实验六质粒DNA的提取
一、实验目的
通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒
二、实验原理
质粒(Plasmid)是独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。它是一种环状的双链DNA分子，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。
本实验利用SDS碱裂解法提取质粒DNA。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被SDS （十二烷基硫酸钠）包盖。当用K+取代Na＋时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。
三、实验材料与试剂
1、实验材料大肠杆菌（含有携带插入片段的质粒PMD-18T）
2、实验试剂
(1) 溶液Ⅰ：Tris·HCl(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L；
(2) 溶液Ⅱ(新鲜配制) ：NaOH 0.2mol/L,SDS 1%(W/V)；
(3) 溶液Ⅲ(100ml)：5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml；
(4) 氯仿－异戊醇（24：1）；
(5) 异丙醇、70%乙醇；
四、实验步骤
（一）提取质粒
1. 挑转化后的单菌落(含PMD-18T质粒)，接种到20ml含有适当抗生素(Amp)的丰富培养基中(LB培养液)，于37℃剧烈振摇下培养过夜。（由老师完成）
2. 将1.5ml的培养物倒入1.5ml的EP管中，于4 ℃以12000rpm离心1min。
3. 离心结束, 弃去上层培养液，再向离心管中加入1.5ml的培养物，于4 ℃以12000rpm 离心1min。
4. 弃去上层培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
5. 将细菌沉淀重悬于100μl冰预冷的溶液Ⅰ中,用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀(无块状悬浮)。
6. 加200μl新配制的溶液Ⅱ于每管细菌悬液中,盖紧管口,快速颠倒离心管5次,以混合内容物,注意动作一定要轻柔缓和，切勿振荡!将离心管放置于冰上(2min)。
7. 加150μl用冰预冷的溶液III,盖紧管口,反复颠倒数次,使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀,之后将管置于冰上3～5min。
8. 4 ℃以12000rpm离心5 min,将上清液（400 μl ）转移到另一离心管中。
9. 加等体积的氯仿：异戊醇（24：1）振荡混匀。 4 ℃以12000rpm离心5min，将上清液（300 μl ）转移到另一离心管中。
10. 加2/3体积的异丙醇沉淀质粒DNA,振荡混匀,于冰上放置15min。
11.4 ℃以12000rpm离心5min。小心吸去上清液，将离心管倒置于纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。
12. 加1ml 70％乙醇溶液洗涤沉淀，振荡混匀, 4 ℃12000rpm离心5min。弃去上清液，在空气中使DNA沉淀干燥（约5-10分钟）。
13. 用20μl灭菌的蒸馏水溶解DNA,加1μl胰RNA酶37 ℃消化RNA 30min。
14. 用1%的琼脂糖凝胶电泳检测质粒的提取状况。
五、实验结果
我组为第7组，由电泳图谱可以看出，电泳得到3个条带，条带较为清晰。最前面的一条带为超螺旋的质粒DNA（分子量2000bp），中间的条带为两条链均发生断裂而形成的线形DNA；最慢的条带为一条链发生断裂的开环质粒DNA。
六、思考题
1. 试述在提取质粒过程中溶液I、II、III的作用是什么?
