6种方法测定蛋白质含量 一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4――2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1) 2NH3+H2SO4――(NH4)2 SO4(2) (NH4)2 SO4+2NaOH――2H2O+Na2SO4+2NH3(3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（biuret法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1.试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05NaOH配制。 （2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2.器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 （三）操作方法 1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30分
含量测定方法学验证内容及可接受标准 1．准确度 可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于2.0%。 2．线性 其主峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。 可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.998，Y轴截距应在100％响应值的2％以内，响应因子的相对标准差应不大于2.0%。 3．精密度 1）重复性 件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于2.0%。 2）中间精密度 4．专属性 可接受的标准为：空白对照应无干扰，主成分与各有关物质应能完全分离，分离度不得小于2.0。以二极管阵列检测器进行纯度分析时，主峰的纯度因子应大于980。 5．检测限
主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。 6．定量限 主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液主峰的保留时间的相对标准差应不大于2.0%。 7．耐用性 方法：分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH值变化±0.2、柱温变化±5℃、 可接受的标准为：主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离；各条件下的含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%。 8、系统适应性 应不大于2.0%，主峰保留时间的相对标准差应不大于1.0%。另外，主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离，主峰的理论塔板数应符合质量标准的规定。 有关物质测定方法学验证内容及可接受标准： 1．准确度 该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般要求根据有关物质的定量限与质量标准中该杂质的限度分别配制三个浓度的供试品溶液各三份（例如某杂质的限度为0.2%，则可分别配制该杂质浓度为0.1％、0.2％和0.3％的杂质溶液），分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收率数据的相对标准差（RSD）。该项目的可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%，相对标准差应不大于10%。 2．线性 线性一般通过线性回归方程的形式来表示。具体的验证方法为：在定量限至
铵盐中氮含量的测定（甲醛法） 一、实验目的 1．掌握甲醛法测定铵盐的方法。 2．掌握铵盐含量的计算。 二、实验原理 常见的铵盐如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、是强酸弱碱盐，虽然NH 4+ 具有酸性，但由于Ｋ a ﹤10 –8 所以，不能直接滴定。生产和实验室中常采用甲醛法测定铵盐的含量。首先，甲醛 与铵盐反应，生成（CH 2）6N 4H + 和H + ，然后，以酚酞为指示剂，用NaOH 标准溶液滴定。其反应式为： 4NH 4+ + 6HCHO =（CH 2）6N 4H + + 3H + + 6H 2O （CH 2）6N 4H + + 3H + + 4OH – =（CH 2）6N 4 + 4H 2O 三、试剂 1．NaOH 标准滴定溶液c(NaOH)=L 。 2．酚酞指示液（10g/L ）。 3．中性甲醛溶液（1︰1）：取市售40%甲醛的上层清液于烧杯中，用水稀释一倍，加入1～2滴酚酞指示液，用LNaOH 标准溶液滴定至溶液呈浅粉色，再用未中和的甲醛滴至刚好无色。 四、实验内容 准确称取硝酸铵样品～3.0g(若是硫酸铵，称样量应先估算)，放入100mL 烧杯中，加30mL 水溶解。将溶液定量转移至250mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。 用移液管吸取上述试液至锥形瓶中， 加5mL 中性甲醛溶液，摇匀，放置一分钟。在溶液中加2滴酚酞指示液，用c （NaOH ）=LNaOH 标准滴定溶液滴定至溶液呈浅粉色30s 不褪即为终点，平行测定三次，同时作空白。 五、计算公式 34343c(NaOH)[V(NaOH)-V()]10M(NH NO ) ω(NH NO )100%25m 250 -??=?? 空白 式中 ω（NH 4NO 3）——NH 4NO 3的质量分数，％；
