1.2 脂肪酶的研究与应用
1.2.1 脂肪酶的研究概况
脂肪酶可以根据其来源分类，分为微生物脂肪酶、动物脂肪酶和植物脂肪酶。脂肪酶可以很容易地从微生物真菌（如南极洲假丝酵母）或细菌（如荧光假单胞菌）中通过发酵过程高产量地生产出来，其过程缺乏基本的净化步骤。一些脂肪酶表现出对底物的位置专一性，而另一些则不然。对不同来源的游离脂肪酶类型的比较研究表明，荧光P.脂肪酶具有最高的酶活性。通常，来自真菌来源的脂肪酶比来自细菌来源的脂肪酶表现出更好的甘油三酯酯交换活性。
作为一种多功能生物催化剂，脂肪酶具有其他酶蛋白无法比拟的优点[15]：1、在有机溶剂中具有良好的稳定性；2、催化过程不需要辅助因子，一般不发生副反应；3、可以催化水解，酯化，酯交换等众多反应[16]；4、具有独特的化学选择性、区域选择性及立体选择性；5、底物谱广，可催化非天然底物进行反应。与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶生产周期短，分离纯化相对简单，并可利用基因工程和蛋白质工程等技术实现酶的改造并构建生产工程菌[17]，适合工业化生产与应用。1994年，丹麦Novozymes公司首次应用基因工程菌生产来源于Thermomyces lanuginosus的脂肪酶Lipolase，此后许多来源于微生物的脂肪酶也实现了商业化生产[18]。脂肪酶的应用领域日益扩大，被广泛运用于生物柴油、食品加工、面粉改良、造纸造酒、有机合成等化工领域[19]。
1.2.2 脂肪酶的结构及催化机制
脂肪酶是一类重要的水解酶，催化三酰甘油酯中酯键的裂解，具有广泛的生物技术应用价值。脂肪酶是在人体内正确分配和利用油脂所必需的酶。脂蛋白脂肪酶(LPL)在毛细血管中很活跃，它通过水解包装脂蛋白中的甘油三酯，在防止血脂异常方面起着至关重要的作用。30年前，有人提出了一种不活泼的LPL低聚物的存在。M., Tushar Ranjan (2020)指出天然油中高浓度的omega - 3脂肪酸(?-3 FAs)对于维持身体健康非常重要。脂肪酶是一种很有前途的富集催化剂，但脂肪酶的脂肪酸特异性较差。
在脂肪酶催化酯键水解的过程中，活性酶的构象和四面体跃迁态的稳定都是至关重要的。利用蛋白酶定点突变实验的x射线结构数据和结果已被用作预测可
能在脂肪酶中起关键作用的氨基酸残基的基础。克隆了根霉脂肪酶基因，并在大肠杆菌中表达。该基因的定点突变被用来测试计算机辅助预测特定氨基酸在该酶中的功能作用的有效性。通过对米根霉脂肪酶变异体的动力学常数的检测，我们可以识别出直接参与催化反应或稳定酶活性几何结构的氨基酸残基。这些结果与分子力学模拟相结合，基于同源衍生的结构模型，提供了关于结构-功能关系的新信息。对数据的解释与其他水解酶(如蛋白酶)的结果一致。
1.3 固定化酶
1.3.1 固定化酶的意义
固定化酶是相对于游离酶而言，是指将能自由移动的游离酶限定不能自由活动的过程，常被用于修饰生物酶。固定化酶的主要作用是提高酶的产酶率和操作稳定性，同时促进酶的再利用。因此，作为生化催化剂，固定化酶相比游离酶有着先天的优势，其反应过程更简单、更容易操作、可多次使用、成本相对低廉、催化速度更快、不易污染、更易于从反应混合物中分离而不污染产物等。
1.3.2 固定化酶的制备方法
酶固定化方法大体上可以分为物理法和化学法，其中物理法包括吸附法、包埋法；其余比如交联法、结合法、离子法属于化学方法。
1.3.
2.1 物理方法
（1）吸附法
吸附法一般指的是包括离子吸附在内的物理吸附。物理吸附指将酶附着于载体上，它不改变酶的结构，酶的活性几乎不受影响，酶的活性保持较好。但也有缺点，就是酶与其载体连接性不够好，容易分离，而且吸附后产生酶的活性不够高。
离子吸附属于特殊的物理吸附，其载体是特殊的水不溶性载体，和普通的物理吸附一样，活性几乎不受影响和弱化，产生的固定化酶活性，相比普通的物理吸附更高。
（2）包埋法
包埋法也是一种物理法，其不改变酶的分子结构，就是将酶包埋在孔状载体中使其固定化的过程。包埋系统条件要求较低，包埋法适用范围较广，不发生化学反应，酶的活性和稳定性保持较好。包埋法常用于污水处理，如果要用于食品、药品生产催化，对包埋材料的无毒无害性有严格要求。
1.3.
2.1 化学方法
（1）交联法
交联法是一种化学固定化酶的方法，采用交联试剂将酶内部分子、酶分子与载体分子、酶分子与惰性蛋白分子发生化学反应，形成共价键。该方法可以使包括酶在内的交联物分子结构变得更复杂，提升酶的活性和稳定性。但由于交联剂价格一般很昂贵、采用此方法成本太高，所以一般不单独使用，常结合其他方法，比如吸附或包埋法，既固化酶，又提高酶的活力。
（2）结合法
结合法无论是采用离子键还是共价键进行结合，都改变分子结构，属于化学方法。离子键结合法顾名思义采用的载体是离子交换剂，该方法操作简易、酶的活性保持较好，但是酶与载体结合不紧密，当外部环境发生变化时，容易发生分离。共价键结合法相比离子键结合法，恰好相反，操作复杂、对载体要求较高，但酶与载体结合紧密，酶不易与载体分离，使用时间相比离子键结合法能长很多。
1.3.3 新型固定化酶技术
开发新一代固定化酶，应充分利用快速发展的遗传技术、有机化学、计算化学和生物信息学、反应器和反应设计等科学技术。为了提高酶的产量，无论是独立的或作为催化级联过程，工业生物催化剂必须考虑酶的多种生物转化，从而提高成本效益。
新型固定化酶的大规模生产进展缓慢，这与它们较高的成本和储存问题有关。科学家和工业生产者需要加强合作，促使固定化酶的新矩阵和交叉连接物就可以更好地适应不同的化学过程。因此，深入了解如何实现高功能酶固定化方案非常有必要。在合适的底物支持下，需考虑到交叉连接和预先的应用等固定化生物催化剂。为了实现工业水平的绿色酶过程，需要为研究稳定酶的可用性以及酶的固定-稳定和再活化开发出有效的策略[29-31]。
1.3.3.1基于新型固定化载体的固定化酶技术
（1）金属有机框架固定化酶
金属有机框架（Metal-Organic Frameworks, MOF）是一种新型的固定化酶的材料[32]。该材料由于其多孔隙、比表面积相对较大、孔径可收放、金属位点开放等特征，近年来被广泛用于固定化酶，具体技术可分为物理吸附、化学连接和牢笼包埋[33]。
传统的固定化酶系统由于缺乏对酶的定位、底物和产物的扩散、酶和辅酶的可及性等方面的最优空间控制，难以实现高效的无细胞酶系统。Li（2018）提出一个策略来扩大以锌为本底的金属有机框架（mof）（称为NU-100 x, x = 3, 4, 5, 6, 7）的孔隙孔径（从3.3到6.7海里）。通过维护扭转角度的精确控制与连接器，来实现与不同孔径的孔隙进行关联。为了验证，使用扩展的NU-100x MOF结构来封装乳酸脱氢酶（LDH），并演示在无细胞生物合成催化系统中使用捕获的蛋白质。值得注意的是，固定化于MOF大孔中的LDH可被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶（NAD和NADH）利用，允许原位辅酶再生，使LDH的活性高于游离酶。
（2）新型纳米材料载体固定化酶
随着纳米科学和技术的迅速突破，且纳米材料由于其拥有极大的比表面积和良好的载荷性，常被用来固定化酶。
尽管作为蛋白质分析的黄金标准，经典的酶联免疫吸附试验(ELISA)目前受到越来越多的敏感性和简洁性需求的挑战。针对当前的需求，纳米材料的最新进展为提高酶联免疫吸附试验的性能和扩大其适用性提供了许多有希望的工具。介绍了纳米材料支持的策略，在不显著改变传统ELISA格式的情况下，显著提高了分析性能。将特别关注纳米材料作为酶联免疫吸附试验中新型读出系统的功能作用，包括作为基质替代品、酶替代品和非酶信号放大器的作用。
纳米粒子已广泛应用于多种酶的固定化。然而，酶在NPs上的稳定是一个主要的挑战，对调节酶的活性及其在医学上的应用至关重要。为了克服这些挑战，有必要探索酶是如何附着在纳米材料上的，以及酶的性质如何受到这些相互作用的影响。Sharifi M.（2020）指出固定化酶进入NPs的不同策略及其相应的抗温度和ph的稳定性，总结了表面电荷、颗粒大小、形态和聚集等因素对固定化酶稳定性的影响。综述了固定化酶在NPs中的活性，揭示了生物分子与NPs相互作用的更多细节。
