酶分子改造的方法及应用
摘要：酶工程是研究酶的生产和应用的一门技术性学科，进入20世纪后，随着微生物发酵技术的发展和酶分离纯化技术的更新，酶制剂的研究得到不断推进并实现了其商业化生产，但直接利用酶制剂时存在酶的稳定性差、使用效率低、不能在有机溶剂中反应等缺点。通过酶的修饰可提高酶的稳定性，消除或降低酶的抗原性，使之更适合生产和应用的要求。近年来发展的蛋白质工程技术则使酶的定向改造成为可能。随着生物技术的发展，酶工程将引起巨大的变革。
关键词：酶分子修饰蛋白质工程模拟酶
引言：近年来，酶工程开始兴起，迅速发展，其研究成果也越来越广泛地运用于各个领域。虽然如此，但是由于酶一离开其特定的环境条件就会变得不太稳定，不适合大批量生产的需求，因此，大规模应用酶和酶工艺的还不多。在工业应用中，底物及产物带来的影响常常导致pH偏离酶作用的最适条件的中性范围，使酶难以发挥作用。在临床应用上，绝大多数酶对人体而言都是外源蛋白质，具有抗原性，直接注入会引起人体的过敏反应。所以人们希望能够通过各种人工方法改造酶，使其更能适应各方面的需要。
1.酶分子改造的方法
1.1酶分子修饰
酶分子修饰[1]（Modification of Enzyme Molecule）即通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程。酶分子修饰在提高酶的活力、增强酶的稳定性、降低或消除酶的抗原性、研究各种物理因素对酶分子空间构象的影响，进一步探讨酶分子的结构与功能之间的关系等方面具有重要意义。
1.1.1酶分子的主链修饰
酶分子的主链修饰[2]就是利用酶分子主链（肽链或核苷酸链）的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。
1.1.1.2主链的切断修饰[3]
主链断裂后，引起酶活性中心的破坏，酶的催化功能丧失（用于探测酶活性中心的位置）。酶活性中心的空间构象维持不变，酶的催化功能也可以保持不变或损失不多，但是抗原性有发生改变。这样可以提高药用酶的使用价值。主链断裂有利于酶活性中心的形成，可使酶分子显示其催化功能或使酶活力提高。
1.1.1.3主链的连接修饰
将两种或者两种以上的酶通过主链连接在一起，形成一个酶分子具有两种或者多种催化活性的修饰方法称为酶的主链连接修饰。在一个酶分子上具有两种或多种催化活性的酶称为多酶融合体。通过基因融合技术将两种或两种以上的酶的基因融合在一起形成融合基因，再经过克隆和表达，有可能获得各种多酶融合体。
1.1.2酶的侧链基团修饰[4]
采用一定的方法使酶的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰。
其意义在于（1）可以研究各基团在酶分子中的作用，并用于研究酶的活性中心的必需基团。（2）可以测定某一种基团在酶分子中的数量。（3）可以提高酶的活力、增加酶的稳定性、降低酶的抗原性，以提高酶的使用价值。（4）可能获得自然界原来不存在的新酶种。例如，某些抗体酶和人工改造的核酸类酶等。
1.1.3 酶的组成单位置换修饰
酶蛋白的基本组成单位是氨基酸，将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法，称为氨基酸置换修饰。酶RNA的基本组成单位是核苷酸，将酶分子核苷酸链上的某一个核苷酸换成另一个核苷酸的修饰方法，称为核苷酸置换修饰。
通过酶的组成单位置换修饰[5]，可以提高酶活力、增加酶的稳定性或改变酶的催化专一性，常用的技术为定位突变。
1.1.3.1定点突变技术
定点突变 [6](site directed mutagenesis)是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。定点突变技术用于酶分子修饰的主要过程如下：(1)新酶分子结构的设计(2)突变基因碱基序列的确定(3)突变基因的获得：根据欲获得的突变基因的碱基序列及其需要置换的碱基位置，合成引物，通过PCR技术获得所需基因。
1.1.3.2盒式突变技术
1985年Wells[7]提出的一种基因修饰技术——盒式突变，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体。利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧造成两个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化的双链DNA片段替代被消化的部分。这样一次处理就可以得到多种突变型基因。
1.1.4酶分子的其他修饰方法
1.1.4.1金属离子置换修饰[8]
有些酶分子中含有金属离子，而且往往是酶活性中心的组成部分，对酶催化功能的发挥有重要作用。若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性；若进行金属离子置换，可能提高酶的活力或增加酶的稳定性。
1.1.4.2酶分子的物理修饰[9]
通过各种物理方法（高温、高压、高盐、低温、真空、失重、极端pH值、有毒境）
使酶分子的空间构象发生某些改变，而改变酶的某些特性和功能，从而提高酶的催化活性，增强酶的稳定性或改变酶的催化动力学特性的方法。酶分子物理修饰的特点：不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变。只是使副键发生某些变化和重排，使酶分子的空间构象发生某些改变。
1.2酶的蛋白质工程[10]
蛋白质工程(protein engineering)是以蛋白质的结构规律及其生物功能烦人关系为基础，通过基因重组技术改造或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。
1.2.1蛋白质工程的基本流程
首先利用传统蛋白质纯化方法纯化目标蛋白质，测定它的三维空间结构，并进行稳定性、催化活性等蛋白质功能分析；在
建立蛋白质三维结构模型基础
上，进行蛋白质分子设计，确立
突变位点或区域并预测突变后
蛋白质的结构与功能；在明确突
变位点或蛋白质序列改变的区
域后，对负责突变体编码基因进行构建；实验分析突变后蛋白质的功能，检测是否与原来的预测相符合。
1.2.2蛋白质工程的方法
以重组DNA 技术为核心的基因工程技术改造蛋白质，还有定位诱变技术（即定点突变技术）、盒式突变技术以及重叠延伸PCR 技术。
1.3生物酶的人工模拟
与普通化学催化剂相比，酶具有高效的催化活性、高度的反应专一性和反应条件温和的优点，但在实际应用时存在不稳定以及来源有限等问题。为了得到活性高、稳定性好、价格低廉的酶，人们通过基因工程、蛋白质工程等对现有的酶进行改造，寻找新酶。另外，在酶的结构与功能、酶对底物的分子识别和酶的生物进化等研究过程中，也需要设计简单的酶模型来模拟天然酶，开始酶的模拟。
模拟酶是根据酶的催化机制，利用有机化学、生物化学等方法，设计合成一些较天然酶简单的非蛋白质或蛋白质分子，也称人工酶。
1.3.1抗体酶
抗体酶又称催化抗体，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力相结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的催化活性，是一种新型人工酶。迄今为止，产生抗体酶的方法有两种：①以反应过渡态类似物（小分子）作为半抗原，然后让动物免疫系统产生针对半抗原的具有催化活性的抗体；②通过化学修饰、点突变以及基因重组技术将催化基因直接引入抗体的结合部位。
1.3.2印迹酶
自然界中，分子识别在生物体，如酶、受体和抗体的生物活性方面发挥着重要作用，这种高选择性来源于与底物相结合的部位的高特异性。为获得这样的结合部位，科学家们应用环状小分子或冠状化合物（如冠醚、环糊精、环芳烃等）来模拟生物体系。如果以一种分子充当模板，其周围用聚合物交联，当模板分子去除后，此聚合物就留下了与此分子相匹配的
蛋白质工程的基本流程
空穴。如果构建合适，这种聚合物就像“锁”一样对钥匙具有识别作用。这种技术被称为分子压印技术，又称生物压印技术。
印迹酶包括分子印迹酶和生物印迹酶。
2.酶分子的应用
2.1医药领域[11]
据《左传》记载，我们的祖先在2500多年前，就懂得利用麦麹治病，实质上是利用在谷物中生长的各种微生物所产生的酶类进行疾病治疗。1894年，日本的高峰让吉从米曲霉中制得淀粉酶，用于治疗消化不良。20世纪后半叶，生物科学和生物工程飞速发展，酶在医药领域的应用越来越广泛。
在医药领域使用的酶具有种类多、用量少、效率高等特点。
2.1.1用酶进行疾病的诊断
通过酶的催化作用测定体内某些物质的含量变化，或者通过体内原有酶活力的变化情况进行疾病诊断的方法叫做酶学诊断。
2.1.1.1根据体内酶活力的变化诊断疾病
一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在某一范围的。当人们患上某些疾病时，则由于组织、细胞受到损伤或者代谢异常而引起体内的某种或某些酶的活力发生相应的变化。
通过酶活力变化诊断疾病
2.1.1.2用酶测定体液中某些物质的变化诊断疾病
用酶测定物质的量的变化诊断疾病
2.1.2用酶进行疾病预防和治疗
用于预防和治疗疾病的酶称为药用酶，药用酶具有疗效显著、副作用小等特点。
酶在疾病预防和治疗方面的应用
2.1.3用酶制造药物
2.1.
