细胞毒理学及其研究方法
公共卫生学院劳动卫生教研室金亚平
定义:
毒理学(Toxicology)是研究外源性物质对生命有机体损伤作用规律及其机制的一门学科。
细胞毒理学(Cytotoxicology):
是研究外源性物质对生命细胞损伤作用规律及其机制的一门毒理学分支学科。
研究内容
细胞毒理学是以培养细胞为研究对象进行毒理学研究的一门科学，它主要是应用体外模型对外界环境中有害因子(物理、化学和生物)进行监测，评价其对人体可能产生的危害。
研究有害因子的一般毒性作用
判断外源性有害因子对细胞的一般毒性及评价可能引起的潜在毒性作用。
可通过光学显微镜/电镜及其他方法，直接观察体外培养细胞受损的性质与程度，如细胞的形态学改变、贴壁性差、生长速度减弱、细胞退化、死亡及完整性受损等。
已知对人类有毒性作用的大多数药物或毒物，在体内与体外的毒性效应是一致的。
研究有害因子的特异毒性作用
从哺乳动物或人体的不同组织器官分离出不同类型的细胞。用以筛检不同毒物对不同细胞的毒性。有害因子诱变作用及致癌作用: 体外培养细胞，特别是哺乳动物的离体细胞已广泛应用于体外测试诱变和致癌的试验中，其包括基因点突变、染色体畸变、姊妹染色单体互换、染色体显带、DNA 损伤、程序外DNA合成和细胞恶性转化等。如砷的致癌作用。
研究有害因子在细胞内的代谢
体外培养细胞可能是研究毒物代谢最合适的体外试验模型。体外细胞培养避免了体内复杂因素(如神经-内分泌、营养物质等)的干扰，可以按研究者预先设计的需要，来严格控制有害因子的剂量及与细胞接触的时间。可以直接检测、分析细胞内代谢的改变，容易了解毒物代谢与毒性之间的量-效关系。如砷体内代谢等。
研究有害因子的毒作用机制
也是研究有害因子毒性作用机制的最合适的材料。如用已建立的体外细胞转化系统研究辐射及化学致癌物诱发细胞癌变的机制，用血管上皮细胞和星形胶质细胞的体外培养系统研究毒物对血脑屏障的损伤，用巨噬细胞和成纤维细胞组成的体外培养系统，研究二氧化硅致矽肺纤维发生、发展过程及其作用机制。
用于药物的筛选、进行药效学评价
可用于研究药物的作用、毒副反应及其作用机制，为选择疗效好、毒副反应小的药物提供资料，在此研究基础上，对疗效好、毒性小的初筛药物，再用动物实验模型加以验证。
细胞毒理学发展简史
细胞毒理学作为毒理学的一个分支学科出现是近10多年的事。因此，它是一门较新的学科。
其优点:
(1) 可以按实验要求控制实验条件，把整个实验安排在体外进行，在体外直接观察到细胞形态发生的改变，便于了解毒物与毒性作用之间的关系。
(2) 实验条件易于控制，可严格控制作用物的剂量和作用时间，排除体内复杂的神经-内分泌因素的干扰，实验结果稳定，重复性好。
(3) 操作简便，不需要复杂的大型仪器设备，实验经济。
(4) 可同时提供大量的生物学性状相同的细胞系(株)作为研究对象，避免了动物间的个体差异，实验易重复。
局限性：
因为细胞是在离开机体整体环境下，独立生长在体外环境中，其生物学性状多少会发生某些改变，
所获得的结果可能与人体或动物体的整体实验结果存在某些差异。因此，细胞毒理学实验结果存在着由体外实验结果推论体内实验结果的问题。
细胞毒理学研究的实验条件
无菌间：
(1) 超净工作台：应有照明和紫外线消毒装置。
(2) CO2培养箱：维持恒定的5％CO2浓度，温度在37.0±0.5℃。
(3) 紫外线灯：无菌间天花板上应安装1-2个紫外线灯，每天操作前30min进行空气消毒。
(4) 空调器：尤其在炎热的夏季。
倒置显微镜：用于活体培养细胞观察，最好有显微摄像装置，可对活体细胞进行拍摄。
普通显微镜：用于细胞计数，固定标本的检测。
显微摄像：可对培养细胞的生长、分裂或对作用物的反应情况进行动态拍摄观察。
高压蒸气消毒器
在体外细胞培养过程中所需的许多物品和液体都需要高压蒸汽消毒。消毒所需的压力和时间，根据不同消毒对象而异。
消毒条件：
玻璃器皿为15磅压力(121 ℃)，15min；
液体溶液为10磅压力(115 ℃)，10min。
冰箱、冰柜
各种培养用的液体、试剂、药品溶液、血清都需要冷藏，一般常用已配好的培养液可在4℃冰箱或冰柜保存；血清、胰蛋白酶等需要保存在-20℃或更低温度的冰箱内；某些特殊用途的生化试剂，如各种工具酶等则需保存在低温(-80℃)冰箱内。
过滤器
由滤器、滤膜组成。滤膜是除茵的主要材料，一般孔径为0.22μm，去除细菌，但对于小于0.2μm 的支原体或小于0.1μm的病毒无去除作用。过滤除茵操作应在无菌间超净台内进行。
微量滤器
当滤过的溶液较少时，可选用微量薄膜滤器，其结构与蔡氏滤器一样，小间夹着一层纤维素酯薄膜，以0.22μm的薄膜除菌效果最好。
培养瓶、培养皿和培养板
有玻璃材料或塑料材料制成。用玻璃培养瓶或皿比较经济，可反复清洗使用。
玻璃器皿的清洗
新玻璃器皿：先用清水冲洗，再浸入洗衣粉或洗洁精水溶液中煮沸半小时。然后用毛刷刷洗，流水冲至肥皂沫除尽为让。瓶壁上沾有肥皂液会影响细胞贴壁生长，即使1:100万的肥皂痕迹也会有影响。清水冲洗干净后、浸入清洁液中过夜。取出，流水冲洗，冲洗时用力震摇，最后用蒸馏水冲洗2-3次，烘干。
使用过的玻璃器皿
用后立即浸入清水中，防止蛋白质粘附于瓶、皿壁表面难以洗脱，然后浸入洗洁精水溶液中，用毛刷刷洗，其余清洗步骤同上。浸泡于清洁液中是玻璃器皿清洗过程中关键的一步。要求将整个器皿完全浸入清洁液中，不要有气泡。
清洁液：用浓硫酸、重铬酸钾和蒸馏水配制而成，有很强的氧化作用，去污效果十分好。
塑料器皿的清洗
由于塑料器皿耐腐蚀性不强，且质地较软，其清洗方法与玻璃器皿有所不同。不能用清洁液浸泡。常规清洗方法：用清水浸泡24h，再用2％NaOH溶液浸泡过夜。取出、清水冲洗后，用5％稀盐酸溶液浸泡30min，蒸馏水冲洗或蒸馏水浸泡24h后，取出，冲洗、凉干、备用。
金属器材的清洗
新金属器材表面常涂有防锈油，因此，在清洗前，须先用纱布蘸汽油擦去防锈油。再用洗洁精水溶液刷洗，流水冲洗，最后用蒸馏水冲洗3次，晾干、消毒备用。使用过的金属器材先用清水冲洗，再浸入洗洁精水溶液中刷洗，清水冲洗、蒸馏水浸泡或冲洗后，擦干、备用。
橡胶制品的清洗
新橡胶制品带有大量滑石粉，先用清水将滑石粉冲净，再用2％NaOH溶液煮沸20min，清水冲洗，再用1%稀盐酸浸泡30分钟，蒸馏水浸泡24h后，取出，蒸馏水冲洗，烘干备用（温度不宜过高）。使用过的橡胶制品浸人清水中，用洗洁精水溶液煮30min，清水冲洗20min，蒸馏水中浸泡24h后，取出，蒸馏水冲洗，烘干备用。
消毒
紫外线: 消毒效果与照射距离成反比。一般照射30min即可。
优点：是消毒效果好、消毒面积大、使用方便。
缺点：是产生臭氧，对末直接照射的物品无消毒效果。
干热消毒: 消毒时温度为160 ℃，时间90-120min。
优点：使用简便，消毒后物品干燥。
缺点：是热传导慢，消毒时间长。
湿热消毒
即高压蒸气消毒。溶液消毒时，瓶口不可塞死，以免瓶内压力过大破裂。消毒结束后，先排气，待压力自然下降后，打开锅盖，以免溶液喷出。消毒好的物品，置70 ℃温箱内烘干后，备用。
优点：是消毒效果好，时间短；
缺点：是需专人监管，随时注意压力变化。
过滤除菌
用于液体消毒
玻璃滤器：常用G-6型滤器，不适于血清等高蛋白液体过滤，因滤板孔径易被堵塞而失去作用。蔡氏滤器：由金属制成，中间夹有纤维滤膜。适用于血清及一般液体的过滤。可用正、负压抽滤。微型滤器：过滤时可将溶液的损失减少到最小程度。其过滤效率高，使用方便。
消毒剂消毒：常用乙醇、来苏尔、新洁尔灭、过氧乙酸等，用于消毒超净台、桌椅、墙壁、天花板、地板及操作者的手等。常用：0.1%新沽尔灭溶液和70%乙醇溶液。
平衡盐溶液(Balanced Salty Solution, BSS)
Hanks液缓冲能力较弱，Earle液缓冲能力较强。在配制消化液宜采用Ca、Mg含量较低的PBS 液或无Ca、Mg离子的D-Hanks液。
天然培养基--血清
除特殊适应的细胞或因特殊实验目的而选择无血清培养基外，一般的细胞培养都必须加入血清。血清加入的原则是既可维持细胞良好地生长，又不浪费血清。一般为5-40％，通常为10-20％。常用血清有：新生小牛血清、胎牛血清和马血清等。肿瘤细胞或恶性转化细胞对血清浓度要求较低，一般5％血清即可满足其细胞生长的需要。
较理想的血清是胎牛血清
原因是：血清中胎球蛋白和无机盐离子含量较高，不含有抗体，对细胞生长较有利。年幼动物血清的质量高于年长动物。由于不同地区和批次的血清质量差别较大，一个实验用同一批血清为宜。作免疫或激素试验时，因血清可能引入不必要的免疫因素的干扰。血清使用前须经彻底的补体灭活（水浴中56℃，灭活30min）。
合成培养基
一般地讲，合成培养基只能维持细胞不死，不能促进细胞增殖或生长，尚需添加血清等。
合成培养基的选择：根据实验要求、实验室条件、细胞种类及研究者本人的经验。实际应用中发现，一种培养基可适用于多种细胞的培养，常用的有：RPMI-1640、F12、199、MEM，可适用于多种
细胞系(株)的培养。
合成培养基的优点
1. 使培养条件标准化，易于控制培养的条件；
2. 使细胞生长条件稳定，便于体外观察；
3. 可规范细胞培养操作程序，简化操作步骤；
4. 可准确测定培养体系中物质成分的变化，以评价细胞生长与代谢状况；
5. 不含对细胞生长有害的物质，利于细胞生长；
6. 可人工合成，来源方便，质量有保证。
细胞分离液(消化液)
其作用为
1. 在制备原代细胞时消化组织、分散细胞；
2. 在细胞传代时使细胞脱离生长表面(瓶壁)和使细胞团离散成单个细胞。
可以单独使用，也可按一定比例混合使用，主要取决于所培养细胞的要求。
胰蛋白酶
水解细胞间的蛋白质，使细胞离散。不同种类的组织或细胞对胰酶的浓度，作用温度和时间的要求不同。浓度大、温度高和作用时间长对细胞的离散作用就大，但超过一定限度会损伤细胞。Ca2+、Mg2+和血清会降低其活性。所以，胰酶要用无Ca2+、Mg2+的溶液配制，在终止消化作用时，可加入血清或含血清的培养液。胰蛋白酶溶液的常用浓度是0.25 - 1％。
乙二胺四乙酸钠(EDT A)
EDTA是螯合剂，其毒性小、价格低廉。使用浓度为0.02%。用无钙、镁溶液溶解后，高压灭菌，分装小瓶，于室温或冷藏保存。
胰酶-EDT A消化液
胰酶和EDTA联合使用时离散细胞的能力会更高，其终浓度分别为0.25％和0.02％。滤过除菌，分装小瓶于-20℃保存。一瓶最好一次用完，不宜反复冻融。
