细胞培养—无菌操作
细胞培养是一种常见的生物技术操作，可以用来研究细胞的生理功能、细胞的增殖和分化以及生物化学反应等。在进行细胞培养时，无菌操作至
关重要，因为细胞非常容易受到外部微生物的污染，从而影响实验结果的
准确性。下面将介绍细胞培养的无菌操作步骤。
1.准备工作
在进行细胞培养之前，需要准备好以下工具和试剂：
-培养皿：使用符合实验要求的培养皿，常见的有培养瓶、细胞培养
板等。
-培养基：根据实验需要选择适当的培养基，例如DMEM、RPMI-1640等。
-无菌操作台：无菌操作台提供一个无菌的工作环境，可以防止微生
物的污染。
-显微镜：显微镜可以用来观察细胞的形态和增殖情况。
-移液器和吸头：用于移液操作，需要保持无菌。
-无菌培养液：例如乙醇、连苯三氯和消毒液等。
-消毒器材：例如灭菌器、高压蒸汽灭菌器和紫外线灭菌器等。
2.准备培养皿和培养基
将培养皿放入无菌操作台的工作区域内，通过高压蒸汽灭菌器或紫外
线灭菌器对培养皿进行灭菌处理，确保其表面无菌。然后用无菌移液器加
入适量的培养基到培养皿中，根据实验需要选择适当的培养基。
3.细胞接种
将需要进行细胞培养的细胞按照预定的密度接种到培养皿中。在进行
细胞接种前，需要将细胞培养液中的细胞进行离心，去掉上清液，然后用
适量的培养基将细胞悬浮液稀释到适当的细胞密度。在接种细胞时需要注意，避免将培养皿的口部接触到任何表面，以免引入微生物污染。
4.细胞培养
将接种好的细胞培养皿放入细胞培养箱或培养箱中进行培养，保持适
当的温度和湿度。通常将细胞培养箱设置在37摄氏度，5%二氧化碳的环
境中，以模拟人体体内的条件。在细胞培养过程中需要定期检查细胞的状态，观察细胞的形态和增殖情况。
5.细胞培养的无菌操作
在培养细胞的整个过程中，需要保持无菌操作。在进行任何操作之前，需要在无菌操作台上烧毁以杀死细菌和真菌。接种细胞、更换培养基、观
察细胞等一系列操作都需要在无菌操作台上进行，以减少细胞受到外部污
染的机会。
6.细胞传代
随着细胞的增殖，细胞数目会不断增加，细胞所在的培养皿可能会变
得拥挤，影响细胞的生长和分化。因此，需要定期对细胞进行传代，即将
细胞从一个培养皿中移植到新的培养皿中。在进行细胞传代时，需要先将
原始培养皿中的培养基和细胞悬浮液吸出，然后用无菌的移液器将细胞转
移到新的培养皿中。
7.细胞冻存
在一些情况下，需要将细胞保存起来以备后续使用。此时，可以使用特殊培养基和添加剂，将细胞冻存起来。冻存细胞前，需要对细胞进行离心操作，去除培养基后再加入冻存培养基中。然后将细胞和冻存培养基混合均匀，分装到冷冻管中，通过冷冻仓或液氮保存。
细胞培养是一项需要细心和耐心的工作，无菌操作是保证实验结果准确性的关键。通过严格遵守无菌操作的步骤和规范，可以有效地防止细胞培养中的微生物污染，从而获得可靠的实验结果。
细胞培养中无菌操作技术 细胞培养中的无菌技术： 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转1 0 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株的操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管、吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面的中央无菌区域，勿在边缘的非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌的实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身的安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染的细胞株应特别小心操作，并选择适当等级的无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 的产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头的伤害等。 5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶的CO2 压力
5.2. CO2 培养箱的CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 5.3. 无菌操作台内的airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。
花鲈肌肉和肝脏组织细胞原代培养 1.细胞培养准备工作 准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。具体工作如下： 一、清洗 （1）常用器具：细胞培养瓶、细胞培养板、培养皿、广口瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、电子天平、纱布、脱脂棉、止血钳、镊子、解剖 剪、解剖刀、解剖针、注射器、注射器过滤器、移液枪、枪头、 离心管、细胞冻存管、酒精灯、试管架、超净工作台、倒置显微 镜、生化培养箱、烘箱、液氮罐、封口膜、喷壶、以及洗刷用品 等。 （2）玻璃器皿清洗：烧杯、量筒、玻璃棒、广口瓶（瓶盖不泡盐酸，清洗赶紧后直接高压灭菌）等玻璃器皿自来水刷洗，除去灰尘， 烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、 砷等物。