第六章离子交换分离技术
1.离子交换法是应用离子交换剂作为吸附剂通过静电引力吸附在离子交换器上，然后用洗脱剂洗脱下来从而达到分离、浓缩、纯化的目的。现已广泛应用于生物分离过程在原料液脱色、除臭、目标产物的提取，浓缩和粗分离等方面发挥着重要作用。
2.离子交换法要使用离子交换剂，常用的离子交换剂有两种：
使用人工高聚物作载体的离子交换树脂
是使用多糖做载体的多糖基离子交换剂
3.离子交换树脂是一种不溶于酸、碱和有机溶剂的固态高分子聚合物。
4.离子交换树脂的构成：载体或骨架：功能基团；平衡离子或可交换离子
5.离子交换反应是可逆的，符合质量作用定律
6.离子交换树脂按照活性离子的分类
树脂活性离子带正电荷，可与溶液中的阳离子发生交换，称为阳离子交换树脂
树脂活性离子带负电荷，可以溶液中的阴离子发生交换，称为阴离子离子交换树脂
7.离子交换树脂分离纯化物质主要通过选择性吸附（进行吸附时具有较强的结合力）和分步洗脱这两个过程来实现
8.强酸性阳离子交换树脂洗脱顺序：酸性<中性<碱性
9.离子交换树脂的分类方法有4种
按树脂骨架的主要成分分：聚苯乙烯型树脂；聚苯烯酸型树脂；多乙烯多氨-环氧氯苯烷树脂；酚-醛型树脂；
按骨架的物理结构来分：凝胶型树脂（微孔树脂，呈透明状态，高分子骨架）；大网格树脂（大树树脂，填充剂）；均孔树脂（等孔树脂）；
按活性基团分类：阳离子交换树脂，对阳离子具有交换能力
强酸性阳离子交换树脂：活性基团为硫酸基团（-SO3H）和次甲酸磺酸基团（-CH2SO3H）。都是强酸性基团能在溶液中解离出H+。
弱酸性阳离子交换树脂：活性基团由羧基（-COOH）和酚羟基（-OH），交换能力差。
阴离子交换树脂：活性基团为碱性，对阴离子具有交换能力
强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铵基团（-NR3OH），能在水中解离出OH-而呈碱性
弱碱性阴离子交换树脂：伯氨基（-NH2）仲氨基（-NHR）或叔氨基（-NR2），能在水中解离出OH-，但解离能力较弱，交换能力差
以上4种树脂是树脂的基本类型，各种树脂的强弱最好用其活性基团的pK来表示
11.大孔型离子交换树脂的特点
载体骨架交联度高，有较好的化学和物理稳定性和机械强度
孔径大
表面积大，表面吸附强
孔隙率大，密度小
12.离子交换树脂的命名由3位阿拉伯数字组成：第一位数字代表产品的分类，第二位数字代表骨架，第三位数字微顺序号
13.离子交换树脂的理化性能：交联度；交换容量；粒度和形状（色谱用50到100目树脂，一般提取纯化用20到60目树脂）；滴定曲线（是检验和测定离子交换树脂性能的重要数据）；稳定性；膨胀性（膨胀度）
14.交换容量（名解）：是每克干燥的离子交换树脂或每毫升完全溶胀的离子交换树脂所能吸附的一价离子的毫摩尔数。
15.离子交换选择性
离子化合价（离子交换树脂总是优先吸附高价离子，阳离子的被吸附顺序为：Fe3+>AI3+>Ca2+>Mg2+>Na+；阴离子的被吸附顺序为：柠檬酸根>硫酸根>硝酸根）
离子的水化半径
溶液浓度，在稀溶液中比较大
离子强度（尽可能采用低离子强度）
溶液的pH
树脂与离子间的辅助力
有机溶剂的影响
树脂物理结构的影响
16.离子交换速度的影响因素
数值力度，树脂的交联度，溶液流速，离子的化合价，离子浓度，温度，离子的大小（小离子的交换速度比较快）
17.对阴离子交换树脂的选择
一般根据被分离物质所带的电荷来决定选用哪种树脂?
