动物细胞与组织培养---指从活的机体中取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术
组织培养--细胞培养、组织培养和器官培养。
细胞培养的现实意义
生物技术上：生产各种生物技术产品
科学研究上：在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等
临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某疾病的治疗等
细胞培养技术的优点
1.研究的对象是活细胞:在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。
2. 研究条件可以人为控制
3. 研究的样本可以达到比较的均一
4. 研究内容便于观察、检测和记录
5.研究的范围比较广泛
6.研究的费用相对较经济
细胞培养的缺点
现在人工模拟体内环境的技术已经很高, 但人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同。
当细胞被置于体外培养后, 生活在缺乏动态平衡的环境中, 时间久了，必然发生变化
体内外细胞的差异
1. 与体内主要不同
相对孤立、相对单一，
缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响
2. 主要表现
失去原有组织结构和细胞形态
分化减弱或不显
细胞趋向单一化
培养细胞的分化
1．不适应
2．脱分化或去分化
体外细胞培养物的生长类型
按生长方式: 2种类型
粘附型(贴壁型)细胞: 附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。大多数细胞
悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。
贴附生长型细胞在体内、外粘附方式存在差异
体内：粘附是全方位
外形具有复杂的立体特征。
体外：多数情况，细胞只有一个附着平面
外形一般与体内时明显不同
贴附生长型根据粘附生长时形态的不同，主要分为4类：
1.上皮细胞型：
仅形态上似体内，类似体内的上皮细胞
来源于外胚层、内胚层细胞
扁平，不规则多角形，中有圆形核
易相连成片
生长时呈膜状移动
很少脱离细胞群而单个活动
2.成纤维细胞型
凡在培养中形态与成纤维细胞类似的
由中胚层间充质组织起源的组织
胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等的突起，中间有卵圆形核
排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而单独行动。
游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起
3.游走细胞型
伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动。
形状不稳定。单核细胞、巨噬细胞及某些肿瘤细
4.多形型细胞
有一些组织和细胞，如神经组织的细胞等，难以确定他们规律和稳定的形态，都归入多形细胞型。
悬浮生长型--- 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持在悬浮状态下生长
特点：在悬浮条件下生长良好
细胞圆形，单个或小细胞团
优点
生存空间大，提供数量大
传代方便(不需消化)
易于收获
可获得稳定状态
缺点
观察不方便
很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)
正常动物细胞培养的典型特征
核型（染色体）正常，表明没有明显的基因改变。
细胞的传代次数大约在50代左右，有限的寿命反应了细胞的生长调节。
细胞无恶性，表现在将该细胞注入免疫抑制动物不能形成肿瘤。
贴壁依赖、接触抑制和密度抑制表明其增殖受到抑制，当细胞在介质表面生长至汇合单层时增殖就停止。
培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间，包括原代培养期、传代培养期及衰退期三个阶段
原代培养期---也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周
特点：
1，细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。
2，与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。
3，细胞独立生存性差。
4，初代培养的细胞多呈二倍体核型。
传代：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代
特点：
在整个生命期中此期的持续时间最长，整个培养过程的主要时期。
细胞增殖旺盛，细胞生长活跃，并能维持二倍体核型。
衰退期
特点：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。
体外培养细胞一代生存期--“一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间
1.潜伏期-----细胞对传代操作所致损伤的恢复期和对新的生长环境的适应期，一般为期
6~24h。也是原代培养开始时细胞必须经历的时期。
接种到培养器皿内以后，细胞开始经历黏附、贴壁和铺展等过程。
修复损伤，熟悉环境，恢复生长，但很少分裂。
接种的细胞密度越大，数量越多，细胞群体越容易适应体外环境，潜伏期就短。
2.指数增生期----是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段，培养物中的细胞数量呈指数增长。细胞群体均一，理想的实验用细胞。
3.停滞期----虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累，pH 降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则脱落死亡，故传代应越早越好
细胞分裂活动（即增殖活性）的衡量指标
有丝分裂指数---指培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比
细胞群体倍增时间：培养物中细胞数量翻倍的平均时间
体外培养细胞的遗传学特征
（一）核型变化
（二）永生化和恶变
（三）细胞性别
体外培养细胞的生存环境
（一）无污染环境
（二）温度
（三）气体环境和氢离子浓度
体外培养细胞生存所需基本物质
（一）糖
（二）氨基酸
（三）维生素
（四）促生长因子
（五）其它物质
细胞培养的常用液体
水
平衡盐溶液---由无机盐、葡萄糖组成，维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养。主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。
消化液---进行原代培养时常常需要将组织块消化解离形成细胞悬液，传代培养时也需要将贴壁细胞从瓶壁上消化下来。胰酶溶液和EDTA溶液，胶原酶溶液
消化酶抑制剂----血清，大豆胰蛋白酶抑制剂
pH调整液----NaHCO3溶液，HEPES溶液
抗生素液---青霉素，链霉素
谷氨酰胺补充液----（1）频繁打开盖子，增加了破坏无菌状态的可能性；
（2）过多的追加L-谷氨酰胺，增加了培养基中氨的毒性水平
培养基-----细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质。天然培养基，合成培养基
天然培养基---是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基
血清的主要作用
提供基本营养物质
提供激素和各种生长因子
提供结合蛋白
提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。
对培养中的细胞起到某些保护作用---抗蛋白酶
血清的缺点
对大多数细胞，在体内状态，血清不是它们接触的生理学液体，可能改变某种细胞在体内的
正常状态
血清含一些对细胞产生毒性的物质
动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致。
取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性。
血清的使用使得实验和生产的标准化困难，其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产中分离纯化工作很难完成。
大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵，是构成动物细胞培养对生产成本的主要部分之一
血清的使用
大部分血清在使用前必须灭活处理，即56℃30分钟。灭活的目的是灭活血清中的补体和支原体。
基本培养基包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物。
原代培养
1取材组织:
2 组织细胞的分离：机械法：离心、切割分离、机械分散法
消化法：胰酶、EDTA、胶原酶