胶原酶
胶原蛋白富含甘氨酸、羟脯氨酸，普通的蛋白酶对其水解力弱，因此对甘氨酸、羟脯氨酸丰富的组织细胞的分散需用胶原酶。胶原酶种类较多，不同生化试剂公司产品的种类、纯度、酶活性都有一定差异，使用时应根据所消化组织的特点，并参考文献及产品说明来确定。胶原酶一般配成10倍贮存液，使用前作10倍稀释，使用浓度一般为l-5mg/m1。
胶原
没有营养功能，但可为培养细胞的粘附和迁移提供适宜的界面。用于组织块培养及不易贴壁细胞的附着，并改善生长界面的性质以适合细胞的生长。在这个作用中它比血浆的优点多，可代替血浆。因为，凝结的血浆易被细胞消化，而胶原却不会被破坏。由于胶原的粘度较大，难于滤过除菌，故在整个胶原提取操作中应保持无菌操作。
鼠尾胶原制备
1. 取尾腱：大鼠尾在75％酒精中浸泡30min，取出，将鼠尾切成1.5cm左右的小段，抽尾腱。
2. 浸出胶原：剪碎尾腱，浸入150ml 0.1％醋酸溶液中，4℃、48h，不时振摇。
3. 分离：离心4000rpm×30min，取上清，115 ℃高压蒸汽灭菌后，分装。-20℃保存。
4. 使用方法：取少许胶原涂于培养瓶皿培养面的内壁上。以倾斜平皿时不流动为宜。通氨气，作用30min，使胶原凝出。用生理盐水冲洗，凉干后使用。在接种细胞前用培养液冲洗。
温度
人和哺乳动物细胞培养的最适宜温度为37.0±0.5℃。细胞对低温的耐受力要比对高温强。将细胞置于25-35℃的条件下，细胞仍能缓慢生长。将细胞置于4℃下数小时后，再放置于37℃温箱内，细胞仍能生长。如果将温度降低至冰点以下，细胞会因冰冻而死亡。
酸碱度
细胞生长的最适pH值为7.0-7.4。到7.6时，细胞虽有代谢，但已不再分裂增殖。细胞耐酸性的能力一般要比碱性强。所以，在配制培养液时有“宁酸勿碱”之说。培养液的pH值一般是以CO2／HCO3-缓冲体系来调节的。其不足之处是：培养液在配制、保存或使用过程中，特别是在反复使用后，CO2气体易从培养液中释放出来，从而使培养液的pH值升高。
HEPES [4-(α-羟乙基)-1-呱嗪乙烷磺酸]
是目前常用的缓冲剂。它的缓冲能力强而持久，在pH 6.8-7.2范围内具有良好的缓冲作用。可先配成100倍的贮存液(1mol/L)，使用时的浓度为10mmol/L。
原代细胞培养的基本技术
取材：
应绝对无菌取材，但对暴露于外界的组织，应先将所取的组织放入70%酒精或含青、链霉素的培养液中浸泡10-20min后，立即培养或把组织剪成1mm3左右的小块，放入培养液中，置4℃贮存，但存放时间不宜超过24小时。理论上，动物和人的所有组织均可培养。但实际上，幼年尤其是胚胎组织及肿瘤组织或其他分化程度低的组织较容易培养。
细胞离散法
一、机械分散法：某些组织，如脑、胚胎及肿瘤组织，可采用该法。先用组织匀浆器研碎组织，然后通过细胞筛获得单细胞悬液。此法简便省时，但对细胞有一定损伤。
二、酶消化法：
1. 胰蛋白酶：适合消化间质较少的软组织。
2. 胶原酶：适用纤维、上皮等组织，作用缓和。
3. 联合应用:可将胰蛋白酶和胶原酶混合或先后应用以消化某些硬组织，如骨组织等，其效果更佳。胰蛋白酶消化程序
(1) 先将组织剪成lmm3大小，置三角烧瓶中，加入比细胞多30-50倍的0.25％胰酶液。
(2) 37℃水浴中消化30min，期间要不时摇动。
(3) 消化后，吸上清液于离心管中，800~1000rpm离心5min，取沉淀，用Hanks液洗两次。
(4) 加入培养液，200目筛网滤过，用于培养。
上述方法称为热消化，也可将组织放入胰酶后，置4℃，进行缓慢消比。消化时间可延长12-24h，此法称冷消化法。
细胞培养程序
置细胞培养箱中培养，2-3天后换一次培养液。类上皮细胞约5-7天长成单层细胞，成纤维细胞则3-4天。单层细胞如继续培养,则易老化，甚至脱落。因此，需要换成维持液(仅含2％血清的培培养液)，以后每隔5-7天换维持液，一般可维持1-3周。长成单层的原代细胞也可进行传代培养，即1瓶传成2瓶。
淋巴细胞的分离
取1ml抗凝血加1ml Hanks液稀释，沿管壁加入盛有2m1淋巴细胞分离液的试管内（勿与分离液混合），2500~3000rpm离心20min。管内分四层，自上而下为血浆，单个核细胞，颗粒白细胞、红细胞。用毛细管层轻轻吸出全部单核细胞。用Hanks液洗两次，每次1000rpm离心10min，最后用RPMIl640配成细胞悬液备用。
细胞的冻存、复苏与运输
原理：向培养基中加入保护剂甘油或二甲基亚砜(DMSO)，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。储存在-130℃以下。
注意事项
慢冻快融：标准的冷冻速度为1~2℃/min，当温度达到-25℃时，下降速度可增至5~10℃/min。到
-l00℃时则可迅速浸入液氮中。
融化细胞时，速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的-5~0℃后，细胞仍能生长，活力不受任何损害。
细胞冻存的具体步骤
1. 收集对数生长期细胞，24小时前换液。
2. 制成细胞悬液，调整细胞密度。冻存的细胞数量应比平常多一些。
3. 分装冷冻管中，严密封口，放入纱布小袋中(内放铅块) ，系以线绳，线绳末端系小牌，注明细胞名称、操作者和冻存日期。
冻存方法：当前已有专用细胞冻存器，能精确控制冷冻速度。
方法一：把冷冻管悬在液氮罐口，在30-40min时间内，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。
方法二：冷冻管置于4 ℃30~60 min→(-20 ℃30min*) →-80 ℃16~18 h(或隔夜) →液氮罐长期储存。
方法三：冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃至–80 ℃以下，再放入液氮罐长期储存。
* -20 ℃不可超过1h，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80 ℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
细胞复苏的具体步骤
1. 迅速取出液氮中保存的冷冻管，迅速放入37-40℃水浴中使其在1min内融化。5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。
2. 无菌操作下打开冻存管：
1) 将细胞悬液转移到培养瓶中，补足生长液，培养。待细胞贴壁(约4h)后，换培养液。
2) 将细胞悬液转移至离心管中，补加10ml培养液，500-1000r/min离心5min，去上清，用培养液制成细胞悬液，装入培养瓶中，培养，24h后换液一次。
细胞运输
液氮或干冰保存运输法：保存效果好。但麻烦，需要特殊容器，且不适于长途运输。
充液法：简便易行。具体方法如下：选生长状态好的细胞，待接近连接成片时，去掉旧培养液，充满新培养液，液量要达到培养瓶颈部，旋紧瓶盖，保留微量空气。空气过多，运输时产生气泡干扰细胞。妥善包装后，在四、五天内对细胞活力无大影响。到达目的地后，倒出大部分培养液，保留维持细胞生长所需的液量，培养，次日传代。
细胞培养的污染检测与排除
“污染”是指：凡是混入培养环境中对细胞生存有害的成分或造成细胞不纯的异物。
细胞培养的污染因素包括：
1. 微生物：多见，如真菌、细菌、病毒和支原体；
2. 化学因素：少见；
3. 其它种类细胞的污染：细胞间的交叉污染会造成细胞系不纯。
细菌与霉菌的污染
霉菌污染容易发现，大多形成白色或浅黄色菌团漂浮于培养液表面，肉眼可见，有的散在生长，镜下可见丝状菌丝，纵横交错于细胞之间。
细菌污染时培养液混浊。较轻时镜下可见小的菌体在细胞间移动，也可涂片染色镜检或进行培养液细菌培养，加以确定。
支原体的污染和检测
是最常见的污染微生物，目前各实验室使用的传代细胞中约11%有支原体污染。
支原体的检测
支原体的大小介于细菌和病毒之间，最小的直径0.2μm ，能通过滤菌器。常在购进的各种血清中就有支原体的存在。因支原体无细胞致死毒性，可与细胞长期共存。培养液一般也不发生混浊，外观上给人以“正常”的感觉，实则细胞受到多方面的潜在影响，如细胞变形，影响DNA合成，以致抑制细胞的生长。
支原体的检测
直接培养法:
原理：在培养基中直接培养支原体，观察其生长及菌落生成。
特点：是目前最直接与灵敏的步骤。
缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来。
荧光染色法:
用能与DNA特异结合的荧光染料染色，荧光显微镜下观察。因支原体含有DNA，能着色。被支原体污染的细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到大小不一的萤光小点，
造成支原体污染的原因
支原体的来源:
已受污染的细胞；
操作人员的疏失；
已受污染的培养基、血清；
操作环境不良、实验器具不洁等。
由于支原体为人口腔中的正常菌丛，实验操作时，须十分注意。
细胞受支原体污染，最好的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。
细胞培养常见问题及回答
为什么在培养基中加酚红？
被作为pH值指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。但酚红有固醇类激素作用（特别是雌激素）。为避免固醇类激素反应，尤其培养哺乳类细胞时，可用不加酚红的培养液。由于酚红干扰检测，做流式细胞检测时，也可使用不加有酚红的培养液。
二价离子抑制胰酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？
是的。EDT A可用来螯合游离的钙、镁离子，以保持胰酶的活性。在胰酶处理细胞前，用EDT A清洗细胞，可消除培养基中的二价离子。
细胞解冻培养时，是否应马上去除DMSO？
除少数对DMSO 特殊敏感的细胞株外，大部分细胞株在解冻后，应直接放入含有10-15ml 新鲜培养液的培养瓶中培养，待隔天再换新鲜培养液，以去除DMSO，如此可避免细胞解冻后，无法生长或贴附的问题。
何谓FBS, FCS, CS, HS ?