（1）溶液Ⅰ：Tris·HCl(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L；
主要作用是使细菌悬浮，此外EDTA 可抑制DNase的活性。
(2) 溶液Ⅱ(新鲜配制) ：NaOH 0.2mol/L,SDS 1%(W/V)；
碱会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA排放到上清中；在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，可被SDS 包盖。
(3) 溶液Ⅲ(100ml)：5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml；
K+置换了SDS中的Na+，得到PDS（十二烷基磺酸钾），这些复合物可以从溶液中有效地沉淀下来，经离心除去。
2. 描述质粒DNA的电泳图谱，并解释产生的现象及可能的原因？
实验中得到的质粒DNA电泳图谱显示共有三条带，其中：
最快的一条带是超螺旋的质粒DNA；中间的是线性DNA，质粒的两条链均断裂形成了线性分子；最远的一条是开环的质粒DNA，有一条链断裂。后两种情况的发生主要是由于在质粒提取过程中，机械力、酸碱度、试剂等的原因，使质粒DNA链发生断裂。
题目：质粒DNA的提取及检测 一．实验目的: 1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法； 2.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。 二．实验原理 1. 质粒 (Plasmid)： 一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。 2.载体(Vector)： 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。 3.分离质粒DNA： （1）培养细菌使质粒扩增； （2）收集和碱裂解细菌； （3）分离和纯化质粒DNA。 4.碱裂解法 （1）溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl 作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解
（2）溶液Ⅱ：L NaOH，2% SDS，临用前1：1配制 作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性 （3）溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml，冰醋酸，双蒸水 作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。 5.电泳 带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线 性关系。因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。 6.提取质粒 在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA 、 闭环超螺旋DNA 。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒 DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉 开环。但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料 含量有关。 三．实验材料及设备 1.实验材料： （1）含质粒pUC18大肠杆菌，塑料离心管，EP管架，微量取液器和取液器吸头，常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶等）； （2）提取的pUC18，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，剪刀，取液器吸头。实验设备：
质粒DNA的提取和纯化实验报告
实验一、质粒DNA的提取和纯化 一、实验目的： 1、学习并掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。 2、初步了解DNA纯化的原理。 二、实验原理 1、细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 2、质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 3、碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 4、纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 三、实验步骤 1、挑取单菌落接种到含Amp的LB液体培养基试管内（3.5ml/管） 2、将试管放入恒温震荡培养箱中，37℃，200r/min培养12-16h。 3、将菌落转入1.5ml离心管中（尽量倒满）1200r/min，离心30s（沉淀菌体） 4、重复一次第三步的过程 5、弃掉上清液并扣干，加入预冷的Solution1 100微升，剧烈震荡打散菌体
实验一、质粒DNA的提取及检测 【实验目的】 1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤 2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 3、学会PCR操作的基本技术 第一部分质粒DNA的提取 一、实验原理： 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 二、仪器与试剂 1、仪器恒温摇床、台式离心机 2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿 三、实验步骤 1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19 质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。 2、取1.5mL培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。 3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。 4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。 5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。 6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置15min。 7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。 8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min， 将上清转移到另一离心管中。 9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。12000r/min，离心5min。 倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 10、用1mL70℅乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干 燥。 11、加20μLTE缓冲液，其中含有20μg/mL的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20℃保存。