3 培养方法：组织块培养法
单层细胞培养
悬浮细胞培养
注意事项
分离组织：
使用锋利的刀具，减少对组织的损伤。
在取材时除去脂肪和坏死组织。
离心转速要适度。
消化及接种：
选取合适的消化酶，消化的时间因组织而异，一般为30 min。
接种的密度应比传代培养大——选择营养丰富的培养基和血清
克隆培养法---指单细胞培养，使之无性繁殖获得克隆细胞株的方法
细胞株---从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株
贴壁细胞的冻存
酶解贴壁细胞，分离时尽可能温和，使对细胞的损伤减少到最小。
在完全生长培养基中，再次悬浮分离细胞，确定有活力细胞数。
以大约1000 rpm离心5分钟沉淀细胞。使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。以5×106到1×107细胞/ml密度，在冻存液中悬浮细胞。
分装进冻存管，将冻存管置于湿的冰上或放入4℃冰箱中１小时。
细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中过夜，然后转移到液氮中长期贮存
悬浮细胞的冻存
计数将要冻存的活细胞。细胞应该处于对数生长期。以大约1000 rpm离心5分钟沉淀细胞，使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。
以５×106到5×107细胞/ml密度，在包含有血清的冷冻培养基中再次悬浮细胞。
分装进冻存管，将冻存管置于湿冰上或放入4℃冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。
细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。
冻存细胞的复苏
冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并直接加入完全生长培养基中。若细胞对冻存剂（DMSO或甘油）敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中
细胞融合一般是指用人工的方法，即利用电流或各种融合剂，把两个邻接的细胞界膜溶解掉，使二个或二个以上的细胞合并成一个细胞
融合细胞的特征
(一)它具有接近双亲细胞的全套染色体组，含有四倍体或多倍体，但这种杂交细胞的染色体组是不稳定的，尤其是种间杂交细胞更不稳定
(二)融合细胞的表现形式多种多样，一方面固然是由于制备融合细胞时可以按照人们的意志组合使产生多样性，另一方面确实也是由于这种杂交细胞的遗传不稳定性引起的
(三)融合细胞中两个亲本具有遗传互补作用
诱导细胞融合的主要方法
病毒诱导融合
化学融合剂诱导融合---其中最常用的是聚乙二醇（PEG）
电融合---指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合
单克隆抗体---是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的与单一抗原决定簇结合的抗体。
抗原决定簇---抗原分子上可以诱导出抗体的部位或片段
多克隆抗体----一种抗原通常具有多个不同的抗原决定簇，因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定簇的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体
杂交瘤细胞---将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的
人抗鼠抗体（HAMA）反应----鼠来源的单抗在人体内是外源物质，很可能会产生人体免疫系统对它的排斥反应：产生抗鼠的抗体
为什么要对鼠源性单克隆抗体进行改造使之人源化，改造方法
原因：血清半衰期短，20h
抗原抗体结合力、亲和力不够
募集效应细胞产生副作用
HAMA反应：8－10天出现，20－30天高峰, 加速单抗清除。
过敏休克
人源性单克隆抗体的制备
细胞工程单克隆抗体技术
1 人-鼠杂交瘤单克隆抗体----人脾细胞＋鼠骨髓瘤细胞
2 人-人杂交瘤单克隆抗体----人脾细胞＋人骨髓瘤细胞
3 EB 病毒转化-融合技术------利用EB病毒转化B淋巴细胞为永生细胞
与鼠骨髓瘤细胞融合
4 转基因动物制备单克隆抗体------人抗体基因(除CDR)导入小鼠胚胎
转基因小鼠
抗原免疫
标准杂交瘤方法
5 重症联合免疫缺陷小鼠制备单克隆抗体SCID-----既无有功能的T细胞也无B细胞的小鼠,对异源移植物不产生任何排斥反应
基因工程抗体----根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体
单克隆抗体在医学上的应用
（一）用作诊断试剂
（二）用作研究工具
（三）用于疾病的治疗
抗体治疗的机制
阻断和中和作用
Fc的免疫效应机制
信号传导和细胞凋亡
免疫调节
靶向
抑制肿瘤的生长
单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题
单克隆抗体的特异性---由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应
异种抗体反应---鼠源性单抗用于人体，导致异源性超敏反应
胚胎工程----利用人工方法影响、改变动物胚胎品质和发育进程的一种生物技术。
原始生殖细胞PGCs :就是指能发育为精子或卵子的祖先细胞，是在生殖腺内定位以前的生殖细胞
精子发生----从精原干细胞SSCs 到形成高度分化和特异精子的极其复杂的细胞分化过程
精原干细胞的增殖分化、减数分裂、精子形成
卵泡: 卵巢皮质内由一个卵母细胞和其周围许多小型卵泡细胞所组成
原始卵泡、生长卵泡和成熟卵泡
排卵---卵细胞和它周围的卵丘颗粒细胞一起被排出的过程
精子获能---精子刚排出时是不能与卵受精的，需要在雌性生殖道中孵育一段时间，使覆盖在其表面的精浆蛋白被去除才能获得受精能力，这种现象称为精子获能，精子获能也可在体外进行
顶体反应----当获能的精子与卵子相遇时，覆盖于精子顶体表面的细胞膜与顶体外膜融合，并释放出多种酶系，这一过程称为顶体反应
受精过程三步曲
①精子穿过放射冠；
②精子穿过透明带；
③精、卵质膜融合，细胞核融合。
精卵融合----精子穿过卵透明带后，进入卵周间隙，头部细胞膜与卵膜融合，进而成为卵膜的一部分，整个精子也就进入卵中，这个过程
精子具备受精能力的三个要素
精子获能、顶体反应、与卵融合
皮质反应与透明带反应-----精卵融合时，诱导卵膜特性发生改变，可阻止第二个精子进入卵内，这一机制称为卵膜封闭。同时，激活后的卵胞浆排出的皮质颗粒可通过诱导透明带反应，也可以拒绝其他精子的通过。
植入(着床)-----胚泡埋入子宫内膜的过程称植入，又称着床。通常位于子宫体部和底部
胚胎工程的主要技术
1 人工授精
2 体外受精(试管婴儿)--第一代试管婴儿，主要解决女性因素
3 显微受精(单精注射--第二代试管婴儿，主要解决男性
4 种质资源的低温冷冻保存
5 性别控制
6 体细胞克隆
7 胚胎干细胞
8 转基因动物
辅助生殖技术(ART)---指运用医学技术和方法对精子或卵、受精卵、胚胎进行人工操作，以
达到受孕目的的技术。
家畜人工授精操作流程
采精
精液处理---检测，稀释，冷冻，其他处理
输精
体外受精IVF
适用人群：女方输卵管阻塞或炎症，男方精子异常
关键步骤
人工诱发超排卵
采集卵细胞
体外受精
体外培养
胚胎移植
发育阻滞----体外受精的早期胚胎在体外发育过程中，往往会停滞在某一阶段不再发育，此现象称之为发育阻滞。
克服阻滞现象方法
一是改进培养液成分，改善培养条件，尽量满足早期胚胎发育所需物质，确定并减除对其发育不利的成分。
二是利用体细胞共同培养体系，以提供发育所需的物质条件。
胚胎分割：将一枚胚胎用显微手术的方法分割成两分，四分，甚至八分胚，经体内或体外培养，然后移植于受体中，以得到同卵双生或同卵多生后代的技术
原理---卵裂球具有发育成为一个个体的全能性
单精注射(显微受精)ICSI---又称第二代试管婴儿,显微受精技术是体外受精与显微操作技术相结合的一项胚胎工程技术，使得由透明带和卵质膜所形成的生理受精障碍得以排除。
ICSI的特点
正常受精率高，多精受精率低
精子浓度、形态对受精无影响
着床前基因诊断(第三代)PGD技术的难点
胚胎细胞活检
单细胞诊断技术
干细胞---是具有自我更新和分化潜能的细胞。
干细胞的分类
按来源分类---胚胎干细胞(ES细胞) 成体干细胞
按分化潜能分类----全能干细胞多能干细胞专能干细胞
胚胎干细胞---当受精卵分裂发育成囊胚时，内细胞团的细胞就是胚胎干细胞
特点：具有很强的分化能力，可以无限增加,它能长成动物的任何组织和器官
成体干细胞---位于成体的组织和器官
特点：在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序进行分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。
胚胎干细胞的建系
分离＋培养
１分离方法：
(1)利用干细胞特征分离---流式细胞仪分离法
(2)免疫外科学方法----去除滋养层细胞
(3)酶解法----酶消化去除滋养层细胞后培养