泡盐酸12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗， 自来水冲干净，然后用蒸馏水冲洗干净后用烤箱烘干，高压灭菌， 烘干备用。 （3）塑料器皿的清洗：细胞培养皿、培养板、培养瓶可以直接使用，进口枪头、进口离心管高压灭菌。 （4）金属制品的清洗：止血钳、镊子、解剖剪、解剖刀等先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水， 然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好， 高压灭菌，再烘干备用。 （5）棉织品：纱布和脱脂棉，高压灭菌，再烘干备用。 二、溶液配制 （1）PBS： 用电子天平准确称取NaCl /8.0 g，KCl /0.2 g，KH2P04/
0.29 g，Na2HP04-12H20/ 1.42 g溶于800 mL的超纯水中，用玻璃 棒搅拌至溶解后调节pH值为7.2～7.4，然后定容至1L。置于高 压灭菌锅中灭菌30min，冷却到室温后分装，于4℃冰箱冷藏备用。 等渗0.01MPBS（1X PBS）细胞培养用，用电子天平准NaCl/8.00g浓度为8/58.5=0.13675M，本配方主要靠NaCl，KCl/0.20g浓度为0.2/74.5=0.00268M，Na2HPO4·12H2O/2.90g浓度 为 2.90/358= 0.0081M Na2HPO4·2H2O/1.44g浓度为 2.90/358= 0.0081M，KH2PO4/0.24g浓度为0.25/136= 0.0019M，溶于800 mL 的dddH2O，用玻璃棒搅拌至溶解，dddH2O定容至1000ml。置 于高压灭菌锅中灭菌30min，冷却到室温后分装，于4℃冰箱冷藏 备用。 用电子天平准确称取NaCl /8.0 g，KCl /0.2 g，KH2P04/ 0.2g，Na2HPO4-7H20/2.16 g，MgCL2·6H2O/0.1g，CaCL2/0.1g溶于 800 mL的超纯水中，用玻璃棒搅拌至溶解后调节pH值为7.2～7.4，然后定容至1L。置于高压灭菌锅中灭菌30min，冷却到室温后分 装，于4℃冰箱冷藏备用。 （2）0.25%胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶粉末（1：250）0.25g，用PBS在容量瓶中定容至100ml，0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装，于－ 20℃保存。 （3）0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液：准确称取0.25g的Trypsin 和0.02g的EDTA，用PBS在容量瓶中定容至100ml，调节pH值 为7.2-7.4，用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，用2mL的离心管 分装，冻存于-20℃冰箱备用。 （4）培养基：基础培养基MEM，这是使用最为广泛的培养基；完全培养基配置方法为：1L MEM基础培养基添加4.76g HEPES充分 溶解后，用NaOH將PH调到7.4，加2ng/ml bFGF，20%小牛血 清，1mmol/L的L-谷氨酸，50mmol/L的2-巯基乙醇，100IU/ml 青霉素和100ug/ml链霉素。 （5）HEPES溶液：配置100×贮存液（1mol/L），在99ml培养液中加
细胞实验考核要点 一、准备工作 1、清点超净台中仪器物品（垃圾桶、饭盒中三种管、橡胶塞、蓝枪头、移液枪、电子枪、50ml离心管、镊子、剪刀、marker笔、打火机、卫生纸、6孔板、平衡50ml内含1ml离心管），合理布置台面。 2、超净台灭菌：酒精喷洒超净台面，紫外照射20min左右。 3、预热：将PBS、10%FBS、胰酶装进PE手套中，37℃预热备用。 二、实际操作1、点燃酒精灯 2、从水浴锅中取出预热的三种液体，喷酒精后放入超净台，用卫生纸擦拭瓶壁酒精。撕开三个封口膜。瓶口在外焰烧灼烧，拧松三个瓶盖，以备用。 3、手喷酒精后，旋松并取出T25瓶。在显微镜下观察细胞长势，若细胞密度达到了80%-90%，则可以进行传代。注意若显微镜没有人用过，需要在载物台附近喷洒酒精后擦拭。 4、将T25拿到超净台里面。手进入台面内需酒精喷洒消毒（后不赘述）。打开吸泵。 5、来回灼烧吸泵铁头。旋开T25瓶，注意灼烧瓶盖，瓶盖扣放。铁头插上两个蓝枪头，瓶身倾斜吸去瓶中原培养基。灼烧瓶盖和瓶口后盖盖，不要盖太紧。 6、取1ml移液枪，将T25竖起来，向未生长细胞的侧壁打入5ml PBS冲洗。盖盖后左右上下稍移动。将PBS吸出。关吸泵！ 7、向瓶中加入500ul胰酶。稍混合均匀。放入培养箱中消化2min。计时。 8、2min内需完成的操作 （1）取出一个50ml离心管。 （2）烧套管：镊子在火上过一下，套管盒稍稍开一小口，用镊子取出一个套管，火上来回灼烧，然后放置在离心管架上。 （3）烧弯头吸管：从烧瓶中用镊子取出一个塞子。弯头吸管盒稍开一小口，确定是不是塞棉花的一头。镊子稍稍过火灼烧，开一小口，镊子夹出塞棉花一头，放下镊子，拿出吸管。盒子放回原处。将塞子塞入弯头吸管中。手持塞子来回在火上灼烧，完毕后放入套管中。9、取出培养箱中消化的细胞，显微镜及肉眼观察消化是否合适。若在显微镜下看到细胞质壁分离呈球形，大部分细胞已经脱离瓶壁游走在视野中，肉眼观察有白色的成片细胞脱落，说明消化完成。 10、将消化完成的T25放入超净台，加入500ul培养基。