ICS 67.050 B 45
DB12
鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测
实时荧光PCR 法
Quantitative PCR method for animal derived materials in meat and meat products
天津市市场和质量监督管理委员会发布
前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准由天津市农村工作委员会提出。
本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市东丽区产品质量监督检验所。本标准主要起草人：赵新、易萌、刘娜、兰青阔、刘雪岩、陈锐、朱珠、王成、徐石勇。
本标准2016年9月首次发布。
鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测
实时荧光PCR法
1 范围
本标准规定了鲜冻畜、禽肉中动物源性成分（包括牛、羊、猪、鸡、鸭等）的定量PCR检测方法的术语和定义、检测方法、结果计算。
本标准适用于生鲜、冷冻畜禽肉中动物源性成分的定量PCR检测。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
实时荧光PCR real time PCR
实时荧光PCR是指PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，对未知模板进行定性或定量分析。
3.2
Ct值cycle time
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
3.3
内参基因reference gene
能够同时检测出多种动物源性成分的基因（包括牛、羊、猪、鸡、鸭等）。
3.4
牛源性成分bovine-derived materials
牛种属特异性DNA片段。
3.5
羊源性成分ovine-derived materials
羊种属特异性DNA片段。
3.6
猪源性成分porcine-derived materials
猪种属特异性DNA片段。
3.7
鸡源性成分chicken-derived materials
鸡种属特异性DNA片段。
3.8
鸭源性成分duck-derived materials
鸭种属特异性DNA片段。
4 原理
根据牛、羊、猪、鸡、鸭等的DNA特征序列，筛选种间保守区域设计一对通用引物和种内特异性区域设计五对种属特异性引物，通用引物可同时扩增牛、羊、猪、鸡、鸭等多种动物源性DNA，采用TaqMan实时荧光PCR技术，根据标准参照物模板含量与Ct值间的线性关系，绘制标准曲线，计算试样中种属特异性基因和内参基因的比值，从而对鲜冻畜、禽肉中动物源性成分进行定量检测。
5 检测方法
5.1试剂和材料
除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T 6682规定的一级水。
5.1.1DNA提取用试剂
三氯甲烷；异戊醇；乙酸钠；无水乙醇；Tris饱和酚；裂解液：10 mmoL/L Tris-HCl（pH 8.0），25 mmol/L EDTA（pH8.0），5 g/L SDS，0.1 g/L蛋白酶K；TE缓冲液（Tris-HCl、EDTA缓冲液）：10 mmoL/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。
5.1.2 TaqMan荧光PCR反应试剂盒
5.1.3 引物和探针。
表1 动物源性成分内参基因和种属特异性基因引物和探针序列
用水分别将上述引物和探针稀释到10 μmol/L，探针需避光保存。预期扩增片段信息参见附录A，TaqMan探针引物其5′端标记荧光报告基团（如FAM、ROX等），3′端标记对应的荧光淬灭基团（如TAMRA、BHQ1等）。
5.1.4 阳性对照
用已知含相应动物源性成分的样品作阳性对照。
5.1.5 双蒸水。
5.2 仪器
荧光定量PCR扩增仪；核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计；分析天平，感量0.1 g和0.1 mg；离心机：离心力12000 g；微量移液器：0.5μL～10μL，10μL～100μL，10μL～200μL，100μL～1000μL；实时荧光PCR反应管；重蒸馏水发生器或纯水仪；恒温水浴箱。
