植物遗传资源学报2007,8(4):396～400Journal of Plant Genetic Res ources
38份瓠瓜种质资源遗传多样性的I SSR 分析
高 山1
,许端祥1
,林碧英1
,钟开勤
2
(1福建省福州市蔬菜科学研究所,福州 350012;2福建农林大学园艺学院,福州 350002)
摘要:采用I SS R 分子标记技术对源自中国7个省份的38份瓠瓜种质进行遗传多样性分析。12个I SSR 引物共扩增出96条多态性带,平均每个引物扩增的多态性带数为8条,多态性比率平均为83.5%。聚类分析将供试的38份种质分为4个类群
8组,主坐标分析将其分为4个类群10组。I SS R 分子标记的分类结果与瓠瓜的农艺性状分类和地理分布有一定的相关性。
关键词:瓠瓜;种质;遗传多样性;I SSR
收稿日期:2007204215 修回日期:2007208228基金项目:福州市科技星火项目(2005-03)
作者简介:高山,硕士,副研究员,主要从事蔬菜遗传与育种研究
Geneti c D i versity Analysis of 38Bottle Gourd
[L agena ria sicera ria (M ol.)St and.]Accessi ons by I SSR
G AO Shan 1
,XU Duan 2xiang 1
,L I N B i 2ying 1
,ZHONG Kai 2qin
2
(1Fuzhou Institute of V egetable C rops,Fuzhou 350012;2College of Horticulture
in Fujian A griculture and Forestry U niversity,Fuzhou 350002)
Abstract:I nter 2si m p le sequence repeat (I SSR )were used t o detect the genetic diversity a mong 38bottle gourd accessi ons fr om 7p r ovinces in China .T welve I SSR p ri m ers p r oduced 96poly mor phic bands,with averaged 8poly 2mor phic bands each p ri m er pair .The average percentage of poly mor phic bands was 83.5%.38accessi ons were clustered int o 4gr oup s and 8subgr oup s based on the I SSR data by the method of clustering analysis,and 4gr oup s and 10subgr oup s by the method of p rinci pal coordinates analysis .The results fr om I SSR molecular markers showed obvi ous correlati on with the agr onom ic characteristics classificati on and the geographical distributi on of the bottle gourd accessi ons .
Key words:L agenaria sicera ria (Mol .)Stand .;Ger mp las m;Genetic diversity;I SSR
瓠瓜L agenaria siceraria (Mol .)Stand .,原产赤
道非洲南部低地,在我国栽培历史悠久,可上溯到新石器时代,是长江以南地区广泛种植的瓜类蔬菜,类型和品种十分丰富。但是我国对瓠瓜的种质资源研究甚少,基于分子水平的遗传多样性更缺乏研究,国内未见有关于分子标记在瓠瓜上的研究报道,国外相关文献曾报导利用RAP D 标记对瓠瓜遗传多样性
的研究[1～2]
。
I SSR (I nter 2si m p le sequence repeat poly mor phic
DNA )是由Zietkiewicz 等[3]
创建的一种分子标记技术,根据植物基因组中具有丰富的简单序列重复(SSR s )的特点,在SSR 的3′或5′端加锚1～4个嘌呤或嘧啶碱基,组成单引物进行重复序列间DNA 的
PCR 扩增。I SSR 标记克服了RAP D 标记稳定性差
的缺点,具有标记重复性好、多态性丰富、有显性或
共显性的特点。目前,该标记技术已广泛应用在种质鉴定、亲缘关系分析、遗传多样性分析和遗传图谱
构建等研究上[4～9]
。
本研究利用I SSR 分子标记技术分析瓠瓜种质资源的遗传多样性,旨在为瓠瓜遗传资源的鉴定、优良品质资源的发掘、改良以及在杂种优势育种上的应用提供参考。
1 材料与方法
111 材料
试验材料为38份由福州市蔬菜科学研究所历
4期高 山等:38份瓠瓜种质资源遗传多样性的I SSR分析
年收集的地方品种以及从台湾引进的部分品种,经
6代自交纯化的稳定自交系(表1),38份种质都属
于瓠瓜的变种之一———瓠子。
表1 供试材料的名称及来源
Table1 O r i g i n and nam e of the bottle gourd accessi on s
编号No.品种名称
Na me
来源
O rigin
编号
No.