拿出烧好的弯头吸管深入瓶里面吹打瓶壁细胞。注意尽量少产生气泡，每次吹打不要完全将液体排出，这样气泡会大量减少。吹打时要全方位多角度，瓶身每个部位不留死角。 11、将含细胞的液体加入50ml离心管。离心5min。注意平衡离心管。此时将枪调最大量程。 12、5min内需完成的操作 （1）取出两个6孔板，放入超净台中。标记细胞名称、操作者、时间。需用的10个孔分别标记为1-10。 （2）烧10ml管：类似烧弯头吸管的方法灼烧10ml管。注意插到电子移液枪中。刻度应朝着自己能够看清的方向。烧好后备用。 13、取出离心完成的50ml离心管。打开吸泵。 14、旋开瓶口，稍向下倾斜吸出上层液体。盖上离心管盖子。关吸泵。 15、向离心管中加入23ml左右的培养基DMEM。吹打均匀。（师姐要求将T25 传代到6孔板的10个孔中，稀释比例为1:5，每个孔加2ml，大致需要20ml的液体，为了减少液体的损失，需稍多加一点，约23ml左右，不必太精确） 16、向6孔板中每个孔中加入2ml左右的细胞悬液。每次加入之前需再次吹打重悬，防止细胞沉淀。铺板后即可放入培养箱中继续培养。 17、善后工作：封口PBS、DMEM、胰酶，标记日期等信息。回收垃圾和非回收垃圾的放置。
细胞培养无菌操作基本技术 细胞培养是现代生物学研究中常用的一种实验技术，能够使细胞在体 外条件下生长和繁殖。无菌操作是细胞培养过程中非常重要的一项技术手段，可以保证细胞培养环境的无菌纯净，避免细胞被外部微生物污染。本 文将介绍细胞培养中常用的无菌操作基本技术，并结合实例进行详细说明。 无菌操作基本技术主要包括以下几个方面： 1.实验前准备 在进行无菌操作前，首先需要准备好实验所需的培养基、培养器具和 其他实验工具。这些器具和工具需要经过高温高压灭菌处理，以确保其无菌。此外，实验人员还需佩戴无菌手套、穿戴无菌实验服，并对实验台面 进行彻底的清洁消毒，保持实验环境的无菌。 2.灭菌操作 在进行无菌操作前，需要对培养器具进行灭菌处理。常用的灭菌方法 有干热灭菌和湿热灭菌两种。干热灭菌是将培养器具置于高温烘箱中，持 续加热若干小时，以达到灭菌目的。湿热灭菌则是将培养器具置于高压高 温的蒸汽中，进行高压灭菌。此外，对于一些无法耐受高温高压的培养器具，还可使用化学灭菌方法，如使用过氧化氢和酒精进行消毒。 3.无菌操作技术 在进行无菌操作时，需要遵循一定的操作规范。首先，实验人员应将 实验器具放入无菌工作台中，在UV灯的照射下进行灭菌处理。然后，实 验人员需要将自己的双手放入无菌手套中，并使用无菌皮培养工具进行操作。接下来，需要准备好含有培养基的培养皿，并用无菌注射器将细胞转
移到培养皿中。在操作过程中，需要注意避免造成培养基的污染，尽量减 少对培养基的接触时间，以防止细菌或其他微生物的污染。 4.维持无菌操作环境 在进行细胞培养过程中，需要维持无菌操作环境。实验人员应避免在 实验台面上散落细胞培养基、细胞碎片或其他可能造成污染的物质。细胞 培养箱和无菌安全柜的门不可长时间打开，以防止空气中的微生物进入工 作区域。并且需要定期对无菌安全柜和细胞培养箱进行清洁和消毒。同时，实验室人员需要经常进行手部清洁，并定期更换无菌手套和实验服，保持 实验环境的无菌。 细胞培养中的无菌操作是进行细胞培养实验的基础，能够产生可靠的 实验数据，并在细胞学研究中发挥重要作用。但是，无菌操作需要高度的 操作技巧和仔细谨慎的态度，对实验人员的要求很高。因此，在进行无菌 操作前，实验人员需要接受系统的培训，并熟悉无菌操作的各项技术要点，以确保实验的成功进行。
细胞培养—无菌操作 细胞培养是一种常见的生物技术操作，可以用来研究细胞的生理功能、细胞的增殖和分化以及生物化学反应等。在进行细胞培养时，无菌操作至 关重要，因为细胞非常容易受到外部微生物的污染，从而影响实验结果的 准确性。下面将介绍细胞培养的无菌操作步骤。 1.准备工作 在进行细胞培养之前，需要准备好以下工具和试剂： -培养皿：使用符合实验要求的培养皿，常见的有培养瓶、细胞培养 板等。 -培养基：根据实验需要选择适当的培养基，例如DMEM、RPMI-1640等。 -无菌操作台：无菌操作台提供一个无菌的工作环境，可以防止微生 物的污染。 -显微镜：显微镜可以用来观察细胞的形态和增殖情况。 -移液器和吸头：用于移液操作，需要保持无菌。 -无菌培养液：例如乙醇、连苯三氯和消毒液等。 -消毒器材：例如灭菌器、高压蒸汽灭菌器和紫外线灭菌器等。 2.准备培养皿和培养基 将培养皿放入无菌操作台的工作区域内，通过高压蒸汽灭菌器或紫外 线灭菌器对培养皿进行灭菌处理，确保其表面无菌。然后用无菌移液器加 入适量的培养基到培养皿中，根据实验需要选择适当的培养基。
3.细胞接种 将需要进行细胞培养的细胞按照预定的密度接种到培养皿中。在进行 细胞接种前，需要将细胞培养液中的细胞进行离心，去掉上清液，然后用 适量的培养基将细胞悬浮液稀释到适当的细胞密度。在接种细胞时需要注意，避免将培养皿的口部接触到任何表面，以免引入微生物污染。 4.细胞培养 将接种好的细胞培养皿放入细胞培养箱或培养箱中进行培养，保持适 当的温度和湿度。通常将细胞培养箱设置在37摄氏度，5%二氧化碳的环 境中，以模拟人体体内的条件。在细胞培养过程中需要定期检查细胞的状态，观察细胞的形态和增殖情况。 5.细胞培养的无菌操作 在培养细胞的整个过程中，需要保持无菌操作。在进行任何操作之前，需要在无菌操作台上烧毁以杀死细菌和真菌。接种细胞、更换培养基、观 察细胞等一系列操作都需要在无菌操作台上进行，以减少细胞受到外部污 染的机会。 6.细胞传代 随着细胞的增殖，细胞数目会不断增加，细胞所在的培养皿可能会变 得拥挤，影响细胞的生长和分化。因此，需要定期对细胞进行传代，即将 细胞从一个培养皿中移植到新的培养皿中。在进行细胞传代时，需要先将 原始培养皿中的培养基和细胞悬浮液吸出，然后用无菌的移液器将细胞转 移到新的培养皿中。 7.细胞冻存