亚硝酸盐氮测定方法 关键词：生活饮用水，亚硝酸盐氮，测定 水中亚硝酸盐氮含量的多少是了解水污染程度的重要指标，况且亚硝酸盐氮被公认为是潜在的致癌物质，人体摄入过高可使血液中的变性蛋白增加。在《国家标准生活饮用水卫生规范》中亚硝酸盐氮被列为常规检测项目。因此，在日常水质亚硝酸盐氮的检测中，其检测结果的准确性、及时性显得尤为重要。 水中亚硝酸盐氮的测定方法国标采用重氮偶合分光光度法，不仅需要消耗大量的标准溶液、标准样品和试剂，而且极为费时，特别是当测定的水样较多时，采样后如不及时测定，检测人员难以及时判断水质污染程度及水体净化情况。通过查阅大量相关资料，对国标法进行适当改进。本文通过分光光度法和比色法测定水中亚硝酸盐氮，经过一年多的实验及大量检测数据证实：比色法测定水中亚硝酸盐氮具有仪器便宜、操作方便、成本低、检测时间短。精密度、准确度在误差允许范围之内。在紧急情况和平常可以代替分光光度法测定水中亚硝酸盐氮。 一、分光光度法 测定原理 在pH1.7以下，水中亚硝酸盐与氮基苯磺酰胺重氮化，再与盐酸N-(1萘)-乙二胺产生偶合反应。生成紫红色的偶氮染料。 1、方法依据 《生活饮用水标准检验方法》GB/T5750-2006 2、测定范围 本法用重氮偶合分光光度法测定生活饮用水及其水源水中的亚硝酸盐氮。 本法适用于测定生活饮用水及其水源水中亚硝酸盐氮的含量。 水中三氯胺产生红色干扰。铁，铅等离子可能产生沉淀，引起干扰。铜离子起催化作用，可分解重氮盐使结果偏低，有色离子干扰，也不应存在。 3、试剂 （1）氢氧化铝悬浮液 称取125g硫酸铝钾[KAl(SO4)2.12H2O]或硫酸铝铵[NH4Al(SO4)2.12H2O]溶于1000mL纯水中。加热至60oc，缓缓加入55mL氨水(ρ20=0.88g/mL)。使氢氧化铝沉淀完全。充分搅拌后静置，弃取上清液。用纯水反复洗涤沉淀，至倾出上清液中不含氯离子（用硝酸银溶液试验）。然后加入300mL纯水成悬浮液，适应前振摇均匀。 （2）对氨基苯磺酰胺溶液：（10g/L） （3）盐酸N-(1萘)-乙二胺溶液（1.09g/L） （4）亚硝酸盐氮标准储备液[ρ(NO2-_N)=50μg/mL]： 称取0.2463g在玻璃干燥器内放置24h的亚硝酸钠（NaNO2），溶于纯水中，并定容至1000mL。每升加2mL氯仿保存（本试剂剧毒）。 （5）亚硝酸盐氮标准使用液[ρ(NO2-_N)=0.1μg/mL]： 取10.00mL标准储备液于容量瓶中，用纯水定容至500mL。再从中吸取10mL，用纯水于容量瓶中定容至100mL。 （6）仪器
粗多糖含量测定方法学研究资料 一、仪器与试药 (1) 二、方法的研究 (2) 1.检测波长的测定 (2) 2.样品及对照制备方法 (2) 三、方法学验证 (3) 1.线性 (3) 2.精密度实验 (4) 3.稳定性实验 (4) 4.重复性试验 (5) 5.中间精密度实验 (5) 6.准确度试验 (6)
芪参颗粒粗多糖含量测定方法起草说明 标志性成分粗多糖含量测定的方法来源于《保健食品功效成分检测方法》白鸿主编（中国中医药出版社)的第二法，该方法的原理是：多糖经乙醇沉淀分离后，去除其他可溶性糖及杂质的干扰，糖与硫酸在沸水浴中加热脱水生成羟甲基呋喃甲醛（羟甲基呋喃糠醛），再与蒽酮缩合成蓝绿色化合物，其显色强度与溶液中糖的浓度成正比，在625nm波长下比色测定。 主要研究资料如下： 一、仪器与试药 1、仪器 (1) 离心机（湘南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号TD25-WS）； (2) 离心管：50ml； (3) 水浴锅（上海精宏实验设备有限公司，型号 DK-S26）； (4) 旋涡混合器（DioCote，SA8）； (5) SHIMADZU UV-1800 紫外可见光分光光度计； (6) JB760-68 石英比色皿（宜兴市伟鑫仪器有限公司）； (7) TU-1901 双光束紫外可见光分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）； 2、试药 (1) 葡萄糖：广州化学试剂厂，分析纯，批号为-1； (2) 无水乙醇：西陇化学股份有限公司，分析纯，批号为160802 1； (3) 蒽酮：国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号为； (4) 硫酸：广州化学试剂厂，分析纯，批号为-1； (5) 葡萄糖标准液：标准称取干燥恒重的分析纯级葡萄糖，加水溶解，并定容至50ml，此溶液1ml含10mg葡萄糖，用前稀释100倍为使用液（ml）。 (6) %蒽酮硫酸溶液（W/V）：准确称取蒽酮置于烧杯中，缓缓加入100ml 80%硫酸溶解，溶解后呈黄色透明溶液。现用现配。 3、试样