FBS (Fetal Bovine Serum)和FCS (Fetal Calf Serum)是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS是错误的，请不要再使用。CS (Calf Serum)则指小牛血清。HS (Horse Serum)则指马血清。
细胞离心的速度应为多少？
离心速率一般为300g (约1,000rpm)，5 - 10 分钟，转速过高会造成细胞死亡。
培养液中抗生素浓度应为多少？
在无血清培养液中添加的抗生素浓度应至少是有血清培养液中的50%。因为，血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。由于无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能会达到细胞毒性水平。
细胞形态与结构
可分为贴壁型细胞和悬浮型细胞。
贴壁型细胞：绝大多数体外培养的细胞是属于贴壁型细胞。细胞贴壁后，分化现象常变得不显著，易失去原有组织特征，形态上表现单一化。而且提供组织的原机体年龄越幼稚，这种现象就越明显，并能反映其胚层起源，如源于内、外胚层的细胞多呈上皮样细胞，源于中胚层的多呈成纤维细胞，由于细胞形态趋于单一化，因此在判定细胞类型时不能按体内细胞形态标准确定，仅大致分成如下几类，不能生搬硬套。
成纤维细胞：形态与体内成纤维细胞相似，胞体呈梭形或不规则的三角形，中央有圆形核，含1-2个核仁，胞质向外伸出2-3个长短不一的突起。细胞群常借原生质突起连接成网。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质来源的其他组织细胞，如血管内皮、心肌、平滑肌、成骨细胞等，也多呈纤维细胞形态。
悬浮型细胞：在培养瓶内不能贴附在支持物上生长，而呈悬浮状态生长。这类细胞形态呈圆形。如某些癌细胞（白血病细胞）和血液中的淋巴细胞属于悬浮型细胞。
上皮细胞：细胞呈扁平的不规则多多边形或多角形，中央有圆形核，含1-2个核仁。生长时常彼此紧密连接成单层细胞。起源于外胚层和内胚层组织的细胞，如皮肤表皮及其衍生物（汗腺等）、肠道、肝、胰和肺泡上皮细胞等。
游走细胞：细胞在支持物上散在生长，一般不连接成片，胞质常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且方向不规则。细胞形态不稳定，有时难与其他类型细胞相区别。
体外培养细胞分类
1．原代细胞：由体内取出的组织，在体外首次培养，称为原代细胞或初代细胞。这种细胞离体时间短，遗传性状与体内细胞相近，适于进行细胞形态、功能和分化的研究，是较好的实验材料。2．二倍体细胞：待原代细胞培养增殖到一定密度后，将其消化、分瓶再培养(Subculture)，其染色体核型多为二倍体，二倍体细胞具有一定寿命，因此，不宜过多传代，应适时地将细胞贮存于液氮中，用时再复苏。
3．传代细胞：二倍体细胞继续传代培养，细胞的遗传性状和生物学特性可发生改变，失去二倍体的核型，成非整倍体，亦称不死性或永生性细胞，如CHL、V79、CHO、HeLa及3T3细胞等。这类细胞可在体外无限传代培养，成为医学和生物学研究中常用的材料。
体外细胞培养的生长过程
从细胞接种到下一次传代培养叫一代。要经过潜伏期，指数增殖期与停止期三个阶段。细胞接种后呈悬浮状态，贴壁细胞会很快附着于培养瓶壁，各种细胞贴附速度不同，一般在0.5-4h左右。贴壁后需经过潜伏期才能进入生长期；潜伏期长短不同，原代细胞约需24-96h，肿瘤细胞或无限传代细胞仅需6-24h。待细胞分裂相逐渐增多，标志着细胞进入指数增殖期。
细胞分裂数量可作为判定指数增殖期细胞的生长是否旺盛的一个重要指标。
MI是指计数100个培养细胞中的分裂细胞数，一般细胞的MI为0.2％-0.5％。无限传代细胞系或肿瘤细胞的MI可高达3％-5％。
如接种细胞数量适宜，指数增殖期约持续3-5天。细胞数量增多，贴壁细胞可相互接触连成片，正常细胞因发生接触抑制而形成单层细胞，但肿瘤细胞的接触抑制消失，可导致细胞形成多层重叠。由于细胞密度增大，营养液中营养成分会大量消耗，代谢终产物蓄积，细胞进入停止期，细胞虽有代谢活动，不再增殖；此时应进行传代，否则随着培养环境的恶劣变化会发生细胞中毒、变性。重则脱壁死亡。
体外培养细胞的生命过程：
一般经历原代培养期、传代期和衰退期。原代培养期，因细胞刚刚离体，与体内原组织很相似，具异质性，相互依存性强，此期一般持续1-4周。传代期在细胞全生命期中持续时间最长，其特点是细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。原代细胞一般只能传1-3代，如果呈二倍体核型并获得有限传代的细胞系称二倍体细胞系，一般可传30-50代。当传代细胞接近生存期限时，细胞增殖缓慢以至完全停止，进入衰退期，最后死亡。在传代期培养时应注意为保持二倍体细胞性质，细胞应在
传代后早期冻存(不出10代内冻存)。
体外培养细胞的形态变化：
悬浮生长时，不论原来属于哪种类型，胞体均回缩成圆形。呈贴壁生长时，细胞附着于支持物表面后，开始为圆形，短时间后经由球形移行成放射延展细胞，再由延展细胞过渡为极性细胞。
在这一过程中，形态由圆形或椭圆形变成三角形或梭形。成纤维细胞有时不经过放射延展阶段，直接过渡到极性细胞。上皮细胞一般要经过放射延展阶段再进入极性细胞阶段。
不同细胞的原代培养
兔肾细胞的制备：
材料：出生48小时的仔兔。
培养液与试剂：含10％FBS(或CS)的MEM培养液、无Ca、Mg-Hanks液、0.25%胰酶溶液。
器具：各种吸管、离心管、80-100目的不锈钢筛网，皿、瓶，手术刀、剪、镊。70％酒精消毒缸、解剖板等。
实验步骤
取肾：2日龄仔兔一只，断颈处死后，放入70％酒精溶液中浸泡10min后取出，用碘酒，酒精消毒背部皮肤，解剖取肾，除去被膜，放无菌平皿内用Hanks液洗净。
处理与消化：剪下肾皮质部分，移入小三角烧瓶内，细剪成1mm3左右的组织块，D-Hanks液洗3次，吸弃上清液，加约10倍量的0.25％胰酶，于37℃水浴中消化10-30min，当组织块聚合成一团，边缘毛样模糊即可。
分离细胞：用毛细管轻轻吸出消化液，用Hanks液洗l-3次，加10ml培养液。用吸管反复吹打，使细胞分散，制成细胞悬液.然后将细胞悬液通过不锈钢筛网。
细胞计数：取上述获得的细胞悬液，5倍或10倍稀释后计数，调整细胞浓度为(0.5-1)×106/ml，分装培养瓶内培养。
培养及观察：将培养物置37℃孵箱内培养，逐日观察细胞生长情况，一般于2—3天可形成单层细胞，换维持液即可用于试验，或经传代后长成单层时使用。
人胚肾细胞的制备
材料：引产或自然流产的3-5月龄人胚(药物引产不宜使用)，死后不超过6-10h。
取肾：取胎儿，用碘酒和酒精消毒腰背部皮肤，于脊柱两侧剪开皮肤，剥离暴露肾赃，取出肾脏放在平皿内。剥去肾包膜，用5倍量含青、链霉索的Hanks液洗3次，移至另一平皿内，用剪刀从肾脏表面剪取肾皮．移入三角烧瓶中，再细剪成肉泥状（约1-2mm3大小的小块)并用含青、链霉素的D-Hanks液洗涤3次，以除去血细胞。
消化：加入10倍量的0.25％胰酶，在恒温37℃水浴消化30min，然后以1000rpm离心，去除胰酶，立即加入适量的生长液，用吸管吹打，将细胞悬液通过不锈钢滤网。
分瓶培养：根据细胞数用培养液调整合适的细胞浓度（3-5×105/ml)分装于培养瓶内，置37 ℃孵箱内培养，成功可于次日见细胞贴附管壁。培养2-3天换液一次，一般细胞在4-6天长成单层细胞供使用。
神经胶质细胞
广泛分布于中枢和周围神经系统，其数量比神经元大得多，胶质细胞与神经元数目之比约10:1-50:1。胶质细胞可分几种，各有不同的形态特点，用特殊的金属浸镀技术（银染色）或免疫细胞化学方法可显示细胞的全貌。
脑星形胶质细胞原代培养
1. 取出生1-3天的大鼠脑组织，仔细剥除脑膜和血管等成分，置入Hanks液中漂洗1-2次后，置于30~50倍的Hanks液中，脑组织比较柔软，反复吹打即可制成单细胞悬液。
2. 为排除脂肪成分和其它碎块，把悬液注入离心管中，在室温直立5-10分钟后，细胞或细胞团块自然下沉，脂肪等杂物易漂浮于悬液表层，吸除上清，如此反复2~3次，可获得较多的细胞成分。
3. 向末次沉淀物中加入适量培养液，通过纱网或纱布滤过，计数细胞并调整细胞密度，接种入培养瓶或皿中，置5％CO2培养箱中培养。
4. 细胞生长汇合后，可用0.25％胰酶液消化传代。所加消化液的量以能覆盖细胞层即可，待细胞开始从瓶壁脱离（平均5 ~10分钟），加入含有血清的培养液，吹打制成细胞悬液。
*：该细胞接种后贴壁较慢。贴壁后短期内也可能不见细胞分裂，然而一旦生长后即能迅速进入旺盛的增殖状态。
细胞毒理学研究的实验方法
细胞毒性的检测方法
细胞形态观察：毒物可引起细胞形态发生多种变化，如胞体肿胀、萎缩、细胞间隙扩大，失去原有细胞形态特征，膜表面变平，微绒毛数目增多或减少，长短不一、排列繁乱、伪足消失，核肿胀或固缩、破裂、线粒体肿胀或萎缩、内质网扩张，溶酶体破坏等。细胞形态学观察，可对毒物作用的量-效关系进行分析，为评价毒物毒性提供部分依据。
细胞固定染色后观察
观察材料：单层贴壁培养细胞和悬浮培养的细胞。
步骤：预先在瓶内放置一盖片，使细胞在上面贴壁生长，经毒物处理后的细胞，弃去培养液。用PBS液洗2-3次。取出盖片，放在37℃PBS液中漂洗2次，每次1-2min，洗去标本上的血清后，进行固定染色。
如用悬浮培养细胞作材料，先收集细胞，然后离心(800转/min)5-10min，弃去上清，加入少许PBS液，用吹管轻轻吹打，制成细胞悬液，再作涂片，晾干，固定染色。
*：注意树胶封片时令细胞面向载玻片。
细胞生长状况的观察
细胞贴壁率的测定：接种于培养瓶内的细胞，一般在接种后24h内均可贴壁。但细胞受毒物或其他有害因子作用后，发生形态及功能的改变，此时细胞不易贴壁生长，已经贴壁生长的细胞，可从瓶壁上脱落，且呈一定的剂量效应关系。因此，细胞贴壁生长情况，可作为细胞毒性的一个有用的指标。
测定的方法
常规制备细胞悬液，取一定量细胞接种于培养瓶内。置于37℃培养箱内静置培养。于接种后不同时间（如6、12、24和36h），计数悬液中细胞数。
结果表示：
细胞贴壁率(％)
=悬液中细胞数/接种细胞数×100
细胞贴壁率反映细胞生长能力，生长力越强，贴壁率越高，反之越低
细胞存活率测定
意义：细胞存活率主要反映细胞死亡和细胞完整性受损程度。染料排斥法是测定细胞存活率常用方法。存活的细胞可排斥多种染料不着色，而死亡细胞或严重受损细胞因细胞膜通透性发生改变，染料可通过细胞膜而被着色。
方法：常规制备细胞悬液。取一定量细胞悬液于小瓶中。加入台盼蓝染液，染色约lmin，置一小滴悬浓于血细胞计数器内。在显微镜下计数l000个细胞中不着色细胞数。
培养细胞活力测定
四唑盐（MTT）比色法: 商品名噻唑蓝或四吐盐。
原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的生成物的量成正比。再用酶标仪测定OD值。
意义：MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验或肿瘤放射敏感性实验等。
操作步骤
1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养液总量200μl (96孔培养板每孔容积370μl)，37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间(根据实验目的决定培养时间)。
2）加入2mg/ml的MTT液(50μl/孔)；继续培养3小时。
3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150μl／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。
4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570nm）。记录结果。
AlamarBlue法测定细胞活力
原理：为水溶性的染料，对细胞无毒、无害，可以直接加入细胞培养液中。它有两种化学形态：氧化态和还原态。氧化态为蓝色，在600 nm处有最大吸收峰；还原态为红色，在570 nm处有最大吸收峰。氧化态的该染料可被细胞主动摄取，并进入线粒体接受呼吸链传递的电子而变成还原态。根据两种颜色的消长，可计算出某一时间段的还原率，以此来判定细胞的活力。
计算公式为：
还原率(%)=(样品570nm吸光度－培养液空白570nm吸光度)－(样品600 nm吸光度－培养液空白600nm吸光度)×R0；
R0= (10% AlamarBlue培养液570nm吸光度－培养液空白570nm吸光度)／(10%Alamar Blue 培养液600nm吸光度－培养液空白600nm吸光度)。
