006 污染土壤微生物群落结构多样性及 功能多样性测定方法 陈承利,廖 敏3 ,曾路生 (污染环境修复与生态健康教育部重点实验室,浙江大学环境与资源学院,杭州 310029)基金项目:国家重点基础研究发展规划“973”资助项目(2002C B410804);国家自然科学基金资助项目(40201026) 收稿日期:2005206227;修订日期:2006205220 作者简介:陈承利(1982～),男,浙江平阳,硕士,主要从事土壤环境化学与环境生态毒理学研究.E 2mail :clchen1982@1631com 3通讯作者C orresponding author.E -mail :liaom in @https://www.doczj.com/doc/663297126.html, or liaom inzju1@1631com Found ation item :The project was supported by National K ey Basic Research Support F oundation of China (N o.2002C B410804)and National Natural Science F oundation of China (N o.40201026) R eceived d ate :2005206227;Accepted d ate :2006205220 Biography :CHE N Cheng 2Li ,M aster ,mainly engaged in s oil environmental chem istry and ecotoxicology.E 2mail :clchen1982@1631com 摘要:土壤微生物在促进土壤质量和植物健康方面发挥着重要的作用,土壤微生物群落结构和组成的多样性及其变化在一定程度上反映了土壤质量。为了更好地了解土壤健康状况,非常有必要发展有效的方法来研究污染土壤微生物的多样性、分布以及行为等。回顾了近年来国内外污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性的测定方法,包括生物化学技术和分子生物学技术,现将它们的原理、优缺点、实用性及其发展动态作一阐述,同时指出结合这两种技术可为微生物群落分析提供一个更全面的、精确的方法。 关键词:污染土壤;微生物多样性;分子生物学;BI O LOG;P LFA ;PCR ;DNA 文章编号:100020933(2006)1023404209 中图分类号:Q143,Q938,S154 文献标识码:A Methods to measure the microbial community structure and functional diversity in polluted soils CHE N Cheng 2Li ,LI AO Min 3,ZE NG Lu 2Sheng (MOE K ey Laboratory ,Environmental Remediation and Ecosystem H ealth ,College o f Environmental and Resources Sciences ,Zhejiang Univer sity ,Hangzhou ,310029,China ).Acta Ecologica Sinica ,2006,26(10):3404～3412. Abstract :S oil m icroorganisms ,such as bacteria and fungi ,play im portant roles in prom oting soil quality and im proving plant health and nutrition ,thus in fluencing terrestrial ecosystems.Increasing anthropogenic activities ,such as spraw ling urbanization ,agricultural development ,pesticides utilization ,and pollutions from all sources ,can potentially affect soil m icrobial community com position and diversity ,leading to deterioration of soil quality and fertility.H owever ,it is yet to be determ ined how these changes in m icrobial diversity can in fluence surface and ground ecosystems.T o that end ,there is an acute need for reliable and accurate methods to study the community structure and tax onomy of soil m icroorganisms.W ithout the development of effective methods for studying the m icrobial diversity ,distribution ,and behavior in polluted soil ,a thorough understanding of m icrobial diversity ,as well as its im pact