c. 磁性材料载体固定化酶
磁性材料利用其特有的磁性，改变分子粒子运动轨迹，从而实现固定化酶的目的。胰凝乳蛋白酶已被固定在几种非多孔磁性材料上。镍颗粒被认为是最合适的磁性固定化酶载体。固定化在无孔磁性载体上的胰凝乳蛋白酶未被全脂牛奶或澄清酵母匀浆严重污染。这两种物质都迅速污染了AE -纤维素-胰凝乳蛋白酶，而固定化到丙烯酸基离子交换器中的胰凝乳蛋白酶则缓慢地被污染。无孔岩石磁性颗粒的固定化酶活性与颗粒直径成反比。采用吸附固定和戊二醛交联的方法在颗粒上制备适量的胰凝乳蛋白酶。酯水解活性随酶负荷的增加而增加，而酪蛋白水解活性不增加。胰凝乳蛋白酶被来自磁性载体的金属离子抑制。它的部分保护是使用一个初步的蛋白质涂层，并可能被重新激活与EDTA或BSA孵化[40]。
Lei等[41]制备了含有羧基的磁性纳米微球，经氯化亚砜活化，使木瓜蛋白酶与载体的氯酰基团结合。固定化的木瓜蛋白酶相比于游离酶稳定性提高，并可重复使用。Alpay等[42]利用乳液聚合技术合成了磁性纳米颗粒，使用活性蓝(F3GA)对纳米颗粒进行改性，发现在pH为7.0时对木瓜蛋白酶达到最大吸附量，得到的固定化酶表现出良好的pH和温度稳定性。Cao等[43]使用涂有金纳米层的Fe3O4固定木瓜蛋白酶，Fe3O4纳米磁性颗粒系统与游离酶相比具有更高的催化活性和酶解效率，制备的Fe3O4作为固定化酶的载体性能优于常规的固定化载体，并且使用硼氢化钠可以除去该系统表面的失活酶，从而恢复固定酶的活力。Jiang等[44]制备了磁性壳聚糖微球，并通过吸附和交联两种作用相结合对漆酶进行了固定，固定后漆酶的热稳定性和贮存稳定性大大提高。
1.4 核苷类化合物及核苷酯类衍生物
1.4.1 概述
核苷类化合物是一种非常重要的多羟基化合物，在临床医药[45]和功能性高分子材料等领域具有重要的应用价值。核苷类药物是临床上用于抗癌以及治疗病毒类疾病的主要药物，在抗病毒的药物中，核苷类化合物占半数以上，一直都受到广泛关注。6-巯基嘌呤和6-巯基鸟嘌呤是最早应用于抗肿瘤治疗的嘌呤核苷类似物；脱氧核苷类药物，Fludarabine主要应用于慢性淋巴细胞白血病的治疗，Cladribine主要应用于非霍金淋巴瘤的治疗；阿糖胞苷是用于治疗急性骨髓性白血病的脱氧胞嘧啶核苷类似物；氟嘧啶尿苷中的2'-脱氧-5-氟尿嘧啶核苷（Floxuridine, FUdR）对胰腺癌、胸腺癌、结肠癌都有很好的治疗效果，5'-脱氧
-5-氟尿嘧啶核苷（Dloxuridine, DFUR）是用于治疗胃癌、结肠癌、鼻咽癌、宫颈癌、乳腺癌的药物。
然而在临床应用中，核苷类药物也存在着自己的缺陷和不足，比如毒副作用大、口服生物利用率低等问题，因此对核苷类化合物进行结构修饰是核苷类药物研究的一个重要方向。众多研究表明，核苷酯类衍生物具有比原药更高的抗病毒和抗肿瘤活性，抗癌和抗病毒谱更广，同时口服生物利用度也得到了一定的改善，并延长了作用时间。例如泛昔洛韦是阿昔洛韦L-缬氨酰酯，经过结构修饰后改善了阿昔洛韦在口服给药时吸收不良的缺点，用药后能够在肠道内更好低吸收，通过酶的水解后可以完全转变为无环鸟苷，增加了无环鸟苷的生物利用度[49]。泰诺福韦的氨基酸酰胺衍生物的抗HIV活性和抗病毒活性都较原药明显提高。
1.4.2 核苷类化合物的结构修饰
由于核苷类化合物的结构通常含有多个官能团，在核苷及其类似物的合成制备当中，对特定的结构进行保护是能避免副反应发生的有效途径。然而核苷的糖基上羟基众多，利用化学法直接酰化会有反应选择性差，目的产物产率低且分离困难等问题，且对环境不友好。
Wang C（2010）研究表明，与主要的平衡核苷转运蛋白不同，集中核苷转运蛋白(CNTs)缺乏有效的特异性抑制剂。该研究新建立的稳定表达hCNT1或hCNT2的PK15NTD转染细胞中，并在之前建立的PK15NTD/hCNT3细胞中，苯并吡喃酮衍生物及其相关化合物与人类(h) CNTs的相互作用。黄酮类化合物对hCNT2和hCNT3的抑制活性最高，而对hCNT1的选择性最强的抑制剂是香豆素衍生物。hCNT3是对查耳酮类药物表现出中等敏感性的唯一转运蛋白。最有效的化合物是6-羟基-7-甲氧基黄酮，它是hcnt3特异性的，IC(50)为0.57+/-0.20 microM，比标准的CNT抑制剂phloridzin (IC(50)为25+/-3.5 microM)强40倍以上。SAR(构效关系)表明，在黄酮和异黄酮的7位和8位都存在羟基取代基，因此对所有3个hCNTs都具有很高的效力。CoMFA(比较分子场分析)和CoMSIA(比较分子相似性指数分析)3 d-qsar(三维定量结构活性关系)建模表明，静电和疏水性能最具影响力之间的交互类黄酮和hCNT1，而静电、疏水性和氢键供体属性是交互与hCNT2 hCNT3占主导地位。3D-QSAR结果还提示类黄酮和核苷的氢键相互作用可能存在共性，提示这两类化合物的hcnt结合位点存在相似性。我们报道了迄今为止最有效和选择性的非核苷类CNT抑制剂;可以作为研究工具和
/或进一步开发抑制剂的先导物。
可见酶法酰化是进行基团保护、获取更高药效的核苷类化合物的一种有效方法。
1.5 非水介质中的酶催化
1.5.1 非水相酶催化的特点
从土壤中分离出一种产脂肪酶的有效细菌，鉴定为假单胞菌，合成了脂肪酶。通过紫外(UV)和亚硝基胍(NTG)处理，获得了脂肪酶产量提高3.25倍的突变体。发酵条件优化为脂肪酶产率为87.5 U/ml。在pH为9.0和45℃时，脂肪酶活性最高，pH为7.0 ~ 11.0，pH为60℃时，脂肪酶活性稳定，金属离子、表面活性剂和胆盐对脂肪酶活性的影响也进行了研究。脂肪酶是1,3特异性的。在有机溶剂中，脂肪酶的热稳定性显著提高，最佳温度也略有升高。最佳水活度介于0.5和0.6之间。脂肪酶成功应用于有机相催化棕榈油甘油酯水解生产单甘酯(MG)，并对映选择性酯化(R,S)-2-辛醇。脂酶的对映体选择性可通过两亲作用得到显著提高[54, 55]。
枯草素和胰凝乳蛋白酶在各种干燥的有机溶剂中起着催化剂的作用。有机溶剂中酶的转酯化反应遵循Michaelis-Menten动力学，V/Km值与溶剂的疏水性基本相关。胰凝乳蛋白酶和枯草素在有机溶剂中催化所需的水比在其表面形成单分子层所需的水要少得多。胰凝乳蛋白酶在各种有机溶剂中催化活性的巨大差异，部分是由于更亲水的溶剂从酶中去除必需的水，部分是由于溶剂直接影响酶的过程[56-58]。在辛烷的酯交换反应中，胰凝乳蛋白酶和枯草素的速率提高约为1000亿倍;通过位点特异性试剂对酶活性中心进行共价修饰，使酶在有机溶剂中失去催化活性。当辛烷作为反应介质取代水时，胰凝乳蛋白酶对竞争性抑制剂的专一性发生逆转。与水相比，胰凝乳蛋白酶在非水溶剂中的热稳定性和贮存稳定性均有显著提高。有机溶剂中的酶催化现象似乎是由于有机溶剂中蛋白质的结构刚性导致的高动力学障碍，阻止了天然构象的展开[59, 60]。
1.5.2 非水相酶催化的反应体系
用于酶催化的非水介质包括纯有机溶剂体系（Neat organic solvents）、无溶剂体系（Solvent free system）、水-有机溶剂两相体系（Biphasicaqueous-organic
solution）、水不互溶有机溶剂体系（monophasicorganic solution）、反相胶束体系（Reverse micelles）、水互溶有机溶剂体系（Monophasic aqueous-organic solution）超临界流体（Supercritical fluids）、气体（Gases）等，近年来一些新颖的反应介质例如离子液体（Ionic liquids，ILs）等也相继出现，其中离子液体凭借其“绿色”、稳定性高等特点日益受到人们的青睐。
1.5.3 有机溶剂对非水相酶催化的影响
影响不同的甘油、N、N-二甲基甲酰胺(DMF)和水混合封装在1,4-bis-2-乙基己基磺基琥珀酸(AOT) /正庚烷反向胶束(RMs) 2-萘基乙酸酯的酶法水解α-胰凝乳蛋白酶。在与DMF和质子溶剂混合的情况下，使用吸收、发射和动态光散射技术，已经表明溶剂在RMs的极性核心内被分离。质子溶剂固定在AOT上，而DMF固定在聚合体的极核上。因此，DMF不仅有助于水溶性疏水性底物，增加其有效浓度，但令人惊讶的是，它不影响酶的活性。为了获得可靠的结论，必须保证均方根的存在、极性溶剂的包封以及通过底物分区进行校正。此外，为了约束环境对均质介质中溶剂-溶剂相互作用的影响及其对RMs用作纳米反应器的影响。