品种名称
Na me
来源
O rigin
1汉龙青玉湖北20油青早蒲瓜湖南2汉龙碧玉湖北21华蒲1号湖北3改良瓠子瓜湖北22早春二号短瓠湖北4温州长瓜浙江23贵妃瓠瓜湖北5福州芋瓠福建24冷江早熟绿皮瓠子湖南6特优油绿蒲瓜广东25特早短棒瓠瓜湖南7创丰瓠瓜湖北26怡田瓠瓜湖北8青霞二号湖北27台湾瓠瓜台湾9长乐台湾28台湾早生瓠瓜台湾10永乐台湾29早熟瓠瓜江西11超早生瓠瓜广东30早绿短瓠瓜四川12原叶七叶早瓠子江西31春霸瓠瓜四川13孝感瓠子湖北32春秋短瓠子湖北14福圣瓠瓜湖北33早生短棒瓠广东15早生短棒瓠瓜台湾34极早生瓠瓜广东16早熟短棒瓠子台湾35超大碧秀福建17新型短身油绿蒲瓜广东36青秀瓠瓜四川18温蒲1号浙江37金钱头短身油绿蒲瓜广东19杭州长瓜浙江38早生蒲瓜福建
112 D NA提取和I SSR分析
各供试材料采用穴盘育苗,待长至2片真叶,各试材分别选取15株,剪取刚展开的健康嫩叶,液氮研磨,采用改良的CT AB法[6]提取瓠瓜总DNA,用紫外分光光度计在260nm和280nm下测定OD值,检测DNA的质量和浓度,并稀释到30ng/μl作为PCR扩增的模板。
瓠瓜I SSR-PCR反应体系优化为25μl,其中含10×PCR buffer,200μmol/L dNTP,0.5μmol/L引物,
2.5mmol/L Mg Cl2,30ng模板DNA,0.75U的Taq酶。
I SSR引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。
PCR扩增反应在PCR(Eppendorf Mastercycler gradient)仪上进行,PCR扩增程序为:94℃预变性5m in;92℃60s,53～62℃(不同的I SSR引物有其特异退火温度)70s,72℃120s,45个循环;72℃7m in; 4℃保存。反应结束后,PCR产物在含有015μg/m l EB的1.8%琼脂糖凝胶中电泳2h,在捷达凝胶成像系统进行拍照分析。
113 聚类分析和主坐标分析
将电泳图谱清晰且可重复的DNA条带记赋值为“1”,同一位置上的弱带且不重复或未出现带的赋值为“0”,形成“1”、“0”数据矩阵,利用NTSYS2pc 2.10数据分析软件进行聚类分析和主坐标分析。用Si m Qual程序求Nei2L i相似性系数矩阵,用S AHN 程序中的UPG MA方法进行聚类分析,用DCE NTER 程序进行系数矩阵转换,并用E I GEN程序求特征值和特征向量进行主坐标分析,用Tree p l ot模块生成聚类图,构建分子进化树,用3Dp l ot生成主坐标图。
2 结果与分析
211 瓠瓜D NA的I SSR多态性分析
从40个I SSR引物中选取能够产生稳定、清晰多态性扩增条带的12个引物进行分析。结果表明, 38份供试种质间检测到了丰富的遗传多样性(图1)。12个引物(表2)扩增出96条多态性带,每个引物平均8条多态性带。引物多态性信息含量变幅40%～100%,平均为83.5%。
212 聚类分析
利用96条多态性条带建立遗传相似矩阵,经聚类分析构建亲缘关系树状图(图2)。聚类分析表明,38份供试种质的遗传相似系数为0.43～0.96,平均为0.58。福州芋瓠与汉龙碧玉相似性系数最大为0.96,在相似系数0.63处可将供试的38份瓠
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图1 I SSR 引物834对38个瓠瓜材料的I SSR -PCR 扩增电泳图
F i g .1 The I SSR 2PCR am pli f i ca ti on pa ttern s by pr i m er 834on 38bottle gourd accessi on s
表2 I SSR 分析所用的引物序列与扩增结果
Table 2 The pr i m er sequence and the am pli f i ed results of I SSR ana lysis 引物
Pri m er
序列
Sequence 总带数
Total band number
多态性带数
Num.of poly mor phic bands
多态性比率(%)
Percentage of poly mor phic bands
808(G A )8GC 1099010809(G A )8GG 11872.7810(G A )8T 119
81.8812(G A )8C 11
8
72.7
813(CT )8T 524010816(CA )8T 6583.3824(TC )8G 121210010825(AC )8T 548010826(AC )8C 161381.3827(AC )8G 6610010829(TG )8C 131184.6834(AG )8CTT
9910010
Total
115
96
图2 38份瓠瓜材料的I SSR 标记聚类图
F i g .2 D endrogram for 38bottle gourd accessi on s ba sed on I SSR markers by UP
G M A m ethod
8
93
4期高 山等:38份瓠瓜种质资源遗传多样性的I SSR分析