5.3 分析步骤
5.3.1 试样制备
生鲜肉直接进行试样制备，冷冻肉于室温融化后进行制样。充分混匀，用四分法缩分出不少于500 g作为试样，装入清洁容器中，加封后，标明标记。将试样于-20℃冷冻保存。
5.3.2 DNA提取
取待测样本剔去动物组织中的结缔组织和脂肪，液氮预冷后放入研钵中，然后缓慢向研钵中加入液氮，迅速研磨，直到样品成细微的粉末状为止，取100 mg加入2 mL灭菌离心管中；加入500 μL 10% SDS裂解液和20 μL蛋白酶K（20 mg/mL），混匀，55℃水浴消化数小时，期间不停颠倒混匀，直至溶液透明；将消化后的组织裂解液加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒混匀，12000 rpm离心10 min，转移上清至一新离心管，重复1次；加入0.5倍体积的Tris饱和酚和0.5倍体积的氯仿/异戊醇（24:1），缓慢颠倒混匀，12000 rpm离心10 min，转移上清至一新离心管；加入0.1倍体积的乙酸钠溶液和2.5倍体积4℃预冷的无水乙醇，缓慢颠倒混匀，可见白色DNA絮状沉淀析出，-20 ℃沉淀 2 h；12000 rpm 离心5 min，加入500 μL 70%乙醇洗涤沉淀；室温下放置使残余乙醇完全挥发，加入100 μL TE缓冲液溶解DNA沉淀。
5.3.3 标准曲线样品制备
采用牛、羊、猪、鸡、鸭相应的标准品绘制种属特异性基因和16SrDNA内参基因的标准曲线。提取动物源性成分标准物质基因组DNA，用0.1×TE或水稀释梯度稀释，标准溶液至少涵盖5个动物源性成分浓度梯度。
5.3.4PCR反应
5.3.4.1 标准样品和试样实时荧光PCR反应
同时进行标准样品和试样的PCR反应，每个PCR反应设置3次平行。动物源性成分种属特异性基因实时荧光PCR反应按表2在PCR反应管中依次加入反应试剂，混匀；16SrDNA内参基因实时荧光PCR反应按表3在PCR反应管中依次加入反应试剂，混匀。将PCR管放在离心机上，500 g~3 000 g离心10 s，然后取出PCR管，放入PCR仪中。运行实时荧光PCR反应。反应程序为：95℃变性2 min；进行45次循环扩增反应（95℃变性15 s，60℃退火延伸1 min）；在第二阶段的退火延伸（60 ℃）时段收集荧光信号。
表2 动物源性成分种属特异性基因PCR反应体系
表3 16SrDNA内参基因PCR反应体系
5.3.4.2设置对照
应设置阴性对照和空白对照。以鲑鱼精子DNA作为阴性对照PCR反应体系的模板用纯水作为空白对照PCR反应体系的模板。各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与5.3.4.1相同。
5.3.5数据分析
5.3.5.1设定阈值
实时荧光PCR反应结束后，以PCR刚好进入指数期扩增来设置荧光信号阈值，并根据仪器噪声情况进行调整。设定阈值处，要求不同浓度梯度标准品的扩增曲线平行，而且同一样品的不同平行间重复性良好。
5.3.5.2记录Ct值
设定阈值后，荧光定量PCR仪的数据分析软件自动计算每个反应的Ct值，并记录。
5.3.5.3 绘制标准曲线
根据标准溶液的扩增Ct值和初始模板含量的对数间的线性关系，分别绘制动物源性成分种属特异性基因和16SrDNA内参基因的标准曲线。
标准曲线公式：
式中：
y—测试样品的Ct值；
a—标准曲线的斜率；
x—模板靶标浓度以10为底数的对数；
b—标准曲线的截距。
5.3.5.4数据可接受的标准
动物源性成分种属特异性基因阴性对照和空白对照的Ct值≥38；16SrDNA阴性对照和空白对照的16SrDNA内标基因Ct值≥38；标准曲线的R2≥0.98，标准曲线斜率≥-3.6且≤-3.1，满足上述条件，可以进行结果计算。否则重新进行实时荧光PCR扩增。
5.3.5.5含量计算
5.3.5.5.1 计算试样模板靶标浓度
将试样的动物源性成分种属特异性基因和16SrDNA内参基因的Ct值分别带入动物源性成分种属特异性基因和16SrDNA内参基因的标准曲线方程，计算动物源性成分种属特异性基因和16SrDNA内参基因的靶标浓度。
计算试样模板靶标浓度公式：
a b
y n -
=10(2)
式中：
n—模板靶标浓度
y—测试样品的Ct值；
a—标准曲线的斜率；
b—标准曲线的截距。
5.3.5.5.2 计算试样中动物源性成分种属特异性基因含量
将动物源性成分种属特异性基因的靶标浓度和16SrDNA内参基因的靶标浓度带入公式（3），计算出试样中动物源性成分种属特异性基因百分含量。计算试样中动物源性成分种属特异性基因百分含量的公式：