细胞培养中无菌操作注意事项 细胞培养是一种在无菌条件下培养和繁殖细胞的技术。无菌操作是细 胞培养中至关重要的一步，能够避免外源性微生物的污染，确保细胞的纯 度和健康状态。下面将介绍细胞培养中的无菌操作注意事项。 1.实验前准备： a.保持实验室环境清洁整洁，保证无尘、无杂物的操作台。 b.确保实验室设备（如培养箱、无菌工作台等）处于良好的工作状态。 c.准备充足的培养基、培养器具和试剂，并保证其无菌。 d.穿着干净的实验服、戴上帽子和手套。 2.无菌工作台使用： a.将无菌工作台开启至少30分钟，以确保过滤系统充分运行，并使 工作区域完全无菌。 b.在无菌工作台上进行所有操作，避免在无菌环境外开启培养皿或试管。 c.打开和关闭无菌工作台的过程中，手部和工具都应靠近吸力孔，以 防被外界的空气污染。 3.消毒： a.经常清洁操作台面、墙面和设备表面，使用70%酒精或其他消毒剂 擦拭。
b.外科手术型手套应使用无菌消毒的方法洗手，并将手套顶部折叠入 实验服袖口内。 4.包装的无菌器具的使用： a.避免直接触碰培养皿内表面，以防止菌落的扩散。 b.轻轻解开无菌器具的外包装，避免将外包装上的细菌污染到器具上。 c.使用无菌吸管时，保证吸管顶端不接触任何表面。 5.无菌培养基的制备和使用： a.在无菌工作台上制备培养基，使用消毒剂擦拭培养瓶的瓶口，以避 免细菌进入培养基中。 b.使用严格无菌操作规范，避免对培养瓶瓶口、移液器以及培养皿内 部进行接触，以防止细菌或真菌等污染物进入培养基。 c.每次使用前，验证培养基是否真的无菌，如通过看培养基是否有溶 菌圈形成等方法进行验证。 6.细胞传代过程中的无菌操作： a.检查细胞培养器和培养槽是否处于良好的状态，确保无裂纹、附着 物残留等问题，以防止外源性的细菌感染。 b.每次传代前，使用无菌的PBS等缓冲液冲洗细胞，以去除培养基中 的残留物。 c.使用无菌的移液器和无菌的培养皿转移细胞，避免细胞接触受污染 的物体。 7.培养皿的密封和存放：
细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程 1．原代培养（primary culture） 直接从有机体中取出的细胞、组织或器官开始进行体外培养直到第一次传代为止。这种培养称之为原代培养。 2．传代培养（subculture） 细胞从一个培养皿以1：2或1：2以上的比率转移或移植到另一个器皿的培养，这种培养称之为传代培养。 3．悬浮培养（suspension culture） 细胞培养的一种类型。培养时通过一特殊的装置，使细胞瓶按一定的速度不断地转动，使细胞始终处于悬浮状态中进行增殖。 4．克隆（clone） 克隆指的是从一个细胞靠有丝分裂获得的一个细胞群体（population）。 5．细胞系（cell line） 在第二届细胞和组织培养专题讨论会上提出细胞系的概念为“原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（lineages of cells）所组成。如果不能继续传代或传代数有限，可称有限细胞系（finite cell line），如果可以连续传代，则可称为连续细胞系（continous cell line）。以前认为细胞系来自细胞发生了遗传突变，并带有癌变的特点，这种细胞有可能在培养条件下无限的传下去。这种细胞的特点是染色体为异倍体，丧失了正常细胞的“接触抑制”的特性。 6．细胞株（cell strain） 细胞株的概念如下：由原代培养中，用选择或克隆代，选出具有特征标记的细胞，经传代形成细胞株，这些特性或标记在以后的培养中必须保持下去。以前认为经体外传代培养后细胞不表现退化现象，大约可传50代以上者，其染色体维持二倍体不变，保留正常细胞的“接触抑制”等特性。 一常用设备 一准备室的设备： 双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。 二培养室的设备： 液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。 必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。
细胞培养中无菌操作技术 无菌操作技术是细胞培养中非常重要的一项技术，它可以保证细胞培养中的杂菌和细菌等微生物污染得到很好的控制，从而确保细胞培养的成功率和生长质量。本文将详细介绍细胞培养中常用的无菌操作技术及其步骤。 无菌操作技术主要包括无菌操作环境的建立、实验用具的无菌处理、培养基的无菌处理以及细胞的取样和传代等。无菌操作环境的建立是无菌操作的基础，它可以通过消毒和建立无菌罩来实现。常用的消毒方法包括酒精消毒、紫外线消毒和高温高压灭菌等。在建立无菌罩时，应注意选择合适的位置，确保周围环境的清洁，同时要确保无菌罩内部的无菌条件。 实验用具的无菌处理是无菌操作中的重要步骤之一、在实验开始前，应将所需的实验用具经过高温高压灭菌或酒精消毒处理。对于一次性使用的实验用具，可以选择购买已经经过无菌处理的产品。在实验中，应避免直接接触实验用具，使用无菌吸管或钳子等工具进行操作，减少细菌的接触。 培养基的无菌处理是细胞培养中的重要步骤之一、在使用培养基前，应将培养基经过高温高压灭菌或过滤器进行无菌处理。如果使用过滤器进行无菌处理，应注意选择合适的滤器孔径，以防止细菌的通过。在开启培养基瓶盖时，应注意不要直接接触瓶盖内部，以免污染培养基。 细胞的取样和传代也是无菌操作中的重要步骤。在取样前，应将操作区域经过酒精消毒，并在无菌罩中进行操作。使用无菌吸管或针管取样，避免与容器的边缘接触，防止边缘的污染。在传代过程中，应使用无菌吸管或针管将细胞转移至新的培养基中，避免污染。