AlamarBlue是一种新开发的染料（专利号为U.S.5501959，purchased from BioSource International, Camarillo, CA）。在国内尚未被广泛采用。它水溶性好，对细胞无损伤，在培养液中性质稳定，不易自发地氧化或还原。被加入到培养液后可被细胞主动摄取，并进入线粒体，它的氧化还原电位是+380 mV，介于细胞色素氧化酶aa3和分子氧之间，它接受本应传递给氧的电子，而被还原。因此，对呼吸链无阻断作用。
四甲基偶氮唑盐（MTT）是目前在国内应用较广泛的用于评价细胞活力或细胞增殖力的染料，它的氧化还原电位是-110 mV，介于细胞色素和NADH或FMN之间，在呼吸链的中途接受电子。因此，干扰呼吸链中的电子传递。另外，用MTT法测定时，需加入酸性异丙醇终止反应，并使结晶颗粒溶解，因此，不能对细胞进行连续地观察测定。
细胞内生物大分子测定
意义：细胞中蛋白质、DNA等生物大分子物质的合成情况，可定量地反映细胞的生长状况。细胞蛋白含量是反映细胞生长、增殖的指标；而DNA合成测定可反映毒物对分裂，增殖中细胞毒作用。这是一种比细胞存活率更为敏感的毒性反映指标。
蛋白质含量测定
原理：细胞经0.5mol/L的氢氧化钠处理后被溶解而释放出蛋白质。蛋白质含有酚基的酪氨酸，可与酚试剂中的磷钼酸作用产生出蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比关系，借此可计算出细胞中蛋白质含量，而蛋白质含量又反映细胞生长、增殖的状况。(考马斯亮蓝法)
操作步骤：吸取培养液，加入生理盐水5ml，以2000rpm，离心10min，弃去上清液，然后每管再加入0.5N NaOH溶液1ml，消化细胞。
DNA合成的测定
原理：胸腺嘧啶核苷是合成DNA的主要原料之一。用氘(3H)标记的胸腺嘧啶核苷具有很高的放射性活度，在DNA合成过程中可掺入到DNA分子中，并易从细胞中提取出来进行放射性活度测定，所得放射性活度大小反映DNA合成的情况。
甲基绿-派郎宁显示DNA和RNA
原理：甲基绿可使细胞DNA着色，而派郎宁可染RNA。甲基绿DNA着色和派郎宁RNA着色不是化学作用，而是与两种核酸的聚合程度有关。一般认为甲基绿可染高聚分子的DNA，而派郎宁
可染低聚的RNA。但DNA解聚到某一程度时，也可染上派郎宁。
操作步骤
1) 盖玻片上培养贴壁的单层细胞，放入固定液中固定30min。取出晾干。
2) 浸入甲基绿-派郎宁醋酸缓冲液中4-10min。
3) 蒸馏水中漂洗，用滤纸吸干水份。
4) 浸入纯丙酮中分化片刻。
5) 二甲苯透明5min。
6) 树胶封片。
结果：
在正常情况下，细胞核的DNA呈绿色至蓝绿色，核仁和细胞质的RNA呈现蓝红色。经过消失方法的对照标本，仅出现DNA或RNA，或者二者均消失。
注意事项：
派郎宁易褪色，进入丙酮分化时，要快速通过，并注意其颜色变化。
分子杂交技术（molecular hybridization）
原理：具有互补序列的两条单链核苷酸片段，在适当条件下，通过氢键可形成DNA-DNA，DNA-RNA 或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用带放射性的DNA探针，通过放射自显影来显示位置。后来又发明了免疫探针法，将探针核苷酸的侧链加以改造，探针杂交后，其侧链可被带有荧光标记的抗体所识别，从而显示出位置。
Southern杂交
是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA 片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用标记的探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。
PCR技术(polymerase chain reaction)
是在体外将微量目标DNA大量扩增的方法。
反应体系：
①样品DNA；
②引物(primer)：一对人工合成的寡核苷酸链(约15-20个核苷酸)，用于扩增夹在双引物与模板DNA 互补区之间的区域。
③4种dNTP；
④Tag DNA聚合酶，是从一种嗜热水生菌中分离出来的。此酶最适作用温度为75~80℃。
⑤适宜的缓冲体系和适量的Mg2+。
反应过程：
①变性：提高温度(约90-95℃)使DNA双链解离；
②复性：降温(约60℃左右) 使引物与模板结合；
③延伸：升温至70-75℃，在引物的引导下合成模板单链的互补链，从而形成DNA双链片段；
④重复“变性-复性-延伸”过程。最初几次循环中形成的长链DNA较多，但随着反应的进行，长链DNA以算术级数增加，而夹在两个引物之间的目标DNA以指数级数增长。
流式细胞计(Flow cytometer）
流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。分离纯度可达99%。
主要应用
?用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；
?测定细胞群体中不同时相细胞的数量；
?从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；
?分离DNA含量不同的中期染色体。
DNA损伤的测定
原理：DNA链断裂是电离辐射和化学毒物对DNA造成的一种常见的损伤类型。常用DNA解旋的荧光检测法测定(FADU)。DNA双螺旋链会发生解旋；当DNA分子中存在链断裂时，这种解旋速度会加快；溴乙锭(EB)在碱性溶解液中特异性地嵌入DNA双螺旋而引起荧光值增加。通过测定荧光OD值，即可检测DNA链断裂的情况。
单细胞凝胶电泳分析(Single cell gelelectro-phoresis assay,SCGEA)，也称彗星实验(Comet assay) 是近年建立和发展起来的一种快速检测哺乳动物细胞DNA损伤的实验方法，可适用于多种细胞，能够灵敏地检测DNA断裂，在检测诱变剂、射线对DNA的损伤，监测环境污染物对机体的遗传损害，研究致癌机制等方面有广泛的应用。
原理:在高pH(>12.3)下，DNA变性和解旋，从而有利于单链和双链DNA断片的移动。在电场作用下，DNA断片向阳极移行，移动的距离与DNA断片的分子量和电荷数相关，经溴乙啶（EB）染色后，在紫外线照射下发出荧光，受损细胞呈现彗星的外观，明亮的头部为细胞核，DNA断片组成彗尾，尾巴的长度和荧光强度与DNA裂片大小和数量成正比，未受损细胞只有细胞核(彗核)而无彗尾。
SCGE方法的优点：是可用于检测任何细胞的DNA损伤，不受细胞周期的影响，单细胞悬液可用单层细胞培养或组织活检制备。胰酶消化和刮取细胞均可诱导DNA损伤，Singh提出在玻片上先进行单层细胞培养,然后原位进行细胞的处理。
对大体实验，肝细胞可用原位灌流分离，淋巴细胞可取抗凝血用梯度离心或将红细胞裂解后分离，其它细胞可按常规分离方法进行，细胞存活以台盼蓝检测。
实验方法
实验对象：单细胞悬液
制板：PBS配制0.5%正常熔点琼脂糖(NMA)溶液，取100μl滴于洁净的载玻片上，立即盖上盖玻片，使NMA均匀敷在载玻片上，4℃10分钟使凝固。
铺胶：PBS配成3×107/ml 的细胞悬液，取25μl与37℃下75μl 0.5%的低熔点琼脂糖(LMA)溶液混匀，迅速滴在第一层凝胶上，加盖玻片，4℃10分钟，凝固后小心取下盖玻片，在其上滴加75微升0.5% LMA，加盖片冷却凝固。
乳酸脱氢酶(LDH)活性测定
原理：该酶是胞浆内酶，当细胞受到损伤时，可导致该酶释放进入细胞培养液。
方法：LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中使氧化型辅酶I变成还原型辅酶I，后者再通过递氢体使碘硝基氯化四氮唑(INT)还原成紫红色的化合物，在490nm处有吸收峰。此反应较为迅速，在规定条件下，几秒至十几秒可达到最大反应速度，并能在最初3min内维持不变，测定每分钟吸光度的变化值，作为LDH活性指标，并以此评价靶细胞被破坏的程度。
羟脯氨酸的测定
意义：组织细胞中羟脯氨酸的含量是衡量机体胶原组织代谢的重要指标。
测定原理：将样品用酸(碱)高温水解，使分解成游离羟脯氨酸后，经氯胺氧化成吡咯，吡咯与对-二甲氨基苯甲醛进一步反应生成红色化合物，此化合物在560nm波长有最大吸收。
此方法无需特殊设备，简单易行，是测定组织细胞胶原化的一种重要方法。
细胞化学技术
细胞化学染色（cytochemical staining）是利用染色剂可同细胞内某种成分发生化学反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究的技术。利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。
基本原则
(1)要保持细胞的良好形态与结构特征。
(2)在标本制作过程中，应尽可能地不影响酶的自然定位和活性。
(3)底物和其他辅助试剂应以同样速度渗入所有受试细胞及其各结构中去。
(4)底物对待测酶应当具有尽可能高的特异性，即只受待测酶的作用。
(5)辅助试剂应当不干扰酶的反应，也不影响底物的渗透。
(6)酶反应产物应迅速被同一孵育液中存在的辅助试剂所捕捉。
(7)捕捉后的酶反应底物形成终产物应即刻沉淀，既不溶于水，也不溶于脂质，形成的沉淀应当是稳定的，形态是无定形细小的结晶。
(8)参与反应的物质不结合或不吸附到酶反应部位以外的其他结构上。
固定(Fixation)
在酶组织化学中，固定是一种重要的前处理步骤。固定的目的是：
1.保存组织和细胞的形态结构；
2.终止细胞代谢过程，防止细胞自溶；
3.防止酶反应孵育过程中，使细胞形态和大小发生改变或使组织细胞成分丢失和移位；
4.破坏膜的渗透屏障，以利于底物和捕捉剂穿透细胞膜等。
细胞固定的方法有：
物理固定：如血膜空气快速干燥、冷冻干燥或直接冷冻切片。
化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂均能对细胞结构和其中的某些化学物质加以固定保存。不同化学试剂所保存的化学成分、对酶活性的影响、保存结构的细腻度均不相同。因此，要根据实验要求和组化反应，选择最佳的固定方法和固定剂。如显示多糖常用乙醇固定，而显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。
固定存在的不利影响：
1.固定过程中有组织成分的丢失，以蛋白质丢失为例，乙醇固定可使蛋白质丢失8.3％，丙酮固定丢失13％，而甲醛固定蛋白质丢失最少，几乎是0％；
2.固定可使蛋白质变性，从而引起酶的活性下降或完全失活。
常用的固定剂：醛和丙酮
37％~40％的甲醛水溶液，也称福尔马林。这种溶液中含有少量杂质，其对酶反应有抑制作用，故不宜用在酶细胞化学中。较纯的甲醛可用多聚甲醛加热解聚而获得。酶细胞化学中的甲醛固定，一般用缓冲液配制，其浓度不超过4％，因高浓度甲醛对酶活性影响较大，固定时间一般不超过6h，固定后要用缓冲液冲洗，一般在4度条件下放置12-24h为宜。
与甲醛比较，戊二醛的分子量较大，穿透组织的能力较甲醛弱。但它有两个醛基，反应速度比甲醛快，故对细胞微细结构的保存较甲醛好，但对酶活性的保存却不如甲醛。其常用浓度为1.5％-3.0％，浓度过高，对酶活性抑制作用太强，而浓度过低，则达不到原位固定和适当结构保存的目的。
丙酮是脱水剂，其固定作用是使蛋白质失去水化层而产生沉淀。因此，在很大程度上可使酶活性中心的基团处于原状。但丙酮可使蛋白质变性，从而影响酶的活性。
多糖显色法
原理：细胞内的多糖、粘多糖及粘蛋白等均可用PAS法来显示。其化学原理是利用过碘酸氧化作用，打开C-C键，将CHOH-CHOH变成CHO-CHO，而释放出醛基，这种新生的醛类和无色碱性品红能形成紫红色化合物。
结果：糖原呈紫红色颗粒，上皮粘蛋白呈淡红到深紫红色，粘蛋白及中性粘多糖呈深紫红色，糖蛋白常呈淡红色。
不依赖酶催化活性的方法
免疫组织化学方法
(1)免疫荧光法：抗体用荧光素标记。可分为直接法和间接法。
(2)免疫酶法：抗体可用辣根过氧化物酶或其他酶(如酸性磷酸酶、碱性磷酸酶)标记，又可分为酶标抗体法、酶标记抗体酶法和杂交抗体法。
(3)其他标记抗体法，如铁蛋白、放射性同位素和其他重金属标记法。
免疫组化检测步骤
0.1M PBS洗 3 min×3 →纯丙酮固定20 min →0.1M PBS洗3min×3 →3% H2O2 用0.1M PBS配制30 min →0.1M PBS洗 3 min×3，吹干画圈→正常羊血清20 min（甩，不洗，从此不能干）→滴加一抗，4度过夜→0.1M PBS洗 5 min×3 →滴加二抗，室温1.5小时→0.1M PBS洗 5 min×3 →SABC 室温30 min →0.1M PBS洗 5 min×4 →DAB 显色（避光）5-30 min →
苏木素复染：苏木素染液5-15 min →自来水洗3-5 min →1%盐酸酒精数秒钟→自来水洗1-5 min →弱碱性水溶液显兰0.5-1 min →流动自来水充分水洗5-10 min或数小时→镜检→蒸馏水洗2-3次→脱水、透明、中性树胶封固。