(3)
式中：
c—试样中动物源性成分种属特异性基因的百分含量(%)；
n OA-PRLP（Rd1、Sus-ACTB、Chk、Duc）—动物源性成分种属特异性基因靶标浓度；
n16SrDNA—内参基因16SrDNA浓度。
6 结果分析与表述
6.1 16SrDNA内参基因和动物源性种属特异性基因均出现典型扩增曲线，且16SrDNA内参基因和动物源性种属特异性基因的Ct值<36，表明样品中检出某动物源性成分。表述为“样品中检测出某动物源性成分，某动物源性成分含量为c”。
6.2 16SrDNA内参基因出现典型扩增曲线，且Ct值<36，动物源性种属特异性基因Ct值≥36或未出现典型扩增曲线，表明样品中未检出某动物源性成分。表述为“样品中未检测出某动物源性成分”。
6.3 16SrDNA内参基因和动物源性种属特异性基因出现典型扩增曲线，16SrDNA内参基因Ct值<36，动物源性种属特异性基因Ct值在36～38之间，应进行重复实验。如重复实验结果符合6.1-6.2的情况，依照6.1-6.2进行判断；如重复实验动物源性种属特异性基因出现典型扩增曲线，但Ct值仍在36～38之间，则判定样品检出某动物源性成分，表述为“样品中检测出某动物源性成分”。
6.4 16SrDNA内参基因和动物源性种属特异性基因未出现典型扩增曲线，或Ct值≥38，表明样品中未检出动物源性成分。表述为“样品中未检测出动物源性成分”。
6.5 16SrDNA内参基因和动物源性种属特异性基因出现典型扩增曲线，但Ct值均在36～38之间，应进行重复实验。如重复实验结果符合6.1- 6.4的情况，依照6.1- 6.4进行判断；如重复实验16SrDNA 内参基因和动物源性种属特异性基因出现典型扩增曲线，但Ct值仍在36～38之间，则判定样品检出某动物源性成分，表述为“样品中检测出某动物源性成分”。
附录A
（资料性附录）
A.1牛种属特异性基因实时荧光PCR扩增产物核苷酸序列
注：划线部分为Rd1-F和Rd1-R引物序列，方框内为探针Rd1-P序列。
A.2羊种属特异性基因实时荧光PCR扩增产物核苷酸序列
1 CCAACATGCC TTTAAACCCT CAAAAACCAT TGAGACTGGC GGGGAAGGAA AGGCAGCCAA 61 ACAGAGCGAG TCAGAAGGCT ACAGTTCC
注：划线部分为OA-F和OA-R引物序列，方框内为探针OA-P序列。
A.3猪种属特异性基因实时荧光PCR扩增产物核苷酸序列
1 GGAGTGTGTA TCCCGTAGGT GCACAGTAGG TCTGACGTGA CTCCCCGACC TGGGGTCCCC 61 AGCACACTTA GCCGTGTTCC TTGCACTCTC TGCATGTCCC CAG
注：划线部分为Sus-F和Sus-R引物序列，方框内为探针Sus-P序列。
A.4鸡种属特异性基因实时荧光PCR扩增产物核苷酸序列
1 CCCTCCTCCT TTCATCCTCA TTTCTATGAA TCCGGGCCTC ATATCCACGG TTCCGCTATG 61 AC
注：划线部分为Chk-F和Chk-R引物序列，方框内为探针Chk-P序列。
A.5鸭种属特异性基因实时荧光PCR扩增产物核苷酸序列
1 AAGCCTTCCT CTAGCTCAGC CGCTTAAACA ACGCAAAACT AAAGAATCCC ACTAATTAAG 61 ACTTAACTAA AGCATTTTCT
注：划线部分为Duck-F和Duck-R引物序列，方框内为探针Duck-P序列。
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附件4 食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR法 BJS 201904 1 范围 本方法规定了肉及肉制品中猪、驴、山羊、绵羊、牦牛、鼠源性成分检测的实时荧光PCR方法。 本方法适用于肉及肉制品中猪（Sus scrofa）、驴（Equus asinus）、山羊（Capra hircus）、绵羊（Ovis aries）、牦牛（Bos grunniens）、鼠源性成分的一种或多种成分同时定性检测。 注：本方法中鼠源性成分包括海狸鼠（Myocastor coypus）、小鼠（Mus musculus）、大鼠（Rattus norvegicus）、豚鼠（Cavia porcellus）和竹鼠（Rhizomy spruinosus）源性成分。 