(4)显微外科学方法----去除滋养层细胞后培养
２ES细胞的分化抑制培养
在ES细胞的培养过程中，一方面要给以足够的营养物质以满足其增殖的需要，另一方面要抑制其分化，其中前者由基础培养基来解决，后者则由分化抑制物来完成。
分化抑制物---饲养层条件培养基白血病抑制因子
饲养层细胞---是将选用的细胞经γ射线照射或经丝裂霉素C处理而阻断其有丝分裂所得到的细胞层
条件培养基：是将大鼠肝细胞等细胞培养一定时间后，回收细胞培养液，经一系列处理后制为贮存液，使用时以一定比例加到ES细胞培养基中.优点是使ES细胞直接利用培养细胞分泌到培养液中的生长因子，可消除饲养层细胞的干扰，免受丝裂霉素C致癌剂的影响，而且操作比较简单。
胚胎干细胞的建系过程
分离囊胚的内细胞群
与饲养层细胞共培养，ES细胞非分化增殖分离胚胎生殖脊细胞
------→胚胎干细胞的鉴定------→定向诱导分化-------→前体细胞-----→功能
细胞
胚胎干细胞的鉴定
（1）细胞形态特征、取材部位---典型的ES细胞体积较小，有一个大核，核内有一个或多个明显的核仁，胞质较少。细胞之间界限不清晰，紧密聚集呈鸟巢状克隆。
（2）细胞表面的特殊标志
（3）细胞内干细胞标志基因的表达---碱性磷酸酶染色，呈阳性
（4）端粒酶
（5）核型分析
（6）分化潜能
分化能力检测
①体外分化试验
②体内分化试验
③核移植检测
④嵌合体形成检测
干细胞诱导分化的常用方法
（1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质
（2）将ES细胞与特定的细胞共培养
（3）将某种分化诱导因子的基因转入ES细胞内
胚胎干细胞诱导分化的途径
①拟胚体的形成
②非拟胚体形成途径
目标：定向分化
拟胚体（EB）是胚胎干细胞在体外一定条件下自发形成的类似早期胚胎的球体结构，早期发育的简单拟胚体包含了外层的原始内胚层和内层的原始外胚层，这种结构与胚胎发育过程中的卵圆柱期结构十分相似
胚胎干细胞研究的意义（应用前景）
研究哺乳动物个体发生发育规律
研究细胞分化
研究基因功能
生产转基因动物
治疗性克隆
研究细胞癌变机理及新药物的筛选
胚胎干细胞研究面临的难题
增殖与分化的矛盾
潜在致癌机制
器官形成困难重重
伦理冲突
诱导多能干细胞---筛选出4 个与胚胎干细胞多能性更为密切相关的基因，并将它们导入到小鼠胚胎成纤维细胞和鼠尾成纤维细胞，成功地将其重编程为具有胚胎干细胞多能性的细胞
成体干细胞---成体干细胞是在成体组织内具有自我更新能力并能分化产生一种或一种以上子代组织细胞的未成熟细胞
成体干细胞的特点
数量少，难以识别、分离纯化
体外培养时不能长时间增殖
具有可塑性※（神经干细胞—造血干细胞）
在完全分化前经历一个中间类型即祖细胞阶段
成体干细胞种类
造血干细胞HSCs
间充质干细胞MSC
精原干细胞
神经干细胞
表皮干细胞
肠干细胞
肝干细胞
三个部位生产/存储造血干细胞
大部分在骨髓里，即骨髓造血干细胞。
在外周血液中，也就是在血管里面有少量的造血干细胞。
在脐带里有丰富的造血干细胞
造血干细胞的分离和鉴定
免疫吸附法（抗原和抗体特异性结合）
磁性标记CD34单克隆抗体
加入供体外周血
抗原和抗体特异性结合
通过分选系统
造血干细胞吸附到柱子上,其他细胞流在血液中
干细胞的共性--自我更新、多向分化和归巢的能力
间充质干细胞的特性
具有强大的增殖能力和多向分化潜能
具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能。
具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。
修复缺损器官的方法
自体移植
异体移植
组织代用品
组织工程---应用生命科学和工程学的原理和方法，研究、开发用于组织和器官修复、替换或增进其功能的生物替代品的一门学科。
组织工程的基本要素
细胞(－增殖、分化、自组装成组织和器官
生长因子－调节细胞的增殖和分化
胞外基质－支撑和指导细胞增殖、分化
核移植分类
供体细胞核的来源---胚胎细胞核移植体细胞核移植
核移植目的----生殖性克隆治疗性克隆（细胞治疗，组织替代，器官移植）
供受体种间关系---同种核移植异种核移植
克隆缺陷
效率低、成本高
后代异常：初生体重增加、死亡率高、发育不良
细胞质带来线粒体DNA
克隆动物端粒随供体动物年龄的增加而减少
人是特定生理、心理和社会的集合体，具有特定人格
核移植技术的应用
制备转基因克隆动物，进行药物生产
培育优良品种，扩大良种种群
异种克隆，拯救濒危动物
治疗性克隆
培育各种实验动物
基础理论研究
转基因动物-----是指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定地遗传给后代的动物。
基因工程技术胚胎工程技术
哺乳动物转基因技术的主要环节
1 目标基因克隆和体外重组
2 外源基因的导入
3 外源DNA整合、转录及表达的分子检测
4 转基因动物品系或品种的建立
外源基因的导入方法
显微注射法
逆转录病毒载体感染
精子载体介导法
胚胎干细胞介导法
细胞核移植技术
YAC介导的基因转移
显微注射法原理
供体母鼠注射孕马血清--- 48小时---注射人绒毛膜促性腺激素---超排卵---此鼠与雄鼠交配获取受精卵----将构建的外源基因在体外用显微注射器注射到受精卵的雄原核中----移植到假孕母鼠输卵管内
显微注射法的优点：
转移率较高、整合效率达30%；
外源基因长度可达数百Kb；
方法相对简单；
导入过程直观。
缺点：
设备昂贵、操作复杂；
随机整合、首尾相连的多拷贝；
转基因效率较低；
常造成插入位点附近宿主DNA大片段缺失、重组等突变，出现动物严重生理缺陷。
逆转录病毒载体感染法原理
当逆转录病毒的RNA 进入细胞后，逆转录成DNA，依靠逆转录病毒的整合酶及其末端特异的核苷酸序列，DNA前病毒可整合到染色体上，从而将其所携带的外源基因插入到染色体上。
优点：在各种转基因方法中，逆转录病毒感染法的转基因效率是最高的，且为单拷贝随机整合。
缺点：逆转录病毒载体在设计时虽然缺失了病毒的复制功能序列，但是复制大量载体DNA 所需的辅助病毒基因组有可能与目的基因一起整合到同一细胞核中，就可能大量复制病毒，造成严重的污染，故不安全
精子载体法
只有附睾精子和经洗涤去精清的精子才能有效地携带外源DNA，这说明精浆中某种因子强烈抑制外源DNA的结合。这些因子可能直接作用于DNA分子，也可能竞争结合在精子表面的结合部位而间接起作用。
促进DNA与动物精子结合的方法
1 共孵育法
2 电穿孔法
3 脂质体法
胚胎干细胞法
是在基因组相应位点进行同源重组或置换，而将外源DNA定向整合到内源基因组中表达。将转染的胚胎干细胞注射入受体囊胚腔，可参与嵌合体的形成，将来出生的动物的生殖系统就有可能整合上外源基因，通过杂交繁育得到纯合目的基因的个体
优势
（1）打破了物种的界限，突破了亲缘关系的限制，加快了动物群体遗传变异程度；
（2）可以进行定向变异和育种，利用同源重组技术对ES细胞进行遗传操作，通过细胞核移植生产遗传修饰性动物，有可能创造新的物种；
（3）利用ES细胞技术，可在细胞水平对胚胎进行早期选择，这样可以提高选择的准确性，缩短育种时间。
转基因动物的应用
（1）动物品种改良；
（2）生物制药(乳腺生物反应器)；
（3）建立人类疾病的动物模型；
（4）生产可移植用的动物器官；
（5）基因治疗(动物模型)；
（6）基因打靶
基因打靶技术(--是一种在胚胎干细胞(ES)技术和同源重组技术的基础之上,定向改变生物活
体遗传信息的实验手段
研究意义
基因功能研究
人类疾病动物模型的研制
经济动物遗传物质的改良
三个主要环节
打靶载体的构建
靶细胞转染与筛选
由中靶细胞制备转基因动物
根据打靶细胞的不同，基因打靶主要分为
1 胚胎干细胞介导的基因打靶技术
2 体细胞克隆介导的基因打靶技术
胚胎干细胞介导的基因打靶技术
获得ES细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES细胞。通过显微注射将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传
体细胞克隆介导的基因打靶技术
直接在体细胞中进行基因同源重组，体外筛选中靶细胞，再以之为核供体获得转基因后代，是当前家畜基因打靶的一条有效途径
体细胞体外培养的有限性和同源重组概率低
基因打靶的必备条件
胚胎干细胞
打靶载体
基因敲除的基本程序
打靶载体的构建
打靶载体导入ES细胞：重组置换
基因敲除ES细胞注射入胚泡
胚泡植入假孕小鼠的子宫中
嵌合体的杂交育种
正负双向选择系统
同源重组时，只有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外部分将被切除。
随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体内。
置换型载体含有正负选择基因各一，正选择基因多为neo基因，位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达。负选择基因在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端，常用HSV-tk基因，在同源重组时，tk基因将被切除而丢失，相反在随机整合时，所有的序列
均保留
乳腺生物反应器