1.菌液OD值越高，质粒产量越高 2.大肠杆菌OD值越高，提取的质粒的浓度就越高吗？？？还要看质粒纯度，纯度一般 在1.8-1.9最适合，再高了就是蛋白污染 3.一般而言gene导入原核细胞称转化，导入真核细胞称转染。 4.用QIANGEN质粒提取试剂盒提取质粒，我没有提不出来的经历，有以下几点要注意， 从细胞、试剂盒及操作三个方面考虑： 1..确定细菌是阳性转化子，应该含有你的质粒，过夜摇菌已足够，记得加抗生素。 2.关于试剂。溶液2中是否浑浊，SDS在低温产生结晶，使用前用37度水浴。溶液3 中的醋酸钾可能产生结晶，使用前应该温水溶解。确认洗脱液1中的乙醇没有挥发，闻一闻就知道了。洗脱液2是否在使用前已加乙醇，加乙醇后在盖子上打钩，以免与没加的混淆。 3.抽提过程中，加溶液1（放4度保存）后应该充分悬浮菌体，以便裂解充分；加溶液 2和3应该快，加溶液2后打开盖有丝状物，加溶液3出现絮状沉淀，离心要充分。 请严格按说明书操作。 如果你觉得以上几点你都做的很好，试剂盒是新的，换含其它质粒的菌株试一试，如pUC18的转化子。如果试剂和是用过的，放置太久，换其它试剂盒吧，要不换土法试试！ 5.Qiagen我卖这么多个，到目前还是零投诉。不过出现问题基本如下： 1。如果是质粒超纯试剂盒，得率偏低，因为Qiagen自己得专利树脂填料，对纯度得要求比对得率得要求高，在超纯质粒的抽提过程中，得率比同类产品要低些，不过OD 得比值很好，就是纯度很高。 2。如果是质粒小提，快速提取等，基本不出什么问题。 有些操作要注意， 1。Solution2,3有没有沉淀。 2。细菌培养过程中，有没有抗生素选择压力，不然质粒丢失。 4。收获细菌有没有测OD值，有些仅凭目测，呵呵，又差异得。 不过，有个建议，质粒小提，快速提取，就不要用Qiagen得了，偏贵。 6.从你跑的电泳来看，你的质粒不是很多，差不多就是300ng,可能你的小片段太少，所 以你的小片断那就看不出来了，不知道你大片段分子是小片段的多少倍，一般跑电泳能看到在50ng左右,标准的MARK是每条带是50ng,如果你即使切下来了，但你的小片段太小，也是什么都看不到的，这里有一个大约估计量的公式，小片段的纳克数等于大片段纳克数乘他们分子量的比值 7.提取质粒失败的可能的原因：1：克隆有问题；2：提质粒时裂解时间过长；3：质粒提 取试剂盒的溶液有问题；4：有点可能本身拷贝数就比较低，可换感受态重新转化后提质粒
实验六质粒DNA的提取 一、实验目的 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒 二、实验原理 质粒(Plasmid)是独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。它是一种环状的双链DNA分子，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。 本实验利用SDS碱裂解法提取质粒DNA。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被SDS （十二烷基硫酸钠）包盖。当用K+取代Na＋时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。 三、实验材料与试剂 1、实验材料大肠杆菌（含有携带插入片段的质粒PMD-18T） 2、实验试剂 (1) 溶液Ⅰ：Tris·HCl(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L； (2) 溶液Ⅱ(新鲜配制) ：NaOH 0.2mol/L,SDS 1%(W/V)； (3) 溶液Ⅲ(100ml)：5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml； (4) 氯仿－异戊醇（24：1）； (5) 异丙醇、70%乙醇； 四、实验步骤 （一）提取质粒 1. 挑转化后的单菌落(含PMD-18T质粒)，接种到20ml含有适当抗生素(Amp)的丰富培养基中(LB培养液)，于37℃剧烈振摇下培养过夜。（由老师完成） 2. 将1.5ml的培养物倒入1.5ml的EP管中，于4 ℃以12000rpm离心1min。 3. 离心结束, 弃去上层培养液，再向离心管中加入1.5ml的培养物，于4 ℃以12000rpm 离心1min。 4. 弃去上层培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。 5. 将细菌沉淀重悬于100μl冰预冷的溶液Ⅰ中,用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀(无块状悬浮)。
质粒DNA的提取 一、实验方法 碱裂解法抽提质粒DNA 二、实验原理 基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。 三、实验步骤 1）质粒提取 1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。 2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。 3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟 4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。 5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。 6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA 7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟 8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇 9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA 2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳 灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I) 加样：质粒+上样缓冲液→混匀 电泳 结果观察：UV灯下 四、实验结果 五、实验分析 裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质 1、防止DNA裂解：Solution 1 1）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解 2）、所含EDTA抑制酶活性 2、溶解与变性：Solution2 1)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性