2原理 提取样品DNA，通过特异性引物探针进行动物源性成分的实时荧光PCR扩增，根据PCR 扩增反应中产物荧光信号及扩增曲线判定，实现对样品动物源性成分的定性分析。 3试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T 6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。 3.1检测用引物和探针 (a) 猪cytb基因检测用引物探针序列为： 5’端引物：5’-GCACTTTATCCTGCCATTCATCATT-3’ 3’端引物：5’-GTACAAGGATTAGTAGGATTAGT-3’ 探针：5’-FAM-CGCCCTCGCAGCCGTACATCTCCTA-BHQ1-3’ (b) 驴nad5基因检测用引物探针序列为： 5’端引物：5’-GCTAGCCTCATTATCAGTAT-3’ 3’端引物：5’-GTGATGAGGATACGTGCT-3’ 探针：5’-FAM-TCATATCATCAATCCTCAACACCCACA-BHQ1-3’ (c) 山羊cytb基因检测用引物探针序列为： 5’端引物：5’-CTTTATCCTCCCATTCATCATCA-3’ 3’端引物：5’-GAATTCCTGTGGGGTTGTTC-3’ 探针：5’-FAM-GCTCTCGCCATAGTCCACCTGCTTTTC-BHQ1-3’ (d) 绵羊cytb基因检测用引物探针序列为： 5’端引物：5’-CTCATGCTACTAGTACTATTTACG-3’
行业标准《出口动物源性食品中动物种类的定性检测T-RFLP方法》 编制说明 一、任务来源 根据国家认证认可监督管理委员会2009年《关于下达2009年度出入境检验检疫行业标准制（修）订计划的通知》下达的编写任务通知（计划编号2009B134），由北京出入境检验检疫局负责《出口动物源性食品中动物种类的定性检测T-RFLP方法》的起草工作。 本标准是按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构与编写规则》的要求进行编写的。 二、标准编制的目的和意义 随着人们生活水平的提高和生活节奏的加快，人们对禽、肉、鱼等食品及其加工食品（如香肠、罐头等）的需求也在不断增加。对于一些凭肉眼难以辨认其来源的动物源性食品（尤其是经过加工的食品），某些商家在经济利益的驱使下，常常用比较廉价的动物品种替代比较昂贵的动物品种。现存比较常见的商业欺诈行为之一就是乱贴标签，标签上标明的原料成分与实际使用的原料成分不符。这种行为不仅损害了消费者的经济利益和健康，而且还有可能打乱正常的市场竞争秩序。 为了更好地保护消费者的身体健康，维护消费者的经济利益，也考虑到宗教信仰问题，世界各国都对食品标签的内容做了严格的规定。例如，在新加坡市场上，食品标签必须包括食品的品名（或对食品真实性的描述用语）和食品的成分，当食品由两种或多种成分构成时，对每一种成分应按它们的重量或所占比例给予恰当说明，其顺序应按照他们占有的重量百分比递减标示。我国的《预包装食品标签通则》（GB7718-2004）也对食品标签的具体内容作了明确规定。国家质检总局于早在2000年就颁布了《中华人民共和国进出口食品标签管理办法》。该办法第二章标签审核的第十一条明确规定“进出口食品标签审核的内容包括：标签的格式、版面以及标注的与质量有关的内容是否真实、准确”。对于乱贴标签现象，世界各国也在相关法规中作出明确规定。如瑞士《食品条例》(Food Ordinance)的第十九章中要求食品标签不允许欺骗消费者。我国的《预包装食品标签通则》（GB7718-2004）中也明确规定“食品标签的所有内容，不得以错误的、引起误解的或欺骗性的方式描述或介绍食品”。 法规已经明确规定食品必须加贴标签，而且食品标签不允许欺骗消费者。贯彻执行这类法规的条件之一就是食品监管机构必须具有判断食品标签是否存在欺诈行为的能力。对于动物源性食品而言，一个重要的判断依据就是检测其标签上标明的动物种类是否与实际使用的动物种类相符，即进行动物种类鉴定。因此，开展动物源性食品中动物种类鉴定方法的研究对于更好地保障我国进出口食品的质量和安全、加强对国内动物源性食品市场和生产企业的监管，从而保护消费者的切身利益具有重要意义。 目前，我国已颁布的与动物种类鉴定有关的国家标准和行业标准有： 1）GB/T 20190-2006 饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应（PCR）法2）GB/T 21101-2007 动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法PCR方法 3）GB/T 21102-2007 动物源性饲料中兔源性成分定性检测方法实时荧光PCR法 4）GB/T 21103-2007动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法实时荧光PCR