定量分析方法的方法学验证 定量分析方法的方法学验证 定量分析方法验证的目的是证明采用的含量测定方法适合于相应分析要求，在进行定量分析方法学研究或起草药品质量标准时，分析方法需经验证。 验证内容有：线性、范围、准确度、精密度（包括重复性和重现性）、检测限、定量限和耐用性等。 一，线性 线性是指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物质浓度直接呈正比关系的程度。 应在规定的范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，制备一系列供试品的方法进行测定，至少制备五份供试样品；以测得的响应信号对被测物浓度作图，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。回归方程的相关系数( r ) 越接近于1 ，表明线性关系越好。 用UV 法测定时，以对照品配制一定浓度范围的对照品系列溶液，吸光度A一般在0.3 ～0.7 ，浓度点n ＝5 ，用浓度C 对A作线性回归，得一直线方程，方程的截距应接近于零，相关系数r 应大于0.9999 。 用HPLC 法测定时，以对照品配制一定浓度范围的对照品系列溶液，浓度点n ＝5 ～7 ，用浓度 C 对峰高h 或峰面积A或被测物与内标物的响应值之比进行线性回归或非线性拟合（如HPLC-ELSD ），建立方程，方程的截距应趋于零，相关系数r 应大于0.999 。 线性关系的数据包括相关系数、回归方程和线性图。 二，范围 范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。 范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果及要求确定。对于有毒的、具特殊功效或药理作用的成分，其范围应大于被限定含量的区间。 三，精确度 准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率( ％) 表示。准确度应在规定的范围内测试。用于定量测定的分析方法均需做准确度验证。 1. 测定方法的准确度 可用已知纯度的对照品做加样回收率测定，即于已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量的已知纯度的被测成分对照品，依法测定。用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。 在加样回率收试验中须注意对照品的加入量与供试品中被测成分含有量之和必须在标准曲线线性范围之内；加入的对照品的量要适当，过小则引起较大的相对误差，过大则干扰成分相对减少，真实性差。 回收率% = [(C-A)/B]*100% 式中，A为供试品所含被测成分量；B 为加入对照品量；C 为实测值。 2. 数据要求 在规定范围内，取同一浓度的供试品，用 6 个测定结果进行评价；或设计 3 个不同浓度，每个浓度各分别制备 3 份供试品溶液进行测定，用9 个测定结果进行评价，一般中间浓度加入量与所取供试品含量之比控制在l ∶ 1 左右，其他两个浓度分别约为供试品含量的80% 和120% 。应报告供试品取样量、供试品中含有量、对照品加入量、测定结果和回收率( ％) 计算值，以及回收率( ％) 的相对标准偏差(RSD) 或可信限。 四，精密度 精密度是指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间接近的程度。 1. 精密度的表示方法 气相色谱法和高效液相色谱法是对同一供试液进行至少五次以上的测定；精密度一般用相对标准偏差(relative standard deviation, RSD) 表示：RSD= 标准偏差/ 平均值′ 100 ％
实验四水体自净程度的指标 前言 各种形态的氮相互转化和氮循环的平衡变化是环境化学和生态系统研究的重要内容之一。水体中氮产物的主要来源是生活污水和某些工业废水及农业面源。当水体受到含氮有机物污染时，其中的含氮化合物由于水中微生物和氧的作用，可以逐步分解氧化为无机的氨 (NH3)或铵 (NH4+)、亚硝酸盐 (NO2-)、硝酸盐 (NO3-)等简单的无机氮化物。氨和铵中的氮称为氨氮；亚硝酸盐中的氮称为亚硝酸盐氮；硝酸盐中的氮称为硝酸盐氮。通常把氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮称为三氮。这几种形态氮的含量都可以作为水质指标，分别代表有机氮转化为无机氮的各个不同阶段。在有氧条件下，氮产物的生物氧化分解一般按氨或铵、亚硝酸盐、硝酸盐的顺序进行，硝酸盐是氧化分解的最终产物。随着含氮化合物的逐步氧化分解，水体中的细菌和其它有机污染物也逐步分解破坏，因而达到水体的净化作用。 有机氮、氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的相对含量，在一定程度上可以反映含氮有机物污染的时间长短，对了解水体污染历史以及分解趋势和水体自净状况等有很高的参考价值，见表6-1。目前应用较广的测定三氮方法是比色法，其中最常用的是：纳氏试剂比色法测定氨氮，盐酸萘乙二胺比色法测定亚硝酸盐氮，二磺酸酚比色法测定硝酸盐氮。 一实验目的 1.掌握测定三氮的基本原理和方法。 2.了解测定三氮对环境化学研究的作用和意义。 二仪器器材 (1) 玻璃蒸馏装置。 (2) pH 计。 (3) 恒温水浴。 (4) 分光光度计。 (5) 电炉：220V/1KW。 (6) 比色管：50 mL。 (7) 陶瓷蒸发皿：100或200 mL。 (8) 移液管：1 mL、2 mL、5 mL。容量瓶：250 mL。 三实验步骤 1. 氨氮的测定——纳氏试剂比色法 (1) 原理 氨与纳氏试剂反应可生成黄色的络合物，其色度与氨的含量成正比，可在425 nm波长下比色测定，检出限为0.02 μg/mL。如水样污染严重，需在pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中预蒸馏分离。 (2) 试剂 ①不含氨的蒸馏水：水样稀释及试剂配制均用无氨蒸馏水。配制方法包括蒸馏法（每升蒸馏水中加入0.1 mL浓硫酸，进行重蒸馏，流出物接受于玻璃容器