3.1用无色杆菌蛋白酶制造人胰岛素
无色杆菌蛋白酶可以特异性地催化胰岛素B链羧基末端上的氨基酸置换反应，由猪胰岛素（Ala30）转变为人胰岛素（Thr30）,以增加疗效。
2.1.
3.2用β-葡萄糖苷酶制造抗肿瘤人参皂苷
人参皂苷是人参的主要有效成分，其中人参皂苷Rh1和Rh2能够抑制癌细胞生长和增值，具有抗肿瘤的功效，尤其人参皂苷Rh2的抗肿瘤功效最为显著。
人参皂苷Rh2属于人参二醇皂苷，如果将糖基改变，就可能从其它人参二醇皂苷制造得到所需的人参皂苷Rh2。首先，将人参二醇皂苷经过水解，去除它们在C-20位置上的糖链，就可获得人参皂苷Rg3。人参皂苷Rg3在β-葡萄糖苷酶的催化作用下，水解去除C-3位置上糖链的末端葡萄糖残基，就可获得所需的人参皂苷Rh2。
2.2其他领域
食品领域：保鲜、增味，生产淀粉类、蛋白质类食品，对果蔬类食品进行加工。如溶菌酶，可以杀灭食品中的细菌，以达到防腐保鲜的效果。
工业领域：生产工业产品，处理工业原料，增强产品使用效果。如木质素酶，水解除去造纸原料纤维中的木质素，不但可提高纸的产量，而且大大减轻环境污染程度。
农业领域：对农产品进行保鲜、加工及质量检测，生产饲料。如胆碱酯酶，利用其活性变化，可检测农产品是否受到有机磷农药污染。
环保、能源领域：环境监测，废水处理，生产可生物降解材料、生物柴油、氢气。如利用乳酸脱氢酶的同工酶监测重金属对环境的污染。
生物技术领域：去除细胞壁，进行大分子切割，分子拼接。如限制性核酸内切酶，可识
别碱基排列顺序，在特定位点进行切割。
参考文献：
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《装备制造技术》 2007年第 10期 收稿日期 :2007-08-21 作者简介 :申海兰 , 24岁 , 女 , 河北人 , 在读研究生 , 研究方向为微机电系统。 分子动力学模拟方法概述 申海兰 , 赵靖松 (西安电子科技大学机电工程学院 , 陕西西安 710071 摘要 :介绍了分子动力学模拟的基本原理及常用的原子间相互作用势 , 如Lennard-Jones 势 ; 论述了几种常用的有限差分算法 , 如 Verlet 算法 ; 说明了分子动力学模拟的几种系综及感兴趣的宏观统计量的提取。关键词 :分子动力学模拟 ; 原子间相互作用势 ; 有限差分算法 ; 系综中图分类号 :O3 文献标识码 :A 文章编号 :1672-545X(200710-0029-02 从统计物理学中衍生出来的分子动力学模拟方法 (molec- ular dynamics simulation , M DS , 实践证明是一种描述纳米科技 研究对象的有效方法 , 得到越来越广泛的重视。所谓分子动力学模拟 , 是指对于原子核和电子所构成的多体系统 , 用计算机模拟原子核的运动过程 , 从而计算系统的结构和性质 , 其中每一个原子核被视为在全部其他原子核和电子所提供的经验势场作用下按牛顿定律运动 [1]。它被认为是本世纪以来除理论分析和实验观察之外的第三种科学研究手段 , 称之为“计算机实验” 手段 [2], 在物理学、化学、生物学和材料科学等许多领域中得到广泛地应用。
根据模拟对象的不同 , 将它分为平衡态分子动力学模拟 (EM DS (和非平衡态分子动力学模拟 (NEM DS 。其中 , EM DS 是分子动力学模拟的基础 ; NEM DS 适用于非线性响应系统的模拟 [3]。下面主要介绍 EM DS 。 1分子动力学方法的基本原理 计算中根据以下基本假设 [4]: (1 所有粒子的运动都遵循经典牛顿力学规律。 (2 粒子之间的相互作用满足叠加原理。 显然这两条忽略了量子效应和多体作用 , 与真实物理系统存在一定差别 , 仍然属于近似计算。 假设 N 为模拟系统的原子数 , 第 i 个原子的质量为 m i , 位置坐标向量为 r i , 速度为 v i =r ? i , 加速度为 a i =r ?? i , 受到的作用力为 F i , 原子 i 与原子 j 之间距离为 r ij =r i -r j , 原子 j 对原子 i 的作用力为 f ij , 原子 i 和原子 j 相互作用势能为 ! (r ij , 系统总的势能为 U (r 1, r 2, K r N = N i =1! j ≠ i ! " (r ij , 所有的物理量都是随时 间变化的 , 即 A=A (t , 控制方程如下 : m i r ?? i =F i =j ≠ i
分子动力学的模拟过程 分子动力学模拟作为一种应用广泛的模拟计算方法有其自身特定的模拟步骤,程序流程也相对固定。本节主要就分子动力学的模拟步骤和计算程序流程做一些简单介绍。 1. 分子动力学模拟步驟 分子动力学模拟是一种在微观尺度上进行的数值模拟方法。这种方法既可以得到一些使用传统方法,热力学分析法等无法获得的微观信息,又能够将实际实验研究中遇到的不利影响因素回避掉,从而达到实验研宄难以实现的控制条件。 分子动力学模拟的步骤为: (1)选取所要研究的系统并建立适当的模拟模型。 (2)设定模拟区域的边界条件,选取粒子间作用势模型。 (3)设定系统所有粒子的初始位置和初始速度。 (4)计算粒子间的相互作用力和势能,以及各个粒子的位置和速度。 (5)待体系达到平衡,统计获得体系的宏观特性。 分子动力学模拟的主要对象就是将实际物理模型抽象后的物理系统模型。因此,物理建模也是分子动力学模拟的一个重要的环节。而对于分子动力学模拟,主要还是势函数的选取,势函数是分子动力学模拟计算的核心。这是因为分子动力学模拟主要是计算分子间作用力,计算粒子的势能、位置及速度都离不开势函数的作用。系统中粒子初始位置的设定最好与实际模拟模型相符,这样可以使系统尽快达到平衡。另外,粒子的初始速度也最好与实际系统中分子的速度相当,这样可以减少计算机的模拟时间。 要想求解粒子的运动状态就必须把运动方程离散化,离散化的方法有经典Verlet算法、蛙跳算法(Leap-frog)、速度Veriet算法、Gear预估-校正法等。这些算法有其各自的优势,选取时可按照计算要求选择最合适的算法。 统计系统各物理量时,便又涉及到系统是选取了什么系综。只有知道了模拟系统采用的系综才能釆用相对应的统计方法更加准确,有效地进行统计计算,减少信息损失。 2. 分子动力学模拟程序流程 具体到分子动力学模拟程序的具体流程,主要包括: (1)设定和模拟相关的参数。 (2)模拟体系初始化。 (3)计算粒子间的作用力。 (4)求解运动方程。 (5)循环计算,待稳定后输出结果。 分子动力学模拟程序流程图如2.3所示。