（80%酒精数秒或稍长→95%酒精0.5-1 min →无水酒精Ⅰ1-5 min →无水酒精Ⅱ1-5 min →二甲苯I 1-5 min →二甲苯II 1-5 min →封固）
与依赖酶催化活性的方法相比．有下述局限性：
1. 只反映出酶分子的存在，不能说明该分子有无催化活性。
2. 不能区分酶所在部位是其产生的部位或是其发挥功能活性的部位。
依赖酶催化活性的方法
原理：细胞中待测酶，作用于溶解在反应液中的外加底物，形成反应产物。当这种反应产物自身是不溶性的，或者与溶液中的其他物质反应而变为不溶时，在原位发生沉淀。通过光镜或电镜观察，即可反映酶在细胞内的定位。若经酶化反应，即形成不溶性的产物，则无需第二步反应，这类方法称不需捕捉反应的方法。若反应后的产物仍是可溶性的，则必须使初产物与反应液中的另一物质(捕捉剂)发生反应，形成不溶性沉淀，这类方法称需捕捉反应的方法。
显示方法
1. 金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成的有色沉淀，借以辨认所检查的物质或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，以显示出酶活性。
2. 偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成有色染料。
3. Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。这种反应通常用于显示糖和脱氧核糖核酸。
4. 联苯胺反应：过氧化物酶分解H2O2，产生活性氧，后者再将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。
5. 普鲁士蓝反应：三价铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝。
6. Formazane反应：显示脱氢酶。
7. “Nadi”反应：显示细胞色素氧化酶。
8. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类使脂类显色。
9. 茚三酮反应：显示蛋白质。
碱性磷酸酶
原理：磷酸酶能分解磷酸酯，用磷酸酯作为底物，其被磷酸酶水解后放出磷酸基。在pH9.2-9.8的条件下，磷酸基与钙盐起作用，形成磷酸钙，因磷酸钙无色，所以须将它变成磷酸钴，再和黄色硫化胺作用，成为硫化钻，呈黑色沉淀。
步骤：
(1)培养的贴壁细胞标本，干燥，入冷丙酮中固定15-30min。取出、干燥。
(2)入37℃碱性磷酸酶孵育液内2h，孵育液现用现配。
(3)蒸馏水洗。入2％硝酸钙2min。
(4)入2％硝酸钻2min。蒸馏水洗。
(5)入1％硫化铵(现用现配)1min。自来水洗。
(6)用2％甲基绿复染细胞核。
(7)脱水、透明，树胶封片。
结果：碱性磷酸酶呈淡灰、淡黄、灰黑色，色深者表示酶含量高。
三磷酸腺苷酶(ATPase)
原理：A TP酶使A TP变成ADP，释放出磷酸基，并在碱性条件下，磷酸基与钙盐作用形成磷酸钙，因其无色，故须使其变为磷酸钴再与硫化胺作用形成黑色硫化钴沉淀，而显示出碱性A TP酶。在中性条件下，则显示中性A TP酶。在酸性条件下，磷酸基与铅(Pb)作用，形成磷酸铅，磷酸铅再与硫化铵反应生成硫化铅，呈棕黑色沉淀，从而显示出酸性A TP酶。
检测步骤：
1.单层贴壁细胞标本入冷丙酮液中。
2.取出、干燥。入酸性A TP酶孵育液3h。
3.蒸馏水洗。入2％醋酸速洗一下。
4.蒸馏水洗，入2％硫化铵1min，自来水洗。
5.干燥，入96％至100％酒精脱水。
6.甲苯透明，树胶封片。
对照组标本：孵育液中免去A TP，而用蒸馏水代替，其他操作相同。
结果：A TP酶呈棕黄色沉淀，含酶量愈多，着色愈深，对照组标本无酶反应。
琥珀酸脱氢酶显示法
原理：该酶可使琥珀酸钠脱氢，通过电子载体，如辅酶Q，使硝基蓝四唑接受H+被还原，显示紫蓝色颗粒沉淀。
步骤：(1)培养的细胞标本，干燥。
(2)入孵育液1h，37℃(温育时间可调)。
(3)蒸馏水漂洗。入4％甲醛盐水溶液。
(4)酒精脱水。二甲苯透明。树胶封片。
结果：琥珀酸脱氢酶呈紫蓝色沉淀，含酶量愈高，着色愈深。对照组标本无酶反应。
食品毒理学 苏 丹 红 安 全 性 毒 理 学 评 价 组员：李润之周丹罗慧沈永 娟郭丽伟管健王申 杰
班级：食品质量与安全15-2 指导老师：郭东起老师 苏丹红安全性毒理学评价 李润之周丹罗慧沈永娟管健郭丽伟王申杰 指导老师：郭东起 摘要本试验用昆明种小白鼠对苏丹红Ⅰ进行了较系统的毒理学试验包括急性毒性试验、亚急性毒性试验。在对小鼠进行以苏丹红Ⅰ绝对致死量(LD100)和最大耐受量(LD0)测定的基础上制定急性毒性试验用药剂量范围进小鼠急性毒性试验并确定苏丹红Ⅰ的半数致死量(LD50)参照小鼠1/7-1/28 LD50确定试验用药最高剂量以昆明种小白鼠为动物模型进行亚急性毒性试验。研究苏丹红Ⅰ对小鼠外周血细胞和肝、脾、肾的毒性和的损伤作用并对其毒性作用机理进行了初步探讨为全面评价苏丹红Ⅰ对哺乳动物的毒理效应提供科学依据。通过显微和超微结构的观察证明苏丹红Ⅰ能够导致小鼠肝、脾、肾各织织发生损伤使其生理机能降低。不同剂量苏丹红Ⅰ染毒后病理组织结构变化的差异为判断和分析苏丹红Ⅰ中毒效应提供了充分的形态依据。 关键词苏丹红Ⅰ小鼠；半数致死量；急性毒性试验；亚急性毒性试验 1引言 民以食为天食品是人类赖以生存和发展的最基本的物质条件。在我国国民经济中食品工业己成为第一大产业。根据有关资料显示早在1993年至1998年我国食品工业总产值由3430亿元增至6000亿元平均每年递增12℅。2003年我国食品工业总产值是首破12000亿元远远超过汽车工业总产值9400亿元的水平。但是全球及我国接连不断发生的恶性食品安全事故引发了人们对食品安全的高度关注也促使各国政府重新审视这一己上升到国家公共安全高度的问题各国纷纷加大了对本国食品安全的监管力度。2003年4月16日我国国家食品药品监督管理局正式挂牌标志着我国食品安全工作迈入了综合监管与具体监管相结合的新阶段也表明了我国政府与时俱进、切实抓好食品安全工作的决心。然而有关食品安全的负面消息依然不断阜阳劣质奶粉、致癌毒大米、山东“掺胶”龙口粉丝、苏丹红致癌、南京冠生园月饼。在我国无论食源性疾病还是化学性污染物对公众健康的危害都以惊人的速度上升。 苏丹红系列染料是人工合成亲脂性偶氮化合物。因其对光线的敏感性不强物品被染色后能长期保持颜色不容易褪色所以在社会各个领域都得到了广泛的应用。20世纪70年代以后食品、医药和化妆品领域才禁止苏丹红的使用。而后苏丹红做为化工染料主要用于彩色蜡、地板蜡、油脂、汽油和鞋油等的增色添加剂还可以用于焰火礼花的着色[1]。 研究表明苏丹红Ⅰ可引起大鼠肝脏癌变但对小鼠没有致癌性目前尚无充分的证据证明对人体有致癌性。国际癌症研究中心(IARC)在其1999年公布的对人致癌性总评价表中将苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ定义为对人致癌性尚无法分类的物质[3]最近国际癌症研究机构对苏丹红的致癌作用进行了分析评价将其归类为三类致癌物但这种致癌物进入人体后代谢为二类致癌物即人类可能致癌物。 1995年欧盟(EU)国家己禁止其作为色素在食品中添加。1996年我国在《食品添加剂使用卫生标准》中也禁止将苏丹红作为食品添加剂使用[1]。但由于其染色鲜艳、价格低廉印度等一些国家在加工辣椒粉的过程中添加苏丹红。2003年初欧盟(EU)从印度进口的红辣椒中检出苏丹红Ⅰ同时在一些其它食品中也检测到这种物质为此欧洲委员会(EC)于2003年6月底发布禁止进口含有苏丹红Ⅰ的红辣椒及红辣椒制品的禁令[4]12月EC的禁令产品从苏丹红Ⅰ扩大Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四种[5]。2005年2月18日英国食品标准署向消费者发出警告并在其网站上公布了亨氏、联合利
实习一实验动物的一般操作技术 一、目的和意义 毒理学研究需要用实验动物来进行各种实验，通过对动物的实验观察和分析来研究毒作用，获得毒物的毒性、剂量-反应关系、毒作用机制等方面的资料，因此动物实验是毒理学研究中重要的手段之一。 通过本次实习学习毒理学实验中有关动物实验的基本操作技术，掌握实验动物的选择、动物抓取、染毒方法和生物材料的采集等技术。 二、内容 （一）健康动物的选择 无论选择哪种种属品系的动物进行实验，均要求选择健康的实验动物。健康动物检查时要求达到：外观体型丰满，被毛浓密有光泽、紧贴体表，眼睛明亮，行动迅速，反应灵活，食欲及营养状况良好。选择时重点检查以下项目： 1.眼睛明亮，瞳孔双侧等圆，无分泌物。 2.耳耳道无分泌物溢出，耳壳无脓疮。 } 3.鼻无喷嚏，无浆性粘液分泌物。 4.皮肤无创伤、无脓疮、疥癣、湿疹。 5.颈部要求颈项端正，如有歪斜提示可能存在内耳疾患，不应选作实验动物。 6.消化道无呕吐、腹泻，粪便成形，肛门附近被毛洁净。 7.神经系统无震颤、麻痹。若动物（大鼠、小鼠）出现圆圈动作或体位倒置呈圆圈摆动，应该放弃动物。 8.四肢及尾四肢、趾及尾无红肿及溃疡。 （二）实验动物的性别鉴定 动物性别不同对毒物的敏感性也不同，这可能与性激素、肝微粒体羟基化反应有关，也随受试物而异。因此，要根据实验要求选择性别，一般实验如对性别无特殊要求者，宜选用雌雄动物各半。 1.大鼠、小鼠主要依肛门与生殖孔间的距离区分，间距大者为雄性，小者为雌性。成年雄鼠卧位可见到睾丸，雌性在腹部可见乳头。 2.豚鼠用在一只手抓住豚鼠颈部，另一只手把开靠近生殖器孔的皮肤，雄性动物在圆孔中露出性器官的突起，雌性动物则显出三角形间隙，成年雌性豚鼠胸部有两个乳头。 3.家兔将家兔头轻轻夹在实验者左腋窝下，左手按住腰背部，右手拉开尾巴并将尾巴夹在中指和无名指中间，然后用拇指和食指稍稍把生殖器附近的皮肤扒开。雄兔即可见一圆
药物遗传毒性研究技术指导原则 （第二稿） 二○○六年十月
药物遗传毒性研究技术指导原则 一、概述 (3) 二、基本原则 (4) （一）实验管理 (4) （二）具体问题具体分析 (4) （三）随机、对照、重复 (4) 三、基本内容 (4) （一）受试物 (4) 1、中药与天然药物 (3) 2、化学药物 (3) （二）试验设计的总体考虑 (5) 1、体外试验基本要求 (6) 2、体内试验基本要求 (9) （三）标准试验组合 (10) 1、标准组合试验应具备的特征 (11) 2、推荐的标准试验组合 (8) 3、标准试验组合的调整 (12) （四）与致癌试验相关的附加遗传毒性试验 (9) 四、结果分析与评价 (14) （一）体外试验结果的评价 (15) 1、体外试验阳性结果 (15) 2、体外试验阴性结果 (15)
（二）体内试验结果的评价 (16) 1、体内试验结果阴性时，确定靶组织暴露水平的原则 (16) 2、生殖细胞诱变剂的检测 (18) （三）综合分析与评价 (18) 五、遗传毒性研究进行的时间 (12) 六、参考文献 (19) 七、著者 (20) 八、相关注释 (21) 九、附录 (26)
一、概述 遗传毒性研究（Genotoxicity Study）是药物非临床安全性评价的重要内容，它与其他毒理学研究尤其是致癌性研究、生殖毒性研究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重要环节。拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。 遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的化合物的体外和体内试验，这些试验能检出DNA损伤及其损伤的固定。以基因突变、较大范围染色体损伤、重组和染色体数目改变形式出现的DNA损伤的固定，一般认为是可遗传效应的基础，且是恶性肿瘤发展过程的环节之一（这种遗传学改变仅在复杂的恶性肿瘤发展变化过程中起了部分作用）。在检测此类损伤的试验中呈阳性的化合物为潜在致癌剂和/或致突变剂，即可诱导癌和/或遗传性疾病。由于在人体中已建立了特殊化合物的暴露和致癌性之间的关系，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的关系，故遗传毒性试验主要用于致癌性预测。但是，因为已经确定生殖系统细胞突变与人类疾病有关，所以对可能引起可遗传效应的化合物与可能引起癌症的化合物应引起同样的关注；此外，这些试验的结果可能还有助于解释致癌性试验的结果。因此，在药物开发的过程中，遗传毒性试验的目的是通过一系列试验来预测受试物是否有遗传毒性，在降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。 本指导原则重点阐述遗传毒性试验体内外试验的基本原则，并介