采用分光光度法测定了甘油(GY)-水(38% v/v)混合物/双(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠(AOT)/正庚烷形成的反胶束溶液中2-萘乙酸(2-NA)在α-胰凝乳蛋白酶(α- ct)催化下的水解动力学。为了比较该反应与在以水为核心的胶束以及相应的均相介质中观察到的反应效率，研究了该反应在水/AOT/正庚烷反胶束溶液中以及在两种均相介质(水和基-水，38% v/v混合物)中的反应。在每种介质中，alpha-CT 均通过其色氨酸残基的吸收光谱、发射光谱、荧光寿命和荧光各向异性进行表征。确定了内极性溶剂与表面活性剂摩尔比一定时，AOT浓度对胶束体系动力学参数的影响。此外，所获得的数据可用于评价有机和胶束假相之间的2-NA分配常数。结果表明，在胶束内部加入GY可提高- ct的催化性能。不同介质的荧光各向异性研究表明，与水体系相比，GY的加入增加了体系的粘度。结果表明，反向胶束聚集物中GY的加入降低了α- ct的构象迁移率，提高了酶的稳定性和活性。
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第三章酶的应用技术实践 3.2制备和应用固定化酶 探究目的： 1说出固定化酶和固定化细胞的作用和原理 2、尝试制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。探究预习： 固定化酶技术的发展也促进了固定化细胞技术的发展。20世纪70年代后期出现了固定化细胞 技术。通过各种方法将细胞与一定的载体结合，使细胞仍保持原有的生物活性，这一过程称为细胞固定化。固定化细胞仍能进行正常的生长、繁殖和代谢，由于保留了细胞内原有的多酶系统，这对多步催化的连续反应优势就更加明显。细胞固定化的方法也有多种，主要是吸附法和包埋法两大类。 吸附法是制备固定化动物细胞的主要方法。动物细胞大多数具有附着特性，能够很好地附着在容器壁、微载体和中空纤维等载体上。吸附法制备固定化植物细胞，是将植物细胞吸附在泡沫塑料的大孔隙或裂缝之中，也可将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。 包埋法是指将细胞包埋在多孔载体的内部而制成固定化细胞的方法。凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶等。 海藻酸钠凝胶包埋法制备固定化细胞的操作简便，条件温和，对细胞无毒性。通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化。用海藻酸钠凝胶制备的固定化细胞已用于多种酶的发酵生产与研究。 固定化细胞技术可以取代游离的细胞进行发酵，生产各种物质。 材料用具：干酵母，聚乙烯醇，海藻酸钠，无水CaC2，蒸馏水，烧杯，玻璃棒，酒精灯，三 角架，石棉网，注射器等。 探究过程： 探究反思： 固定化酵母菌技术有哪些优点? 探究示例： 请参照细胞固定化技术的相关基础知识，完成下列问题。 （1）细胞固定化技术一般采用包埋法固定化，采用该方法的原因是 （2）包埋法固定化是指___________________________________ 。 （3）_____________________________________________________________________ 包埋法固定化细胞常用的载体有 ________________________________________________________________ _______________________ 。（答出三种即可） （4）与固定化酶技术相比，固定化细胞技术的优点是 （5）制备固定化酵母细胞的步骤为: 【解析】（1）固定化细胞的方法有包埋法、化学结合法和物理吸附法，一般来说多采用包埋法固定化，因为个大的细胞难以被吸附或结合，且不易从包埋材料中漏出。 （2）（3）包埋法固定化即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠等。 （4）与固定化酶技术相比，固定化细胞技术的成本更低?操作更容易。 （5）制备固定化酵母细胞的程序为：酵母细胞的活化T配制CaC2溶液T配制海藻酸钠溶液T海藻酸钠溶液与酵母细胞混合T固定化酵母细胞。 【答案】（1 ）细胞个大，不易从包埋材料中漏出；（2）将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多 孔性载体中；（3）明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺等；（4）成本更低，操作更容易；（5）①酵母细胞的活化②配制CaC2溶液③配制海藻酸钠溶液④海藻酸钠溶液与酵 母细胞混合⑤酵母细胞的固定化。 【矫正反馈】 1?固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，其中适合细胞固定的方法是（） A.包埋法 B.物理吸附法 C.化学结合法 D.高温冷却法 2.与固定化酶相比，固定化细胞制备的特点是（） A.成本高，但操作更容易 B.成本低，但操作更复杂 C.成本高，且操作更复杂 D.成本低，且操作更容易 3.固定化细胞技术在废水处理中有着重要作用，用于处理含氮、氨丰富的废水的固定化微生物通常是（） ①酵母菌②青霉菌③硝化菌④反硝化菌 ①③D.②④ 让酵母细胞在缺水状态下休眠 让处于休眠状态的酵母细胞重新恢复正常的生活状态 5.下面为制备固定化酵母细胞的步骤，其正确的操作程序是 （） ①海藻酸钠溶液与酵母细胞混合②配制海藻 酸钠溶液③酵母细胞的活化 ⑤配制物质的量浓度为0.05 mol/L的CaC2溶液 A.①②③④⑤ B.③①②⑤④ C.③⑤②①④ 6 .试分析下图中，哪一种与用海藻酸钠作载体制备的固定化酵母细胞相似（ 7 .下列有关固定化酵母细胞制备步骤叙述，不恰当的是（） A.应使干酵母与水混合并搅拌，以利于酵母菌活化 B.配制海藻酸钠溶液时要用小火间断加热的方法 C.向刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母细胞，充分搅拌并混合均匀 D.将与酵母混匀的海藻酸钠溶液注入CaC2溶液中，会观察到CaC2溶液中有球形的凝胶珠形成 8.用固定化酵母细胞发酵葡萄糖溶液时，为了能产生酒精，下列措施错误的是（） A.向瓶内泵入氧气 B.应将装置放于适宜的条件下进行 C.瓶内应富含葡萄糖等底物 D.将瓶口密封，效果更好 探究步骤探究记录结论或解释1.实验准备准备各种实验药品和器具。 2?制备麦芽汁称取一定质量的干麦芽粉，加入其质量4倍的水，在58~65C下 糖化3-4 h。每隔一定的时间用碘液测定，如果仍显蓝色，说明糖化还不完全，继续糖化直至不显色为止，得到麦芽汁。煮沸、冷却麦芽汁后用纱布过滤，再调节pH至6.0，在121 C下灭菌15min，制成无菌麦牙汁。 3.活化酵母菌细胞称取1g干酵母放入50 mL的小烧杯中，加入蒸馏水10 mL。用玻璃棒搅拌酵母菌液，使其活化1h左右。 4.制备固定化细胞称取4g聚乙烯醇（PVA）和0.2 g海藻酸钠，加入无菌水40 mL，适当加热至完全溶化，将溶液冷却至45 C，加入预热至35C的 酵母菌培养液，混合均匀形成酵母菌谒藻酸钠胶液；将酵母菌- 海澡酸钠胶液倒入带有孔径为 2 mm喷嘴的小塑料瓶或吸入注 射针筒中；以恒定的速度滴入预先盛有50 mL饱和硼酸-氯化钙 溶液的烧杯中，采用磁力搅拌器或手摇的方法使溶液不停地旋转；酵母菌-海藻酸钠胶液在溶液中逐渐形成凝胶珠。待凝胶珠在溶液中浸泡30 min后，取出用无菌水洗涤3次备用。 5.发酵麦芽汁将固定化酵母菌细胞凝胶珠加入300 mL无菌麦芽汁中，置于 25C下发酵7~9 d。待发酵结束后品尝其味道。A.①② B.③④ C. 4 .酵母细胞的活化是指（） A.让酵母细胞恢复运动状态 B. C.让酵母细胞内酶活性加倍 D. ④固定化酵母细胞 D.③②⑤①④ ）