除了以上介绍的无菌操作技术，细胞培养中还有一些其他注意事项：在培养室内要注意定期消毒，保持环境的无菌；操作时要避免打喷嚏、咳嗽等行为，防止唾液中的微生物污染实验；尽量避免与其他人员同时进行细胞培养操作，以免相互污染。 总之，无菌操作技术是细胞培养中的重要技术之一，它可以有效控制细胞培养中的微生物污染，确保细胞培养的成功率和生长质量。在无菌操作中，建立无菌操作环境、实验用具的无菌处理、培养基的无菌处理以及细胞的取样和传代等步骤都是非常重要的。同时，细胞培养中还应注意其他细节，如定期消毒、避免打喷嚏等。通过正确使用无菌操作技术，可以确保细胞培养的成功和结果的可靠性。
细胞培养中的无菌技术 细胞培养是现代生物学研究中的一项重要技术。在这个过程中，细胞需要适宜的环境来维持其生长和繁殖。而无菌技术就是保证 细胞培养环境中无任何细菌和病毒的关键技术。下面将介绍一些 细胞培养无菌技术的常用方法。 一、消毒操作 在进行任何细胞培养之前，首先需要对实验室进行消毒操作。 这包括对试管、培养皿、镊子等常用实验用具进行消毒。消毒的 方法包括利用紫外线进行消毒、使用乙醇、过氧化氢、氯仿等消 毒剂进行消毒等。 二、洁净室操作 洁净室是为了防止实验室空气污染而设立的。在洁净室内进行 实验，可以有效地降低实验环境中细菌、病毒等微生物的数量。 洁净室需要进行周期性的消毒操作，并要保证洁净室内的湿度、 温度等参数符合细胞培养的要求。同时，在洁净室内进行实验时 需要佩戴防护服，以避免对细胞培养环境的污染。
三、细胞培养器械清洁 所有使用过的细胞培养器械，例如吸管、移液管、离心管、显 微镜等，都需要进行彻底的清洁。类似消毒操作，可以利用紫外 线进行消毒，或是利用消毒剂进行清洗。 四、培养基准备 无菌细胞培养需要使用无菌培养基。培养基的制备一定要在洁 净室内进行。在制备培养基的时候，需要先对所有试剂进行消毒 操作。为了确保培养基的无菌，还需要经过滤器过滤。 五、细胞处理 在细菌培养过程中，需要对细胞进行定期的检测和处理。例如，在细胞繁殖到一定数量时，需要进行传代操作。在传代时需要对 细胞进行清洗和消毒，以避免可能存在的细菌和病毒污染。 六、实验室操作
在实验室中需要遵守一些基本的无菌操作规范。例如，不要在实验室中吃东西、喝水、吸烟等。并且，在进行细胞培养之前，需要将操作台面和手部彻底清洁，并进行消毒操作。 综上所述，无菌技术是细胞培养过程中至关重要的一步。只有在无菌的环境中，细胞才能够正常繁殖和生长，提供准确的实验结果。因此，在进行细胞培养实验时，无菌技术是必不可少的一环。
细胞培养中无菌操作原理 细胞培养是一种重要的实验技术，用于研究和繁殖细胞。无菌操作是 细胞培养中非常关键的一项技术，它的原理是将实验环境和操作工具彻底 清洁，并采取一系列的防菌措施，以确保培养物中只有目标细胞的生长。 无菌操作原理主要包括以下几个方面： 1.清洁环境：无菌操作必须在无尘、无菌的环境中进行。工作区应保 持清洁，并使用消毒剂对操作台面、试管架等进行消毒。实验室内应保持 较低的湿度，以减少细菌、霉菌的生长。 2.操作工具消毒：在进行细胞培养前，需要对所有操作工具进行彻底 的消毒处理。常用的方法有高温高压灭菌、酒精灯烧燃、紫外线照射等。 对于用于培养细胞的培养皿、培养瓶等容器，可以使用高温高压灭菌仪进 行灭菌。 3.严格操作：在细胞培养的过程中，要避免直接接触空气和其他可能 带有细菌的物质。操作时要佩戴无菌手套，避免手部和器皿的直接接触。 使用专用粉末漏斗将细胞悬液过滤到无菌培养瓶中，避免空气中的微生物 污染。 4.培养基消毒：培养基是细胞培养的关键，因此在培养基制备过程中，必须对培养基进行消毒处理。常用的方法有高温高压灭菌、滤液消毒等。 在培养基制备过程中，还应注意使用无菌操作工具和容器，避免污染。 以上是一些无菌操作的基本原理，但在实际操作中还需要根据具体情 况进行调整。同时，细胞培养过程中还要注意定期监测培养物的无菌性， 及时发现并处理污染问题。
无菌操作的重要性不言而喻，它可以有效地保护细胞培养物的纯度和 健康状态。只有在无菌条件下进行细胞培养，才能获得可靠的实验结果。 无菌操作还广泛应用于医学、食品、制药等领域，以确保产品的质量和安全。 总结起来，无菌操作是细胞培养中非常重要的一项技术，通过清洁环境、消毒操作工具、严格操作和培养基消毒等措施，可以有效地保证培养 物的无菌性。只有在无菌条件下进行细胞培养，才能获得可靠的实验结果。
细胞培养中无菌操作的要求和注意事项细胞培养中无菌操作的要求和注意事项 细胞培养是现代生物学中不可或缺的研究手段之一，而无菌操作是细胞培养的基础，但是在实际操作中我们可能面临着许多不同的挑战。本文将从材料准备、无菌环境、操作要求和注意事项等方面，为读者呈现一些关于细胞培养中无菌操作的基本知识和注意事项。 一、材料准备 在进行细胞培养之前，首先要准备好一系列的培养物和材料。这其中的细节非常重要，因为若未经过足够净化、消毒、或者已经超过了过期日期，就会影响细胞的生长和繁殖。你需要注意以下几点： 1. 无菌哺乳牛血清：血清最好是由经典的公司购买并确保无菌，并且应在低温下储存。 2. 玻璃仪器及塑料制品：使用新的、未污染的塑料制品和玻璃仪器。 3. 消毒工具和消毒剂： ①折射率大于或等于1.49的70%的乙醇消毒剂。 ② 2g/L的有效次氯酸钠，最好制备新的浓度。 ③ 0.1%的氢氧化钠溶液是无菌操作的首选。 二、无菌环境 一个无菌环境可以显著减少细菌和真菌感染的发生率。以下三个因素是细胞培养室无菌操作的关键：