on soil health ,cannot be achieved. The determ ination of species diversity depends on several factors including the intensity of each species ,the total number of species present ,species evenness ,and the spatial distribution of species.M ethods to measure m icrobial community structure and functional diversity in polluted soils can be classified into tw o groups ,i.e.,biochem ical 2based techniques and m olecular biological 2based techniques.T ypically ,diversity studies include the relative com parisons of communities across a gradient of stress and disturbance.W ith current techniques ,it is difficult to study true diversity due to lack of know ledge on com position and the techniques to determ ine the accuracy of the extraction or detection methods.T raditionally ,the analysis of soil m icrobial
土壤微生物数量测定 （一）培养基的制备： Ⅰ测定微生物总量培养基： 1. 细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基） 牛肉膏Beefextract 5.0g 蛋白胨Peptone 10.0g NaCI 5.0g 蒸馏水H20 1000m1 PH 7.2~7.4 2.放线菌培养基（高氏1号琼脂培养基） 可溶性淀粉20g KNO 3 1g K 2HPO 4 0.5g MgSO 4? 7H 2 O 0.5g NaCl 0.05g FeSO4? 7H2O 0.01g pH 7.2-7.4 注：配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调pH。 另：倒平板之前，在溶化的培养基中加重铬酸钾溶液，每300mL培养基加3%重铬酸钾1mL(l00ppm)。 3.真菌培养基（马丁（Martin）-孟加拉红琼脂培养基） 葡萄糖 10.0g MgSO 4.7H 2 O O.5g 蛋白胨 5.0g 孟加拉红33.4mg （或者每升加1%溶液3.3mL） K 2HPO 4 1g 蒸馏水H20 1000m1 PH 自然(4~5) 注：⑴灭菌前加卡那霉素20μg/ml，或者倒平板之前加链霉素。 ⑵倒平板之前加乳酸，每100mL培养基加0.lmL。 以上培养基皆加琼脂15g/L。 Ⅱ测定功能菌所用培养基： 1.亚硝酸细菌培养基（改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基A） (NH4)2SO4 2.0g NaH2PO40.25g MnSO4·4H2O 0.01g MgSO4·7H2O 0.03g K2HPO40.75g CaCO3 5.0g 蒸馏水1000ml PH 7.2 注：CaCO3最后加，不需要溶解，直接调PH，培养基中有这个成分是为了缓冲pH。因为硝化细菌的生长会产生酸化效应，使得氢离子过剩，到了一定程度硝化作用将无法继续，所以要碱性物质平衡酸碱。下同。
土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法 The manuscript was revised on the evening of 2021
土壤酶活性及微生物测定 土壤酶活性测定 取样工具及取样方法 在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。土样在自然条件下烘干装入袋中备用。 所需试剂： 酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、硫酸铵[(NH4)2SO4]、甲苯、苯磷酸二钠、、HAc、酚、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、碘化钾、氯化汞、氢氧化钾、、 配置方法： 铵态氮标准溶液：称取0.4717g(精确至0.0001g)干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4]溶于水中，再加水稀释至1000mL，此溶液1mL含100μg N。往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度，制备成的溶液在490nm下比色，并绘制标准曲线。 醋酸缓冲液：，50g，溶于适量水中，加6mol/LHAc34ml，稀释至500ml。 硼酸缓冲液：，80毫升l硼砂（）和l的硼酸混合。 纳氏试剂：将碘化钾10g溶于10ml水中，边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱和水溶液，直至生成的红色沉淀不再溶解为止。加入氢氧化钾30g并溶解之，再加入氯化汞饱和溶液1ml，加水至200ml。静置，取上层清液，贮于棕色瓶中