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910257118.5 (22)申请日 2019.04.01 (71)申请人 陕西科技大学 地址 710021 陕西省西安市未央区大学园1 号 (72)发明人 徐秦峰 澹台玮 马西亚 (74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任 公司 61200 代理人 范巍 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法及试 剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种鉴别动物源性成分的多 重荧光PCR方法及试剂盒：提取样品中的DNA作为 模板，利用设计的多对物种特异性引物，进行多 重PCR扩增，对多重PCR扩增的产物进行高分辨熔 解曲线分析，根据扩增产物熔解峰的位置判别样 品中所含的动物源性成分。本发明操作简单、检 测周期短、特异性强、检测结果可靠，可以避免开 管造成污染问题以及实现大规模样品的检测。 权利要求书2页 说明书6页序列表2页 附图2页CN 109868321 A 2019.06.11 C N 109868321 A
权 利 要 求 书1/2页CN 109868321 A 1.一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：包括以下步骤： 1)根据样品中的不同动物源性成分的可能掺入情况，确定需要鉴别的各动物源性成分所对应的动物种类，根据确定的动物种类，设计用于扩增对应动物种类的基因组中某段特异性序列的扩增引物； 2)对步骤1)设计的针对不同动物种类的扩增引物进行多重PCR扩增及扩增产物熔解的特异性检验； 3)以提取自所述样品中的DNA为模板，利用经过检验确定的针对不同动物种类的特异性扩增引物进行多重PCR扩增，对扩增得到的产物进行高分辨熔解并获取高分辨熔解曲线，将该高分辨熔解曲线与以各动物种类基因组DNA为模板并采用所述特异性扩增引物扩增得到的对应产物的高分辨熔解曲线进行比对，根据比对匹配的熔解峰位置确定所述样品中动物源性成分的构成情况。 2.根据权利要求1所述一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述步骤1)中，扩增引物扩增的目的片段在200bp以下，扩增的目的片段位于对应动物种类基因组的特异性保守区域，不同动物种类对应的扩增产物在长度和/或GC比值上存在区别。 3.根据权利要求1所述一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述步骤3)中，经过检验确定的特异性扩增引物选自针对山羊的引物对P1、针对绵羊的引物对P2、针对牛的引物对P3、针对水牛的引物对P4中的两对以上引物；其中，引物对P1的序列为：上游引物：5'-GCGGGCAGGGCGGCGGGGGCGGGGCCCACCAAAATTCAACACAATAC CACAT-3' 下游引物：5'-GCGGGCGCCGCCCTGCCCGCAGCGTTATCTTTGTAATAGGTTTTGT-3'引物对P2的序列为： 上游引物：5'-CGTAGATGTAGTATGACTTTTCCT-3' 下游引物：5'-GTGAAGTTAGTTAGGAGAGTAATTATA-3' 引物对P3的序列为： 上游引物：5'-GTTAACAGCTAAACACCCTAGCT-3' 下游引物：5'-AGGTTTGACTCCTCTTTTTACCAA-3' 引物对P4的序列为： 上游引物：5'-CCAAAATTTAACACAATCCCGCAA-3' 下游引物：5'-CATTGGTCGTGGTTGAATTCCA-3'。 4.