利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物，指导外源基因在乳腺中的表达，并从转基因动物的乳汁中获取重组蛋白
表达载体的构建
目的基因的选择
体外重组
基因转导
胚胎移植
鉴定
优点
产出高,产品活性高
成本低、周期短
不耗能、无污染
存在问题：
位点整合问题
组织特异性表达
蛋白的翻译后修饰
分离和纯化
转基因技术
伦理道德
染色体工程---是按照人们的需要对生物的染色体进行操作, 添加、削弱或替代染色体，从而达到定向育种或创造人工新物种的目的
染色体倍性改造工程----指有目的、有计划地增加或减少一组或几组同源或异源染色体，以创造动植物新品种的一项染色体工程技术。多倍体育种和单倍体育种
动物的多倍体育种
染色体加倍技术(人工诱导)
化学诱导法：秋水仙素细胞松弛素B
物理学方法：温度休克法水静压法
生物学方法
多倍体的倍性鉴定
直接法：染色体计数DNA含量测定
间接法：体积测量蛋白质电泳生化分析
动物多倍体育种的意义
多数具有良好的生长率
低等动物的种间杂交优势非常明显
巨大性
育性低(四倍体可育)
动物的单倍体育种
人工单性生殖
雌核发育----指精子虽然能正常地钻入卵子中并激活卵子，但精子的细胞核并未参与卵球的发育，胚胎的发育仅在母体遗传物质的控制下进行
雄核发育----用经过紫外线、X线或γ线处理的卵子与正常的精子受精，再在适当时间施以冷、热或高压等物理处理，使进入卵子内的精子染色体加倍，而发育成完全为父本性状的二倍体。
人工诱导雌核发育的方法
（1）精子遗传物质的失活
（2）细胞分裂的阻止
雌核发育的鉴别
鉴别雌核发育的个体，通常以颜色、形状和生化等方面的指标为根据。目前，还采用细胞学和遗传标记的方法
动物染色体结构的改造
染色体片段的删除和重排
染色体的易位工程
人工染色体---人工构建的含有复制起始点、着丝粒和端粒三个关键系列的载体系统。
3个关键序列：
1.自主复制DNA序列
2.着丝粒DNA序列
3.端粒DNA序列
三种人工染色体
酵母人工染色体
细菌人工染色体
哺乳类人工染色体
人工染色体的应用
物理图谱和定位克隆
基因功能鉴定和转基因的研究
染色体结构和功能关系研究
基因治疗
细胞分化：细胞后代在形态结构和功能上发生差异的过程
细胞的脱分化：分化的细胞在一定条件下，可以转变为胚性细胞，重新获得分裂能力
愈伤组织：脱分化的细胞经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性、松散的细胞团
细胞的再分化：脱分化后的分生细胞在一定条件下，重新分化为各种类型的细胞，并进一步发育成完整植株
愈伤组织再分化形成再生植株的途径：
器官发生途径：愈伤组织诱导形成器官，再形成完整植株（先根后芽或先芽后根）
胚状体发生途径：由愈伤组织诱导形成类似种子的胚的结构，同时产生芽端和根端的结构，称胚状体。经过与合子胚相似的发育过程，形成完整植株
胚状体类型-----体细胞胚、生殖细胞胚
分化期细胞的特点
1.分化期细胞在生理、生化方面有剧烈的变化：酶的活性增强、营养物质累积、RNA和组蛋白的合成速度加快
2.分化期细胞的形态大小保持相对稳定，愈伤组织不再增殖，细胞由平周分裂转变为组织内部局部的分裂，形成“瘤状”或“片状”的分生组织结构
影响植物细胞脱分化和再分化的因素
内部因子：遗传性状、生理状况
外部因子：营养条件、环境条件
机械和生理隔离对植物细胞的脱分化和再分化非常重要
植物激素在植物细胞分化和再分化中的作用
激素在细胞分化中起着重要的有时是决定性的作用
生长素是植物脱分化培养基中不可缺少的成分
生长素作用机制：可以与组蛋白结合，活化相关基因的表达，启动细胞分裂
2，4-D作用：启动细胞脱分化，形成胚性细胞团，广泛应用于诱导各种愈伤组织的培养基细胞分裂素作用：能够维持并促进脱分化细胞分裂
生长素、分裂素是植物细胞再分化中不可缺少的激素
生长素能促进植物根的形成并抑制芽的形成
生长素/细胞分裂素的比例，影响愈伤组织的生长和器官的发生
植物组织培养：在含有营养物质及植物生长物质的培养基中，培养离体植物组织并诱导使其长成完整植株的技术。
高压蒸汽灭菌：适用于固体培养基
过滤除菌：适用于液体培养基
植物细胞的大规模培养系统
悬浮细胞培养
固定化培养系统
植物器官培养系统
植物细胞大规模培养的影响因素
外植体的选择
环境因子的影响
培养基选择
植物快速无性繁殖技术-----利用离体培养技术，将来自优良植物的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织、细胞进行离体培养，在短期内获得大量遗传性一致的植株。单株无性系
特点：遗传组成完全一致
优点：繁殖数量大、速度快；可以形成育苗的工厂化
离体无性繁殖的程序
无菌母株制备
不定芽增殖
完整植株的形成
再生植株的锻炼和驯化
再生植株的鉴定
丛芽：在每个芽眼处形成的多个芽体
不定芽增殖
侧芽（腋芽）途径
器官发生途径
胚状体途径
再生植株的驯化
首先进行日光锻炼
然后进行湿度锻炼
移栽时洗净培养基
移栽10天内要保持较高的空气湿度
再生植株的鉴定
植物形态学鉴定
细胞学鉴定
植物脱毒方法
微茎尖培养法：越靠近生长点，病毒浓度越低
株心组织培养法：绝大多数病毒是通过微管组织传播的，珠心组织与周围其他组织没有微管联系
热处理法：植物细胞比病毒耐高温
植物快速繁殖和试管苗工厂化生产中的注意事项
污染
植物材料的预处理（改变生理状态，有利生长、分化）
变异的控制
体外单倍体诱导：通常是指利用离体培养花药或小孢子的方法，诱导形成单倍体植株
单倍体育种：将具有单套染色体的单倍体植物，经人工染色体加倍，使其成为纯和二倍体，从中筛选出优良个体，直接繁育成新品种；或选出具有单一优良性状的个体，作为杂交育种
大规模细胞培养技术简介 大规模培养技术应用简介通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。上世纪60-70 年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织获取生物制品已远远不能满足这一需求。随着细胞培养的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培养技术趋于成熟。 所谓动物细胞大规模培养技术( large-scale culture technology )是指在人工条件下(设定ph、温度、溶氧等) ，在细胞培养工厂 (Cosmo Cat.No. 1101-400 or 1101-800 )或生物反应器( bioreactor )中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho(中华仓鼠卵巢) 细胞、BHK-21( 仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。 在过去几十年来，该技术经有了很大发展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube 等贴壁细胞培养，发展为一次性细胞培养工厂( Made by Cosmo )或生物反应器 (Bioreactor )进行大规模细胞培养。第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。 随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，特别是培养表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。因而必须为工业化生产开创一种新的技术方法。自70 年代以来，细胞培养用生物
动物细胞 编辑 动物细胞立体结构图组成动物体的细胞称为动物细胞，植物细胞和动物细胞大体上相同，都有细胞核、细胞质和细胞膜。但是也有不同的地方：这就是植物细胞在细胞膜外面，有一层厚而坚硬的细胞壁，而动物细胞是没有细胞壁的；植物细胞中有扁球状的叶绿体．而动物细胞里没有这种结构，植物细胞中有囊状的液泡，而动物细胞里的液泡却不明显。 目录 1简介 2结构特征 3培养 4培养液的成分 5培养液的特点 6培养 7基本过程 8动植物组织培养区别 9动物细胞培养的应用 10相关词条 1简介 动物细胞立体结构图组成动物体的细胞称为动物细胞，人体或动物体的各种细胞虽然形态不同，基本结构却是一样的，都有细胞膜、细胞质和细胞核。 2结构特征
中心粒 核糖体 滑面内质网 高尔基小泡 高尔基体 微绒毛 核仁 细胞核 核被 粗面内质网 溶酶体 线粒体 质膜 滑面内质网 动物细胞有细胞核、细胞质和细胞膜，没有细胞壁，液泡不明显，含有溶酶体,动物细胞的结构有细胞膜、细胞质、细胞器、细胞核；它们的主要作用是控制细胞的进出、进行物质转换、生命活动的主要场所、控制细胞的生命活动。细胞内部有细胞器：细胞核，双层膜，包含有由DNA和蛋白质构成的染色体。内质网分为粗面的与滑面的，粗面内质网表面附有核糖体，参与蛋白质的合成和加工；光面内质网，表面没有核糖体，参与脂类合成。