酶固定化技术及其应用 摘要： 酶因其优良的催化性能而被广泛应用，但游离酶应用过程中有许多缺点，固定 化酶技术因此而产生，并且迅速发展。本文主要介绍传统的固定化酶技术、新 型固定化酶技术、新型载体材料及固定化酶技术的应用。 关键词：酶固定化；载体；应用 The enzyme is widely applied because of its fine catalyzed performance, but in the dissociation enzyme application process has many shortcomings, the fossilization enzyme technology therefore produces, and develops rapidly. This article main introduction traditional fossilization enzyme technology, new fossilization enzyme technology, new carrier material and fossilization enzyme technology application. 一、前言 酶的本质是一类具有催化功能的蛋白质，与化学催化剂相比具有反应速度快、反应条件温和、底物专一性强,可在水溶液和中性pH 下操作等优点。但其 高级结构对环境十分敏感，物理因素、化学因素和生物因素均可使没丧失活力。 而且，随着反应过程的进行，反应速率会下降。此外，游离酶在反应液中和产 物在一起，反应后酶不能回收重复利用，也使得产物的分离纯化更为复杂。以 上的这些因素使得酶在工业中的应用受到了极大的限制，找到解决这些问题得 方法十分迫切。 可喜的是，经过专家学者的不断努力，发现将酶用特殊的载体固定，酶仍能与底物有效的进行反应。这中酶的出现，使得酶与产物在反应液中相互分离，具有可回收、重复利用等优点，从而使生产工艺可以实现连续化、自动化。 酶的固定化是指将酶限制或固定在某一局部空间或特定的固体载体上进行其特有的催化反应，并可回收及重复利用的技术，在催化反应中以固相状态作 用于底物。近年来，固定化酶的研究得到了人们极大的关注，并取得了许多重 要成果。下面以酶的固定化方法为核心,介绍一些有关酶固定化技术的应用及研 究新进展。 二、传统酶固定化技术
浅谈酶工程及其在食品领域中的应用 摘要：酶工程是现代生物技术的重要组成部分。酶作为生物催化剂,具有高催化效率,专一性强,反应条件温和及酶活性可以调控。本文介绍了酶工程和酶在食品领域中的应用，并对酶工程技术研究应用前景做了整体展望。 关键词：酶工程，固定化，食品 1.酶和酶工程 1.1简述酶和酶工程 酶是由生物体产生的具有催化活性的蛋白质.它能特定地促成某个化学反应而本身却不参加反应,且具有反应率高、反应条件温和、反应产物污染小、能耗低、反应容易控制等特点.这些特点比传统的化学反应具有较大的优越性.【1】酶工程技术是现代五大生物工程技术之一，是利用酶或者微生物细胞、动植物细胞、细胞器等所具有的某些功能，借助于工程学手段来提供产品或服务于社会的一门科学技术。酶工程技术的应用范围很广，主要包括酶的分离和提取、各类酶的开发和生产、固定化技术的研发、酶反应器的研制等几个方面【2】 1.2酶的来源、提取、分离和纯化 酶的来源主要有植物、动物和微生物。最早人们多从植物、动物组织中提取,例如从动物胰脏和麦芽中提取淀粉酶、从动物胃膜,胰脏、木瓜、菠萝中提取蛋白酶。酶是蛋白质，因此一切蛋白质的分离原则都应该遵行。酶作为特殊的蛋白质，最重要的原则是纯化过程中一定要保持其活性。酶的分离纯化化学方法一般很据酶的分子量、等电点、疏水性等生化性质，选择相应的沉淀、盐析、层析方法。 1.3酶的生产 微生物种类多,几乎所有酶都能从微生物中找到,而且它的生产不受季节、气候限制;由于微生物容易培养,繁殖快,产量高,故酶大多有微生物生产。近年来,随着基因工程技术的迅速发展,又为酶产量的提高和新酶种的开发开辟了新的途径。例如利用改良的过氧化物酶能够在高温和酸性条件下脱甲基和烷基,生产一些食品特有的香气因子。此外,运用基因工程技术,提高葡萄搞异构酶,纤维素酶,糖化酶等酶活力的研究也取得了一定的成绩。【4】基因工程的克隆流程包括:目的基因的获得、将目的基因克隆到合适的质粒载体;、将重组质粒转染细胞和表达产物的检测。其中，目的基因的获得主要有三条途径:以含有目的的基因的生物DNA 中获得、以DNA作为目的基因和用化学方法合成目的基因。在宿主体系的选择方面，目前在食品级酶的生产中,原核生物一般选用枯草杆菌、地衣芽抱杆菌、乳酶链球菌、嗜热链球菌等。真核生物一般以酵母和哺乳动物细胞作宿主细胞。【16】 1.4 固定化酶 1.4.1固定化酶简介 酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，进行特有的催化反应，并可回收及重复利用的技术。酶的化学本质是蛋白质，其最大弱点是不稳定性，对酸、碱、热及有机溶液容易发生酶蛋白的变性作用，从而降低或失去活性。而且酶往往在溶液中进行反应，反应以后会残留在溶液系统中不易回收，造成最终产品生化分离提纯操作上的麻烦。加之酶反应只能分批进行，难于连续化、自动化操作。这大大地阻碍了酶工程的发展应用为克服上述缺点，要将游离酶固定化后进行应用。固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶，用人工方法固定在载体上。由于固定化酶的运动被化学或物理的方法限制了，能将其从反应介质中回收，所以它原则上能在批量操作或连续操作中重复使用酶。固定化酶技术是酶工程的核心，它使酶工程提高到一个新水平。【6】 1. 4.2吸附法 吸附法是通过非特异性物理吸附法或生物物质的特异吸附作用将酶吸附在炭、有机聚合物、玻璃、无机盐、金属氧化物或硅胶等材料上。该方法又分为物理吸附法和离子吸附法。
黑曲乳糖酶的固定化 方法：吸附交联法 载体：以阳离子交换树脂D151 交联剂：戊二醛 与游离酶性质相比： 最适作用温度：降低 热稳定性：降低。 最适pH值：乳糖酶经固定化处理后,其最适pH值较游离酶稍向碱性方向移动 酸碱稳定性：固定化酶酸碱稳定pH值范围在2.5 ～ 4.5;而游离酶酸碱 稳定pH值范围在5.0 ～7.0。 总之，应用吸附交联法制得的固定化乳糖酶, 较游离酶在牛奶的天然pH值下使用 更为适宜, 且操作稳定性好。 脂环酸芽孢杆菌α-葡萄糖苷酶固定化 方法：物理交联法 载体：壳聚糖 交联剂：戊二醛 最适pH：固定化α-葡萄糖苷酶的最适pH 4.5，与游离酶的pH 5.2 相比，其最适pH 值向酸性方向偏移，具有更强的耐酸性，但对碱的耐受性有所降低。 最适温度：固定化酶的最适温度较游离酶有所提高，从游离酶的52 ℃提高到固定化酶的55 ℃，说明固定化后α-葡萄糖苷酶的热稳定性有所提高。 酸碱稳定性：游离酶的耐碱性较固定化酶弱，而pH 大于9.5 时固定化酶活性降低，小于游离酶。 热稳定性：经固定化处理的α-葡萄糖苷酶的热稳定性有了极大的提高。当温度65 ℃时，固定化酶保持近100%酶活力，而游离酶完全失去活性。 总之，相对于游离酶，经壳聚糖固定化后酶的活性中心构象更稳固，削弱了不利因素对酶活性的影响，增加了固定化α-葡萄糖苷酶的稳定性，有利于工业化应用。 漆酶固定化 方法：物理吸附法 载体：纳米多孔金 最适pH：固定化后漆酶具有与游离酶相似的活力-pH 轮廓图, 最佳反应pH 都是 4.5。与游离酶相比固定化不但使漆酶可稳定的pH 范围变宽了(pH 3.5～6.0), 也明显提高了漆酶的耐酸耐碱性 最适温度：固定化酶的最佳反应温度为60 ℃, 较游离酶的40 ℃上升了20 ℃ 热稳定性：固定化后漆酶的热稳定性明显提高 重复利用性：固定化酶具有很好的重复利用性 总之，相对于游离态, 固定化漆酶的最适pH 没有改变, 但最适温度却从游离态的40 ℃上