?食品添加剂的食品毒理学评价与食品安全性 ?2010/1/3 16:55:37 ?食品添加剂对于改善食品色香味，对于食品原料乃至成品的保质保鲜，对于提高食品的营养价值，对于食品加工工艺的改善以及新产品的开发等诸多方面，都发挥着极为积极的作用。由于食品工业的快速发展，食品添加剂已经成为现代食品工业的重要组成部分，并且已经成为食品工业技术进步和科技创新的重要推动力。 对食品添加剂的毒理学的评价是正确认识和安全使用食品添加剂的基础。 一．食品添加剂的基本概念 FAO／WHO在1962年所提出的食品添加剂的国际定义为：“国际食品标准计划中的食品添加剂，是指其本身通常不作为食品消费，也不作为通常食品的典型成分使用的物质，所以，不论有无营养价值，在食品的制造、加工、调制、处理、装填、包装、运输或保管的过程中，出于技术目的(包括调味、着色、赋香等)而有意识地添加到食品中的物质。这些物质本身或其副产物直接或间接地成为食品的一部分，或给食品的性质以影响，或者可以充分造成预结果。它们不包括污染物质或者是为了维持或改善食品营养价值的物质”。 根据《中华人民共和国食品卫生法》（1995年）的规定：食品添加剂是指“为改善食品品质和色、香、味，以及为防腐和加工工艺的需要而加入食品中的化学合成或者天然物质”；同时规定，“为增强营养成分而加入食品中的天然或人工合成的属于天然营养素范围的食品添加剂”称为“营养强化剂”。因此，营养强化剂显然也属于食品添加剂范畴。 在食品加工和原料处理过程中，为使之能够顺利进行，还有可能应用某些辅助物质。这些物质本身与食品无关，如助滤、澄清、润滑、脱膜、脱色、脱皮、提取溶剂和发酵用营养剂等，它们一般应在食品成品中除去而不应成为最终食品的成分，或仅有残留。对于这类物质特称之为食品加工助剂。 二．食品添加剂分类 根据GB12493-1990《食品添加剂分类和代码》规定，按其主要功能作用的不同分为：酸度调节剂、抗结剂、消泡剂、抗氧化剂、漂白剂、膨松剂、胶姆糖基础剂、着色剂、护色剂、乳化剂、酶制剂、增味剂、面粉处理剂、被膜剂、水分保持剂、营养强化剂、防腐剂、稳定和凝固剂、甜味剂、增稠剂和其它共21类。 因食品用香料品种太多单独列出，见GB/T 14156-1993《食品用香料分类与编码》。 GB2760《食品添加剂使用卫生标准》,按照食品添加剂的功能分类分为酸度调节剂、抗结剂、消泡剂、抗氧化剂、漂白剂、膨松剂、胶姆糖基础剂、着色剂、护色剂、乳化剂、酶制剂、增味剂、面粉处理剂、被膜剂、水分保持剂、营养强化剂、防腐剂、稳定和凝固剂、甜味剂、增稠剂、其他、香料共22类，并以附录
剂量－效应关系：表示化学物质的剂量与个体中发生的量反应强度之间的关系。曲线基本类型是S形曲线。剂量-反应关系：表示化学物质的剂量与某一群体中质反应发生率之间的关系。替代法又称“3R”法：优化试验方法和技术，减少受试动物的数量和痛苦，取代整体动物实验的方法。 毒效应谱：①机体对外源化学物的负荷增加；②意义不明的生理和生化改变；③亚临床改变；④临床中毒；⑤甚至死亡。毒作用的类型：①速发性或迟发性作用； ②局部或全身作用；③可逆或不可逆作用；④超敏反应⑤特异质反应。 急性毒作用带：为半数致死剂量与急性阈剂量的比值，表示为：Zac=LD50/Limac。Zac值小，说明化学物质从产生轻微损害到导致急性死亡的剂量范围窄，引起死亡的危险性大；反之，则说明引起死亡的危险性小。 慢性毒作用带：为急性阈剂量与慢性阈剂量的比值，表示为：Zch= Limac /Limch。Zch值大，说明Limac 与Limch之间的剂量范围大，由极轻微的毒效应到较为明显的中毒表现之间发生发展的过程较为隐匿，易被忽视，故发生慢性中毒的危险性大；反之，则说明发生慢性中毒的危险性小。 选择性毒性：水平：可发生在物种之间、个体内（易感器官为靶器官）和群体内（易感人群为高危人群三个水平。原因：①物种和细胞学差异；②不同生物或组织器官对化学物质生物转化过程的差异；③不同组织器官对化学物质亲和力的差异；④不同组织器官对化学物质所致损害的修复能力的差异。 毒性和毒效应的区别：毒性是化学物固有的生物学性质，我们不能改变化学物的毒性。毒效应是化学物毒性在某些条件下引起机体健康有害作用的表现，改变条件就可能影响毒效应。 ADME过程：吸收：是外源化学物从机体的接触部位透过生物膜屏障进入血液的过程。分布：是指外源化学物吸收后随血液或淋巴液分散到全身组织器官的过程。代谢。排泄：外源性化学物及代谢产物由机体向外转运的过程，是机体中物质代谢过程中最后一个重要环节。 毒理学研究方法的优缺点：①流行病学研究：优：真实的暴露条件；在各化学物之间发生相互作用；测定在人群的作用；表示全部的人敏感性。缺：耗资、耗时多；无健康保护；难以确定暴露，有混杂暴露问题；可检测的危险性增加必需达到2倍以上；测定指标较粗。②受控的临床研究：优：规定的限定暴露条件；在人群中测定反应；对某组人群(如哮喘)的研究是有力的；能测定效应的强度。缺：耗资多；较低浓度和较短时间的暴露；限于较少量的人群(一般＜50)；限于暂时、微小、可逆的效应；一般不适于研究最敏感的人群。③体内试验：优：易于控制暴露条件；能测定多种效应；能评价宿主持征的作用；能评价机制。缺：动物暴露与人暴露相关的不确定性；受控的饲养条件与人的实际情况不一致；暴露的浓度和时间的模式显著地不同于人群的暴露。④体外试验：优：影响因素少，易于控制；可进行某些深入的研究；人力物力花费较少。缺：不能全面反映毒作用，不能作为毒性评价和危险性评价的最后依据；难以观察慢性毒作用。 药物引起呼吸系统毒性的机制并举例：吗啡：引起呼吸中枢抑制；箭毒生物碱：引起呼吸肌麻痹；呋喃妥因：介导的氧化损伤；多柔比星：细胞毒药物对肺泡的直接损害；胺碘酮：细胞内磷脂的沉积；紫杉醇：介导P物质的释放；环磷酰胺：致癌变作用。 常用的致突变试验：细菌回复突变试验（Ames试验）、微核试验、染色体畸变分析、姐妹染色单体交换试验SCE、果蝇伴性隐性致死试验、显性致死试验、程序外DNA合成试验、单细胞凝胶电泳试验。
细胞毒性实验设计方案 1.准备材料：DMEM(高糖) 胰酶双抗(青霉素/链霉素）DAPI MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4%多聚甲醛指甲油 6孔培养板 96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL) 一包0.45μm滤膜 灭菌： 50mL，10mL，5mL离心管两种枪头 2.实验方案 本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅 （SiO 2 -SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时 夹心二氧化硅中药物得以释放。本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化 硅（SiO 2-SS-HA/DOX）的细胞毒性。实验组为SiO 2 -SS-HA/DOX、SiO 2 -SS-HA、DOX， 空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维 细胞为正常细胞模型。 采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO 2 -SS-HA/DOX、 SiO 2 -SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞。培养基中含有10% (v/v) FBS和1% (w/v) 双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的SiO 2-SS-HA/DOX、SiO 2 、HA、DOX药物载 体培养基溶液。 (1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型: 培养基的配置：双抗 1% 血清12% DMEM 87% 具体操作步骤： 细胞的复活： ①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37℃温水中，使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，加5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。（每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。） ③将培养瓶放入培养箱中培养。 细胞的传代： 将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL，冻存于-20℃，每次使用一管，避免反复冻融。 ①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%的酒精放入超净台。 ②将培养液倒入废液缸，残留培养基用吸管吸干净，操作完成后，培养瓶口
毒理学实验设计 ——镉对肾脏的急性损害作用 设计者：余擎3100304094 李敏3100304091 一、实验背景及依据： 镉是环境中广泛存在的有毒重金属元素之一，镉污染及危害已经是一个全球性的环境医学问题。 在日本，人中毒事件主要是由于镉引起的，如一种“itai-itai”病的中毒，即是由镉中毒引起的。研究发现在镉污染地区的人们的骨头、肝、肾中都富集有大量的镉，尤其是肾在长期的职业性接触中会受到严重的损害。 肾脏是急性镉暴露的重要靶器官，会引起在临床上表现为管状功能紊乱的氨基酸尿、蛋白尿和糖尿病，以及肾肿胀、肾小管有管型和上皮细胞脱落、肾小球毛细血管从坏死。 目前，对镉致急性肾损害的机制上不明确，但根据有关资料报道：镉可损害肾小管而干扰肾对蛋白质的排出和再吸收等作用，并影响近端肾小管功能，出现糖尿病，使尿钙和尿酸增加。 二、实验目的和意义： 目的：了解镉的急性损害作用，镉对肾脏毒性的蓄积作用 意义：通过了解镉的急性作用，掌握镉的危害，同时积极预防镉的污染。掌握随机分组方法，以及实验数据的统计。 三、实验内容与方法： 1、实验动物：健康昆明小白鼠30只，雌雄各半，体重18~25g,，由实验中心提供。 2、主要试剂：氯化镉（CdCl2) 3、分组与染毒：30只小鼠按体重随机分组为5组，每组6只，CdCl2染毒剂量分别为0mg/kg、1.5mg/kg、3.5mg/kg、5.5mg/kg、7.5mg/kg，对照组注射生理盐水。灌胃1次。第2天处死动物。 （注：查相关资料得：实验动物为小白鼠，CdCl2经口染毒的LD50为150mg/kg,参照LD50值得的1/20~1/100设置四组剂量组，剂量间距为2。） 四、样本采集与处理： 1.使用代谢笼收集小鼠尿液 2.小鼠处死后，立即取肾脏，准确称取1份0.2g肾组织,置于消化液中消化，用于测定肾脏消化液中的镉浓度。 3.另取一份肾组织，制作肾脏病理切片。用于观察肾组织有无变化。 五、观察指标：
87 BIOLOGICAL REACTIVITY TESTS, IN VITRO The following tests are designed to determine the biological reactivity of mammalia n cell cultures followi ng con tact with the elastomeric plastics and other polymeric materials with direct or in direct patie nt con tact or of specific extracts prepared from the materials under test. It is essential that the tests be performed on the specified surface area. When the surface area of the specime n cannot be determ in ed, use 0.1 g of elastomer or 0.2 g of plastic or other material for every mL of extraction fluid. Exercise care in the preparation of the materials to preve nt con tam in ati on with microorga nisms and other foreign matter. Three tests are described (i.e., the Agar Diffusi on Test , the Direct Con tact Test and the Elution Test ).1 The decision as to which type of test or the