1. 洁净的工作台面：必须将工作区域保持洁净干燥。实验室内的空气 含有许多菌落数量，而在工作室内，热气上升，带着灰尘和污染物质，堆积在培养物中，导致细胞的污染。 2. 过滤空气：在培养室内可以使用HEPA过滤器，过滤空气中的微生物。 3. 严格的个人防护措施：可以使用手套、口罩等工作装备，防止口咳 嗽和其他体液通过呼吸进行感染。 三、操作要求 在日常操作中，细胞培养技术无疑是最需要注意无菌操作的实验之一。下面是一些操作要求的细节： 1. 洗手：在接触细胞培养物或配制培养液之前，应先彻底洗手。 2. 消毒工具和仪器：使所有的工具，包括显微镜、显微镜片、移液器、离心机、传染性物质涂片、细胞培养器等，都要经过彻底的消毒。 3. 改变培养物：更换培养物前，一定要将培养瓶洁净清理，并将外部 污染物完全清除。 4. 替换培养基：在更换培养基时，应注意平衡一下体积，尽量减少气 泡的形成。 四、注意事项 在进行细胞培养时，需要特别注意以下几点：
实验1 细胞培养室的设置和无菌操作 【实验原理】 细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。一般标准的细胞培养室应包括配液室、准备室和培养室。三室既相互连接又相对独立，各自完成培养过程中的不同操作。 【实验目的】 ①了解培养室的设置和设备。 ②学习无菌概念和无菌操作要领。 【操作步骤】 1．实验室设置 （1）配液室 （2）准备室 （3）培养室 培养室内要完全密闭，保持恒定的温度，在设计上要注意以下几点： ①培养室的位置最好设在阴面，阳光不能直接照射的地方，防止室内温度增高。 ②天花板的高度不要超过2米，以保证紫外灯的有效杀菌效应， ③门一般用拉门，以防止空气流动。 ④天花板、地板和四周墙壁要光滑无死角，要镶瓷砖或涂油漆，这样设计，一是便于清洗和消毒，另外也不易在墙角堆积灰尘。 2．实验室常用设备 （1）准备室的设备 ①双蒸馏水蒸馏器：制备双蒸水。 ②酸缸：盛洗液，浸泡玻璃器具。 ③烤箱：洗涤完的玻璃器皿用烤箱烘干。 ④高压锅：玻璃器皿、解剖用具、部分液体、塑料器具等灭菌。不同物品其有效灭菌压力和时间不同。 ⑤储品柜1：放置未消毒物品。 ⑥储品柜2：放置已消毒物品。
⑦包装台：灭菌前的包装用。 准备室注意事项： ①预防蒸馏器被烤干。 ②放置水池中的水渗出。 ③勿将酸液溅到衣物或地面。 ④勿将高压锅排气阀和安全阀堵塞。 ⑤已消毒物品应与未消毒物品分柜存放。 （2）配液室的设备 ①天平（扭力天平和电子天平）：称量用 ②pH计： ③磁力搅拌器： （3）细胞培养室的设备 ①超净工作台： 超净工作台的种类很多，有单面单人、单面双人、双面双人或双面四人等，其工作原理是利用鼓风机，使通过高效滤气的空气，徐徐通过台面，这样使工作环境中具无菌而均匀的空气。 根据层流方式的不同，超净工作台主要分为水平层流式和垂直层流式两种，基本原理大致相同，都是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器，由此送出的洁净气流从一定的均匀的断面风速通过无菌，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。但两种净化台的气流方向不同。
紫外灭菌原理： 紫外线灭菌是用紫外线管照射进行的。波长在220-300纳米的紫外线称为“杀生命区”，其中以260钠米的杀菌力最强。紫外线作用于细胞DNA，使DNA链上相邻的嘧啶碱形成嘧啶二聚体（如胸腺嘧啶二聚体），抑制了DNA复制。另外，空气在紫外线照射下可以产生臭氧，臭氧也有一定的杀菌作用。紫外线透过物质的能力很差，适用于空气及物体表面的灭菌，与被照物的距离以不超过1.2米为易，照射时间以视紫外线灯管的功率大小、被照空间及面积大小，根据灭菌效果测定结果而定。由于紫外线对人体有伤害作用，因此，不要在紫外线灯照射下进行操作。 酒精灯灭菌： 酒精灯的外焰温度可达400-500℃，可以杀死其10厘米以内的细菌。 酒精灭菌： 酒精能吸收细菌蛋白的水分，使其脱水变性凝固，从而能达到杀菌的目的。75%的酒精与细菌的渗透压相近，可以在细菌表面蛋白未变性前逐渐不断地向菌体内部渗入，使细菌所有蛋白脱水、变性凝固，最终杀死细菌，酒精浓度低于75%时，由于渗透压低，也会影响杀菌能力；酒精浓度高时，对细菌蛋白脱水过于迅速，使细菌表面蛋白质首先变性凝固，形成了一层坚固的包膜，酒精反而不能良好地渗入细菌内部，以致影响其杀菌能力。 高压灭菌的原理： 在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 漂白粉灭菌原理： 漂白粉为白色粉末，一般含10%-20%（质量/体积）的次氯酸钙[Ca(ClO)2],使用时用饱和溶液，杀菌的原理在于它分解出具有杀菌作用的氯气。氯与蛋白质中的氨基结合，使菌体蛋白质氧化，代谢功能发生障碍。 过滤膜过滤原理： 细菌都有一定的大小，如果过滤器的滤膜，或者滤柱，（或者其他的），孔径小于细菌的直径，那么当液体或者气体通过的时候，细菌就被挡住过不去，那么过去的液体或者气体，就是无菌的。细菌过滤膜的孔径为0.02 m。