酚的标准溶液：（1）原液—1克酚溶于蒸馏水中定容至1升，溶液在暗色中稳定，（2）工作液—取50ml原液稀释至1升（1ml含酚）；分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容（分别相当于、、、、、、毫克酚），待颜色稳定后，570nm比色绘制标准曲线。 测定方法 磷酸酶活性测定 一、试验原理 土壤中的磷，很大部分以有机磷化合物的形式存在。磷酸酶能促进有机磷化合物的水解。实验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物质的矿化起着主要作用；土壤的磷酸酶活性，在很大程度上取决于土壤的腐殖质含量，活性磷量，能矿化有机磷化合物的微生物数量，植物类型等因素，土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况。 二、实验仪器 恒温箱、分光光度计、 三、实验药品 甲苯、苯磷酸二钠、酚、醋酸缓冲液、硼酸缓冲液、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、 四、实验步骤 取5克过20目筛的风干土样于50毫升容量瓶中，用(16滴)毫升甲苯处理，15分钟后，加入5毫升苯磷酸二钠溶液（6.75克苯磷酸二钠溶于水，并稀释至1升）和5毫升相应的缓冲液（碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液，中性磷
土壤微生物分离纯化及测数 作者：土壤微生物|分离纯化及测数来源：生物秀时间：2008-5-28 一、实验目的要求 1 了解土壤微生物的分离纯化及测数的基本原理。 2 学习并掌握微生物分离纯化技术方法。 3 学习并掌握微生物平板菌落计数的技术方法。 二、基本原理 土壤是微生物生活的大本营，其中含有大量不同类型的微生物，可按照一定的方法将各类微生物通过分离进行纯培养，并能对特定类群进行数量测定。基本原理是通过稀释使菌体细胞充分分散，单细胞得以生长发育形成菌落，可使用稀释法或平板划线法进一步纯化，还可通过平板菌落计数，推算单位重量土壤样品含有微生物的数量。 三、实验步骤 （一）土壤样品采集 在待测田块上，若田块面积小于50平方米则按对角线三点采样，若田块面积大于50平方米按对角线五点采样。采样一般定点于耕作层0--20cm，先除去表土1--2cm，以无菌铲采土足量充分混匀后用无菌塑料袋分装。 （二）好气性细菌的分离纯化及测数 1.制备土样稀释液 吹吸三次混匀 无菌操作 另留一管不稀释留作对照（CK） 2.培养基的准备
融化牛肉膏蛋白胨培养基，融化后保温在48℃。并取6个无菌培养皿，分别在皿底贴好标签，注明10-5、10-6、CK（每个稀释度要两个平行皿，对照要两个平行皿）。 3.倾注法接种 先按10-6，10-5的顺序将不同稀释度菌悬液接入对应平皿中（每个平皿接入1ml），再向每个平皿倾注约15 ml的牛肉膏蛋白胨培养基（48℃）待冷凝，混合均匀。 4.保温培养 将已经接种的平皿静置10min后，放入温箱倒置培养3--5日（30℃），观察结果。
5.分区划线法纯化 平板划线分离，其划线方法有以下两种：
1. 土壤微生物生物量的测定 (滴定法 一、实验目的和内容 土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5~10μm 3活的微生物总量, 是土壤有机质中最活跃的和最易变化的部分。耕地表层土壤中,土壤微生物量碳(Bc 一般占土壤有机碳总量的 3%左右,其变化可直接或间接地反映土壤耕作制度和微生物肥力的变化,并可以反映土壤污染的程度。近 30年来,国外许多学者对土壤微生物生物量的测定方法进行了比较系统的研究,但由于土壤微生物的多样性和复杂性,还没有发现一种简单、快速、准确、适应性广的方法。目前广泛应用的方法包括:氯仿熏蒸培养法(FI 、氯仿熏蒸浸提法(FE 、基质诱导呼吸法(SIR 、精氨酸诱导氨化法和三磷酸腺苷(A TP 法。 氯仿熏蒸浸提法(FE 的原理是:土壤经氯仿熏蒸处理,微生物被杀死,细胞破裂后, 细胞内容物释放到土壤中,导致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物生物量碳。 二、实验材料和用具 仪器:培养箱;真空干燥器;真空泵;往复式振荡机(速率 200次每 min ; 1L 广口玻璃瓶;定量滤纸;紫外分光光度计; LNK-872型消煮炉(江苏省宜兴市科教仪器研究所试剂: 1. 无乙醇氯仿:市售的氯仿都含有乙醇(作为稳定剂 ,使用前必须除去乙醇。方法为:量取 500ml 氯仿于 1000ml 分液漏斗中,加入 50ml 硫酸溶液[ρ(H2SO 4=5%], 充分摇匀, 弃除下层硫酸溶液, 如此进行 3次。再加入 50ml 去离子水, 同上摇匀, 弃去上部的水分,如此进行 5次。将下层的氯仿转移存放在棕色瓶中,并加入约 20g 无水 K 2CO 3,在冰箱的冷藏室中保存备用。 2. 硫酸钾溶液 [c(K2SO4=0.5mol·L -1]称取硫酸钾(K 2SO 4,化学纯 87.10g ,先溶于