根据权利要求3所述一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述多重PCR扩增的反应体系包括DNA模板、引物对P1、P2、P3和P4、PCR反应试剂、双蒸水以及荧光染料。 5.根据权利要求1所述一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述高分辨熔解的程序为：将多重PCR扩增的产物在闭管条件下从65℃开始逐渐升温至95℃，同时连续检测荧光强度。 6.根据权利要求1所述一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述样品采集自乳制品或生乳。 7.一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于：包括针对不同动物种类的特异性扩增引物、PCR反应试剂、荧光染料、双蒸水以及对照品对应的高分辨熔解曲线。 8.根据权利要求7所述一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所 2
ICS 67.050 B 45 DB12 鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测 实时荧光PCR 法 Quantitative PCR method for animal derived materials in meat and meat products 天津市市场和质量监督管理委员会发布
前言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由天津市农村工作委员会提出。 本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市东丽区产品质量监督检验所。本标准主要起草人：赵新、易萌、刘娜、兰青阔、刘雪岩、陈锐、朱珠、王成、徐石勇。 本标准2016年9月首次发布。
鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测 实时荧光PCR法 1 范围 本标准规定了鲜冻畜、禽肉中动物源性成分（包括牛、羊、猪、鸡、鸭等）的定量PCR检测方法的术语和定义、检测方法、结果计算。 本标准适用于生鲜、冷冻畜禽肉中动物源性成分的定量PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光PCR real time PCR 实时荧光PCR是指PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，对未知模板进行定性或定量分析。 3.2 Ct值cycle time 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 3.3 内参基因reference gene 能够同时检测出多种动物源性成分的基因（包括牛、羊、猪、鸡、鸭等）。 3.4 牛源性成分bovine-derived materials 牛种属特异性DNA片段。 3.5 羊源性成分ovine-derived materials 羊种属特异性DNA片段。 3.6 猪源性成分porcine-derived materials 猪种属特异性DNA片段。 3.7 鸡源性成分chicken-derived materials 鸡种属特异性DNA片段。 3.8 鸭源性成分duck-derived materials 鸭种属特异性DNA片段。
附件3：2014年反刍动物饲料中牛羊源性成 分 例行监测计划 为打击在反刍动物饲料中添加牛羊源性成分的违法行为，切断“疯牛病”通过饲料的传播途径，确保反刍动物生产安全，根据农业部的统一安排，2014年我省继续组织对牛羊养殖和反刍动物饲料生产比较集中的饲料生产、经营企业和牛羊养殖场（户）进行牛羊源性成分例行监测。 一、监测范围 全省各市、县（市、区）。 二、监测对象 生产、经营、使用反刍动物饲料和动物源性饲料的企业以及牛羊养殖场（户）。 三、监测的产品种类和检查内容 ⒈反刍动物饲料产品：包括商品预混合饲料、精料补充料、浓缩饲料和养殖场（户）自配饲料。 ⒉动物源性饲料产品：包括进口和国产鱼粉、猪肉粉、禽肉粉、羽毛粉和虾粉。 ⒊对饲料生产、经营企业和牛羊养殖场（户）储存、销售、使用的商品反刍动物饲料和动物源性饲料产品的标签进行检查。