3培养 细胞培养是指细胞在体外条件下的生长，动物细胞在培养的过程中不再形成组织。 概念：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。 4培养液的成分 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。动物细胞培养成功的关键在于培养液中是否含有动物血清，因为由于动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，此外动物血清中也包含了一些动物的激素和酶，可以促进细胞的发育。 5培养液的特点 液体培养基、含动物血清。 6培养 .动物细胞培养液的成分：体外细胞培养所需营养物质与体内基本相同，例如，需要糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素等。将细胞所需的上述物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。由于动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，因此在使用合成培养基时，通常需加入血清、血浆等一些天然成分。 2.动物细胞培养液的特点：液体培养基、通常含动物血清。 3.动物细胞培养的条件： ①无菌、无毒的环境：对培养液和所有培养用具进行无菌处理，通常还要在培养液中加入一定量的的抗生素，以防被污染。此外应定期更换培养液，以便清除代谢产物防止细胞代谢产物累积对细胞自身产生危害。 ②营养物质：无机物（无机盐、微量元素等），有机物（糖、氨基酸、促生长因子等）。 ③血清和血浆(提供细胞生长必须的营养成份) 。 ④温度和pH（36.5±0.5℃，7.2~7.4）。 ⑤气体环境（95%的空气+5%CO 2的混合气体）。 其中5%CO2气体是为保持培养液的pH稳定。
动物细胞培养和核移植技术 备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课 教学目标 知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。 过程与方法 情感态度 与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激 发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯 物主义观念。 教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景 教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。 教学用具多媒体课件 课时安排1课时 教学内容设计与反思 板书设计:
教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。 （1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养 植物体细胞杂交 （2）植物体细胞杂交的结果是产生了？ （3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？ 二、讲授新课: （一）动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段 动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 （二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形 成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问 题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的 脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神 经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验 不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后， 在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物 细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关 的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的 培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程： 引导学生阅读课文44--46面相关内容。
仲恺农业技术学院学报,18(3):64~70,2005 Jou r na l o f Zhongkai University o f Agriculture an d Technology 文章编号:1006-0774(2005)03-0064-07 动物细胞大规模培养技术研究进展 吴方丽1,金伟波2,王保莉2,3,张涌3 (1.西北农林科技大学植物保护学院; 2.西北农林科技大学生命科学学院; 3.西北农林科技大学生物工程研究所,陕西杨凌712100) 摘要:利用动物细胞大规模培养技术可生产多种生物制品,为提高细胞活力和细胞生长密度,采用有多种添加成分的无血清培养基培养细胞,选择既有利于细胞生长又可提高培养细胞密度的微载体和条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器,在线监控细胞生存环境和生理活动,减少培养过程中培养基的抑制因素,从而给细胞提供更好的生存环境;另外通过向细胞中导入抗凋亡基因,可减缓细胞凋亡的发生,提高细胞活性和蛋白产量;此外,在动物细胞大规模培养过程中,利用多孔微载体能高效、大量地增殖细胞,具有良好的应用前景. 关键词:动物细胞;培养环境;生物反应器;微载体 中图分类号:Q251文献标识码:A Research advance in large-scale culture of animal cells W U Fang-li1,JIN We-i bo2,W ANG Bao-li2.3,ZHANG Yong3 (1.College of Plant Protection; 2.College of Life Sciences; 3.Institute of Bio-Eng i neering, Northwest A&F University,Yangling712100,China) Abstract:Many biological products were manufactured by means of large-scale culture of animal cells.To increase cell-specific productivity and cell density,serum-free media supplemented with several nutriments were used for cell culture,and microcarriers were chosen in favor of cell growth and high cell density.Biore-ac tors with simple manipulation,good qualification and aeration were adopted.More suitable conditions for cell gro wth could be given through on-line supervising the environment for cell gro wth and restraint factors in cell culturing.Furthermore,the anti-apoptosis genes using recombinant DNA technology can increase cell viability and productivity.Porous microcarriers was emphasized in large-scale culture of animal cells. Key words:animal cell;culture environment;bioreac tor;microcarrier 组织培养技术是19世纪末由胚胎学技术衍生而来.近一个世纪以来,从能维持组织存活到生长出新细胞,从少数组织到各种组织细胞的培养,从精细的实验室培养技术到大规模的生产工艺,组织培养技术已成为生物制品生产以及基因工程等领域必不可少的工具之一.目前,动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、细胞培养环境的优化、生物反应器的改良、改变细胞特性、提高产品的产出率与保证其质量上. 在动物细胞大规模培养的过程中,最根本的是使细胞的培养条件达到最优化,尽可能消除或减轻环境对细胞的影响,维持细胞高存活力和高效表达.若以生产蛋白为目的的体外细胞培养,同时还要充分考虑细胞表达产物的后续纯化. 收稿日期:2005-04-18 基金项目:国家高技术研究发展计划(863)计划资助项目(2001AA21308);西北农林科技大学重点专题基金资助项目. 作者简介:吴方丽(1979-),女,河南睢县人,助教,博士.