分子动力学方法模拟基本步骤 1.第一步 即模型的设定，也就是势函数的选取。势函数的研究和物理系统上对物质的描述研究息息相关。最早是硬球势，即小于临界值时无穷大，大于等于临界值时为零。常用的是LJ势函数，还有EAM势函数，不同的物质状态描述用不同的势函数。 模型势函数一旦确定，就可以根据物理学规律求得模拟中的守恒量。 2 第二步 给定初始条件。运动方程的求解需要知道粒子的初始位置和速度，不同的算法要求不同的初始条件。如：verlet算法需要两组坐标来启动计算，一组零时刻的坐标，一组是前进一个时间步的坐标或者一组零时刻的速度值。 一般意思上讲系统的初始条件不可能知道，实际上也不需要精确选择代求系统的初始条件，因为模拟实践足够长时，系统就会忘掉初始条件。当然，合理的初始条件可以加快系统趋于平衡的时间和步伐，获得好的精度。 常用的初始条件可以选择为：令初始位置在差分划分网格的格子上，初始速度则从玻尔兹曼分布随机抽样得到；令初始位置随机的偏离差分划分网格的格子上，初始速度为零；令初始位置随机的偏离差分划分网格的格子上，初始速度也是从玻尔兹曼分布随机抽样得到。 第三步 趋于平衡计算。在边界条件和初始条件给定后就可以解运动方程，进行分子动力学模拟。但这样计算出的系统是不会具有所要求的系统的能量，并且这个状态本身也还不是一个平衡态。 为使得系统平衡，模拟中设计一个趋衡过程，即在这个过程中，我们增加或者从系统中移出能量，直到持续给出确定的能量值。我们称这时的系统已经达到平衡。这段达到平衡的时间成为驰豫时间。 分子动力学中，时间步长的大小选择十分重要，决定了模拟所需要的时间。为了减小误差，步长要小，但小了系统模拟的驰豫时间就长了。因此根据经验选择适当的步长。如，对一个具有几百个氩气Ar分子的体系，lj势函数，发现取h为0.01量级，可以得到很好的相图。这里选择的h是没有量纲的，实际上这样选择的h对应的时间在10-14s的量级呢。如果模拟1000步，系统达到平衡，驰豫时间只有10-11s。 第四步 宏观物理量的计算。实际计算宏观的物理量往往是在模拟的最后揭短进行的。它是沿相空间轨迹求平均来计算得到的（时间平均代替系综平均）
酶分子的化学修饰方法 1.酶的表面修饰 2.酶分子的内部修饰 3.与辅因子相关的修饰 4.金属酶的金属取代 1.1酶的表面修饰 1.1.1化学固定化 例如:①固定在电荷载体上，由于介质中的质子靠近载体，并与载体上的电荷发生作用，使酶的最适pH向碱性(阴离子载体)或向酸性(阳离子载体)方向偏移。这样，在生产工艺中需几个酶协同作用时，由于固定化可使不同酶的最适pH彼此靠近。②将糖化酶固定在阴离子载体上，其最适pH由4.5升到6.5，与D-木糖异构酶的最适PH(7.5)靠近，这样，可简化高果糖浆生产工艺。如果载体与底物带相同电荷，固定化后反应系统Km值增加；带相反电荷，Km值降低。当酶与载体连接点达到一定数目时，可增加酶分子构象稳定性，防止其构象伸展而失活。 1.1.2 酶的小分子修饰作用 例如:③将α—胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更强的NH2COOH并达到一定程度时，酶的热稳定性在60℃时，提高了1000倍，温度更高时稳定化效应更强烈。这个稳定的酶能经受灭菌的极端条件而不失活. 1.1.3酶的大分子修饰 例如:④聚乙二醇连到脂肪酶、胰凝乳蛋白酶上所得产物溶于有机溶剂，在有机溶剂存在下能够有效地起作用。嗜热菌蛋白酶在水介质中通常催化肽链裂解，但用聚乙二醇共价修饰后，其催化活性显著改变，在有机溶剂中催化肽键合成，已用于制造合成甜味剂。 1.1.4 分子间交联
例如:⑤戊二醛将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起。这种杂化酶的优点是，胰凝乳蛋白酶的自溶作用降低，也使其反应器体积减少。将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶交联而形成的杂化酶，可作为部分代谢途径的模型，则有可能在体内将它们输送到同一部位而提高药效。 1.2酶分子的内部修饰 1.2.1非催化活性基团的修饰 例如: ①将胰凝乳蛋白酶的Met192氧化成亚砜，则使该酶对含芳香族或大体积脂肪族取代基的专一性底物的束缚口袋有关．也说明底物的非反应部分束缚在酶的催化作用中有重要作用。 1.2.2酶蛋白主链修饰 例如: ②用蛋白酶对ATP酶有限水解，切除其十几个残基后，酶活力提高了5.5倍。该活化酶仍为四聚体，亚单位分子量变化不大。这说明天然酶并非总是处于最佳的催化构象状态。 1.2.3催化活性基团的修饰 例如: ③枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser残基转化为Cys残基，新产生的巯基蛋白酶对肽或脂没有水解能力，但能水解高度活化的底物，如硝基苯脂。 1.2.4肽链伸展后的修饰 例如: ④为了有效地修饰酶分子内部的区域，Mozhea等提出先用脲、盐酸胍处理酶．使其肽链充分伸展。为修饰酶分于内部疏水基团提供可能性，然后，让修饰后伸展肽链在适当条件下．重新折叠成具有某种催化活性的构象。⑤Saraswothi等描述了一种新奇的原则上可能普遍适应改变底物专一性的方法。即先让酶变性，然后加入相应于所希望酶活力的竞争件抑制剂，待获得所希望酶
分子动力学模拟 分子动力学就是一门结合物理,数学与化学的综合技术。分子动力学就是一套分子模拟方法,该方法主要就是依靠牛顿力学来模拟分子体系的运动,以在由分子体系的不同状态构成的系统中抽取样本,从而计算体系的构型积分,并以构型积分的结果为基础进一步计算体系的热力学量与其她宏观性质。 这门技术的发展进程就是: 1980年:恒压条件下的动力学方法(Andersenの方法、Parrinello-Rahman法) 1983年:非平衡态动力学方法(Gillan and Dixon) 1984年:恒温条件下的动力学方法(能势‐フーバーの方法) 1985年:第一原理分子动力学法(→カー?パリネロ法) 1991年:巨正则系综的分子动力学方法(Cagin and Pettit)、 最新的巨正则系综,即为组成系综的系统与一温度为T、化学势为μ的很大的热源、粒子源相接触,此时系统不仅同热源有能量交换,而且可以同粒子源有粒子的交换,最后达到平衡,这种系综称巨正则系综。 进行分子动力学模拟的第一步就是确定起始构型,一个能量较低的起始构型就是进行分子模拟的基础,一般分子的其实构型主要就是来自实验数据或量子化学计算。在确定起始构型之后要赋予构成分子的各个原子速度,这一速度就是根据玻尔兹曼分布随机生成,由于速度的分布符合玻尔兹曼统计,因此在这个阶段,体系的温度就是恒定的。