如果被分离物质带正电荷，应采用阳离子交换树脂；被分离物质带负电荷，应采用阴离子交换树脂
对离子交换树脂强弱的选择
当目的物具有较强的碱性和酸性时，宜选用弱酸性或弱碱性的树脂以提高选择性并便于洗脱；如果目的物是弱酸性或弱碱性的小分子物质时，往往选用强碱性或强酸性树脂，以保证有足够的结合力，便于分部洗脱。对于大多数蛋白质酶和其他生物大分子的分离多采用弱碱或弱酸性树脂，以减少生物大分子的变性有利于洗脱并提高选择性。
对离子交换树脂型的选择
使用弱酸或弱碱性数值分离物质时，不能使用H或OH型，因为这两种交换剂分别对这两种离子具有很大的亲和力，不容易被其他物质所代替，应选用钠型或氯型
18.离子交换树脂操作条件的选择
交换时的pH：合适的ph应具备三个条件：ph应在产物的稳定范围内；能使产物离子化；能使树脂解离
溶液中产物的浓度
洗脱条件
19.再生（名解）：让使用过的树脂重新获得使用性能的处理过程
20.阳离子树脂受有机物污染时可用处理再生溶液：10%NACI+2%~5%NaOH混合溶液
21.阴离子树脂可在1mol/L HCI中保存，阳离子在1mol/L NaOH中保存
22.离子交换的操作方式
静态操作：静态交换是将树脂与交换溶液混合置一定的容器中搅拌进行。
静态法操作简单、设备要求低，是分批进行
动态操作：是先将树脂装柱。交换溶液以平流方式通过柱床进行交换。该法不需要搅拌、交换完全、操作连续。适合多组分分离
23.葡聚糖凝胶的分离是根据分子量不同。能大量引入活性基团而骨架不被破坏，交换容量很大，是离子交换纤维素的3-4倍，外形呈球形，装柱后，流动相在柱内流动的阻力较小，流速理想，最适用于大分子的分离纯化。
24.离子交换葡聚糖命名时将活性基团写在前面，然后写骨架Sephadex，最后写原骨架的编号。葡聚糖凝胶G-25（Sephadex G-25）孔径最小
25.普通的井水，自来水等都是含Ca2+、Mg2+的硬水。利用钠型磺酸树脂除去水中的Ca2+、Mg2+等碱金属离子后即可制得软水。
26.一级交换：原水经过阴、阳树脂一次的交换
27.抗生素是发酵行业的一大类产品，利用离子交换树脂可以选择性吸附分离多种离子型抗生素，不仅回收率高，而且得到的产品纯度较好。
28.洗脱：离子交换完成后将树脂弱吸附的物质释放出来重新转入溶液的过程
实验报告 课程名称：生物化学实验（甲） 指导老师： 成绩：__________________ 同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶 一、实验目的和要求： 1、学习离子交换层析的基本原理； 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术； 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。 二、实验内容和原理： 1、离子交换层析（Ion Exchange Chromatography 简称为IEC ） 离子交换层析是常用的层析方法之一。它是以离子交换剂为固定相，根据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换剂与流动相中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH 值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH 改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。 离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。 基质————电荷基团————反离子 专业： 姓名： 学号： 日期： 地点： 装 订 线 溶液中的离子或离子化合物
阳离子交换剂基质—+ 《==可逆交换==》+ 阴离子交换剂基质+ —《==可逆交换==》— 由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。 2、酶活力检测(定性检测） 蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，如采用3.5－二硝基水杨酸法，其原理是 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。 本实验在离子交换层析分离纯化的过程中，对分离纯化样品采用 3.5－二硝基水杨酸法来初步判定样品中还原糖含量的多少，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。 三、实验材料与试剂：
水的深度处理工艺综述 人类对膜的认识是从自然界中存在的膜开始的，到现在，各种人工合成膜已成为了我们生活中不可或缺的一部分。其种类繁多，作用也千差万别，但他们具有一个共同的特点-选择透过性。 水的膜技术的应用开始于20世纪60年代，最早使用反渗透膜进行海水淡化。其后膜技术得到了迅速发展，并被众多领域应用。自用于反渗透脱盐后，又开发出纳滤、超滤和微滤技术，这些不同的膜都有其独特的性能，可满足不同的处理要求。 1定义 膜从广义上可以定义为两相之间的一个具有选择透过性的薄层屏障。 膜分离是指在某种推动力作用下，利用膜的选择透过性能，达到分类混合物（如溶液）中离子、分子以及某些微粒的过程。与传统过滤器的最大不同是，膜可以在离子或分子范围内进行分离，并且该过程是一种物理过程，不需发生相变化和添加助剂。在某种推动力的作用下，利用某种隔膜特定的透过性能，使溶质或溶剂分离的方法，称为膜分离。 膜分离是用天然或人工合成膜，以外界能量或化学位差作推动力，对双组份或多组分溶质和溶剂进行分离、分级、提纯和富集的方法。膜分离可以用于液相和气相分离，可以用于水溶液体系、非水溶液体系、水溶胶体系以及含有其他微粒的水溶液体系等。 分离溶质时一般叫渗析，分离溶剂时一般叫渗透。 2分类与特点 膜可以是固态的，也可以是液体甚至是气态的。膜可以是均相的或非均相的，对称的或非对称的，可以是带电的或中性的，而带电膜又可以是带正电或带负电的，或二者兼而有之。膜可以是具有渗透性的，也可以是具有半渗透性的，但不能是完全不透过性的。目前使用的分离膜绝大多数是固相膜。由于膜材料的种类非常丰富，制备条件也多种多样，一般来说膜的分类有以下几种： （1）按分离机理：反应膜、离子交换膜、渗透膜等； （2）按膜的形态：均质膜和非对称膜；