土壤学实验讲义 （修订版） 吴彩霞王静李旭东 2012年10月
目录 实验一、土壤分析样品采集与制备 实验二、土壤全氮的测定—凯氏定氮法实验三、土壤速效钾的测定 实验四、土壤有效磷的测定 实验五、土壤有机质的测定 实验六、土壤酸度的测定
实验一土壤分析样品采集与制备 一、实验目的和说明 为开展土壤科学实验，合理用土和改土，除了野外调查和鉴定土壤基础性状外，还须进行必要的室内常规分析测定。而要获得可靠的科学分析数据，必须从正确地进行土壤样品(简称土样)的采集和制备做起。一般土样分析误差来自采样、分样和分析三个方面，而采样误差往往大于分析误差，如果采样缺乏代表性即使室内分析人员的测定技术如何熟练和任何高度精密的分析仪器，测定数据相当准确，也难于如实反映客观实际情况。故土样采集和制备是一项十分细致而重要的工作。 二、实验方法步骤 (一)土样采集 分析某一土壤或土层，只能抽取其中有代表性的少部份土壤，这就是土样。采样的基本要求是使土样具有代表性，即能代表所研究的土壤总体。根据不同的研究目的，可有不同的采样方法。 1.土壤剖面样品 土壤剖面样品是为研究土壤的基本理化性质和发生分类。应按土壤类型，选择有代表性的地点挖掘剖面，根据土壤发生层次由下而上的采集土样，一般在各层的典型部位采集厚约l0厘米的土壤，但耕作层必须要全层柱状连续采样，每层采一公斤；放入干净的布袋或塑料袋内，袋内外均应附有标签，标签上注明采样地点、剖面号码、土层和深度。 图1 土壤剖面坑示意图
2. 土壤混合样品 混合土样多用于耕层土壤的化学分析，一般根据不同的土壤类型和土壤肥力状况，按地块分别采集混合土样。一般要求是： (1)采样点应避免田边、路旁、沟侧、粪底盘以及一些特殊的地形部位。 (2)采样面积一般在20—50亩的地块采集一个混合样可根据实际情况酌情增加样品数。 (3)采样深度依不同分析要求而定，一般土壤表层取0-10cm，取样点不少于5点。可用土钻或铁铲取样，特殊的微量元素分析，如铁元素需改用竹片或塑料工具取样，以防污染。 (4)每点取样深度和数量应相当，集中放入一土袋中，最后充分混匀碾碎，用四分法取对角二组，其余淘汰掉。取样数量约1公斤左右为宜。 (5)采样线路通常采用对角线、棋盘式和蛇形取样法。 (6)装好袋后，栓好内外标签。标签上注明采样地点、深度、采集人和日期，带回室内风干处理 (二)土壤样品制备 样品制备过程中的要求： (1)样品处理过程中不能发生任何物理和化学变化，以免造成分析误差。 (2)样品要均一化，使测定结果能代表整个样品和田间状态。 (3)样品制备过程包括：风干一分选一去杂一磨碎一过筛—混匀一装瓶一保存一登记。 风干一将取回的土样放在通风、干燥和无阳光直射的地方，或摊放在油布、牛皮纸、塑料布上，尽可能铺平并把大土块捏碎，以便风干快些。 分选一若取的土样太多，可在土样均匀摊开后，用“四分法”去掉一部分，留下1000克左右供分析用。 去杂、磨细和过筛一将风干后土样先用台称称出总重量，然后将土样倒在橡皮垫上，碾碎土块，并尽可能挑出样品中的石砾、新生体、侵入体、植物根等杂质，分别放入表面皿或其它容器中；将土样铺平，用木棒轻轻辗压，将辗碎的土壤用带有筛底和筛盖的0.25mm 筛孔的土筛过筛，并盖好盖、防止细土飞扬。不能筛过的部分，再行去杂，余下的土壤铺开再次碾压过筛，直至所有的土壤全部过筛，只剩下石砾为止。(样品通过多大筛孔、应依不同分析要求而定)。 混匀装瓶一将筛过的土壤全部倒在干净的纸上，充分混匀后装入500～1000ml磨口瓶中保存。每个样品瓶上应贴两个标签，大标签贴在瓶盖上。书写标签用HB铅笔或圆珠笔填
甲钴胺片的含量测定检测方法研究 徐丽平徐慧娟杭州康恩贝制药有限公司 摘要目的：建立甲钴胺片含量测定方法，为甲钴胺片质量标准相关检测项目提供检测方法和实验依据。方法：样品碾细，以流动相溶解，制备供试品溶液；色谱分析条件：色谱柱为Diamonsil 5u C18，250×4.6mm；流动相：乙腈-0.03mol/L 磷酸二氢钠（磷酸调pH为3.5）（19:81）；流速1.0ml/min；检测波长：342nm。结果：甲钴胺线性关系良好，平均回收率100.7%。结论：本法测定结果准确，可用于甲钴胺的含量测定。 关键词：甲钴胺，高效液相色谱法 甲钴胺片活性成分甲钴胺，主要用于治疗周围神经病。由于甲钴胺对光敏感，故需包衣，包衣材料成分复杂，干扰大，现有的紫外分光光度法重现性差。本实验采用HPLC法测定甲钴胺的含量，结果准确，复现性好。 1 仪器及试药 高效液相色谱仪：安捷伦1100，VWD检测器，？？工作站；电子天平：？2100；超声波清洗器。 甲钴胺对照品，浙江省药品检验所标定，批号：？，含量：？；乙腈为色谱纯，磷酸二氢钠为分析纯；甲钴胺片为本公司生产，规格0.5mg。 2 色谱条件 色谱柱：Diamonsil 5u C18（250×4.6mm）；流动相：乙腈-0.03mol/L磷酸二氢钠（磷酸调pH为3.5）（19:81）；流速1.0ml/min；检测波长：342nm；柱温：常温；进样量：20μl。理论塔板数按甲钴胺峰计算不低于2000，甲钴胺与相邻杂质峰的分离度应符合要求。 3溶液的制备 3.1对照品溶液 3.2供试品溶液 3.3空白溶液 4系统适用性试验 取处方量的空白辅料，照含量测定法进行测定，空白辅料不干扰测定，结果见附图2-1（图谱：c:\HPCHEM\1\DATA\JGAFFX\00009）
氨氮硝酸氮亚硝酸氮测定 方法总结 Last revision on 21 December 2020