另外,在随机生成各个原子的运动速度之后须进行调整,使得体系总体在各个方向上的动量之与为零,即保证体系没有平动位移。 由上一步确定的分子组建平衡相,在构建平衡相的时候会对构型、温度等参数加以监控。 进入生产相之后体系中的分子与分子中的原子开始根据初始速度运动,可以想象其间会发生吸引、排斥乃至碰撞,这时就根据牛顿力学与预先给定的粒子间相互作用势来对各个例子的运动轨迹进行计算,在这个过程中,体系总能量不变,但分子内部势能与动能不断相互转化,从而体系的温度也不断变化,在整个过程中,体系会遍历势能面上的各个点,计算的样本正就是在这个过程中抽取的。 用抽样所得体系的各个状态计算当时体系的势能,进而计算构型积分。 作用势的选择与动力学计算的关系极为密切,选择不同的作用势,体系的势能面会有不同的形状,动力学计算所得的分子运动与分子内部运动的轨迹也会不同,进而影响到抽样的结果与抽样结果的势能计算,在计算宏观体积与微观成分关系的时候主要采用刚球模型的二体势,计算系统能量,熵等关系时早期多采用Lennard-Jones、morse势等双体势模型,对于金属计算,主要采用morse势,但就是由于通过实验拟合的对势容易导致柯西关系,与实验不符,因此在后来的模拟中有人提出采用EAM等多体势模型,或者采用第一性原理计算结果通过一定的物理方法来拟合二体势函数。但就是对于二体势模型,多体势往往缺乏明确的表达式,参量很多,模拟收敛速度很慢,给应用带来很大困难,因此在一般应用中,通过第一性原理计算结果拟合势函数的L-J,morse等势模型的应用仍非常广泛。 分子动力学计算的基本思想就是赋予分子体系初始运动状态之后,利用分子的自然运动在相空间中抽取样本进行统计计算,时间步长就就是抽样的间隔,因而时间步长的选取对动力学模拟非常重要。太长的时间步长会造成分子间的激烈碰撞,体系数据溢出;太短的时间步长会降低模拟过程搜索相空间的能力,因此一般选取的时间步长为体系各个自由度中最短运动周期的十分之一。但就是通常情况下,体系各自由度中运动周期最短的就是各个化学键的振动,而这种运动对计算某些宏观性质并不产生影响,因此就产生了屏蔽分子内部振动或其她无关运动的约束动力学,约束动力学可以有效地增长分子动力学模拟时间步长,提高搜索相空间的能
vasp做分子动力学的好处，由于vasp是近些年开发的比较成熟的软件，在做电子scf速度方面有较好的优势。 缺点：可选系综太少。 尽管如此，对于大多数有关分子动力学的任务还是可以胜任的。 主要使用的系综是NVT和NVE。 下面我将对主要参数进行介绍！ 一般做分子动力学的时候都需要较多原子，一般都超过100个。 当原子数多的时候，k点实际就需要较少了。有的时候用一个k点就行，不过这都需要严格的测试。通常超过200个原子的时候，用一个k点，即Gamma点就可以了。 INCAR： EDIFF 一般来说，用1E-4或者1E-5都可以，这个参数只是对第一个离子步的自洽影响大一些，对于长时间的分子动力学的模拟，精度小一点也无所谓，但不能太小。 IBRION=0 分子动力学模拟 IALGO=48 一般用48，对于原子数较多，这个优化方式较好。 NSW=1000 多少个时间步长。 POTIM=3 时间步长,单位fs,通常1到3. ISIF=2 计算外界的压力. NBLOCK= 1 多少个时间步长，写一次CONTCAR，CHG和CHGCAR，PCDAT. KBLOCK=50 NBLOCK*KBLOCK个步长写一次XDATCAR. ISMEAR=-1 费米迪拉克分布. SIGMA =0.05 单位:电子伏 NELMIN=8 一般用6到8,最小的电子scf数.太少的话,收敛的不好. LREAL=A APACO=10 径向分布函数距离,单位是埃. NPACO=200 径向分布函数插的点数. LCHARG=F 尽量不写电荷密度,否则CHG文件太大. TEBEG=300 初始温度. TEEND=300 终态温度。不设的话，等于TEBEG. SMASS -3 NVE ensemble；-1 用来做模拟退火；大于0 NVT 系综。 ///////////////////////////////////////////////////////////////////// ///////////////////////////////////////////////////////////////////// 1)收敛判据的选择 结构弛豫的判据一般有两种选择：能量和力。这两者是相关的，理想情况下，能量收敛到基态，力也应该是收敛到平衡态的。但是数值计算过程上的差异导致以二者为判据的收敛速度差异很大，力收敛速度绝大部分情况下都慢于能量收敛速度。这是因为力的计算是在能量的基础上进行的，能量对坐标的一阶导数得到力。计算量的增大和误差的传递导致力收敛慢。 到底是以能量为收敛判据，还是以力为收敛判据呢？关心能量的人，觉得以能量
第四章酶分子改造 教学目的：使学生了解酶分子改造的意义和酶分子改造的常用方法。 教学重点、难点：酶分子改造的常用方法，酶蛋白侧链基团修饰和氨基酸置换修饰。 教学方法：讲授 教学手段：多媒体 第一节酶分子修饰概述 一、概述 酶的广泛应用 应用大规模应用酶和酶工艺的尚不够多 酶自身缺点是最根本的原因 不稳定，不适合大量生产需要 工业应用中，常偏离酶最适pH 临床上，外源蛋白质，具有抗原性 改变酶特性的两种主要方法 化学修饰 基因工程技术（蛋白质工程） 二、概念 指通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的过程 创造出天然酶不具备的某些优良性状 提高酶活力 增加酶稳定性 消除或降低酶的抗原性，扩大应用范围，提高经济效益 三、酶分子修饰常用方法 部分水解酶蛋白的非活性主链 利用小分于或大分子物质对活性部位或活性部位以外的侧链基团进行共价修饰 酶辅因子的置换等 基因工程、蛋白质工程（氨基酸置换） 第二节金属离子置换修饰 一、概念 通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法，简称离子置换法二、原理 金属离子往往是组成酶活性中心的部分，对酶的催化功能起重要作用 金属离子的除去、加入与金属离子的置换 活力改变、稳定性等改变 只适用于本来就含有金属离子的酶？ 三、常用金属离子 Ca 2+、Mg 2+、Zn 2+、Mn 2+、Co 2+、Cu 2+、Fe 2+ 四、操作 酶纯化 EDTA鳌合