干细胞培养过程中的无菌操作注意事项 干细胞，作为一种具有自我更新和多向分化潜能的细胞，被广泛应用于组织工程、再生医学以及药物研发等领域。在干细胞的培养过程中，保持无菌操作十分重要。无菌操作的实施可以有效地防止细菌、真菌或病毒的污染，确保干细胞的安全和有效性。在进行干细胞培养过程中，以下是几个关键的无菌操作注意事项。 1. 清洁和无尘环境 干细胞培养实验室的环境应该保持清洁、无尘，并且定期进行消毒。工作台面、培养箱、显微镜、培养皿、实验器具等都应当经过消毒处理，并定期更换耗材以防止交叉感染。实验人员进入实验室前，应以适当的个人保护装备，例如实验服、手套、面罩等，预防外来污染。 2. 消毒培养用具和试剂 在进行干细胞培养前，所有用于培养的器具和试剂都必须经过适当的消毒处理。培养皿、离心管、培养液瓶盖等都应该在高压灭菌器中进行灭菌处理，确保无菌状态。在实验过程中，尽量避免直接接触培养物，以减少污染风险。 3. 使用无菌技术和操作 在无菌操作中，遵循良好的无菌技术和操作步骤非常关键。实验人员应在清洁 的工作台上操作，避免与非无菌物品接触。在捕捉和转移干细胞时，使用一次性无菌吸管和移液器以减少污染风险。重复使用的器具在使用前必须经过蒸汽高压灭菌。 4. 培养液的准备和处理 培养液是维持干细胞生长和分化所必需的基础。为了保持培养液的无菌状态， 实验人员应严格遵循操作规程。使用加有抗生素和抗真菌药物的培养液可以减少细菌和真菌的污染。此外，培养液的保存也非常重要。未使用的培养液应密封保存在恒温箱或冰箱中，避免暴露在空气中，防止细菌和其他微生物的污染。
5. 定期检测培养物的无菌性 为了确保培养物的无菌状态，我们应定期检测培养物中的微生物污染。例如， 可采用细菌培养法、真菌培养法和PCR技术等方法，检测培养物中是否存在细菌、真菌或病毒的污染。如果发现污染，应立即采取措施，如更换培养液、移除受污染的培养皿等，以确保干细胞培养物的质量。 在干细胞培养过程中，无菌操作是确保细胞线的健康和安全的关键步骤。通过 建立清洁无尘的工作环境、使用无菌技术和器具、定期消毒和检测培养物的无菌性等措施，可以有效地降低污染风险，提高干细胞培养的成功率。同时，严格的无菌操作也为干细胞的应用研究提供了有力的保障。
细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程细胞培养实验是指将动植物组织或细胞从体内分离并在无菌条件下培 养的一种技术手段。这种技术可以用于研究细胞的生物学特性、疾病的发 生机制以及药物的筛选等方面。以下是细胞培养实验的基本流程和无菌操 作的相关知识。 一、细胞培养的基本知识 1.细胞培养的种类：常用的细胞培养种类有原代细胞培养、细胞株的 维持和传代培养以及细胞系的培养。 2.细胞培养的培养基：细胞培养的培养基可以分为无血清培养基和含 血清培养基。其中，无血清培养基是通过添加一定的生长因子和营养物质 来满足细胞生长的需要，而含血清培养基则是使用含有细胞生长因子和营 养物质的胎牛血清来供养细胞。 3.传代培养的液氮保存：为了保持细胞株的可用性，可以将细胞株保 存在液氮中，以备将来使用。 4.细胞培养中的无菌操作：细胞培养实验需要在无菌条件下进行操作，以防止细胞污染和外源性菌落的输入。 1.工作台和操作区域的消毒：操作前，需要用75％的酒精或其他合 适的消毒剂彻底清洁工作台面、培养箱、玻璃器皿等操作区域。 2.培养器具的消毒：需要对培养器具如离心管、移液枪、显微镜等进 行高温高压的无菌处理。 3.培养基的制备和滤过：制备培养基时需要将培养基溶液进行高温高 压的杀菌处理，并使用0.22微米的滤膜滤过杂质。
4.无菌技术的掌握：在细胞培养实验中，需要学习和掌握无菌技术， 如无菌操作台、细菌灯和无菌手套等的正确使用方法。 5.细胞的分离和悬浮：将组织样本放入消化液中，进行细胞的分离和 悬浮，并通过离心和过滤的方式获得单个细胞悬浮液。 6.细胞培养的接种：将细胞悬浮液接种在含有培养基的培养皿或离心 管中，放入培养箱中进行培养。 7.细胞传代的操作：当细胞达到一定密度后，需要进行细胞传代操作。传代操作时，需要将细胞悬浮液转移到新的培养皿中，并加入新的培养基 进行细胞的维持和生长。 总之，细胞培养实验是生物学研究中不可或缺的一项实验技术，掌握 细胞培养的基本知识和无菌操作流程对实验结果的准确性和可靠性至关重要。通过良好的实验操作和合理的实验设计，细胞培养实验可以为科学研 究提供重要的数据和支持。
细胞室无菌技术标准操作规程 一、无菌室的灭菌 1. 定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。超净台上滤网需每月清洗1次。 2. CO2孵箱（培养箱）灭菌：用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射。 3. 实验前灭菌：打开紫外灯、超净台各20-30分钟。在开紫外灯杀菌前，应确认无菌室无人后方可开紫外灯杀菌。 4. 实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。 ５．定期检测下列项目：钢瓶之CO2压力；CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，每周更换）；无菌操作台内之气流压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网（300小时/预滤网，3000小时/HEPA）。 6. 水槽可添加消毒剂（Zephrin 1:750），定期更换水槽的水。 二、实验人员的无菌准备 1. 肥皂洗手； 2. 穿好隔离衣，放好拖鞋； 3. 用75％酒精棉球擦净双手； 三、无菌操作的要点 1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面； 2.靠近酒精灯火焰操作； 3.器皿使用前必须过火灭菌； 4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火； 5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液