number of tests to be performed to assess the potential biological response of a specific sample or extract depends upon the material, the final product, and its inten ded use. Other factors that may also affect the suitability of sample for a specific use are the polymeric composition; processing and cleaning procedures; con tact ing media; in ks; adhesives; absorptio n, adsorptio n, and permeability of preservatives; and con diti ons of storage. Evaluatio n of such factors should be made by appropriate additi onal specific tests before determining that a product made from a specific material is suitable for its in ten ded use. Materials that fail the in vitro tests are can didates for the in vivo tests described in Biological Reactivity Tests, In Vivo 88 . USP R EFERENCE S TANDARDS 11 —USP High-Density Polyethylene RS. USP Positive Bioreaction RS. Cell Culture Preparation —Prepare multiple cultures of L-929 (ATCC cell line CCL 1, NCTC clone 929; alternative cell lines obtained from a standard repository may be used with suitable validation) mammalian fibroblast cells in serum-suppleme nted minimum esse ntial medium hav ing a seedi ng den sity of about 10 5 cells per mL. Incubate the cultures at 37 1 一in a h±midified
兽药临床前毒理学评价试验指导原则 一、概述 (一)定义与目的 为保障新兽药对使用对象动物（靶动物）的安全，特别是人的食品消费安全，必须对临床前兽药的毒理学（或安全性）进行评价。目前，对兽药的安全性进行评价一般采取毒理学评价方法，包括三性（急性、亚慢性、慢性毒性）试验和三致（致突变、致畸、致癌）试验，以预测新兽药的安全性。临床前药物毒理学评价的目的是预测临床用药的安全性，为临床试验提供可靠的参考。毒理学评价结果不但为最后确定该化合物是否可以作为新兽药使用提供科学依据，还是制订动物性食品中最高残留限量（MRL）的重要依据。 （二）适用范围 本指导原则适用于评价兽用化学药品（化学合成药、抗生素、药物饲料添加剂）及消毒剂临床前的安全性。 1.兽用原料药需明确下列信息：①供试药品名称，包括通用名、化学名；②供试药品（必要时包括杂质）的化学结构、纯度、性状及物理、化学性质；③供试药品的质量标准及其说明；④供试药品的质量检验报告及稳定性报告；⑤供试药品的适用范围、使用方法和最低、最高推荐量；⑥供试药品的贮存条件、注意事项及保质期。 2.兽药制剂需明确下列信息：除提供第1条所要求的资料外，还需提供制剂配方和生产工艺。 3.供试药品样品数量要求：需提供每个供试药品同一批号的3份样品及其检验报告；每份样品应为检验需要量的5～10倍。必要时，还需提供适当的对照品。 评价兽药安全性的毒理学试验必须在农业部认定、并具有GLP试验条件的机构进行。 二、毒理学评价程序及内容
兽药毒理学评价试验一般分为五个阶段，具体研究内容如下： （一）第一阶段：急性毒理学试验阶段 的测定：所有用途的原料药必做； 1.经口LD 50 的测定：注射用原料药必做，肌注、皮下注射或腹腔注射 2.注射途径LD 50 途径任选一种； 的测定：供皮肤给药的原料药必做； 3.经皮LD 50 4.皮肤刺激试验：供注射和透皮吸收的制剂必做； 5.肌肉刺激试验：供肌内注射的制剂必做； 6.眼结膜刺激试验：眼科用、喷雾和易挥发的制剂必做； 7.粘膜刺激试验：子宫注入剂、喷雾和易挥发的制剂必做； 8.溶血性试验：静脉注射用制剂必做。 （二）第二阶段：亚慢性毒性试验阶段 研究内容有：30～90天亚慢性毒性试验：所有原料药必做； （三）第三阶段：致突变试验阶段 原料药必做此阶段试验，各种制剂可不做此阶段试验。 1.Ames试验，必做； 2.小鼠骨髓细胞微核试验，必做； 3.小鼠精子畸形试验或睾丸精原细胞染色体畸变分析试验任选一项，必做； 4.小鼠骨髓细胞染色体畸变分析试验，必要时选做； 5.显性致死试验，必要时选做； 以上致突变试验的组合必须考虑原核细胞和真核细胞、生殖细胞与体细胞、体内和体外试验相结合的原则，任何原料药不能低于三项，必要时做四至五项；如果在1～3项试验有阳性结果或可疑时，可选做第4、5项试验。 （四）第四阶段：生殖毒性试验阶段 原料药必做此阶段试验，各种制剂可不做此阶段试验。 1.传统致畸胎试验：所有原料药必做； 2.繁殖毒性试验：选做；如果做此项试验，可不做第1项试验。
毒理学实验方法与技术 作者：王心如主编 出版社：人民卫生出版社 ?出版时间：2006-2-1 ?字数：302000 ?版次：1 ?页数：203 ?印刷时间：2006-2-1 ?开本： ?印次： ?纸张：胶版纸 ?I S B N ：9787117056618 ?包装：平装 所属分类：图书>> 医学>> 医药卫生教材 第一章毒理学实验基础 第一节毒理学实验的原则和局限性 在描述毒理学的试验中，有三个基本的原则： 1.化学物在实验动物产生的作用，可以外推于人。基本假设为：①人是最敏感的动物物种；②人和实验动物的生物学过程包括化学物的代谢，与体重(或体表面积)相关。这两个假设也是全部实验生物学和医学的前提。以单位体表面积计算在人产生毒作用的剂量和实验动物通常相近似。而以体重计算则人通常比实验动物敏感，差别可能达10倍。因此可以利用安全系数来计算人的相对安全剂量。已知人致癌物都对某种实验动物具有致癌性。实验动物致癌物是否都对人有致癌性，还不清楚，但此已作为动物致癌试验的基础。一般认为，如果某一化学物对几个物种实验动物的毒性是相伺的，则人的反应也可能是相似的。 2.实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对人潜在危害的必需和可靠的方法。此原则是根据质反应的概念，随剂量或暴露增加，群体中效应发生率增加。毒理学试验中，一般要设3个或3个以上剂量组，以观察剂量-反应(效应)关系，
确定受试化学物引起的毒效应及其毒性参数。毒性试验的设计并不是为了证明化学品的安全性，而是为了了解化学品可能产生的毒作用。仅仅检测受试化学物在人的暴露剂量是否引起毒效应是不够的，尽管此剂量已超过人可能的暴露剂量。当引起毒效应的最低剂量(LOAEL)与人的暴露剂量接近时，说明该化学物不安全。当该剂量与人的暴露剂量有很大的距离(几十倍，几百倍或以上)，才认为具有一定安全性，此距离越大，安全性越可靠。如果在研究中所用的一系列的剂量不能引起毒性效应，则认为所用剂量还不足够高，应增加剂量，以确定受试化学晶的毒性。但如果在试验的最高剂量组的剂量与人可能的暴露剂量有足够的安全界限，则对于安全性评价来说未观察到毒效应的研究是可以接受的。在毒理学试验中实验模型所需的动物总是远少于处于危险中的人群。为了在少量动物得到有统计学意义的可靠的结果，需要应用相对较高的剂量，以使效应发生的频率足以被检测到。例如，低达0.01％的癌症发生率，这意味着在100万人群中有100人发生癌症，此发生率太高，不能为公众接受。在实验动物直接检测如此低发生率将至少需要30000只动物。因此，在毒理学试验中，对相对较少的实验动物必须以较高剂量进行试验，然后根据毒理学原则外推估计低剂量的危险性。 3.成年的健康(雄性和雌性未孕)实验动物和人可能的暴露途径是基本的选择。成年的健康(雄性和雌性未孕)实验动物是为了使实验结果具有代表性和可重复性。以成年的健康(雄性和雌性未孕)实验动物作为一般人群的代表性实验模型，而将幼年和老年动物、妊娠的雌性动物、疾病状态作为特殊情况另作研究。这样可降低实验对象的多样性，减少实验误差。毒理学实验结果的敏感性取决于受试物处理引起毒效应强度和实验误差两个因素，处理引起的毒效应强，实验误差小，则实验结果的敏感性增加，反映受试物处理的真实效应，反之亦然。实验设计是要规定实验条件，严格控制可能影响毒效应的各种因素，保证实施质量，降低实验误差。只有这样，才能保证试验结果的准确性和可重现性。外源化学物从不同途径染毒实验动物所表现的毒性可有很大差异，这是由于染毒部位解剖生理特点不同，外源化学物吸收进入血液的速度和量也不同，首先到达的器官和组织也不同。因此，毒理学试验中染毒途径的选择，应尽可能模拟人接触该受试物的方式。历史上，环境污染物及某些药物所引起的中毒和死亡多次发生，引起各国的重视，推动了毒理学的发展，各国政府主管部门制订和多次修订了有关药品
细胞毒性实验设计方案 1. 准备材料：DMEM高糖)胰酶双抗(青霉素/链霉素)DAPI MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4% 多聚甲醛指甲油6 孔培养板 96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL) 一包0.45 pm滤膜 灭菌：50mL , 10mL 5mL离心管两种枪头 2. 实验方案 本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅 (SiO^SS-HA/DOX ,在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时夹心二氧化硅中药物得以释放。本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅(SiO2-SS-HA/DOX 的细胞毒性。实验组为SiO2-SS-HA/DOX SQ2-SS-HA、DOX 空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维细胞为正常细胞模型。 采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO2-SS-HA/DOX SQ2-SS-HA、DOX空白对照组为纯细胞。培养基中含有10%(v/v) FBS和1%(w/v) 双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的SQ2-SS-HA/DOX SiO2、HA DOX药物载体培养基溶液。 (1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型： 培养基的配置：双抗1% 血清12% DMEM 87% 具体操作步骤： 细胞的复活： ①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37°C温水中，使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，力卩5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。(每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。) ③将培养瓶放入培养箱中培养。 细胞的传代： 将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL冻存于-20 C，每次使用一管，避免反复冻融。 ①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%勺酒精放入超净台。
细胞毒性实验方案 Prepared on 22 November 2020