透析、超滤、分子筛除鳌合物 加入不同金属离子确定实验结果 五、例 锌型蛋白→钙型蛋白，活力提高20%-30% 杂离子型a-淀粉酶→钙离子型，活力提高并增加稳定性，结晶型活力比一般杂离子型结晶高3倍以上 Fe-SOD→Mn-SOD，对H2O2稳定性增强，对NaN3敏感性显著降低 Zn-酰基化氨基酸水解酶→Co型，最适pH从8.5降低到7.0，Km增大 第三节大分子结合修饰 一、概念 利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。是目前应用最广泛的方法。 二、方法 1、修饰剂选择 根据酶分子结构和修饰剂特性选择 右旋糖酐、PEG、肝素、葡聚糖、环糊精、CMC、蔗糖聚合物（Ficoll）、聚氨基酸等 2、修饰剂活化 大分子修饰剂使用前一般要活化，才能与酶分子中相应基团共价结合 考虑酶和大分子修饰剂的空间位阻效应 不同的酶结合的修饰剂种类和数量不同，造成酶功能的改变也不一样，需试验确定最佳的修饰剂的种类和浓度，并注意操作条件 例 PEG：甲基化屏蔽一个羟基得到单甲氧基聚乙二醇（MPEG） 不同类型的PEG衍生物： 聚乙二醇均三嗪衍生物 聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物 聚乙二醇胺类衍生物 聚乙二醇马来酸酐衍生物 右旋糖苷-（高碘酸HIO4）活化右旋糖苷 3、修饰 活化后的大分子修饰剂与经分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH 值等条件下反应，使两者以共价键结合 4、分离 通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶 三、大分子修饰作用 提高酶活力（空间构象改变，利于底物结合） 1分子核糖核酸酶+ 6.5分子右旋糖苷—酶活提高2.25倍 1分子胰凝乳蛋白酶+ 11分子右旋糖苷—酶活提高原来的5.1倍 1分子胰凝乳蛋白酶+ 11分子右旋糖苷—酶活提高5.1倍 增加酶的稳定性 降低或消除酶蛋白抗原性 精氨酸酶（抗癌）经PEG结合修饰后，其抗原性显著降低或消除
酶分子的改造方法及研究进展 裴蓓 10生物技术及应用班 摘要：酶工程的研究已经发展到分子水平，在体外通过基因工程、化学、物理等手段改造酶分子结构与功能，大幅提高了酶分子的进化效率和催化效率，生产有价值的非天然酶。本文对常见的酶分子的改造方法做了一个简单的介绍化学修饰法、生物酶工程法、定点突变法，最后结合当今的形式对酶改造的发展前景做了描述。 关键词：酶分子改造方法前景 正文： 1 酶分子改造的目标 1.1 提高酶的稳定性 1.2 提高酶的活性 1.3 增强酶的选择性 1.4 改变酶的表面特性 2 改造酶分子的方法 近年来，特别是随着蛋白质工程的(protein engineering)应用，即把分子生物学、结构生物学、计算生物化学结合起来，根据蛋白质结构与功能关系的知识，经过计算机辅助的分子设计，按照人类的需要，产生性能优良的酶分子。就目前情况来看，现在常用的酶分子修饰方法有：2.1化学修饰法 在应用过程中，有时会因酶的稳定性差、活力不够理想及具有抗原性等缺点而使其应用受到一定的限制，为此常需对酶进行适当再修饰加工，以改善酶的性能。酶的修饰可分为化学修饰和选择性遗传修饰两类。酶分子的化学修饰是指通过主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造,造的目的在于改变酶的一些性质，创造出天然酶不具备的某些优良性状扩大酶的应用以达到较高的经济效益。酶分子的化学修饰常见的方法有：部分水解酶蛋白的非活性主链，利用小分于或大分子物质对活性部位或活性部位以外的侧链基团进行共价修饰，酶辅因子的置换等。2.2生物酶工程法 酶的化学修饰法并非改造酶的惟一手段。随着人们对酶的深入研究以及氨基酸一级结构的测定、基因重组技术的应用等，可以彻底地改造、合成并且模拟酶。这也就是生物酶工程的主要内容。生物酶工程主要包括基因工程技术生产酶和蛋白质工程技术改造酶两方面内容。 对自然酶的化学结构进行修饰以改善酶的性能的方法很多。例如，a一淀粉酶一般有 Ca2+，Mg等金属离子，属于杂离子型，若通过离子置换法将其他离子都换成Ca2=，则酶的活性提高3倍，稳定性也大大增加；胰凝乳蛋白酶与水溶性大分子化合物右旋糖酐结合，酶的空间结构发生某些细微改变，使其催化活力提高4倍；还有对抗白血病药物——天冬酰胺酶的游离氨基进行修饰后，该酶在血浆中的稳定性也得到很大的提高。 酶进行化学修饰时，应注意：(1)修饰剂的要求 (2)酶性质的了解 (3)反应条件的选择大多
酶分子改造的方法及应用 摘要：酶工程是研究酶的生产和应用的一门技术性学科，进入20世纪后，随着微生物发酵技术的发展和酶分离纯化技术的更新，酶制剂的研究得到不断推进并实现了其商业化生产，但直接利用酶制剂时存在酶的稳定性差、使用效率低、不能在有机溶剂中反应等缺点。通过酶的修饰可提高酶的稳定性，消除或降低酶的抗原性，使之更适合生产和应用的要求。近年来发展的蛋白质工程技术则使酶的定向改造成为可能。随着生物技术的发展，酶工程将引起巨大的变革。 关键词：酶分子修饰蛋白质工程模拟酶 引言：近年来，酶工程开始兴起，迅速发展，其研究成果也越来越广泛地运用于各个领域。虽然如此，但是由于酶一离开其特定的环境条件就会变得不太稳定，不适合大批量生产的需求，因此，大规模应用酶和酶工艺的还不多。在工业应用中，底物及产物带来的影响常常导致pH偏离酶作用的最适条件的中性范围，使酶难以发挥作用。在临床应用上，绝大多数酶对人体而言都是外源蛋白质，具有抗原性，直接注入会引起人体的过敏反应。所以人们希望能够通过各种人工方法改造酶，使其更能适应各方面的需要。 1.酶分子改造的方法 1.1酶分子修饰 酶分子修饰[1]（Modification of Enzyme Molecule）即通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程。酶分子修饰在提高酶的活力、增强酶的稳定性、降低或消除酶的抗原性、研究各种物理因素对酶分子空间构象的影响，进一步探讨酶分子的结构与功能之间的关系等方面具有重要意义。 1.1.1酶分子的主链修饰 酶分子的主链修饰[2]就是利用酶分子主链（肽链或核苷酸链）的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。 1.1.1.2主链的切断修饰[3] 主链断裂后，引起酶活性中心的破坏，酶的催化功能丧失（用于探测酶活性中心的位置）。酶活性中心的空间构象维持不变，酶的催化功能也可以保持不变或损失不多，但是抗原性有发生改变。这样可以提高药用酶的使用价值。主链断裂有利于酶活性中心的形成，可使酶分子显示其催化功能或使酶活力提高。 1.1.1.3主链的连接修饰 将两种或者两种以上的酶通过主链连接在一起，形成一个酶分子具有两种或者多种催化活性的修饰方法称为酶的主链连接修饰。在一个酶分子上具有两种或多种催化活性的酶称为多酶融合体。通过基因融合技术将两种或两种以上的酶的基因融合在一起形成融合基因，再经过克隆和表达，有可能获得各种多酶融合体。 1.1.2酶的侧链基团修饰[4]