6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。 细胞传代培养（消化法）标准操作规程 一、原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 二、材料和试剂 1. 无菌磷酸生理缓冲液(PBS) 2. 胰酶-EDTA溶液(0.05%胰酶-0.53mM EDTA-4Na): 以10ml分装于15 ml无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回温。 3. 新鲜培养基 4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 三、操作步骤 1. 传代前准备 （1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 （2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 （3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 （4）点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 （5）准备好将要使用的消毒后的空培养瓶。 （6）取出预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
细胞培养试验技术 细胞培养环境 1.实验室设计 细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。 2.常用设施及设备 （1）超净工作台：也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。（2）无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。 （3）操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物 （4）洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。 （5）分析间：显微镜、计算机及打印机等。 3.培养器皿 常用细胞培养器皿有培养瓶、培养板、培养皿等。常准备量是使用量的三倍。器皿应选择透明度好、无毒、利于细胞粘附和生长的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。常用的器皿有下面几种。 （1）液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常用规格有500ml、250ml、100ml 等几种。 （2）培养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位，规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml 等几种。
（3）培养皿：用于开放式培养及其它用途。分直径30mm、60mm、120mm 等几种。 （4）吸管：常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度称改良吸管，刻度吸管用于移动液体。常用1ml 和10ml 两种。短吸管也叫滴管，分弯头和直头两种。 （5）离心管：离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿，根据用途不同形态各样，常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。前者分别为50ml、30ml、15ml；后者则多为10ml 和5ml。 （6）其它：如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等。 4.细胞培养温度 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定而适宜的温度。不同种类的细胞对培养温度要求也不同。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1 小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1 小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。相反，温度不低于0℃时，对细胞代谢虽有影响，但并无伤害作用；把细胞放入25－35℃时，细胞仍能生存和生长，但速度减慢；放在4℃数小时后，再回到37℃培养，细胞仍能继续生长。细胞代谢随温度降低而减慢。当温度降至冰点以下时，细胞可因胞质结冰受损而死亡。但是，如果向培养液中加入一定量的冷冻保护剂（二甲亚砜或甘油），可在深低温下如－80℃或－196℃（液氮）长期保存。 5.合适的气体环境 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培