离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。 （一）原理 在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素。在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy，CM）纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），其反离子为阳离子（如Na+等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。 溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异，以白蛋白为最多，依次为球蛋白，球蛋白和球蛋白。 在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。 交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl）都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。当Cl一的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl一浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。因此，在离子交换层析中，一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值。 （二）常用离子交换剂的种类与特性 1.离子交换纤维素离子交换纤维素的种类很多，其种类与特性如表1－1所示。 表1-1 离子交换剂的类型与特点
第六章离子交换分离技术 1.离子交换法是应用离子交换剂作为吸附剂通过静电引力吸附在离子交换器上，然后用洗脱剂洗脱下来从而达到分离、浓缩、纯化的目的。现已广泛应用于生物分离过程在原料液脱色、除臭、目标产物的提取，浓缩和粗分离等方面发挥着重要作用。 2.离子交换法要使用离子交换剂，常用的离子交换剂有两种： 使用人工高聚物作载体的离子交换树脂 是使用多糖做载体的多糖基离子交换剂 3.离子交换树脂是一种不溶于酸、碱和有机溶剂的固态高分子聚合物。 4.离子交换树脂的构成：载体或骨架：功能基团；平衡离子或可交换离子 5.离子交换反应是可逆的，符合质量作用定律 6.离子交换树脂按照活性离子的分类 树脂活性离子带正电荷，可与溶液中的阳离子发生交换，称为阳离子交换树脂 树脂活性离子带负电荷，可以溶液中的阴离子发生交换，称为阴离子离子交换树脂 7.离子交换树脂分离纯化物质主要通过选择性吸附（进行吸附时具有较强的结合力）和分步洗脱这两个过程来实现 8.强酸性阳离子交换树脂洗脱顺序：酸性<中性<碱性 9.离子交换树脂的分类方法有4种 按树脂骨架的主要成分分：聚苯乙烯型树脂；聚苯烯酸型树脂；多乙烯多氨-环氧氯苯烷树脂；酚-醛型树脂； 按骨架的物理结构来分：凝胶型树脂（微孔树脂，呈透明状态，高分子骨架）；大网格树脂（大树树脂，填充剂）；均孔树脂（等孔树脂）； 按活性基团分类：阳离子交换树脂，对阳离子具有交换能力 强酸性阳离子交换树脂：活性基团为硫酸基团（-SO3H）和次甲酸磺酸基团（-CH2SO3H）。都是强酸性基团能在溶液中解离出H+。 弱酸性阳离子交换树脂：活性基团由羧基（-COOH）和酚羟基（-OH），交换能力差。
1.简述分离技术的分类及其分离原理？ （一）机械分离对象是由两相或两相以上所组成的混合物，其目的是简单地将各相加以分离，过程中间不涉及传质过程。 名称分离因子分离原理举例 沉降重力密度差水处理 离心离心力密度差油精制、牛乳脱脂 旋风分离惯性流动力密度差喷雾干燥 过滤过滤介质粒子大小除菌、喷雾干燥/果汁澄清、 颗粒分离 压榨机械力压力下液体流动油脂生产 （二）传质分离是指在分离过程中，有物质传递过程的发生，传质分离的原料，可以是均相体系，也可以是非均相体系。分为两大类：平衡分离过程和速率控制分离过程1平衡分离过程为借助分离媒介（如热能、溶剂、吸附剂等）使均相混合物系统变为两相系统，再以混合物中各组分在处于相平衡的两相中不等同的分配为依据而实现分离。2速率控制分离过程是指借助某种推动力，如浓度差、压力差、温度差、电位差等的作用，某些情况下在选择性透过膜的配合下，利用各组分扩散速度的差异而实现混合物的分离操作。分为膜分离和场分离（三）其他物理场辅助分离技术1.超声波萃取 2.微波辅助萃取 3.超声微波协同萃取 2食品为什么要分离？1获得需要的产品①农作物中非食用物质与食用物质的分离。②多层次、多样化产品的需求。2食品安全性的要求①农药残留。②工业“三废”进入食物链危害人体健康。③天然食品在生长过程中次生代谢产生多种微量的有毒成分。 