瓜种质划分为4个类群。
在第Ⅰ类群中包括了17份种质,可再分为3个组。第1组为汉龙青玉、春霸等7份种质,其中有6份来自湖北,瓜型为长圆柱形、瓜色绿,属早熟类型;第2组为汉龙碧玉、福州芋瓠等8份种质,瓜型圆柱形、瓜色浅绿,属中熟类型;第3组为超大碧秀和青秀瓠瓜,瓜型长棒状、瓜色浅绿,中熟。
第Ⅱ类群有13份种质,分为2组。第1组以温州长瓜、杭州长瓜为代表,来自江浙地区,瓜型线状,早熟类型,共7份材料;第2组包括孝感瓠子、华蒲1号等6份,瓜型圆柱形为主,白绿色。
第Ⅲ类群有6份种质,分为2组。第1组为长乐,源自台湾,植株长势旺,孙蔓结瓜为主,长棒状,属于晚熟类型。第2组5份种质,瓜型圆柱形或短棒状,中晚熟,其中永乐、台湾瓠瓜、台湾早生瓠瓜等3份种质,源自台湾。
第Ⅳ类群有2份种质,分别为早生短棒瓠瓜、早熟短棒瓠子,都来自台湾的短棒瓠瓜。
213 主坐标分析
对I SSR标记的结果进行主坐标分析,前3个主坐标解释的变异分别为20.48%、12.59%和9183%,对38份种质做第一、第二主坐标二维图的排序和前3个主坐标三维图的排序(图3、4),38份瓠瓜种质在第一、二坐标排序中分成4类,在第三个主坐标方向,4个类群内又可以分为若干个小组。
由图3、4可知,第Ⅰ类群有2份种质位于二维坐标图的第Ⅰ区,分别为早生短棒瓠瓜和早熟短棒瓠子,均源于台湾,瓜形短棒。
第Ⅱ类有6份种质,位于二维坐标图的第Ⅰ、Ⅱ区。从第一、二主坐标方向上分析(图3),永乐与周围其他种质的距离较远,可单列为1组。而在第三主坐标方向上,台湾瓠瓜、台湾早生瓠瓜和金钱头短身油绿蒲瓜从原来组中分出来,另外聚为1组。因此,在3个主坐标方向上,可将第Ⅱ类分为3组。该类群有4份种质来源于台湾。
第Ⅲ类有17份种质位于第Ⅱ和Ⅲ区间,以瓜形圆柱形、皮色绿色为主,属早或中熟类型,在第一、二坐标方向没有被细分,在第三坐标方向上被分为2组,第1组包括汉龙青玉、春霸等7份种质,其中有6份来自湖北,表现为瓜型长圆柱形、瓜色绿,属早熟类型;第2组包括汉龙碧玉、福州芋瓠等10份种质,表现为瓜型圆柱形或长棒状、瓜色浅绿,属中熟类型。
第Ⅳ类为13份早熟类型种质,从第一、二主坐标方向(图3)中可分为2组。第1组有6份种质,在第三坐标方向上可再细分2组,来源于浙江,表现为瓜型线状;早熟类型的温州长瓜等4份种质分为一组;来自湖南的油青早蒲瓜、冷江早熟绿皮瓠子分为另一组。第2组有7份瓠瓜种质,新型短身油绿蒲瓜在第三坐标方向上与周围其他种质遗传距离较远,可另分一组。因此,前3个主坐标可将第Ⅳ类群分为4组。
综合前3个主坐标方向,38份瓠瓜种质可分为4个类群10组
。
图3 38份瓠瓜材料依据I SSR分析
的主坐标散点图(图中编号为供试瓠瓜材料编号,下同)
F i g.3 The sca tterplot of pr i n c i pa l coord i n a tes ana lysis
of38bottle gourd accessi on s ba sed on I SSR ana lysis (The nu mbers in the figure are the codes of bottle
gourd accessi ons,the sa me as bel ow
)
图4 38份瓠瓜材料依据I SSR分析的三维主坐标图
F i g.4 Three d i m en si ona l plot of pr i n c i pa l coord i n a tes
ana lysis of38bottle gourd accessi on s
ba sed on I SSR ana lysis
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通过比较图2、3、4可知,对38份瓠瓜种质进行的系统聚类分析和主坐标分析的结果基本一致。但是,主坐标分析可以从不同方向、不同层面更加直观地显示各种质的关系。
3 讨论
I SSR分子标记理论上检测区域可覆盖整个基因组,扩增的多态性条带能较全面地反映群体变异。从本试验结果来看,I SSR技术能有效地检测瓠瓜材料间的遗传变异,对瓠瓜的遗传多样性分析是完全可行的。
本试验中采用系统聚类分析和主坐标分析所获得的结果基本一致,两种分析所表达的信息各有特点:系统聚类分析能提供丰富的数量信息,量化地体现瓠瓜种质之间的关系。主坐标分析能从不同的方向和层面更直观地提供更多的关于瓠瓜各种质或群体的关系。因此,两种方法并不重复,将系统聚类分析和主坐标分析结合起来使用,可以互相印证和补充。
从两种分析的结果可知,瓠瓜种质的农艺性状和地区分布与分子标记存在相关性。从地理分布来看,来自台湾地区的瓠瓜种质首先聚在一起,以晚熟、短棒类型为主,与大部分大陆瓠瓜种质遗传差异很大,这是由于长期的海峡两岸隔绝,不同定向选择的结果。在地方性品种中,如江浙地区长线形、早熟类型的瓠瓜种质和福建地区的瓠瓜在瓜型和熟性上存在明显的差异,分别属不同类群,反映出大陆不同地区之间瓠瓜种质资源的遗传多样性。结果表明,湖北的瓠瓜种质资源存在较丰富的遗传多样性,分布在2个类群中,对育种材料遗传背景的拓展和种质的利用上均有重要的地位和价值。
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