选修一：考点4：制备和应用酶的固定化技术 【学习目标】 1．说出固定化酶概念和方法(A) 2．制备固定化酵母细胞(B) 【知识梳理】 （一）课题背景 酶：优点：催化效率高，低耗能、低污染，大规模地应用于食品、化工等各个领域。 实际问题：对环境条件敏感，易失活；溶液中的酶很难回收，不能再次利用，提高了生产成本；反应后的酶会混合在产物中，如不除去，会影响产品质量。 设想：能否有一种方法使酶发挥它的优点，而没有这些缺点？ 固定化酶：优点：容易与水溶性反应物和生成物分离，可被反复使用 实际问题：一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都 是通过一系列的酶促反应才能得到的 设想：细胞中有多种酶，能否用固定化酶类似的技术来处理细胞？ 固定化细胞：优点：成本低，操作更容易 （二）、固定化酶的应用实例 高果糖浆是指果糖含量为42%的糖浆能将葡萄糖转化为果糖的酶是葡萄糖异构酶。使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板的小孔，而反应溶液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。 （三）、固定化细胞技术 固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。一般来说，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定，而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞个大，而酶分子很小；个大的难以被化学结合或吸附，而个小的酶容易从包埋料中漏出。 包埋法固定化细胞即将微生物细胞均匀包埋在不溶于水的多孔性载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。 〖思考1〗对固定酶的作用影响较小的固定方法是什么？吸附法 〖思考2〗将谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的发酵过程变为连续的酶反应，应当固定（细胞）；若将蛋白质变成氨基酸，应当固定（酶）。 （四）、实验操作 (1)制备固定化酵母细胞 制备固定化酵母细胞需要的材料是干酵母、CaCl2和海藻酸钠溶液 1.酵母菌的活化 活化就是处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。 2.配制物质的量尝试为0.05mol/L的Cacl2溶液 3.配制海藻酸钠溶液 加热溶化海藻酸钠时要注意：微火加热并不断搅拌，防止海藻酸钠焦糊 4.海藻酸钠溶液与酵母菌细胞混合
浅谈固定化酶 固定化酶（immobilized enzyme)是20世纪60年代发展起来的一种新技术。所谓固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。通常酶催化反应都是在水溶液中进行的，而固定化酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，仍具有酶活性的状态。 酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产，但是活性降低，使用范围减小，技术还有发展空间。固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。
固定化酶与水溶性酶相比的优缺点 优点：①固定化酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低。 ②固定化酶极易与反应体系分离，简化了提纯工艺，而且产品收 率高、质量好。 ③在多数情况下，酶经固定化后稳定性得到提高。 ④固定化酶的催化反应过程更易控制。 ⑤固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用 于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作。 ⑥固定化酶与游离酶相比更适于多酶体系的使用，不仅可利用多 酶体系中的协同效应使酶催化反应速率大大提高，而且还可以控制反应按一定顺序进行。 缺点：①固定化可能造成酶的部分失活，酶活力有损失。 ②酶催化微环境的改变可能导致其反应动力学发生变化。 ③固定化酶的使用成本增加，使工厂的初始投资增大、 ④固定化酶一般只适用于水溶性的小分子底物，对于大分子底物 不适宜。 ⑤与完整菌体细胞相比，固定化酶不适宜于多酶反应，特别是需 要辅助因子参加的反应。 ⑥胞内酶进行固定化时必须经过酶的分离纯化操作。 固定化细胞和固定化酶比较,2个的优缺点 固定化细胞：优点：固定化细胞内酶的活性基本没有损失。缺点：固
2019-2020学年度北师大版高中选修一生物第2章酶技术第4节固定化酶的制 备和应用课后辅导练习第八十八篇 第1题【单选题】 下列说法不正确的是( ) A、固定化酶和固定化细胞在应用上的主要区别是后者需要一定的营养 B、固定化酶技术一次只能固定一种酶 C、固定化酶和固定化细胞的共同点之一是酶都是在细胞外起作用 D、固定化酶和固定化细胞都能反复使用 【答案】： 【解析】： 第2题【单选题】 下图是应用固定化酵母进行葡萄糖发酵的装置，下列说法中不正确的是 A、为使固定化酵母可以反复使用，实验要在无菌条件下进行 B、加入反应液后应保持活塞1始终打开，活塞2则必须关闭
C、装置的长导管主要是为了释放CO2并防止杂菌进入反应柱 D、加入反应液的浓度不能过高以免酵母细胞失水过多而死亡 【答案】： 【解析】： 第3题【单选题】 下列有关固定化酶和固定化细胞的说法正确的是 A、某种固定化酶的优势在于能催化一系列生化反应 B、固定化细胞技术一次只能固定一种酶 C、固定化酶和固定化细胞的共同点是所固定的酶都可在细胞外起作用 D、固定化酶和固定化细胞都能反复使用，但酶的活性迅速下降 【答案】： 【解析】： 第4题【单选题】 同工酶具有以下哪个特性?( ) A、具有相同的蛋白质分子结构 B、理化性质相同 C、催化相同的化学反应 D、免疫性能相同 【答案】： 【解析】：
第5题【单选题】 固定化酶和固定化细胞常用的方法不包括( ) A、射线刺激法 B、包埋法 C、化学结合法 D、物理吸附法 【答案】： 【解析】： 第6题【单选题】 加酶洗衣粉既能提高洗涤效果又能缩短洗涤时间而得到普及，洗衣粉中不包括的酶制剂是( ) A、蛋白酶 B、纤维素酶 C、淀粉酶 D、脂肪酶 【答案】： 【解析】： 第7题【单选题】 在以如图所示酶的固定方法模式图中，属于载体结合法的是( )
固定化酶的研究进展 固定化酶是20世纪60年代发展起来的一项新技术。最初主要是将水溶性酶与不溶性体结合起来，成为不溶于水的酶衍生物，所以曾叫过“水不溶酶”和“固相酶”。但是，后来发现，也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出。在这种情况下，酶本身仍是可溶的，只不过被固定在一个有限的空间内不能再自由流动。因此，用水不溶酶或固相酶的名称就不再恰当。在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”的名称[1]。 一固定化酶的发展历程[1] 酶参与体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变换。作为一种生物催化剂，酶可以在常温常压等温和条件下高效地催化反应，一些难以进行的化学反应在酶的催化作用下也可顺利地进行反应，而且反应底物专一性强、副反应少等优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研究。近年来，酶被人们广泛应用于食品生产与检测、生物传感器、医药工程、环保技术、生物技术等领域。 1916年美国科学家NELSON和GRIFFIN最先发现了酶的固定化现象；直到20世纪50年代，酶固定化技术的研究才真正有效地开展；1953年，德国科学家GRUB-HOFER 和SCHLEITH首先将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶等与上述载体结合制备固定化酶；到20世纪60年代，固定化技术迅速发展；1969年日本千畑一郎利用固定化氨基酰胺酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸，是世界上固定化酶大规模应用的首例；在1971年的第一届国际酶工程会议上，正式建议使用固定化酶(mimobilizedenzyme)这个名称。我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是中国科学院微生物所和上海生化所的酶学工作者同时开始了固定化酶的研究工作 二固定化酶的特点[2] [3] 固定化酶具有许多优点：极易将固定化酶与底物、产物分开；可以在较长时间内进行分批反应和装柱连续反应；在大多数情况下，可以提高酶的稳定性；酶反应过程能够加以严格控制；产物溶液中没有酶的残留，简化了提取工艺；较水溶性酶更适合于多酶反应；可以增加产物的收率,提高产物的质量；酶的使用效率提高，成本降低。但是，固定化酶也有其不足之处，如固定化时，酶活力有损失；增加了固定化的成本，工厂开始投资大；只能用于水溶性底物，而且较适用于小分子。 三固定化酶固定化方法[3] [4] 由于所固定的酶或细胞的不同，或者固定的目的及固定用的载体的不同，使固定化方法大相径庭。根据固定的一般机理，可将之分为如下几种方法。酶的固定化方法有：