分子动力学方法 一、引言 计算机模拟中的另一类确定性模拟方法，即统计物理中的所谓合于动力学方法（Molecular Dynamics Method）。这种方法是按该体系内部的内禀动力学规律来计算并确定位形的转变。它首先需要建立一组分子的运动方程，并通过直接对系统中的一个个分子运动方程进行数值求解，得到每个时刻各个分子的坐标与动量，即在相空间的运动轨迹，再利用统计计算方法得到多体系统的静态和动态特性，从而得到系统的宏观性质。在这样的处理过程中我们可以看出：MD方法中不存在任何随机因素。在MD方法处理过程中方程组的建立是通过对物理体系的微观数学描述给出的。在这个微观的物理体系中，每个分子都各自服从经典的牛顿力学。每个分子运动的内禀动力学是用理论力学上的哈密顿量或者拉格朗日量来描述，也可以直接用牛顿运动方程来描述。确定性方法是实现Boltzman的统计力学途径。这种方法可以处理与时间有关的过程，因而可以处理非平衡态问题。但是使用该方法的程序较复杂，讨算量大，占内存也多、本节将介绍分子动力学方法及其应用。 原则上，MD方法所适用的微观物理体系并无什么限制。这个方法适用的体系既可以是少体系统，也可以是多体系统；既可以是点粒子体系，也可以是具有内部结构的体系；处理的微观客体既可以是分子，也可以是其他的微观粒子。 实际上，MD模拟方法和随机模拟方法一样都面临着两个基本限制：一个是有限观测时间的限制；另一个是有限系统大小的限制。通常人们感兴趣的是体系在热力学极限下（即粒子数日趋于无穷时）的性质。但是计算机模拟允许的体系大小要比热力学极限小得多，因此可能会出现有限尺寸效应。为了减小有限尺寸效应，人们往往引入周期性、全反射、漫反射等边界条件。当然边界条件的引入显然会影响体系的某些性质。 对于MD方法，向然的系综是微正则系综，这时能量是运动常量。然而，当我们想要研究温度和（或）压力是运动常量的系统时，系统不再是封闭的。例如当温度为常量的系统可以认为系统是放置在一个热俗中。当然，在MD方法中我们只是在想像中将系统放入热浴中。实际上，在模拟计算中具体所采取的做法是对一些自由度加以约束。例如在恒温体系的情况下，体系的平均动能是一个不变量。这时我们可以设计一个算法，使平均动能被约束在一个给定值上。由于这个约束，我们并不是在真正处理一个正则系综，而实际上仅仅是复制了这个系综的位形部分。只要这一约束不破坏从一个状态到另一个状态的马尔科夫特性，这种做法就是正确的。不过其动力学性质可能会受到这一约束的影响。 自五十年代中期开始，MD方法得到了广泛的应用。它与蒙特卡洛方法一起已经成为计算机模拟的重要方法。应用MD方法取得了许多重要成果，例如气体或液体的状态方程、相变问题、吸附问题等，以及非平衡过程的研究。其应用已从化学反应、生物学的蛋白质到重离子碰撞等广泛的学科研究领域。 二、分子运动方程的数值求解 采用MD方法时，必须对一组分于运动微分方程做数值求解。从计算数学的角度来看，这个求解是一个初值问题。实际上计算数学为了求解这种问题己经发展了许多的算法，但并不是所有的这些算法都可以用来解决物理问题。下面我们先以一个一维谐振子为例，来看一下如何用计算机数值计算方法求解初值问题。一维谐振子的经典哈密顿量为 （2.1） 这里的哈密顿量（即能量）为守恒量。假定初始条件为x(p)、p(0),则它的哈密顿方程是对时间的一阶微分方程 （2.2） 现在我们要用数值积分方法计算在相空间中的运动轨迹(X(t)、p(t)) 。我们采用有限差分法，将微分方程变为有限差分方程，以便在计算机上做数值求解，并得到空间坐标和动量随时间的演化关系。首先，
分子动力学(MD) 1 分子动力学（MD）基础 1.1 MD分类 1.2 MD简介 1.3 MD适用范围 2 分子动力学运动方程数值求解 2.1 基础知识 2.1.1 运动方程 2.1.2 空间描述 2.1.3 最小作用量原理 2.1.4 拉格朗日(Lagrange)方程 2.1.5 哈密顿(Hamilton)方程 2.2 粒子运动方程的数值解法 2.2.1 Verlet算法 2.2.2 欧拉(Euler)预测—矫正公式 2.2.3 Gear预测—矫正方法 3 分子动力学原胞与边界条件 3.1 分子动力学原胞 3.2 边界条件 3.2.1 自由表面边界 3.2.2 固定边界 3.2.3 柔性边界 3.2.4 周期性边界 4 势函数与分子力场 4.1 势函数 4.1.1 两体势 4.1.2 多体势 4.2 分子力场 4.2.1 分子力场函数的构成
4.2.2 常用力场函数和分类 5 分子动力学模拟的基本步骤 5.1 设定模拟所采用的模型 5.2 给定初始条件 5.3 趋于平衡计算 5.4 宏观物理量的计算 6 平衡态分子动力学模拟 6.1 系综 6.2 微正则系综的分子动力学模拟6.3 正则系综的分子动力学模拟
1 分子动力学（MD）基础 1.1MD分类 微正则系综（VNE） 正则系综（VNP） 平衡态MD 等温等压系综（NPT） 经典MD 等焓等压系综（NPH） 巨正则系综（ＶＴμ） 非平衡态ＭＤ 量子MD 1.2分子动力学(MD)简介 分子动力学是在原子、分子水平上求解多体问题的重要的计算机模拟方法。分子动力学方法为确定性模拟方法，广泛地用于研究经典的多粒子体系的研究中,是按该体系内部的内禀动力学规律来计算并确定位形的转变。 分子动力学方法是通过建立一组分子的运动方程，并通过直接对系统中的一个个分子运动方程进行数值求解，得到每个时刻各个分子的坐标与动量，即在相空间的运动轨迹，再利用统计计算方法得到多体系统的静态和动态特性, 从而得到系统的宏观性质。 在分子动力学中，粒子的运动行为是通过经典的Newton运动方程所描述。系统的所有粒子服从经典力学的运动规律，它的动力学方程就是从经典力学的运动方程——拉格朗日(lagrange)方程和哈密顿(Hamilton)方程导出。 1.3适用范围 原则上，分子动力学方法所适用的微观物理体系并无什么限制。这个方法适用的体系既可以是少体系统，也可以是多体系统；既可以是点粒子体系，也可以是具有内部结构的体系；处理的微观客体既可以是分子，也可以是其它的微观粒子。 实际上，分子动力学模拟方法和随机模拟方法一样都面临着两个基本限制：