细胞毒性实验设计方案 1.准备材料：DMEM(高糖)胰酶双抗(青霉素/链霉素） DAPIMTT(5mg/mL)DMSOPBS4%多聚甲醛指甲油6孔培养板96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL)一包μm滤膜 灭菌：50mL，10mL，5mL离心管两种枪头 2.实验方案 本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅（SiO2-SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时夹心二氧化硅中药物得以释放。本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅（SiO2-SS-HA/DOX）的细胞毒性。实验组为SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维细胞为正常细胞模型。 采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞。培养基中含有10%(v/v)FBS和1%(w/v)双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的SiO2-SS-HA/DOX、SiO2、HA、DOX药物载体培养基溶液。 (1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型: 培养基的配置：双抗1%血清12%DMEM87% 具体操作步骤： 细胞的复活： ①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37℃温水中，使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，加5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。（每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。） ③将培养瓶放入培养箱中培养。 细胞的传代：
《毒理学实验》课程大纲 课程代码： 课程学分：2 课程总学时：28 适用专业：生物科学专业 一、课程概述 1．课程性质 毒理学是利用医学实验动物学、分子生物学、遗传学、免疫学、细胞学以及病理学等相关学科的技术，从预防医学的角度，研究人类生产和生活活动中可能接触的外源化学物对机体的生物学作用，特别是损害作用及其机理，为制定防治措施和制定使用标准提供科学依据，并做出安全性评价、为科学管理提供指导的一门应用科学。 2．课程背景 在环境污染和环境安全问题日趋严重的今天，毒理学已经也应该作为一门人类的生存常识课程开设了。外源化学物几乎在时时刻刻、方方面面威胁、损害着我们的身体。尽早尽快地了解毒理学知识，是认识、预防、治疗外源化学物损伤的前提，是做好管理和正确使用的基础，是保证环境安全和食品安全的必要条件。 3．课程价值 通过本课程的学习，可使学生了解身边的有害物质及其对人体的危害方式，掌握毒理学的基础理论、基本知识和基本技能，初步熟悉毒理学的原理，概念和应用，并对毒理学的国内外新成就和发展有所了解，为学生预防身边有害物质的侵害提供方法，为政府制定防治措施和制定使用标准提供科学依据，为进一步学习有关学科打下毒理学的基础。 二、设计理念与开发思路
1．设计理念 毒理学是研究人类生产和生活活动中可能接触的外源化学物对人体的损害作用及其机理的科学。本课程是为保护人类健康而设计，它可以为预防和治疗现代频发高发的人类疾病提供基本的思路和方法。2．开发思路 面向全体学生,注重素质教育；整体设计目标,体现灵活开放；突出学生主体,尊重个体差异；倡导目标驱动,强调体验实践；注重过程评价,促进学生发展；开发课程资源,拓展学用渠道。 三、课程目标 （一）课程的总体目标 为获得保护自己、他人乃至全人类的健康的知识和技能的需要和进一步增强和增加保护环境的意识和行动而使学生较全面地理解和掌握毒理学基本概念、基本原理和基本技能。在学习过程中注重培养学生热爱生命、保护环境的道德理念，使学生能够认清潜伏在我们身边环境中、甚至日常生活和每天饮食中能经常伤害到我们身体的有毒有害物质，培养学生增强自我保护同时也珍爱他人，免受身边有毒有害物质伤害的能力，并注意引导和培养学生学会使用自学大纲、教科书和教学参考书，不断提高学生的动手能力、自学能力、语言表达能力和创新意识。 (二)具体目标 1、知识目标 （1）培养学生掌握毒理学及实验的基础知识。 （2）使学生能够认识和掌握潜伏在我们身边环境中、甚至日常生活和每天饮食中能经常伤害到我们身体的有毒有害物质。 （3）培养学生能运用所学知识对世界范围内特别是我国癌症、心脑血管疾病高发频发予以合理的解释并能给出一些预防方法的建议。 （4）培养学生能了解本课程的实际应用和发展动态。
MTT法测细胞毒性 试剂 MTT溶液四甲基偶氮唑盐（MTT）溶于PH7.2的磷酸盐缓冲液中，浓度为5mg/ml，除菌后2ml分装，于4℃避光保存。 含10%SDS的0.01M HCl SDS 10g 浓HCl（36%）86.2 ul 定容至100ml，过滤除菌 方法 1.将SP2/0细胞计数，调节细胞数至105/ml，制备10ml细胞悬液，加入96孔 板，100ul/孔，即细胞数104/孔。空白孔不加细胞悬液。 ,37℃条件下培养24小时。 2.5%CO 2 3.每孔加入用含5%血清的DMEM 10倍系列稀释的毒素100ul。阴性对照孔不 加毒素。 ,37℃条件下培养72小时。 4.5%CO 2 5.吸除药液120 ul, 每孔加入新鲜配制的MTT溶液20ul,即终浓度为1mg/ml， 37℃条件下培养4小时。 6.吸去上清50 ul，每孔加入150 ul含10%SDS的0.01M HCl溶液，震荡30 分钟。 7.酶标仪上测定A570。 8.计算细胞死亡率： 细胞死亡率（%）=（1-实验组A570/对照组A570）×100% 注意 1．细胞数范围：（0.5~2）×104。 2．MTT终浓度为0.5~2.5mg/ml，但一般浓度在0.5~1mg/ml就可以获得满意的结果。 3．加入MTT后，37℃条件下培养4~6小时。 4．设置空白与对照 空白孔：——+——+MTT+有机溶剂 对照孔：细胞+——+MTT+有机溶剂 5．DMSO易结冰（其溶点为18~20℃），室温偏低的条件下影响甲肷的溶解，使检测的光吸收值降低，且有机溶剂溶解的时间不能过长，如10分钟就可以获得结果。用SDS作溶剂可使所测光吸收值数日不变。
保健食品安全性毒理学评价试验的四个阶段和 内容 集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-
保健食品安全性毒理学评价试验的四个阶段和内容发布日期：2013-04-03 浏览次数:1605 字号：[] 毒理试验的四个阶段和内容 1第一阶段：急性毒性试验 经口急性毒性：LD50，联合急性毒性，一次最大耐受量试 验。 2第二阶段：遗传毒性试验，30天喂养试验，传统致畸试验 2.1基因突变试验：鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验 （Ames试验）为首选，其次考虑选用V79/HGPRT基因突变试验， 必要时可另选其它试验。 2.2骨髓细胞微核试验或哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试 验。 2.3TK基因突变试验。 2.4小鼠精子畸形分析或睾丸染色体畸变分析。 2.5其它备选遗传毒性试验：显性致死试验、果蝇伴性隐性 致死试验，非程序性DNA合成试验。 2.630天喂养试验。 2.7传统致畸试验。 3第三阶段：亚慢性毒性试验----90天喂养试验、繁殖试 验、代谢试验 4第四阶段：慢性毒性试验（包括致癌试验） 1、药物的毒性试验分为两类，其一特殊毒性试验，包含致癌、致残、致突变，号称三致试验；作此试验的单位必须是国家指定并认可的；一般单位即使做了也不被国家认可！通常一类创新药必须做的。无论一个药
物的药效如何好，只要含有三致试验的特殊毒性（动物若干代繁殖后，查看），该药物将不会允许上市的。 2、其二，一般毒性试验，通常用老鼠或兔子去做，主要是测定半数致死量；若某个药物的半数致死量是有效使用剂量的2倍以上，通常认为是临床使用安全的，若半数致死量比有效剂量略大一点，那就谁也不敢使用了，万一略微超一点量就会导致患者死亡！
名词解释 绪论 1、毒理学（toxicology）：毒理学的传统定义是研究外源化学物对生物体损害作用的学科。 2、现代毒理学：它已发展为所有外源因素对生物系统的损害作用，生物学机制，安全性评 价与危险性分析的学科。 2 3、替代法（alternatives）：又称“3R”法，即优化试验方法和技术，减少受试动物数量痛苦，取代整体动物实验的方法。 一．毒理学基本概念 1、易感生物学标志（biomarker of susceptibility）：是关于个体对外源化学物的生物易 感性的指标，即反应机体先天具有或后天获得的对暴露外源物质产生反应能力的指标。 2、外源化学物（xenobiotic）：是在人类生活的外界环境中存在可能与机体接触并进入机 体在体内呈现一定生物学作用的化学物质，又称为“外源生物活性物质”。 3、生物学标志（biomarker）：是指外源化学物通过生物学屏障进入组织或体液后，对该 外源化合物或其生物学后果的测定指标，可分为暴露标志、效应标志、易感性标志。 4、暴露生物学标志（biomarker of exposure）：是测定组织、体液或排泄物中吸收的外 源化学物、其代谢物或与内源性物质的反应产物，作为吸收剂量或靶剂量的指标，提供关于暴露于外源化学物的信息。 5、效应生物学标志（biomarker of effect）：机体中可测出的生化、生理、行为或其他改 变的指标，包括反映早期的生物效应、结构和（或）功能改变、及疾病的三类标志物，提示与不同靶剂量的外源化学物或其代谢物有关联的对健康有害效应的信息。 6、阈值（threshold）：为一种物质使机体开始发生效应的剂量或浓度，即低于阈值时效 应不发生，而达到阈值时效应将发生。 7、致死剂量或浓度：指在急性毒性试验中外源化学物引起受实验动物死亡的剂量或浓度， 通常按照引起动物不同死亡率所需剂量来表示。 8、生物有效剂量（biologically effictive dose）/ 靶剂量（target dose）：是指送达剂量中
1、药物毒理学研究思路的转变 1. 1 发现毒理学在药物毒理研究中的发展 最初, 药物毒理学家在药物开发中的作用仅局限于中后期参与药物的临床前毒性评价, 不能积极主动地指导和协调新药开发的前期工作, 导致许多有很好开发前景的药物由于毒性或其他安全性因素而中途夭折; 即使经过结构改造后最终进入医药市场, 也不可避免地造成人力资源的巨大浪费, 人为地拉长了新药研发周期。因此, 为了提高新药早期毒性的科学预测性, 西方各大制药公司将过去的临床前和临床安全性评价的药物毒理学早期研究模式转变为在新药发现阶段即对新化学实体进行毒理学与药理学、药效学、药动学相结合的筛选和优化的发现毒理学研究模式,通过综合分析药效学、药动学及毒理学的各项指标, 评价系列NCEs的研发前景, 从中筛选出毒性小的候选新药进行后续研究。其研究的思路是将药物毒理学研究贯穿于新药发现、临床前安全性评价、临床试验和上市后监督与跟踪的整个过程中, 这就是发现毒理学研究的产生背景。 1. 2 全程式新药安全性研究评价新模式 伴随发现毒理学在新药毒理学研究中的发展,新药毒理学研究的模式也逐步从传统的临床前评价、临床评价的两阶段模式, 向早期发现毒理学(包括体外短期毒性筛选﹑组学技术﹑生物信息学技术)、临床前评价、临床评价、上市后监督再评价的四阶段全程评价模式转变, 形成了全程式新药安全性研究评价的新模式。 2 新技术、新方法 2. 1 转基因动物技术 药物毒性作用机制尤其是慢性毒性药物作用机制异常复杂, 找出药物毒性作用的靶点尤为困难。基因敲除技术为阐明某些基因或生物大分子在药物毒性发生中的作用提供了新途径。如通过敲除胚胎干细胞中某些与胚胎正常发育、男性不育或者正常免疫功能(如生长因子、干扰素)有关的基因, 目前已成功地阐明了类视黄醇致畸、表氯醇致男性不育及5-氟-2-脱氧尿嘧啶核苷酸致骨髓抑制的机制。与传统的规范性动物致癌实验相比, 用转基因动物进行致癌性筛选的优越性显而易见。应用现有的转基因动物进行致癌性筛选, 可以缩短时间和减少费用。目前已建立的检测模型或研究模型有:过量表达癌基因的转基因动物模型, 如TG, AC 小鼠, HK-fos转基因小鼠等。基因敲除动物致癌检测模型。转基因动物用于生殖毒性研究。所有这些都是在产品研究开发的早期或中期, 用转基因动物进行致癌性筛选的优越之处。 2. 2 发现毒理学技术 发现毒理学的研究性质决定了其研究手段必须具有快速灵活、消耗样品量少、成本低、实验周期短、可同时检测大量样品等特点。目前, 在发现毒理学研究中广泛采用的技术有: 早期毒性筛选系统、毒性作用机制研究、计算机虚拟筛选和毒理组学技术等。