酶的固定化 固定化酶是酶工程的核心，利于实现酶的重复利用及产物与酶的分离。下面以酶的固定化方法为核心，介绍一些有关固定化技术的研究新进展。 1 吸附法 利用多种固体吸附剂将酶或含酶细胞吸附在其表面上而使酶固定方法。该方法最显著的优点是操作简便，条件温和，不会引起酶的变异失活，且载体价廉易得，可反复使用。但酶与载体结合不牢，极易脱落，所以它的使用受到一定的限制。因此，人们不断尝试使用新的载体来解决这易脱落的问题。 通常，吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。 酶被载体吸附而固定的方法称为物理吸附法。从载体对酶的适应性来看，这个方法效果是好的，酶蛋白的活性中心不易受破坏，酶的高级结构变化也不明显，但其缺点是酶与载体的相互作用较弱，被吸附的酶极易从载体表面上脱落下来，不能获得较高活力的固定化酶。该方法常用的载体有活性炭、多孔陶瓷、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。纵伟、刘艳芳等(2008)以磁性壳聚糖微球作为新型载体，并采用物理吸附法固定化脂肪酶，对影响固定化的各种因素进行考察，确定了最优条件，同时比较了游离酶和固定化酶的pH值和热稳定性。结果表明，固定化的适宜条件为：加酶量600 U／g，温度5℃，pH 7．0，固定化时问2 h。固定化酶的pH值和热稳定性都优于游离酶，
固定化酶连续使用5次后，其相对酶活仍为使用前的57.8％，具有较好的操作稳定性。近年来，随着介孔分子筛制备技术的日臻成熟，人们正在考虑用其担当固定化酶的载体。与其他材料相比，介孔分子筛规则的孔道、大的比表面积、极强的吸附性能、稳定的结构等特点，使其具有担当固定化酶载体得天独厚的优势。 王炎等(2008)以介孔分子筛MCM一41作为载体，采用物理吸附法对漆酶进行了固定化，考察了时间、pH和给酶量对固定化效果的影响，并对固定化酶的活性及其稳定性进行了研究，讨论了影响固定化过程和固定化酶性质的主要原因。结果显示，在pH为3.0时，酶和载体比例为62.5 mg／g时吸附12 h固定化效果最好，固定化酶活性回收率为50％。与游离漆酶相比，MCM一41固定化漆酶的最适反应pH略有升高，最适温度没有变化，其pH稳定性和热稳定性都显著优于游离漆酶。固定化漆酶具有可重复操作的性质，与底物反应反复操作1O批次后剩余活性为4O％。 将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合 的固定化方法。该方法的处理条件温和，且酶的高级结构和活性中心的氨基酸很少发生变化，因而可以得到较高活性的固定化酶。采用此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、淀粉酶、纤维素酶等。陈姗姗等(2008)以阴离子交换树脂为载体、戊二醛为交联剂，对果胶酶进行固定化分析，探讨了温度、pH值、时间、加酶量、戊二醛浓度、交联温度、交联时问对果胶酶固定化效果的影响，同时对固定化果胶酶的酶学特性进行研究。研究结果表明，果胶酶的最佳固定化条件为：温
2019年精选生物《生物技术实践》[第三章酶的应用技术实践第二节制备和应用固定化酶]苏教版巩固辅导[含答案解析]第四十五篇 第1题【单选题】 下列关于加酶洗衣粉的说法中，正确的是( ) ①加酶洗衣粉的效果总比普通洗衣粉的效果好②加酶洗衣粉效果的好坏受很多因素影响③加酶洗衣粉中目前常用的酶制剂有蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶④加酶洗衣粉相对普通洗衣粉来讲有利于保护环境． A、②③④ B、①②③ C、①② D、①③④ 【答案】： 【解析】： 第2题【单选题】 在原材料有限的情况下，能正确表示相同时间内果胶酶的用量对果汁产量影响的曲线是
A、甲 B、乙 C、丙 D、丁 【答案】： 【解析】： 第3题【单选题】 A、温度影响果胶酶的活性 B、若温度从10℃升高到40℃，酶的活性都将逐渐增强 C、40℃与60℃时酶的活性相等 D、该酶的最适温度一定是50℃ 【答案】： 【解析】： 第4题【单选题】 目前，酶已经大规模地应用于各个领域，下列属于酶应用中面临的实际问题的是( ) A、酶对高温不敏感，但对强酸、强碱非常敏感 B、加酶洗衣粉因为额外添加了酶制剂，比普通洗衣粉更易污染环境 C、固定化酶可以反复利用，但在固定时可能会造成酶的损伤而影响活性 D、酶的催化功能很强，但需给以适当的营养物质才能较长时间维持其作用 【答案】：
【解析】： 第5题【单选题】 下列关于纤维素酶的说法，错误的是( ) A、纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种 B、葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖 C、纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁 D、纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖 【答案】： 【解析】： 第6题【单选题】 下列有关固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是( ) A、反应产物对固定化酶的活性没有影响 B、实验室常用吸附法制备固定化酵母细胞 C、若发酵底物是大分子，则固定化细胞优于固定化酶 D、固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明显【答案】： 【解析】：
乳糖酶在乳制品加工中的应用 李倩倩，王丽颖 西南大学荣昌校区动物科学系，重庆 402460 摘要：：乳与乳制品是营养成分十分丰富的天然食品，其营养价值早已得到了世人的公认，然而美中不足的是由于部分人体内缺乏乳糖酶导致的乳糖不耐受现象，影响了他们对乳制品的正常摄入，这在很大程度上制约了乳制品在人们日常生活中的普及和人体对乳制品营养成分的消化吸收。随着现代生物科学技术的发展，人们利用乳糖酶定向水解牛乳中大量的乳糖，从而使得从根本上解决乳糖不耐受这一困绕世人多年的医学难题成为可能。本文就乳糖酶在乳制品加工业生产中的应用作一简要论述，以期对大家有所启迪和帮助。 