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择 3 米力陈志南 33 (第四军医大学细胞工程中心国家863西安细胞工程基地西安710032 摘要目前全世界蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求已远远超过了现有生产能力。动物细胞 规模化生产重组蛋白和抗体的工艺选择可考虑使用当前较成熟的工业化支持技术平台,以缩短产品工艺研发的时间,加快工业化进程。当前被FDA 批准的生物技术产品以及公开发表的生产工艺占有主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养,工艺设计是流加或灌流培养。其大规模细胞培养生产所面临的挑战是获得最大生产力的同时注重维持产品的质量;去除所有培养环境中外源因子的污染,更为精确有效的工艺控制手段,规模化培养中氧气的限定与溶解C O 2浓度累积的控制等。关键词动物细胞大规模培养生产蛋白收稿日期:2003204210 3国家重大科技专项(2002AA2Z 3441 33通讯作者,电子信箱:chcerc2@https://www.doczj.com/doc/62786143.html, 动物细胞大规模培养已成为生物制药领域最重要的关键技术之一,并以其研究的深入和进展推动生物技术产业的迅速发展。专家预言:蛋白治疗药物如糖蛋白,抗体和多肽药物仅仅只是开始进入市场,预计在下一个10年或20年会有一个更为快速的发展。蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求 已远远超过目前全世界的生产能力[1] 。
由于动物细胞表达产品需求的紧迫性和生产工艺的复杂性,大大促进了该技术的深入研究与发展。80年代初首先兴起了生物反应器研究,许多形式的生物反应器被用于哺乳动物细胞培养工艺的研究,如中置搅拌系统,固定单层培养和中空纤维系统等。近10年的研究在解决动物细胞大规模培养的关键屏障技术,如限制性氧气的提供,消耗产物的积累,成熟精确的过程控制,剪切力的敏感性,和贴壁细胞培养规模化放大等问题都取得可喜 的进展[2] 。目前动物细胞工业化生产中主要致力于提高单位细胞的生产力,确保产品质量和过程工艺设计的一致性,减少工业化生产中的污染与自动 化控制等[3] 。以转基因动物和转基因植物为载体的重组蛋白生产在生物制药领域仍具有重要的地位,特别对于每年100kg 的超大规模需求量生产。 目前被美国FDA 批准的生物技术产品和已公开发表的生产工艺,都是较为成熟的工艺,并不代表当前动物细胞研究发展的趋势。因此动物细胞大规模培养生产蛋白或抗体的工艺选择,应综合考虑产品特点、工艺难度与工艺研发时间,以加速其产品产业化的进程。 以下就目前动物细胞大规模培养成熟工艺与当前研究的问题、对策作一简述。 1目前美国FDA 批准的产品与生产工艺 1996年1月至2002年12月美国获得成功批 准的不同的治疗剂和诊断剂产品共31种,其中用哺乳动物细胞培养生产的就有21种(美国FDA 网页http :ΠΠw w w.fda.g ov 。蛋白治疗药物有单克隆抗体治疗乳腺癌的Herceptin ,免疫球蛋白肿瘤坏死因子(T NF 受体融合蛋白治疗类风湿性关节炎的Enbrel 和灭活的甲肝疫苗Vaqta 等。动物细胞培养技术已经成为一个受到普遍信任的产业化生产技术,并逐步形成商业化操作水平。按技术应用专利的分类,我
《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果 器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。 你认为精确配制各种溶液？ 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。
固定化动物细胞大规模培养技术研究进展 石 凯1 熊晓辉1 许建生 2 (1南京工业大学制药与生命科学学院,南京,210009;2苏州农业职业技术学院,苏州,215008) 摘 要 介绍了固定化动物细胞培养过程中主要的技术及其进展,包括吸附、包埋、中空纤维、微囊化等。并在此基础上探讨了固定化动物细胞培养中尚存在的问题以及未来的发展方向。关键词 固定化,动物细胞培养,吸附,微载体,包埋,中空纤维,微囊化 中图分类号 Q 813.1+1 文献标识码 A 文章编号 1000-6613(2002)08-0556-04 固定化技术作为实现动物细胞大规模培养的重要途径,相对悬浮培养而言具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强、产物易于收集和分离纯化、对贴壁型和非贴壁型细胞都适用的优点,因此在动物细胞的大规模培养上得到越来越广泛的应用,相继出现了微载体、中空纤维及微囊化等多种固定化培养技术。本文作者将结合动物细胞的培养特性,介绍目前动物细胞大规模培养中的固定化技术。 1 动物细胞的特点及生长特性 动物细胞虽可像微生物细胞一样,在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养,但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比,有显著差别[1]:①动物细胞比微生物细胞大得多,无细胞壁,机械强度低,对剪切力敏感,适应环境能力差;②倍增时间长,生长缓慢,易受微生物污染,培养时须用 抗生素;③培养过程需氧量少(氧传质系数k L a 大于10h -1即可满足每毫升107个细胞的生长);④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在;⑤原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡;⑥代谢产物具有生物活性,生产成本高,但附加值也高。 动物细胞根据其在体外培养时对生长基质的依赖性差异,分为锚地依赖性和非锚地依赖性。大多数分泌药用蛋白的动物细胞属于锚地依赖性细胞,即要有足够地支持细胞贴壁的表面,又要保持均匀悬浮状态。固定化技术就是解决这两个问题的有效途径。 2 固定化培养方法 在传统的固定化酶技术中,常采用戊二醛、聚丙烯酰胺、聚氨酯等作为固定化细胞载体。但在动物细胞培养中,培养细胞的目的不仅仅要求催化活 力,更重要的是利用细胞来合成和分泌蛋白,因此如何保持细胞的活性显得尤为重要。由于动物细胞的极度敏感性,上述这些固定化方法会对动物细胞 产生毒性,另外多糖(如卡拉胶等)由于具有很高的离子强度也会对细胞产生毒害。故在动物细胞培养中要考虑使用较温和的固定化方法,如吸附、包埋、中空纤维或胶囊化。2.1 吸附2.1.1 多孔陶瓷 KC.Biologicals (USA )公司开发了一种完全自 动化的细胞培养系统[2]。该系统的核心是陶质矩形蜂窝状生物反应器。反应器构型是一圆筒内装置有许多陶质矩形通道的蜂窝状圆柱体。通道长30cm ,截面积是长方形,约为1mm 2,壁厚0.12mm ,可提供4.25m 2的生长表面积。这种结 构的生物反应器,既可用于培养悬浮生长的细胞,又可用于培养贴壁依赖性细胞。 该系统可以连续化生产蛋白质。由于产物直接分泌到培养基中,给分离纯化带来方便。而且细胞不用从培养基中分离,所以不必考虑梯度问题;当培养基高速循环时,可以保持相对恒定的营养物和氧浓度。增加套数即可实现放大。2.1.2 微载体 微载体细胞培养法是一种用于培养锚地依赖性细胞的大规模培养技术,由Van Wezel [3]于1967年首创。这种培养技术是在生物反应器内加入培养 液和一种对细胞无毒害作用的材料支撑的颗粒(微载体),使细胞在微载体表面附着和生长,并通过不断搅拌使微载体保持悬浮状态。培养液中大量的 收稿日期 2001-12-07;修改稿日期 2002-03-05。 第一作者简介 石凯(1977—),男,硕士研究生。电话025-*******-3716。 ? 655? 2002年第21卷第8期 化 工 进 展 CHEMICAL INDUSTR Y AND EN GIN EERIN G PRO GRESS
细胞培养技术
细胞培养发展史及其应用 （一）前言 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。 由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。 （二）细胞培养技术及其历史 细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。 1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。