实验一质粒DNA的提取及定量分析 一、实验原理与步骤 1.实验原理：碱裂解法抽提质粒DNA 质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA 的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后, 溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 2.质粒DNA提取的方法步骤 ①收集菌体：取1.5ml培养液至Ep管中，12000rpm离心1min，弃上清，取沉淀。 ②溶解菌体：将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，强裂振荡混匀。 ③变性：加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒5-6次以混匀内容物，冰上放置5分钟。 ④复性：加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟。 ⑤12000rpm 离心５分钟，取上清移到１个新的Ep管中。 ⑥取上清（≈ 420ul），分别加入1/2体积酚(210ul)，和1/2体积氯仿/异戊醇（24:１） (210ul) ，涡旋震荡混匀溶液。 ⑦12000rpm、离心5分钟。小心移取上清液（≈ 400μl)至另一个新1.5mlEp 管中。
⑧上清液加入２倍体积（≈ 800ul ）预冷无水乙醇，混匀，于 -20℃中静置 0.5h。 ⑨12000rpm, 离心5分钟。弃上清，加入１ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次，12000rpm 离心10分钟。 10.干燥DNA：用移液器小心吸走上清液，然后瞬时离心，再将残余的少量液体移走，用温和的电吹风吹干DNA沉淀（以看不到液滴为准）。 11．加入50μl TE（含20μg/ml RNA 酶，不含DNA酶）溶解DNA，-20℃下保存备用。 二、结果与分析 1.质粒DNA的浓度 经测定，本组的质粒DNA浓度如下：GST-T的为142.7μg/ml，OD260/280=1.99；ProB的为196.5μg/ml，OD260/280=1.94。 分析：本次提取的质粒DNA浓度较高，OD260/280值在1.8-2.0之间，说明这次提取的质粒DNA比较纯。（OD260/280值的参考值为：DNA: 1.8 (RNA: 2.0)比值<1.8：蛋白质污染；比值>2.0: RNA污染。）其原因可能为，取了两次菌液共3ml，菌体数量较多，其携带的质粒DNA也较多，故提取的质粒DNA浓度较高。溶液P1中加入了RNase A，降解了RNA，排除了RNA的污染；溶液P2中含有蛋白变性剂，使蛋白变性沉淀下来，通过离心被除去，且在提取的过程中加入了去蛋白液PD，进一步去除样品中的蛋白质，故提取的质粒DNA比较纯。 2.关于电泳条带：
实验一质粒D N A的提 取
实验一质粒DNA的提取 一、原理 采用碱变性发抽提取质粒DNA。该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异 而达到分离目的的。在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开 变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的 构型，保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 二、方法 1.挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μg/ml 氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。 2.将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。反复数次，收集 全部菌体。 3.倾去上清，滤纸吸干。 4.加30μlTE缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。 5.加30μlTENS溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/L NaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。 6.加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染色 体DNA。 7.上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。 8.上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。 9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。 10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。 lI．加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。 12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混匀。 13．37℃水浴30min。 14．样品放一20℃冰箱保存备用。 三、试剂 1．TE缓冲液(10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0) 配制方法： Tris 1.211g EDTA.Na 0.037g 用800ml重蒸水溶解，用分析纯盐酸调整pH至8.0，加重蒸水定容至1000ml。 2．TENS溶液：(10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/L NaOH,0.5%SDS) 配制方法： NaOH O.4 g SDS 0.5 g 加80mlTE缓冲液溶解。加TE缓冲液定容至lOOml. 3．3.0mol／1醋酸钠溶液(pH5.2) 配制方法：醋酸钠 24.6g 用70ml重蒸水溶解，再用冰乙酸大约调pH至5.2,加重蒸水定容至100ml。 纯净的酚使用时不需要重蒸。市售的酚一般为红色或黄色结晶体，使用之前必须重蒸，除去 能引起DNA和RNA断裂和聚合的杂质。将苯酚置于65℃水浴中溶解，重新进行蒸馏，当温度升至183℃时，开始收集在若干个棕色瓶中。纯酚和重蒸酚都应贮存在-20℃使用前取一瓶重蒸酚于分液漏斗中，加入等体积的lmol／L Tris-HCI(pH8.0)缓冲液，立即加盖，激烈振 荡，并加入固体Tris摇匀调pH(一般100ml苯酚约加l克固体Tris)分层后测上层水相pH 至7.6一8.0。从分液漏斗中放出下层酚相于棕色瓶中，并加一定体积0.1mol／L Tris- HCI(pH8．o)覆盖在酚相上，置4℃冰箱贮存备用。酚是一种强腐蚀剂，能引起腐蚀性损伤，操作时应戴上眼镜和手套。如果皮肤上溅上了酚，应用大量水冲洗或用肥皂水冲洗。酚在空