关键词：乳糖酶；乳制品；应用； Application of lactose in dairy processing LI qianqian.WANG liying Department of Animal Science, Rongchang Campus of Southwest University，Chongqing 402460,China Abstract: Milk and dairy products is very rich in nutrients in natural food, its nutritional value has been recognized, however, a fly in the ointment is due in part to the human body caused by lack of lactase lactose intolerance phenomenon, affecting their normal intake of dairy products, which restricted the dairy products in people's daily life and the popularity of the human body digestion of dairy products in the absorption of nutrients in a very large extent. With the development of modern biological science and technology, people use a lot of lactase hydrolytic milk lactose orientation, so as to fundamentally solve the medical problems that afflict people with lactose intolerance for possible. The application of lactose in dairy industry production are briefly described, with a view to enlighten and help you. Key words: Lactaste; dairy; products; application; 1 乳糖酶
酶固定化技术研究进展 选题说明 酶作为一种生物催化剂，具有高催化效率，高选择性，催化反应条件温和，清洁无污染等特点，其卓越的催化效能，令普通无机催化剂难以望其项背，因此酶的工业化使用一直是广受社会关注的课题，但天然酶稳定性差、易失活、不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难，使其难以在工业中更为广泛的应用。此外，分离和提纯酶以及其一次性使用也大大增加了其作为催化剂的成本，严重限制了酶的工业推广。在此条件下，固定化酶的概念和技术得以提出和发展，并成为近些年酶工程研究的重点。酶的固定化，是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。通过固定化，可以解决天然酶的局限性，实现酶的广泛运用。 基于对于酶的工业化使用和固定化酶的兴趣，我通过互联网和数据库信息检索的方式对酶的固定化技术发展状况进行了初步探索，并对目前的研究成果进行了简要的概括。希望能使大家对这一领域有所认识。 检索过程说明 1，检索工具和数据库 1.1，百度搜索引擎 1.2，Google搜索引擎 1.3，中国期刊全文数据库 1.4，万方数据系统 1.5，重庆维普中文科技期刊数据库 2，检索过程简述
首先，我选择了使用百度和Google搜索引擎进行关键词检索，都得到了浩繁的搜索结果，所的信息主要是百科简介和企业广告信息，介绍较为浅显陈旧，可利用性较差，但可以用于简单的信息了解，在搜素过程中，尝试使用了布尔检索规则如“固定化酶and应用”、高级检索和结果中检索的检索方式，以减小数据量。也尝试了Google学术搜索，得到了很多有用信息。运用维普中文科技期刊数据库搜素“题名或关键词”为“固定化酶”的相关资料得到655条，搜素“题名或关键词”为“固定化酶应用”的相关资料得到72条，检索关键词搜素“题名或关键词”为“固定化酶研究”的相关资料得到4条. 万方数据系统搜索主题词"固定化酶",得到相关资料1024条，搜索“固定化酶技术应用”得到相关资料23条.。中国期刊全文数据库中检索“固定化酶技术”得到相关资料2604条，搜索“固定化酶技术应用”得到相关资料742条 关键词 酶固定化载体制备研究应用 酶固定化技术研究进展 提要： 固定化酶有许多优点，尤其是稳定性和可重复使用性使其在许多领域得到广泛应用。固定化酶技术是一门交叉学科技术。目前已得到长足的发展。本文重点介绍了固定化酶制备的传统方法和近些年出现的一些新方法，同时对酶在一些性能优良的栽体上的固定进行了综述。 正文： 一，传统的酶固定化方法
第二节固定化酶的制备和应用 1．掌握制备固定化酶的常用方法。(重点) 2．掌握酵母菌细胞的固定化技术。(重难点) 1．固定化酶 固定化酶是指用物理学或化学的方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。 2．制备固定化酶的方法 (1)物理吸附法的显著特点是工艺简便且条件温和，在生产实践中应用广泛。 (2)化学结合法是利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联，在酶和多功能试剂之间形成共价键，从而得到三维的交联网架结构。 (3)包埋法是将酶包埋在能固化的载体中。 3．固定化酶的优点：在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后容易与水溶性反应物和产物分离，可被反复使用。 [合作探讨] 探讨1：对固定化酶的作用影响最小的固定方法是哪一种？ 提示：物理吸附法。 探讨2：为什么固定化酶不适合采用包埋法？ 提示：由于酶分子较小，容易在包埋材料中漏出，所以不适合采用包埋法固定化。 探讨3：如果反应物是大分子物质，应该采用哪种方法？ 提示：因为大分子物质不容易进入细胞内，应采用固定化酶技术。 [思维升华] 1．制备固定化酶的常用方法可用下图所示： 2．常用的制备固定化酶的方法
1．最广泛的细胞固定化方法 凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶等。 2．优点 (1)无须进行酶的分离和纯化，减少了酶的活力损失，降低了生产成本。 (2)不仅可以作为单一的酶发挥作用，且可以利用细胞中所含的复合酶完成一系列的催化反应。 (3)对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高。 3．缺点 (1)固定化细胞只能用于生产细胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物。 (2)由于载体的影响，使营养物质和产物的扩散受到一定的限制。 (3)在好氧性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键性的限制因素。 [合作探讨] 探讨1：固定化细胞为什么只能用于生产胞外酶和其他能分泌到细胞外的产物？ 提示：因为固定化细胞固定的是活细胞，细胞膜具有选择透过性，细胞内有用的物质(如胞内酶)是不能自由进出细胞的。 探讨2：能否在刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入活化的酵母菌细胞？ 提示：不能，因为刚溶化好的海藻酸钠溶液温度较高，会将酵母菌细胞杀死。 探讨3：如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，则说明了什么？如果凝胶珠不是圆形或椭圆形，又说明了什么？ 提示：如果凝胶珠的颜色过浅，则说明了海藻酸钠溶液的浓度偏低，固定的酵母菌细胞数目较少；如果凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明了海藻酸钠的浓度过高，制作失败。 [思维升华] 1．制备固定化酵母菌细胞的操作流程 准备各种实验药品和器具