水中氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的测定 一、目的和要求 ?了解水中3种形态氮测定的意义。 ?掌握水中3种形态氮的测定方法与原理。 ?水体中3种形态氮检出的环境化学意义 二、仪器 1．紫外可见分光光度计。 2．500~1000mL全玻璃磨口蒸馏装置。 3．pH计。 4．恒温水浴槽。 5．电炉：220V/1kW。 6．比色管：50mL。 7．陶瓷蒸发皿：100mL或200mL。 8．移液管：1mL、2mL、5mL。 9．容量瓶：250mL。 三、氨氮的测定——纳氏试剂比色法 1、原理 ?氨氮与纳氏试剂反应生成黄棕色的络合物，其色度与氨氮的含量成正比，可在 420nm波长下使用光程长为10mm的比色皿比色测定，最低检出浓度为L。 2K2[HgI4]+3KOH+NH3＝[Hg2O·NH2]I+2H2O+7KI 2、试剂
?无氨水：水样稀释及试剂配制均需用无氨水。配制方法包括蒸馏法（每升蒸馏水 中加入浓硫酸进行重蒸馏，馏出水接收于玻璃容器中）和离子交换法（让蒸馏水通过强酸型阳离子交换树脂柱来制备）。 ?磷酸盐缓冲液（pH为）：称取磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，溶于水中并稀释至 1000mL，配制后用pH计测定其pH值，并用磷酸二氢钾或磷酸氢二钾调节pH 为。 ?吸收液：2％硼酸或L硫酸。 ?纳氏试剂：碘化汞－碘化钾－氢氧化钠。称取16g氢氧化钠溶于50mL水中，冷 却至室温。称取7g碘化钾和10g碘化汞，溶于水中，然后将此溶液在搅拌下， 缓慢加入到氢氧化钠溶液中，并稀释至100mL。贮存于棕色瓶内，用橡皮塞塞 紧，于暗处存放，有效期可达一年。 ?50%酒石酸钾钠溶液：称取50g酒石酸钾钠溶于100mL水中，加热煮沸，以驱 除氨，充分冷却后稀释至100mL。 ?氨氮标准溶液：CN＝1mg/mL。称取无水氯化铵（于100～105℃下干燥2h）溶 于无氨水中，转入1000mL容量瓶内，用无氨水稀释至刻度，摇匀，准确吸取该溶液于1000mL容量瓶内，用无氨水稀释至刻度，其浓度为10ug/mL。 ?硫酸锌溶液：10％（m/V）。 ?氢氧化钠溶液：25％（m/V）。 3、步骤 （1）水样蒸馏 先在蒸馏瓶中加200mL无氯水，加10mL磷酸盐缓冲液和数粒玻璃珠，加热至馏出物中不含氨为止，冷却，然后将蒸馏液倾出（留下玻璃珠）。量取水样200mL置于蒸
凯氏氮的测定方法 （1）、原理 当样品与浓硫酸和硫酸钾的混合物（沸点315~370℃）在催化剂硫酸铜或硫酸汞存在时，一起加热，其中的有机氮和氨态氮转化为硫酸铵。然后加入NaOH溶液使之成碱性，蒸镏使氨释放出来并以硼酸吸收，然后用硫酸滴定硼酸铵。 此法测得的总氮包括了有机氮和原来即以氨态存在的氮，但不包括硝酸盐或亚硝酸盐形式存在的氮，有机氮中的某些化合物如含氮的杂环化合物、吡啶、叠氮化合物、偶氮化合物、硝基和亚硝基化合物等也未包括在内。以此法测定的总氮称之为凯氏（Kjeldagl）氮，即TKN。测定同一水样中氨态氮含量后，总凯氏氮和氨态氮的差值即为有机氮。 （2）、药品与仪器 ①、浓硫酸，密度1.84g/cm3；②、50% NａOH溶液；③、10% CｕSO4溶液；④、4%硼酸溶液； ⑤、无水硫酸钾或无水硫酸钠； ⑥、0.020mol/L(1/2H2SO4标准溶液：吸取分析纯浓硫酸2.80ml，溶于1000ml蒸镏水中，得到约0.10mol/L(1/2H2SO4)溶液，用碳酸钠标定。然后从中吸取200ml，用蒸镏水稀释至1000ml 备用。⑦、混合指示剂：取0.05g甲基红和0.10g溴甲酚绿溶于100ml乙醇中； ⑧、1%酚酞的乙醇溶液；⑨、4%Na2S。9H2O溶液； ⑩、蒸镏水：将普通蒸镏水酸化后加入KMnO4进行蒸镏，并重复蒸镏一次，以使其中不含有任何铵盐或氨。本试验所用蒸镏水均应经过这样的处理； ⑩、浮石：在蒸镏水中煮沸后干燥备用；⑩、600瓦可调温电炉两台；⑩、凯氏烧瓶及凯氏蒸镏装置 （3）、操作步骤 ①消化： 准确量取一定体积（以含氮0.5~10mg为宜）的废水水样置于凯氏烧瓶，加入10ml浓硫酸、5克硫酸钾或硫酸钠、1ml硫酸铜溶液，并放入几块沸石，将凯氏烧瓶以45度的角度固定于通风橱内加热煮沸，烧瓶内将产生白烟。继续煮沸，烧瓶中颜色逐渐变黑，直至溶液完全透明无色或浅绿色。再继续煮沸20分钟。 ②蒸镏： 将凯氏烧瓶冷却，以约150ml蒸镏水冲洗烧瓶壁，加入2.5ml硫化钠溶液和3~5滴酚酞，然后缓慢沿壁加入50mlNaOH溶液尽量使其不与烧瓶内液体混合。立刻将烧瓶按图所示安装到蒸镏装置上去（事先安装好含50ml硼酸的吸收瓶），小心转动烧瓶使烧瓶内的两层液体混合并开始加热。煮沸20~30分钟或在不使用蒸气发生器时蒸发至烧瓶内液体体积减少至原体积约约1/3时，停止蒸镏。 ③滴定： 卸下吸收瓶，加入几滴混合指示剂，以0.02mol/L（1/2H2SO4）滴定至溶液变为紫色。 ④空白试验： 用同样体积蒸镏水代替废水水样，按上述步骤作空白试验。 （4）、计算 总氮＝（V1－V0）* C *14000 / V (mmol/L) V1 ￣￣滴定样品消耗的标准硫酸溶液的体积，ml； V0 ￣￣滴定空白试验消耗的标准硫酸溶液的体积，ml； C ￣￣硫酸标准溶液的准确浓度，mol/L； 14000￣￣每摩尔氮的质量（毫克）数； V ￣￣样品水样的取样体积，ml。