四、监测项目 标签、牛源性成分、羊源性成分。 五、标签检查 承担下半年监测任务的大同市、忻州市、阳泉市、长治市、吕梁市，除提供与样品一致的标签外，每个市须采集2个（每个企业只限抽1个标签）饲料生产企业的产品标签及对应的标准复印件（产品标准采用国家标准和行业标准的不用提供）。 六、抽检依据 ⒈抽样要求 按照《饲料采样》（GB/T14699.1-2005）执行。有证据证明在牛羊饲料中添加使用了乳及乳制品的，不予抽样。 ⒉检测方法 由质检机构根据农业部的规定执行。 七、判定依据和原则 由质检机构根据农业部的规定办理。 八、监测任务分配（见表3） 表3：反刍动物饲料中牛羊源成分例行监测任务分配表
注：1、该样品可从生产、经营、使用反刍动物饲料和动物源性饲料的企业及牛羊养殖场（户）抽样。 2、反刍动物饲料产品包括商品预混合饲料、精料补充料、浓缩饲料、和养殖场（户）自配料。 3、动物源性饲料产品包括进口和国产鱼粉、猪肉粉、禽肉粉、羽毛粉、虾粉。
饲料中动物源性成分检测技术研究进展 摘要: 饲料安全与动物生产、环境污染和人类健康密切相关。动物废弃物进入饲料行业曾经弥补了蛋白质饲料不足的缺口,但却带来了新的问题。饲料中动物源性成分的定性或定量检测技术已成为国内外的研究热点，适用于各种样品、基于各种原理的方法和技术被开发出来。本文以组织学特征为基础的显微镜分析方法、以蛋白质和DNA为基础的免疫学和PCR分析方法、高效液相色谱法和近红外光谱法在动物源性饲料组分中的研究应用进展等方面做了综述,并对其发展趋势进行讨论。 饲料安全已与动物生产、环境污染和人类健康 密切相关。动物源性副产品因富含蛋白质、钙、磷等 营养成分而被应用于畜禽饲料中, 但现有的证据表 明, 在动物饲料中添加未经加热处理牛源性饲料或 感染过痒病因子的牛( 羊) 肉/ 肉骨粉( MBM) 后能够 引发和传播疯牛病( BSE)。 我国于1999、2001和2004年先后 下发了关于对动物源性饲料生产和管理的相关条例, 主要对反刍动物源性饲料组分、MBM、肉粉、骨 粉、血粉、动物内脏干粉和动物废弃物等使用做了严 格的规定。目前关于饲料中动物源性成分检测主要 以样品的组织学特性和品种特异性的生物标记物 ( 如蛋白质、DNA和其他生物大分子等) 为对象, 其 中PCR技术发展迅速, 已逐步被世界各国采用。但 由于动物源性饲料组成上的复杂性, 单一的PCR技 术仍不能克服耗时、效率低和假阳性等问题。因此, 研究并建立一种( 套) 快速、灵敏、可靠的动物源性饲 料检测技术, 对于提高饲料质量、防止饲料掺假、控 制进口饲料安全和制订相关饲料法规等均具有重要 意义。 本文中动物源性成分 是指动物组织以及蛋和奶，包括肉类及其制品(含动物 脏器)、水生动物产品等，检测技术是指上述成分中蛋 白质和DNA等具有种间特异性物质的物种鉴定和含量分 析技术。该技术已成为保护消费者权益和安全的重要技 术手段。 动物源性成分检测技术通常建立在对样品蛋白质、 DNA、脂肪酸等分子结构、序列或组成特异性分析的 基础上。涉及的技术手段包括酶联免疫、聚合酶链式
ICS65.120 B 46 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 2742—2017 饲料中动物源性成分—貂源性组织成分定 性检测方法PCR方法 Animal derived ingredients in Feed - qualitative detection of mink tissue derived ingredients with PCR method 2017-02-23发布2017-03-23实施
前言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。 本标准由辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心提出。 本标准由辽宁省质量技术监督局归口。 本标准起草单位：辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心。 本标准主要起草人：李欣南、韩镌竹、许彬、李洪伟、高红倩、韩春晓、高铎、武凤娇、董娜。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