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数： 1．分离菌株的思路 (1)自然界中目的菌株的筛选 ①依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 ②实例：PCR技术过程中用到的耐高温的Taq DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq 细菌中提取出来的。 (2)实验室中目的菌株的筛选 ①原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度.pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。 培养基选择分解尿素的微生物的原理：培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物 ②方法：能合成脲酶的细菌才能分解尿素。配制以尿素为唯一氮源的培养基，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌。 2．统计菌落数目的方法 (1)稀释涂布平板法（间接） ①当样品的稀释庋足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。 ②通过统计平板上的菌落数来推测样品中大约含有的活菌数。 (2)利用显微镜直接计数 3．分解尿素的细菌的鉴定细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素。 4．实验流程 土壤取样→样品的稀释→将稀释液涂布到以尿素为唯一氮源的培养基上→挑选能生长的菌落→鉴定 知识拓展： 1、Taq细菌是耐高温的微生物。 2、培养基对微生物具有选择作用。配置培养基时根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求，加入某些物质或出去某些营养物质，一直其他微生物的生长，也可以根据某些微生物
（生物科技行业）土壤酶活性及土壤微生物计数测定 方法
土壤酶活性及微生物测定 土壤酶活性测定 取样工具及取样方法 在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。土样在自然条件下烘干装入袋中备用。 所需试剂： 酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、硫酸铵[(NH4)2SO4]、甲苯、苯磷酸二钠、NaAc.3H2O、HAc、酚、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、碘化钾、氯化汞、氢氧化钾、、 配置方法： 铵态氮标准溶液：称取0.4717g(精确至0.0001g)干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4]溶于水中，再加水稀释至1000mL，此溶液1mL含100μgN。往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度，制备成的溶液在490nm下比色，并绘制标准曲线。 醋酸缓冲液：PH5.0，NaAc.3H2O50g，溶于适量水中，加6mol/LHAc34ml，稀释至500ml。 硼酸缓冲液：PH9.0，80毫升0.05mol/l硼砂（Na2B4O7.10H2O）和0.2mol/l的硼酸混合。 纳氏试剂：将碘化钾10g溶于10ml水中，边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱和水溶液，直至生成的红色沉淀不再溶解为止。加入氢氧化钾30g并溶解之，再加入氯化汞饱和溶液1ml，加水至200ml。静置，取上层清液，贮于棕色瓶中 酚的标准溶液：（1）原液—1克酚溶于蒸馏水中定容至1升，溶液在暗色中稳定，（2）
工作液—取50ml原液稀释至1升（1ml含0.05mg酚）；分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容（分别相当于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35毫克酚），待颜色稳定后，570nm比色绘制标准曲线。 测定方法 磷酸酶活性测定 一、试验原理 土壤中的磷，很大部分以有机磷化合物的形式存在。磷酸酶能促进有机磷化合物的水解。实验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物质的矿化起着主要作用；土壤的磷酸酶活性，在很大程度上取决于土壤的腐殖质含量，活性磷量，能矿化有机磷化合物的微生物数量，植物类型等因素，土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况。 二、实验仪器 恒温箱、分光光度计、 三、实验药品 甲苯、苯磷酸二钠、酚、醋酸缓冲液、硼酸缓冲液、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、 四、实验步骤 取5克过20目筛的风干土样于50毫升容量瓶中，用0.8(16滴)毫升甲苯处理，15分钟后，加入5毫升苯磷酸二钠溶液（6.75克苯磷酸二钠溶于水，并稀释至1升）和5毫升相应的缓冲液（碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液，中性磷酸酶用pH7.0的柠檬酸缓冲液，酸性磷酸酶用pH5.0的醋酸缓冲液）。仔细混合后，将反应物置于37摄氏度恒温箱中培养12小时，然后用蒸馏水定容至刻度，摇匀过滤，用5毫升水代替基质以设置对照。为了测定反应混合物中的酚量，取1毫升滤液于100毫升容量瓶中，加5毫升硼酸缓冲液（pH9.0），再加入3毫升2.5%的铁氰化钾和3毫升0.5%的4-氨基安替吡啉，摇动，溶液呈粉红色，