第一章酶工程基础 1.名词解释：酶工程、比活力、酶活力、酶活国际单位、酶反应动力学 ①酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新技术，是工业上有目的地设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在常温常压下催化化学反应，生产人类所需产品或服务于其它目的地一门应用技术。 ②比活力：指在特定条件下，单位质量的蛋白质或RNA所拥有的酶活力单位数。 ③酶活力：也称为酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。其大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高。 ④酶活国际单位: 1961年国际酶学会议规定：在特定条件(25℃，其它为最适条件)下，每分钟内能转化1μmol底物或催化1μmol产物形成所需要的酶量为1个酶活力单位，即为国际单位（IU）。 ⑤酶反应动力学:指主要研究酶反应速度规律及各种因素对酶反应速度影响的科学。 2.说说酶的研究简史 酶的研究简史如下： (1)不清楚的应用：酿酒、造酱、制饴、治病等。 (2)酶学的产生：1777年，意大利物理学家 Spallanzani 的山鹰实验；1822年，美国外科 医生 Beaumont 研究食物在胃里的消化；19世纪30年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。1684年，比利时医生Helment提出ferment—引起酿酒过程中物质变化的因素（酵素）；1833年，法国化学家Payen和Person用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶；1878年，德国 科学家K?hne提出enzyme—从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”（希腊文）。 (3)酶学的迅速发展（理论研究）：1926年,美国康乃尔大学的”独臂学者”萨姆纳博士从 刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质;1930年，美国的生物化学家Northrop 分离得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶结晶，确立了酶的化学本质。 3.说说酶工程的发展概况 I.酶工程发展如下： ①1894年，日本的高峰让吉用米曲霉制备淀粉酶，酶技术走向商业化： ②1908年，德国的Rohm用动物胰脏制得胰蛋白酶，皮革软化及洗涤； ③1911年，Wallerstein从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清； ④1949年，用微生物液体深层培养法进行 －淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕； ⑤1960年，法国科学家Jacob和Monod提出的操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量； ⑥1971年各国科学家开始使用“酶工程”这一名词。 II.在酶的应用过程中，人们注意到酶的一些不足之处，如：稳定性差，对强酸碱敏感，只 能使用一次，分离纯化困难等，解决的方法之一是固定化。 固定化技术的发展经历如下历程： ①1916年，Nelson和Griffin发现蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性； ②1969年，日本千佃一郎首次在工业规模上用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L－氨基酸； ③1971年，第一届国际酶工程会议在美国召开，会议的主题是固定化酶。 4. 酶的催化特点 酶催化作用特性有： ①极高的催化效率：在37℃或更低的温度下，酶的催化速度是没有催化剂的化学反应速率 的1012-1020倍；
乳糖酶的生产技术及其在食品工业应用研究进展 摘要：乳糖酶亦称β-半乳糖苷酶，在工业生产中有广泛的应用，本文通过来源及其性质、基础研究与应用等方面对乳糖酶进行综述。 关键词：乳糖酶；固定化；应用 乳是各种哺乳动物哺育其幼仔最理想的天然食物。它富含优质蛋白质、乳脂、乳糖等营养成分和钙、磷、钾等矿物质以及多种维生素，还含有多种免疫物质、酶、激素等具有生理活性调节功能的生物活性物质。 乳糖是哺乳动物乳汁中特有的糖类，它是由一分子葡萄糖和一分子半乳糖组成的双糖，其合成步骤为：以葡萄糖为前体物质，一部分葡萄糖先转化为半乳糖，然后经乳糖合成酶催化。半乳糖与葡萄糖结合，形成乳糖。人体摄入乳糖后，在消化过程中，经乳糖酶催化，分解为葡萄糖和半乳糖。乳糖是矿物质的载体，能促进钙、磷吸收及整理肠道，其分解产物半乳糖是婴儿脑发育的必需物质，参与脑组织及其神经系统的构成。但是，机体却不能直接利用乳糖，乳糖必须经乳糖酶分解为单糖后才能被吸收和利用（杨卉新等，2014）。 若乳糖酶缺乏者一次摄入较多乳糖，乳糖未能及时被消化吸收，进入结肠后被肠道细菌分解，产生大量乳酸、甲酸等短链脂肪酸和氢气，造成渗透压升高，使肠腔中的水分增多，引起腹涨、肠鸣、肠绞痛直至发生水泻等症状，总称为乳糖不耐受症。乳糖不耐受症状，在中国人群中发生率很高，因此限制了很大一部分国人对牛奶的摄入，而牛奶又是人类良好的优质蛋白、矿物质及维生素的天然来源，故乳糖酶缺乏问题显得尤为突出（张玉英，2014）。 1889年荷兰生物学家，Beijerineek 首次报道了乳糖酶可水解乳糖以来，人们对于乳糖酶的研究日趋完整（蒋世琼，2000）。目前，解决乳糖不耐受的最佳方法是用乳糖酶水解乳糖来生产低乳糖或无乳糖乳制品。而现在商业乳糖酶中乳糖酶的最适温度在37℃左右或者更高（P Nicholas，2002）。国外学者经多年研究，已成功地找到产乳糖酶的微生物，并研制了一系列乳糖酶商品，现已投入市场。有学者研究发现环氧活化水凝胶固定化酶可以更好的解决乳糖不耐症问题（Elnashar et al., 2014）。本文就乳糖酶的生产方式及其在食品加工业生产中应用的研究进展作简要论述。
固定化酶制备及应用的研究进展
固定化酶制备及应用的研究进展摘要：本文主要从分析酶单独应用中的不足、酶的固定化载体、固定化方法等方面介绍了固定化酶制备中的研究进展情况，并且从医药、食品、环保、化学工业、能源等方面其在其中的新应用出发，对固定化酶在新领域中的应用作了综述，给固定化酶研究的发展前景进行了展望，并且指出了今后酶固定化研究的主要方向是多酶的固定化及制备高活性、高负载、高稳定性的固定化酶。 关键字：酶；酶的固定化；载体；酶固定化应用领域 酶是重要的生物催化剂，具有专一性强、催化效率高、无污染、反应条件温和等特点，在制药、食品、环保、酿造、能源等领域都得到了广泛的应用。但在实际应用中，酶也存在许多不足，如大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活，不够稳定；与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产；并且分离纯化困难，也会导致生产成本的提高等。固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用的。随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。固定化酶技术为这些问题的解决提供了有效的手段，从而成为酶工程领域中最为活跃的研究方向之一。本文将从酶生
物催化剂固定化载体、固定化方法和技术及固定化酶的应用等几个方面出发，归纳和综述这些方面近年来的研究进展。 1酶固定化的传统方法 关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进。 1.1 吸附法 吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有活泼的表面。 1.2包埋法 包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。 1)网格型 将酶或包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。 2)微囊型 把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。