动植物细胞的大规模培养 动物细胞培养简介 所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增值过程。在此过程中，细胞不再形成组织。动物细胞培养是生产许多临床和医学上重要生物制品的一种必不可少的方法，这些生物制品包括疫苗、干扰素、激素、生长因子和单克隆抗体等，既推动了生物学和医学的发展，又带来了巨大的社会效益和经济效益。目前, 动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、细胞培养环境的优化、生物反应器的改良、改变细胞特性、提高产品的产出率与保证其质量上。 动物细胞培养的环境 影响动物细胞培养的主要因素有温度、pH值、CO2 、DO、葡萄糖、乳酸、氨、甲基乙二醛、培养基成分等。一般情况下，人和哺乳动物细胞的最适温度为37℃，pH值在7.2-7.4之间，CO2 水平为4-10%, DO维持在20-50%，葡萄糖是细胞培养过程中的能量的主要来源，需要维持在一定水平。乳酸、氨、甲基乙二醛等是动物细胞培养中的主要限制因素。在实际应用中，降低甲基乙二醛的浓度是通过降低葡萄糖用量来实现的。 培养基 用于动物细胞的培养基可以分为天然培养基和合成培养基两大类。 天然培养基的优点是营养成分丰富、培养效果良好；缺点是成分复杂、个体差异大、来源有限。天然培养基的种类很多，包括血清、血浆、组织浸出液、水解乳蛋白等。其中血清是最常用的天然培养基。 合成培养基的优点是既能给细胞提供一个近似于体内的生存环境，又便于控制和提供标准化体外生存环境。然而合成培养基中还是需要加入一定量的天然培养基予以补充。 培养方法 动物细胞的体外培养有两种类型：贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞。 悬浮培养： 悬浮培养主要用于非贴壁依赖性细胞，是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程。对于小规模培养可采用转瓶和滚瓶培养，大规模培养则可采用发酵罐式的细胞培养反应器。悬浮培养对设备的要求也比较简单。 贴壁培养： 贴壁培养是动物培养的一种重要方法，是指必须贴附在固体介质表面上生长的细胞培养，主要用于非淋巴组织和许多异倍体等贴壁依赖性细胞的培养。 优点： 1.细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液，容易更换培养液； 2.因细胞固定载体表面，不需过滤系统，容易采用灌注方式培养，从而达到提高细胞密度的目的； 3.当细胞壁贴于生长基质时，细胞将更有效的表达一种产品； 4.同一设备可培养多种细胞，并根据需要采用不同的培养液和细胞的比例； 缺点： 1.细胞繁殖贴壁后不易消化下来，培养的扩大比较困难； 2.培养设施占地面积大，设备投资大；
2013—2014学年第一学期主备人：康志意审核人：高二生物学科组教务领导：编号：sw201503012 动物细胞与组织培养 班级：学习小组：姓名：小组评价：教师评价： 【学习目标】1、能说出动物细胞与组织培养的概念 2、详细叙述动物细胞与组织培养的过程 【学习重难点】动物细胞与组织培养的过程 【自主学习】认真阅读教材P53-P54的知识完成自主学习和自学效果检测内容 知识点一：动物细胞工程的概念 概念： 说出动物细胞工程的依据、技术手段、基础、应用。 知识点二：动物细胞与组织培养的概念 1、概念： 2、你认为选取怎样的材料适合培养？为什么？ 3、请你概括出动物细胞与组织培养的条件。 4、从培养基的物理性质看，动物细胞培养使用的培养基属于什么？添加了哪些主要的成分？添加了哪些特殊的 成分？ 知识点三：动物细胞与组织培养的过程 1、写出动物细胞培养过程 思考：①为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？怎样处理？ ②动物细胞培养时的分裂方式是什么？会一直分裂下去吗？ 2、写出动物组织培养的过程 思考：动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？为什么？ 3、归纳出不同的动物组织或细胞的培养难易度 4、什么是原代培养和传代培养？ 思考：原代培养的细胞有什么应用？为什么？
【合作探究】请你完成下列表格植物组织培养和动物细胞培养的比较 A．培养基不同 B．动物细胞培养不需要在无菌条件下进行 C．动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能 D．动物细胞能大量培养，而植物细胞不能2．下列有关细胞工程的叙述，不．正确的是( ) A．在细胞整体水平上定向改变遗传物质 B．在细胞器水平上定向改变遗传物质 C．在细胞器水平上定向改变细胞核的遗传物质 D．在细胞整体水平上获得细胞产品 3．用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞( ) A．容易产生各种变异 B．具有更强的全能性 C．取材十分方便 D．分裂增殖的能力强4．下列是动物细胞培养的工具酶的是( ) A．限制性核酸内切酶 B．DNA连接酶 C．胰蛋白酶 D．果胶酶 5、用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是( ) A．都需用CO2培养箱B．都须用液体培养基 C．都要在无菌条件下进行D．都可体现细胞的全能性 6、.下列关于动物细胞培养的叙述正确的是( ) A．培养中的人效应T细胞能产生单克隆抗体 B．培养中的人B细胞能够无限地增殖 C．人的成熟红细胞经过培养能形成细胞株 D．用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞 7．(2008年高考宁夏卷)回答下列有关动物细胞培养的问题： (1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面____________时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的________。此时，瓶壁上形成的细胞层数是____________。要使贴壁细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是__________。 (2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现__________的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成__________细胞，该种细胞的黏着性__________，细胞膜表面蛋白质(糖蛋白)的量__________。 (3)现用某种大分子染料，对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不染色，原因是__________。 (4)检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到__________期的细胞用显微镜进行观察。 (5)在细胞培养过程中，通常在____________条件下保存细胞。因为在这种条件下，细胞中____________的活性降低，细胞____________的速率降低。 (6)给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作__________进行攻击。 【课后反思】你还有什么疑问吗？请写下来或提交小组再进行讨论。
动物细胞与组织培养---指从活的机体中取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术 组织培养--细胞培养、组织培养和器官培养。 细胞培养的现实意义 生物技术上：生产各种生物技术产品 科学研究上：在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等 临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某疾病的治疗等 细胞培养技术的优点 1.研究的对象是活细胞:在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。 2. 研究条件可以人为控制 3. 研究的样本可以达到比较的均一 4. 研究内容便于观察、检测和记录 5.研究的范围比较广泛 6.研究的费用相对较经济 细胞培养的缺点 现在人工模拟体内环境的技术已经很高, 但人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同。 当细胞被置于体外培养后, 生活在缺乏动态平衡的环境中, 时间久了，必然发生变化 体内外细胞的差异 1. 与体内主要不同 相对孤立、相对单一， 缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响 2. 主要表现 失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显 细胞趋向单一化 培养细胞的分化 1．不适应 2．脱分化或去分化 体外细胞培养物的生长类型 按生长方式: 2种类型 粘附型(贴壁型)细胞: 附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。大多数细胞 悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。 贴附生长型细胞在体内、外粘附方式存在差异