含量测定分析方法验证的可接受标准简介 黄晓龙 摘要：本文介绍了在对含量测定所用的分析方法进行方法学验证时，各项指标的可接受标准，以利于判断该分析方法的可行性。 关键词：含量测定分析方法验证可接收标准 在进行质量研究的过程中，一项重要的工作就是要对质量标准中所涉及到的分析方法进行方法学验证，以保证所用的分析方法确实能够用于在研药品的质量控制。为规范对各种分析方法的验证要求，我国已于2005年颁布了分析方法验证的指导原则。该指导原则对需要验证的分析方法及验证的具体指标做了比较详细的阐述。但是文中未涉及各具体指标在验证时的可接受标准，国际上已颁布的指导原则中也未发现相关的要求。另一方面，大多数药品研发单位在进行质量研究时，已逐步认识到分析方法验证的必要性与重要性，大都也在按照指导原则的要求进行分析方法验证，但验证完后却因没有一个明确的可接受标准，而难以判断该分析方法是否符合要求。本文结合国外一些大型药品研发企业在此方面的要求，提出了在对含量测定方法进行验证时的可接受标准，供国内的药品研发单位在进行研究时参考。 1．准确度 该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般要求分别配制浓度为80％、100％和120％的供试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率。 可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于2.0%。 2．线性 线性一般通过线性回归方程的形式来表示。具体的验证方法为： 在80％至120％的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定其主峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。 可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.998，Y轴截距应在100％响应值的2％以内，响应因子的相对标准差应不大于2.0%。 3．精密度 1）重复性 配制6份相同浓度的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所
含量测定分析方法验证 在进行质量研究的过程中，一项重要的工作就是要对质量标准中所涉及到的分析方法进行方法学验证，以保证所用的分析方法确实能够用于在研药品的质量控制。为规范对各种分析方法的验证要求，我国已于2005年颁布了分析方法验证的指导原则。该指导原则对需要验证的分析方法及验证的具体指标做了比较详细的阐述。但是文中未涉及各具体指标在验证时的可接受标准，国际上已颁布的指导原则中也未发现相关的要求。另一方面，大多数药品研发单位在进行质量研究时，已逐步认识到分析方法验证的必要性与重要性，大都也在按照指导原则的要求进行分析方法验证，但验证完后却因没有一个明确的可接受标准，而难以判断该分析方法是否符合要求。本文结合国外一些大型药品研发企业在此方面的要求，提出了在对含量测定方法进行验证时的可接受标准，供国内的药品研发单位在进行研究时参考。 1．准确度 该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般要求分别配制浓度为80％、100％和120％的供试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率。可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在%%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于%。 2．线性 线性一般通过线性回归方程的形式来表示。具体的验证方法为：在80％至120％的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定其主峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。 可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于，Y轴截距应在100％响应值的2％以内，响应因子的相对标准差应不大于%。
3．精密度 1）重复性 配制6份相同浓度的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于%。 2）中间精密度 配制6份相同浓度的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于%。 4．专属性 可接受的标准为：空白对照应无干扰，主成分与各有关物质应能完全分离，分离度不得小于。以二极管阵列检测器进行纯度分析时，主峰的纯度因子应大于980。 5．检测限 主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。 6．定量限 主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液主峰的保留时间的相对标准差应不大于%。 7．耐用性 分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH值变化±、柱温变化±5℃、流速相对值变化±20％时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。可接受的标准为：主峰的拖尾因子不得大于，主峰与杂质峰必须达到基线分离；各条件下的含量数据（n=6）的相对标准差应不大于%。