分子动力学模拟方法的基本原理与应用 摘要: 介绍了分子动力学模拟的基本原理及常用的原子间相互作用势, 如Lennard-Jones势; 论述了几种常用的有限差分算法, 如Verlet算法; 说明了分子动力学模拟的几种系综及感兴趣的宏观统计量的提取。 关键词: 分子动力学模拟; 原子间相互作用势; 有限差分算法; 分子学是一门结合物理，和化学的综合技术。分子学是一套方法，该方法主要是依靠牛顿力学来模拟分子体系的运动，以在由分子体系的不同状态构成的系统中抽取样本，从而计算体系的构型积分，并以构型积分的结果为基础进一步计算体系的量和其他宏观性质。 从统计物理学中衍生出来的分子动力学模拟方法(Molecular Dynamics Simulation, MDS) , 实践证明是一种描述纳米科技研究对象的有效方法, 得到越来越广泛的重视。所谓分子动力学模拟, 是指对于原子核和电子所构成的多体系统, 用计算机模拟原子核的运动过程, 从而计算系统的结构和性质, 其中每一个原子核被视为在全部其他原子核和电子所提供的经验势场作用下按牛顿定律运动。它被认为是本世纪以来除理论分析和实验观察之外的第三种科学研究手段, 称之为“计算机实验”手段, 在物理学、化学、生物学和材料科学等许多领域中得到广泛地应用。 科学工作者在长期的科学研究实践中发现，当实验研究方法不能满足研究工作的需求时，用计算机模拟却可以提供实验上尚无法获得或很难获得的重要信息；尽管计算机模拟不能完全取代实验，但可以用来指导实验，并验证某些理论假设，从而促进理论和实验的发展。特别是在材料形成过程中许多与原子有关的微观细节，在实验中基本上是无法获得的，而在计算机模拟中即可以方便地得到。这种优点使分子动力学模拟在材料研究中显得非常有吸引力。 分子动力学模拟就是用计算机方法来表示统计力学，作为实验的一个辅助手段。分子模拟就是对于原子核和电子所构成的多体系统，求解运动方程(如牛顿方程、哈
第6章分子动力学方法 经典分子动力学方法无疑是材料，尤其是大分子体系和大体系模拟有效的方法之一。分子动力学可以用于NPT，NVE，NVT等不同系综的计算，是一种基于牛顿力学确定论的热力学计算方法。与蒙特卡罗法相比在宏观性质计算上具有更高的准确度和有效性，可以广泛应用于物理，化学，生物，材料，医学等各个领域。本章在介绍分子动力学的基本概念的基础上，简单介绍了分子动力学的基本思想，势函数分类和基本方程。然后介绍了分子动力学的常用系综和典型的NPT，NVE，NVT系综基本方程。结合材料建模中的基本简化方法和技巧，阐述了边界条件和时间积分的数值处理技巧。最后，利用统计力学的基本概念给出分子动力学的计算信息的解析方式。并且结合Materials Explore软件计算分析了CNT的几何结构稳定性。 6.1引言 分子动力学方法(Molecular Dynamics, MD)方法是一种按该体系部的禀动力学规律来计算并确定位形的变化的确定性模拟方法。首先需要在给定的外界条件下建立一组粒子的运动方程，然后通过直接对系统中的一个个粒子运动方程进行数值求解，得到每个时刻各个分子的坐标与动量，即在相空间的运动轨迹，再利用统计力学方法得到多体系统的静态和动态特性，从而获得系统的宏观性质。可以看出，分子动力学方法中不存在任何随机因素，这个也是分子动力学方法和后文要提到的蒙特卡洛方法的区别之一。在分子动力学方法的处理过程中，方程组的建立是通过对物理体系的微观数学描述给出的。在这个微观的物理体系中，每个分子都各自服从经典的牛顿力学定律(或者是拉格朗日方程)。每个分子运动的禀动力学是用理论力学上的哈密顿量或者拉格朗日函数来描述，也可以直接用牛顿运动方程来描述。确定性方法是实现玻尔兹曼的统计力学途径。这种方法可以处理与时间有关的过程，因而可以处理非平衡态问题。但是分子动力学方法的计算机程序相对蒙特卡罗较复杂，其计算成本较高。 分子动力学方法发展历史改革经历了近60年，分子动力学方法是20世纪50年代后期由Alder B J 和Wainwright T E创造发展的。Alder和Wainwright在1957年利用分子动力学模拟，发现了“刚性球组成的集合系统会发生由其液相到结晶相的相转变”，后来人们称这种相变为Alder相变。其结果表明，不具有引力的粒子系统也具有凝聚态。到20世纪70年代，产生了刚性体系的动力学方法，成功地被应用于水和氮等分子性溶液体系的处理；1972年，Less A W和 Edwards S F 等发展了该方法并扩展到了存在速度梯度，即处于非平衡状态的系统。之后，此方法被 Ginan M J等推广到了具有温度梯度的非平衡系统，从而构造并形成了所谓的非平衡分子动力学方法体系。进人20世纪80年代之后，出现了在分子部对一部分自由度施加约束条件的新的分子动力学方法，从而使分子动力学方法可适用于类似蛋白质等生物大分子的解析与设计。分子动力学方法真正作为材料科学领域的一个重要研究方法，开始于由Andersen, Parrinello和Rahman等创立恒压分子动力学方法和Nǒse 等完成恒温分子动力学方法的建立及在应用方面的成功。后来，针对势函数模型化比较困难的半导体和金属等，1985 年人们又提出了将基于密度泛函理论的电子论和分子动力学方法有机统一起来的所谓Car-Parrinello 方法，亦即第一性原理分子动力学方法。这样，分子动力学的方法进一步得到发展和完善，它不仅可以处理半导体和金属的间题，同时还可应用
酶的化学修饰基本原理及修饰酶的性质特点 【摘要】酶是高效生物催化剂，在工业、医学、科研等领域有着非常广泛的应用，尤其在工业生产中创造出巨大的经济效益。但由于酶是蛋白质，稳定性差且在生物体内具有较大的免疫原性，因而严重制约了其应用。对酶分子进行化学修饰是提高其稳定性的方法并且能够降低在生物体内的免疫原性，能够扩大其应用范围，极大地改善酶本质的不足。简要介绍酶的化学修饰基本原理及修饰酶的性质特点。 1酶的化学修饰的基本原理 酶分子的化学修饰就是在分子水平上对酶进行改造，包括对酶分子主链结构的改变和对其侧链基团的改变。前者是分子生物学层次上的修饰，即在己知酶的结构与功能盖系的基础上，有目的地改变酶的某个活性基团或氨基酸残基，从而使酶产生新的性状，又称理性分子设计，理性分子设计主要应用于改造酶的底物特异性?催化特性以及热稳定性，Shaffer等通过将天冬氨酸转氨酶的Val39、 Lys41、Thr47、Ash69、Thrl09和Ash297突变为酪氨酸转氨酶所对应的Leu、Tyr、Ile、Leu、Set和Ser，修饰酶对Phe的活性增加3个数量级，而对Asp的活件没有影响，然而，由于酶的结构、功能和作用机制没自完全了解，而且仅仅把氨基酸序列的同源性作为氨基酸取代的标准，加上氨基酸取代后有可能导致没构想的改变，所以，并非所有理性分子设计都能取得预期效果，这就严重制约了理性分子设计的应用。 1. 1功能基团的修饰 酶分子可离解的基团如氨基（NH2）、羧基（?COOH）、羟基（0H）、巯基（sH）、咪锉基等都可用来修饰。脱氨基作用可改善酶的稳定性，消除酶分子表面的氨基酸的电荷，酰化反应，可改变侧链羟基性质。这些修饰反应，可稳定酶分子有利的催化活性现象，提高抗变性的能力。 1.2用表面活性剂对酶进行化学修饰 除糖基修饰外，也有人用表面活性剂对酶进行化学修饰。表面活性剂的亲水部