课时分层作业(七) (建议用时：45分钟) [基础达标练] 1．下列关于动物细胞培养的叙述，错误的是( ) A．用于培养的细胞大都取自胚胎或幼龄动物的器官或组织 B．将所取的组织先用胰蛋白酶等进行处理使其分散成单个细胞 C．细胞铺满整个培养皿底部时，要将细胞转移到新培养液中继续培养 D．动物细胞培养只能传50代左右，所培育的细胞会衰老死亡 【解析】动物细胞培养至50代左右，细胞增殖会明显减缓，甚至完全停止。 【答案】 D 2．下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是( ) A．贴壁细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞 B．培养过程中多数细胞的基因型会发生改变 C．二倍体细胞的传代培养次数通常是无限的 D．恶性细胞系的细胞可进行传代培养 【解析】动物细胞培养时，具有接触抑制现象，贴壁细胞在培养瓶壁上只可形成一层细胞，A错；细胞在培养过程中，传代次数也是有限的，一般为50次就会死亡，留下来的细胞就是发生了癌变的细胞，遗传物质发生改变，具有不死性，B、C错，D正确。 【答案】 D 3．下列有关体细胞核移植技术的说法不正确的是( ) A．体细胞核移植技术在多种动物中获得了成功，成功率非常高 B．克隆技术的各个环节有待于进一步改进 C．大多数克隆动物还存在一些遗传和生理缺陷类的健康问题 D．克隆动物食品的安全性问题仍然存在争议 【解析】本题考查体细胞核移植技术的利弊。由于体细胞核移植技术是一项新的技术，对于其原理并不完全清楚，成功率并不高，有许多问题仍待解决。 【答案】 A 4．伦理学家极力反对克隆人，以下哪项不是他们反对克隆人的原因( ) A．严重地违反了人类伦理道德 B．冲击了现有的伦理道德观念 C．克隆人是心理不正常的人 D．干扰正常的社会和家庭关系 【解析】克隆人严重地违反了人类伦理道德，冲击了现有的伦理道德观念，干扰了正常社会和家庭关系，我们应持反对态度。
动物细胞工程教学设计 【学习目标】 1、理解动物细胞培养的过程及条件 2、了解动物细胞核移植技术的原理 3、理解动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 【课前知识点背诵】 一、动物细胞培养 1.流程： 2.条件： (1)无菌、无毒：对培养液和所有培养用具无菌处理，添加一定量的抗生素，定期更换培养液以清除代谢产物。 (2)营养：除有机物糖、氨基酸、促生长因子和无机营养无机盐、微量元素外，加动物血清。 (3)适宜的温度和pH：温度为36.5±0.5℃(哺乳动物)，pH为7.2-7.4。 (4)气体环境：含95% 的空气加5% CO2 的混合气体。CO2的作用是维持培养液的PH 3.应用：生物制品的生产、检测有毒物质、医学研究。 4.细胞遗传特性： ①10代以内：原代培养不变②10~50代：细胞株一般不变③50代后：细胞系改变 二、动物体细胞核移植技术和克隆动物 1.动物核移植概念 是将动物的一个体细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新胚胎最终发育为动物个体。 2.过程 3.应用 ①加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育；②保护濒危物种；③生产医用蛋白；④作为异种移植的供体；⑤用于组织器官的移植。 【课堂探究】 考点一：动物细胞培养 例1：实验小鼠皮肤细胞培养(非克隆培养)的基本过程如图所示。下列叙述错误的是( ) A．甲过程需要对实验小鼠进行消毒 B．乙过程对皮肤组织可用胰蛋白酶消化 C．丙过程得到的细胞大多具有异倍体核型D．丁过程得到的细胞具有异质性 探究讨论一：
1.为什么选择动物胚胎或幼龄动物的器官或组织进行动物细胞培养？ 2.进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要成分是什么？用胃蛋白酶行吗？ 3.两次使用胰蛋白酶的作用分别是什么？ 4.多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中。你认为体外培养细胞时需要提供哪些物质和什么样的环境条件？ 5.培养动物细胞的培养基是液体培养基还是固体培养基？培养基中为什么要加入动物血清？ 6.植物组织培养和动物细胞培养的比较 变式训练1：下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是 A．培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞 B．克隆培养法培养过程中多数细胞的基因型会发生改变 C．二倍体细胞的传代培养次数通常是无限的 D．恶性细胞系的细胞可进行传代培养 实战演练1：（2014年浙江卷）下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是 A.连续细胞系的细胞大多具有二倍体核型 B.某些癌细胞在合适条件下能逆转为正常细胞 C.由多个祖细胞培养形成的细胞群为一个克隆 D.未经克隆化培养的细胞系细胞具有相同的性状 巩固训练：如图表示动物细胞培养程序图，请据图回答下列问题： (1)过程②表示________________。 (2)过程③和⑥用________处理组织或贴壁细胞分散成单个细胞，这样做的目的是______________。 (3)④和⑥的过程都要把分散的细胞制成_________________。 (4)过程⑤进行的细胞培养是________，细胞适于________生长增殖。
细胞生物学在生物制药方面的应用及实例 —————动物细胞培养技术 【摘要】现代生物制药产业中有着众多核心技术，其中哺乳动物细胞培养技术作为生物制药产业的下游通用性核心技术之一，发挥着重要作用。动物细胞培养开始于本世纪初，到1962 年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。 【关键词】生物制药动物细胞技术发展历史应用前景 动物细胞技术用于生物制药的历史 早期疫苗产业: 往往利用动物来生产疫苗，譬如用奶牛来生产天花疫苗。 天花是继瘟疫之后世界上传播最广、最可怕的疾病。1555年，墨西哥天花大流行，全国1500万人口中，死了200万人。16-18世纪，欧洲每年死于天花病的人数为50万，亚洲达80万人。有人估计，18世纪内有1.5亿人死于天花。 18世纪后期，一位英国乡村医生E. Jenner发现，一种挤奶女工容易得的、比较温和的疾病的人，对天花也有免疫力。在1798年发表自己的发现 . 到1975年，天花全世界范围内初步消灭了。 1920～1950，开发了多种病毒或细菌疫苗，如伤寒疫苗、肺结核疫苗、破伤风疫苗、霍乱疫苗、百日咳疫苗、流感疫苗等。 1950 ～ 1985期间，细胞工程及其他技术的进步，利用细胞培养技术，生产多种人用疫苗：预防脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、风疹、乙肝和带状疱疹等，并用于生产多种兽用疫苗。用类似的细胞培养技术还可生产酶、细胞因子、抗体等生物制品。而先决条件是能够获得可分泌目的蛋白的细胞系。但这在基因工程技术出现之前，细胞表达蛋白的水平很低，成本高。
大规模动物细胞培养 动物细胞培养开始于本世纪初，到1962年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。由于动物细胞体外培养的生物学特性、相关产品结构的复杂性和质量以及一致性要求，动物细胞大规模培养技术仍难于满足具有重要医用价值生物制品的规模生产的需求，迫切需要进一步研究和发展细胞培养工艺。目前，世界众多研究领域集中在优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率并保证其质量和一致性上。 1.细胞培养环境 细胞培养环境中抑制因素的积聚是提高细胞密度的主要限制因素。体外动物细胞培养中氨离子的积累是抑制细胞生长的主要因素之一。氨的积聚使细胞内UDP氨基己糖(UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺)增加，影响细胞的生长及蛋白的糖基化过程。氨抑制Gln代谢途径，使Asp和Glu消耗增加。细胞消耗Asp增加，可能是细胞线粒体膜上苹果酸－天冬氨酸泵转运NADH加快，使细胞维持糖酵解途径的需要。Asp消耗增加可能会从Gln代谢多经天冬氨酸转氨酶途径而不是丙氨酸转氨酶或谷氨酸脱氢酶途径得以补偿。氨来源于两方面：一是直接来源于培养基，一是细胞代谢所产生。但两者都涉及谷氨酰胺，因此需要防止培养基中Gln自然分解，限制Gln用量，并尽量去除培养基中的氨。 乳酸是细胞糖代谢的产物。高浓度乳酸会抑制乳酸脱氢酶(LDH），从而减少乳酸产生。LDH受抑制后阻止了NADH向NAD的再生及其偶联的丙酮酸/乳酸转换，从而导致NADH增加。NADH增加，部分抑制糖酵解。乳酸抑制糖酵解也导致低浓度丙酮酸，从而导致Gln消耗减少。由于糖酵解和Gln的分解速度降低，能量产生减少，更多的能量用于维持离子浓度梯度，因此高乳酸浓度必将抑制细胞生长。氨和乳酸对细胞的毒性作用已在多种不同的细胞系有大量报道，不同细胞系对于这两种代谢产物的耐受性差别很大，原因可能是不同细胞系葡萄糖和谷氨酰胺代谢过程中关键酶的敏感性不同，或者在不良生长环境下，细胞转换