土壤中氮含量的测定分析 核心提示：摘要：概述了土壤中氮元素的存在形式、土壤全氮、无机氮(包括铵态氮、硝态氮)水解氮、酰胺态氮的测定方法。关键词：土壤；全氮；测定方法土壤是作物氮素营养的主要来源，土壤中的氮素包括无机态氮和有机态... 摘要：概述了土壤中氮元素的存在形式、土壤全氮、无机氮(包括铵态氮、硝态氮)水解氮、酰胺态氮的测定方法。 关键词：土壤；全氮；测定方法 土壤是作物氮素营养的主要来源，土壤中的氮素包括无机态氮和有机态氮两大类，其中95%以上为有机态氮，主要包括腐殖质、蛋白质、氨基酸等。小分子的氨基酸可直接被植物吸收，有机态氮必须经过矿化作用转化为铵，才能被作物吸收，属于缓效氮。 土壤全氮中无机态氮含量不到 5%，主要是铵和硝酸盐，亚硝酸盐、氨、氮气和氮氧化物等很少。大部分铵态氮和硝态氮容易被作物直接吸收利用，属于速效氮。无机态氮包括存在于土壤溶液中的硝酸根和吸附在土壤颗粒上的铵离子，作物都能直接吸收。土壤对硝酸根的吸附很弱，所以硝酸根非常容易随水流失。在还原条件下，硝酸根在微生物的作用下可以还原为气态氮而逸出土壤，即反硝化脱氮。部分铵离子可以被粘土矿物固定而难以被作物吸收，而在碱性土壤中非常容易以氨的形式挥发掉。土壤腐殖质的合成过程中，也会利用大量无机氮素，由于腐殖质分解很慢，这些氮素的有效性很低。 土壤中的氮素主要来自施肥、生物固氮、雨水和灌溉水，后二者对土壤氮贡献很小，施肥是耕作土壤氮素的主要来源，而自然土壤的氮素主要来自生物固氮。 土壤含氮量受植被、温度、耕作、施肥等影响，一般耕地表层含氮量为0.05%～0.30%，少数肥沃的耕地、草原、林地的表层土壤含氮量在 0.50%～0.60%以上。我国土壤的含氮量，从东向西、从北向南逐渐减少。进入土壤中的各种形态的氮素，无论是化学肥料，还是有机肥料，都可以在物理、化学和生物因素的作用下进行相互转化。 1 土壤全氮的测定 1.1 开氏法 近百年来，许多科学工作者对全氮的测定方法不断改进，提出了许多新方法，主要有重铬酸钾-硫酸消化法、高氯酸-硫酸消化法、硒粉-硫酸铜-硫酸消化法。但开氏法目前仍作为一个统一的标准方法，此法容易掌握，测定结果稳定，准确率较高。 开氏法测氮的原理为：在盐类和催化剂的参与下，用浓硫酸消煮，使有机氮分解为铵态氮。碱化后蒸馏出来的氨用硼酸吸收，以酸标准溶液滴定，求出土壤全氮含量（不包括硝态氮）。含有硝态和亚硝态氮的全氮测定，在样品消
一、原理： 过滤后的样品经过一个开放的镀铜镉还原器通道后，硝酸根被还原成亚硝酸根，亚硝酸根通过磺胺处理后，与N-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐偶联，形成深红色的偶氮染料，然后在550nm或者520nm比色分析。 二、样品处理 土壤鲜样采取四分法处理，根据实验用量进行过筛（比目大小视样品含水量而定）。过筛后的土样，取出5g土样放入离心管，加入25ml 氯化钾提取液（2moL/L），震荡2小时后进行离心（8000 g ，15min），静置后过滤，取上清液测定。若不能及时测定，放入4℃冰箱保存。 三、试剂配制： 试剂用水：蒸馏水或去离子水。 （1）显色试剂：（棕色玻璃瓶，避光保存） 150ml水，加入25ml浓磷酸▲，冷却至室温后，加入10g磺胺，再加入0.5g N-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐溶解。用水定容至250ml。加入浓缩探针清洗液（表面活性剂）。 （2）氯化铵-EDTA缓冲液（ammonium chloride-EDTA）：把85g氯化铵和0.1g 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na2）溶解 于水，定容至1L。用浓氨水▲调节PH至。 （3）硝化组件缓冲液：{用来清洗OTCR(镀铜镉还原器通道)}取100ml的氯化铵-EDTA缓冲液，稀释至1L。调节PH至。（4）2%硫酸铜： 10g 五水硫酸铜（）溶于水，定容至500ml。 （5）5mol/L盐酸： 小心慢慢加入浓盐酸▲于水中，冷却后定容至100ml。 （6）硝酸盐存储溶液(1g/L)：（溶液6个月内有效） 7.218g硝酸钾溶于水，定容至1L，加入1ml氯仿▲（防腐剂）。（7）比色管清洗液：（定容时缓慢，防止出现泡沫，室温保存,两个月内有效）取50ml比色管清洗液，加水定容至1L。 （8）进样针清洗液：（定容时缓慢，防止出现泡沫，室温保存，两个月内有效。） 取进样针清洗液，加水定容至1L。 四、测定方法： 土壤硝态氮测定采用SmartChem全自动间断化学分析仪。
实验六 紫外分光光度法测定对乙酰氨基酚片的含量的方法学研究 一、目的要求 1. 掌握确证分析方法的效能指标内容和要求。 2. 熟悉建立分析方法的基本思路。 3. 掌握紫外分光光度法的原理及操作。 二、实验原理 对乙酰氨基酚结构中含有苯环共轭系统，在0.4%氢氧化钠溶液中，于257nm 波长处有最大吸收，其吸收系数为% 11cm E 715。 C 8H 9NO 2 151.16 三、仪器与试剂 对乙酰氨基酚片，对乙酰氨基酚对照品，氢氧化钠，容量瓶，量筒，紫外分光光度计，研钵。 四、实验步骤 1. 线性与浓度范围 取对乙酰胺基酚对照品约40mg ，精密称定，置250mL 量瓶中，加0.4% 氢氧化钠溶液50mL 溶解后，加水稀释至刻度，摇匀。分别精密量取2，4，6，8，10，12mL ，置100mL 量瓶中，加入0.4%氢氧化钠溶液10mL ，加水稀释至刻度，摇匀，照分光光度法，在257nm 的波长处测定吸收度。将浓度C 对吸收度A 回归，得线性回归方程：A=a+bC(r= ,n=6)。线性浓度范围0.0032～0.0192mg/mL. 2. 供试品测定法 取本品10片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于对乙酰氨基酚40mg ），置250ml 量瓶中，加0.4 ％氢氧化钠溶液50ml 及水50ml ，振摇15分钟，加水至刻度，摇匀，用干燥滤纸滤过，精密量取续滤液5ml ，置100ml 量瓶中，加0.4 ％氢氧化钠溶液10ml ，加水至刻度，摇匀，照分光光度法，在257nm 的波长处测定吸收度，按C 8H 9NO 2 的吸收系数（%11cm E ）为715 计算，即得。 3. 回收率试验 取本品10片，精密称定，研细，精密称取细粉适量（约相当于对乙酰氨基酚40mg ），共6份，置250ml 量瓶中，按1：1比例，分别向其中加入对乙酰氨基酚对照品，其余照“供试品测定法”项下的方法操作，按标准曲线法或百分吸收系数法计算回收率。 4. 精密度试验 照“供试品测定”项下的方法操作，计算片剂含量相当于标示量的百分数，6份测定结果的相对标准偏差（RSD ）即为精密度试验结果。 五、注意事项 1. 为减少误差，各样品应尽量平行操作。 2. 比色皿每次用完后应清洗干净。 六、思考题