饲料中动物源性成分—貂源性组织成分定性检测方法PCR方法 1 范围 本标准规定了检测饲料中貂源组织成分的聚合酶链式反应检测方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料中貂源性成分的检测。 本方法的貂源性成分检测限为0.5 %（w/w）。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T19495转基因产品检测 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 SN/T1193基因检验实验室技术要求 3 原理 利用氯仿抽提法或使用等效的基因组DNA提取试剂盒提取DNA，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；PCR产物用限制性内切酶酶切后电泳和测序进行确证。 4 试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂；实验用水为灭菌双重蒸馏水；所有实验室使用的试剂等级应为不含DNA和DNA酶的分析纯试剂，试剂的选购、验收、储存应符合规定。 4.1 引物 根据Primer 6软件设计，貂源性成分扩增产物为622bp，检测用引物（对）序列为： F：5’- TTAGTAGCTCATAACGCCTTG -3’ R：5’- CGTGAGTATGTTCTTGGTTAG -3’ 根据合成引物的标示浓度，用双重蒸馏水配制成10μM。 4.2 BstXⅠ限制性内切酶。 4.3 PCR Master mix（或DNA聚合酶、dNTP等PCR用试剂）。 4.4 基因组DNA提取试剂盒或其他替代试剂。 4.5 裂解缓冲液：250mmol/L SDS，使用前加入蛋白酶K至100mg/mL。
动物源性医疗器械注册技术审查指导原则(2017年修订版)
附件 动物源性医疗器械注册技术审查指导原则 （2017年修订版） 本指导原则旨在指导注册申请人对动物源性医疗器械的注册申报资料进行准备。某些医疗器械可能含有动物来源的材料，这些材料是多种多样的，可以构成该器械的主要部件（例如牛/猪源心脏瓣膜、羊肠缝合线、止血材料等）、涂层或者浸渗剂（例如肝素、明胶、胶原等），也可成为生产过程中所用的辅助材料（例如牛脂等）。动物组织及其衍生物的使用可能会比非生物来源的材料（例如金属、塑料以及织物等）使医疗器械具有更好的性能，但是在另一方面，它们应用到人体则又会增加病毒传播和免疫原性等方面的安全风险，且存在材料表征上的困难，因此对于动物源性医疗器械安全性的评价，需要考虑比常规医疗器械更多方面的内容。如果注册申请人在准备医疗器械注册申报资料时有上述考虑，将有助于更加充分、科学地评价医疗器械产品的风险受益比。 本指导原则是在注册申报资料中有关的技术性文件（研究资料、风险分析资料、产品技术要求及产品说明书）满足一般性要求的基础上，针对动物源性医疗器械产品的特点提出的需特别关注和增加论述的内容要求。此外，注册申请人还应按照《医疗器械注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第4号）、《医疗器械说明书和标签管理规定》（国家食品药品监督管理总局令第6号）、《关于公布医疗器械注册申报资料要求和批准证明文件
格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告2014年第43号）以及总局发布的其他相关文件要求并参考YY/T 0771/ISO 22442系列标准等技术性文件提交注册申报资料。注册申请人应当依据具体产品的特性确定其中的具体内容是否适用。若不适用，应详细阐述其理由及相应的科学依据。注册申请人还应依据具体产品的特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是对注册申请人和医疗器械相关管理部门技术审评人员的指导性文件，不限制相关管理部门对该类产品的技术审评以及注册申请人对注册申报资料的准备工作。本指导原则不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行。如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将进行适时的调整。 本指导原则为2009年发布的《动物源性医疗器械产品注册申报资料指导原则》的修订版。主要修订内容包括：根据《医疗器械监督管理条例》及配套规章调整了指导原则的结构、各级标题和相关内容；增加了动物源性医疗器械免疫原性研究、评价与控制的原则；细化了动物源性医疗器械病毒灭活/去除有效性验证的原则并将之由正文调整至附录；调整了病毒灭活/去除工艺有效性判断的标准等。 一、适用范围 本指导原则适用于全部或部分采用动物组织制成的或取材