第六章 分子动力学方法 6.1引言 对于一个多粒子体系的实验观测物理量的数值可以由总的平均得到。但是由于实验体系又非常大，我们不可能计算求得所有涉及到的态的物理量数值的总平均。按照产生位形变化的方法，我们有两类方法对有限的一系列态的物理量做统计平均： 第一类是随机模拟方法。它是实现Gibbs的统计力学途径。在此方法中，体系位形的转变是通过马尔科夫(Markov)过程，由随机性的演化引起的。这里的马尔科夫过程相当于是内禀动力学在概率方面的对应物。该方法可以被用到没有任何内禀动力学模型体系的模拟上。随机模拟方法计算的程序简单，占内存少，但是该方法难于处理非平衡态的问题。
另一类为确定性模拟方法，即统计物理中的所谓分子动力学方法（Molecular Dynamics Method）。这种方法广泛地用于研究经典的多粒子体系的研究中。该方法是按该体系内部的内禀动力学规律来计算并确定位形的转变。它首先需要建立一组分子的运动方程，并通过直接对系统中的一个个分子运动方程进行数值求解，得到每个时刻各个分子的坐标与动量，即在相空间的运动轨迹，再利用统计计算方法得到多体系统的静态和动态特性, 从而得到系统的宏观性质。因此，分子动力学模拟方法可以看作是体系在一段时间内的发展过程的模拟。在这样的处理过程中我们可以看出：分子动力学方法中不存在任何随机因素。 系统的动力学机制决定运动方程的形式： 在分子动力学方法处理过程中，方程组的建立是通过对物理体系的微观数学描述给出的。在这个微观的物理体系中，每个分子都各自服从经典的牛顿力学。每个分子运动的内禀动力学是用理论力学上的哈密顿量或者拉格朗日量来描述，也可以直接用牛顿运动方程来描述。这种方法可以处理与时间有关的过程，因而可以处理非平衡态问题。但是使用该方法的程序较复杂，计算量大，占内存也多。
碱性磷酸酶的定向进化设计方案 酶分子定向进化又称为酶分子体外进化，属于蛋白质的非理性设计，是蛋白质工程的新策略，是在试管中模拟达尔文进化的过程，利用分子生物学手段在分子水平创造分子的多样性，结合灵敏的筛选技术，迅速得到理想的突变体。与传统的理性设计相比，它不需事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，而是人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，产生基因多样性，并结合定向筛选（或选择）技术，获得具有某些预期特征的改构酶。 方案：在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合酶不具有3’->5’校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的。 DNA改组（DNA shuffling）又称有性PCR(sexual PCR)，原理。该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获取最佳突变组合的酶。通过DNA改组, 不仅可加速积累有益突变，而且可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体。 外显子改组（exon shuffling）类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，前者尤其适用于真核生物。在自然界中，不同分子的内含子间发生同源重组，导致不同外显子的结合，是产生新蛋白质的有效途径之一。与DNA改组不同，外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。定向进化中，突变具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类，降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。 通常,筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关。另有一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。 技术路线：
分子动力学模拟： 对于原子核和电子组成的多体体系，求解运动方程（哈密顿，牛顿，拉格朗日），用经典和量子化方法求解粒子的运动状态。 MC方法：系综（抽样）平均法分子动力学：时间平均 一优点：遇到的不利影响因素回避掉,从而达到实验研宄难以实现的控制条件。核心算法：粒子的运动状态就必须把运动方程离散化，离散化的方法有经典Verlet算法、蛙跳算法(Leap-frog)、速度Veriet算法、Gear预估-校正法等。 缺点：元胞体积和形状不变，不含有自由电子，对金属体系计算不理想。 注意：一般而言，MD模拟时间足够长，初始条件不会影响计算结果，但是会加大构型平衡的计算时间。 二步骤： 1.选取所要研究的系统并建立适当的模拟模型。 2.设定区域的边界条件，选取粒子间相互作用势模型；要注意观察PBC边界条 件的使用，以及计算格子和建模的晶格子之间的关系。体系是单胞沿不同方向重复叠合而组成。但模拟时只保留基本单元，由平移对称矩阵计算得到其他原子的空间坐标。最小近邻的截断半径。 3.设定系统所有粒子的初始位置和初始速度； 4.计算粒子间相互作用力和势能，以及各个粒子的位置和速度；最好与实际模 型相符，以减少达到平衡的时间。势场参数调整，最小近邻的截断半径。 对势：LJ势（惰性气体，过渡金属，柔韧材料），Born-lande势（离子晶体），Morse势，Johnson势（金属）发展到三体势，缺点是导致Cauchy关系，即不能描述晶体的弹性性质。
多体势：80年代以后，EAM势等（晶体对势+核嵌入电子云嵌入能），多用于金属。 5.待体系达到平衡后，构型积分获得体系的宏观性质。选取合适的系综，控制 温度和压力的变化。 控温方法：