尼群地平片含量测定方法学确认方案1
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尼群地平片含量测定、有关物质测定及溶出度测定检验方法确认 文件编号： xxxx药业集团有限公司
尼群地平片含量测定、有关物质测定及溶出度测定检验方法确认方案 起草人_____________ 部门____________ 日期___________ 审核人_____________ 部门____________ 日期___________ 审核人_____________ 部门____________ 日期___________ 批准人_____________ 日期__________ _
目录 一、确认方案 1. 确认的原则和目的 2.范围 3.组织及职责 3.1确认方案和报告的起草、审核、批准 3.2确认方案的培训 3.3组织实施过程中的变更和偏差 3.3实施组织人员 4.标准品和样品信息 5. 分析仪器 6. 实施检验人员信息 7. 确认项目及方法 7. 1含量测定确认 7. 2有关物质测定确认 7. 3溶出度测定确认 8. 结论报告 二、确认报告 三、确认证书
1. 确认的原则和目的 建立尼群地平片测定方法的确认方案，在实验过程中严格按照标准操作，确保试验结果真实可信，以确认尼群地平片按《中国药典》二部测定的方法是否适用于本分析中心。 2.范围 本验证方案适用于尼群地平片含量测定、有关物质测定、溶出度测定的检验方法确认。 3.组织及职责 3.1确认方案和报告的起草、审核、批准 该检验方法确认方案由检验室负责起草，方案经检验室、验证管理办公室、质管部等部门审核，最终由质量副总批准。 确认过程实施完成后，确认过程由方案起草人负责汇总，并经检验室、验证管理办公室、质管部部门主管审核，最终由质量副总批准报告及合格证书。 3.2确认方案的培训 确认方案起草人在方案经质量副总批准后及确认方案实施前，对本次确认实施的相关人员组织培训工作，由检验室主管领导人负责该次验证方案的培训工作，并将该次的培训记录交至人力资源部归档。 3.3组织实施过程中的变更和偏差 该次确认工作组织实施由检验室、验证管理办公室主管领导负责，质管部负责对验证过程中的变更和偏差进行确认。 3.3实施组织人员
氨态氮的测定方法 一、目的与原理： 1、了解掌握单指示剂与双指示剂甲醛滴定法测氨态氮总量的方法与原理： 二、单指示剂甲醛滴定法： (一)原理：氨基酸具有酸、碱两重性质，因为氨基酸含有-COOH基显示酸性，又含有-NH2基显示碱性。由于这二个基的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就可用碱来滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的量，反应式可能以下面三种形式存在。 （二）试剂 (1)40％中性甲醛溶液，以麝香草酚酞为指示剂，用1N NaOH溶液中和。 (2)0.1％麝香草酚酞乙醇溶液。 (3)0.100N氢氧化钠标准溶液。 (三)操作步骤： 称取一定量样品(约含20毫克左右的氨基酸)于烧杯中(如为固体加水50毫升)，加2-3滴指示剂，用0.1OON NaOH溶液滴定至淡蓝色。加入中性甲醛20毫升，摇匀，静置1分钟，此时蓝色应消失。再用0.1OON NaOH溶液滴定至淡蓝色。记录两次滴定所消耗的碱液毫升数，用下述公式计算 计算： 氨基酸态氮(％)=( N V×0.014×100)/W 式中： N：NaOH标准溶液当量浓渡。 V：NaOH标准溶液消耗的总量(m1) W：样品溶液相当样品重量(克)。 0.014：氮的毫克当量。
三、双指示剂甲醛滴定法： (一)原理： 与单色法相同，只是在此法中使用了两种指示剂。从分析结果看，双指示剂甲醛滴定法与亚硝酸氮气容量法(此法操作复杂，不作介绍)相近单色滴定法稍偏低，主要因为单指示剂甲醛滴定法是以氨基酸溶液PH值作为麝香草酚酞的终点。PH值在9.2，而双指示剂是以氨基酸溶液的PH值作为中性红的终点，PH值为7.0，从理论计算看，双色滴定法较为准确。 (二)试剂： (1)三种试剂同单指示剂法 (2)0.1％中性红(50％乙醇溶液) (三)操作步骤： 取相同的两份样品，分别注入100毫升三角烧瓶中，一份加入中性红指示剂2-3滴，用0.100N NaOH溶液滴定终点(由红变琥珀色)，记录用量，另一份加入麝香草酚酞3滴和中性甲醛20毫升，摇匀，以0.100NNaOH准溶液滴定至淡蓝色。按下述公式计算。 计算： 氨基酸态氮(％)=( N(V2-V1)×0.014)/W×100 式中： V2：用麝香草酚酞为指示剂时标准碱液消耗量(毫升) V1：用中性红作指示剂时碱液的消耗量(m1)。 N：标准碱液当量浓度。 W：样品的重量(克)。． 0.014：氮的毫克当量。 注意事项： 测定时样品的颜色较深，应加活性炭脱色之后再滴定．