实验一质粒的提取酶切 实验目的 掌握质粒小量快速提取法。用琼脂糖凝胶电泳法鉴定其纯度。 实验原理 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子。大小在1~200kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。他可独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能却赋予宿主细胞的某些表型。 采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。用酒精沉淀洗涤，可得到质粒DNA。 在细胞内，共价闭环DNA（cccDNA）常以超螺旋形式存在。若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA（ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 限制性内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序DNA片段。EcoR I和Bgl II的识别序列和切口是： EcoR I：G↓AATTC Bgl II: A↓GATCT G，A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。
质粒DNA提取 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，碱裂解法是最为常用的提取方法。其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。 原理：用SDS和NaOH处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA 和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH 值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。再由苯酚/氯仿 /异戊醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。 试剂配制及作用机理 1. 溶液ⅠpH 8.0: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA。 葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2＋和Mg2 ＋等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉。从而起到抑制DNase对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。 2.溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS。使用的时候需现配。 要新配置溶液Ⅱ是为了避免NaOH接触空气中的CO2而减弱了碱性。NaOH是最佳溶解细胞的试剂。不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会在瞬间溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化。用不新鲜的0.4 M NaOH，即便有SDS也无法有效溶解大肠杆菌。SDS是离子型表面活性剂，它主要作用是：a溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜；b解聚细胞中的核蛋白；c能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。 SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便下一步试验的更好进行。 3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。
质粒D N A提取实验 质粒DNA提取可以：（1）快速纯化质粒；（2）用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。 质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。 ? 提取质粒的基本步骤分为三步： ①细菌的培养和质粒的扩增 ②细菌菌体的裂解 ③质粒DNA的纯化 一、材料与试剂准备 1.?材料：大肠杆菌。 2.?仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪。 3.?试剂： （1）SolutionI：25mMTris-Hcl(pH7.4)，10mMEDTA(pH8.0)，50mM葡萄糖，高压灭菌，4℃保存。 （2）SolutionII：0.2MNaOH，1%SDS现配现用。 （3）SolutionIII：5NKAcpH4.8，高压灭菌，4℃保存。 （4）3MNaAcpH5.2，高压灭菌，4℃保存。 （5）异丙醇，溶菌酶（8mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70%乙醇，LB培养基，电泳试剂。 ? 二、实验步骤 1.摇菌培养 1）将鉴定测序正确的克隆菌液涂在LB固体平板。 2）置于37℃恒温培养箱，培养12-17h，待长出菌落。 3）灭菌15ml离心管内加入5ml含抗生素的LB液体培养基，编号标记。 4）挑取单克隆菌团放置液体培养基，每个培养基放置1个菌落。 5）37℃，180rpm，振荡培养过夜。 2.收获细菌并裂解 1）离心扩增好的菌液，按说明书将菌液重悬，转入1.5ml离心管中。 2）用质粒小量抽提试剂盒，按说明书要求提取质粒。 3）细菌高速离心1min,彻底去除上清。 4）加入250ulRB溶液，振荡器充分悬浮细菌。 5）加入250ulLB溶液。立即上下颠倒10次，使细菌裂解，室温，放置2min。6）加入250ulNB溶液。立即上下颠倒10次，使之充分中和，室温，放置2min。7）室温，1500rpm，高速离心15min。 8）将吸附柱放入收集管内，离心得到的上清转移至吸附柱，室温，15000rpm，高速离心30s。