3食品分离过程的特点:分离对象种类多，性质复杂。产品质量与分离过程密切相关。产品要求食用安全。分离对象在分离过程中易腐败。 4食品分离技术的选择原则：先要确定分离的目的，了解待分离混合物中各组分的物理，化学，生物学方面的性质，并要充分关注分离的目标成分。对目标成分，要了解目标成分的性质，它的相对分子质量，化学结构，理化性质，电荷性，热敏性以及生物活性等基础性资料对确定分离方法的选择起决定性作用。 5食品分离技术的考虑因素:产品纯度，回收率（主要）产品价格目标产物的特性混合物中的分子性质经济因素安全与环保 6食品分离技术在食品工业中的地位与作用 1. 是重要的食品工艺过程之一2. 提高农作物综合利用程度，生产高附加值的产品。3.改进食品的营养与风味。4. 符合卫生，安全要求。5. 改变生产面貌。 膜分离技术 1按膜的性质分：⒈天然膜⒉合成膜.按膜的结构分：⒈多孔膜⒉致密膜 3.液膜.按膜的作用机理分：1.吸附性膜2.扩散性膜 3.离子交换膜4.选择渗透膜5.非选择性膜 2膜分离技术的原理:膜分离概念：用天然的或人工合成的膜，以外加压力或化学位差为推动力，对双组分或多组分的溶质和溶剂进行分离，分级，提纯或富集的方法，统称膜分离法。 3膜分离技术特点:在常温下进行,不发生相变化,能耗低,在密闭容器中进行,不用添加化学试剂、添加剂,选择性好,使用范围广,操作简便，易自动化操作 4膜分离的特点1.不发生相变，能耗低。2.一般在常温下操作不需加热，适应于热敏性物质 3.应用范围广。4.以压力为推动力，装置简单、体积小、操作容易、
实验二离子交换层析纯化兔血清IgG 【原理】 DEAE-Sephadex A-50 （二乙氨基- 乙基- 葡萄糖凝胶A-50 ）为弱碱性阴离子交换剂。用NaOH 将Cl - 型转变为OH - 型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ 球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85 ～7.5 ），其余均属酸性蛋白。pH7.2 ～7.4 的环境中。酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50 吸附，只有γ 球蛋白便可在洗脱液中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG 。 【试剂与器材】 1. DEAE-Sephadex A-50 2.0.5mol/L HCl 和NaOH 3.0.1mol/L pH7.4 PBS 4.0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4)
5.0.02 ％NaN 3 6.PEG 7. 无水乙醇 8. 紫外分光光度计 9.1cm×20cm 玻璃层析柱 10. 自动部分收集器 【操作步骤】 1 ．DEAE-Sephadex A-50 预处理称DEAE-Sephadex A-50 （下称A-50 ）5g ，悬于500ml 蒸馏水内，1h 后倾去上层细粒。按每克A-50 加0.5mol/L NaOH 15ml 的比例，将浸泡于0.5mol/L NaOH 液中，搅匀，静置30min ，装入布氏漏斗（垫有 2 层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH 呈中性；再以0.5mol/L HCl 同上操作过程处理，最后以0.5mol/L NaOH 再处理一次，处理完后，将A-50 浸泡于0.1mol/L pH7.4 PBS 中过夜。
2 ．装柱 （ 1 ）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。 （2 ）将0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 沿玻璃棒倒入柱中至1/4 高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50 。待A-50 凝胶沉降2 ～3cm 高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min ，同时连续倒入糊状A-50 凝胶至所需高度。 （ 3 ）关闭出水口，待A-50 凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。 3 ．平衡启开出水口螺旋夹，控制流速 4 滴/min ，使约2 倍床体积的洗脱液流出。并以pH 计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH 值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。 4 ．加样及洗脱启开上口橡皮塞及下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（0.5ml 血清，体积应小于床体积的2% ，蛋白浓度以＜100mg 为宜）。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面
离子交换层析分离氨基酸 [目的] 1．熟悉离子交换层析技术的基本原理和方法 2．熟悉离子交换层析分离氨基酸的基本原理和操作 [原理] 氨基酸是两性电解质，不同的氨基酸有其特定的等电点，在溶液pH小于其pI值时带正电，大于其pI时带负电。故在一定的pH条件下，各种氨基酸的带电情况不同，与离子交换剂上的交换基团的亲和力亦不同。因而得到分离。本实验选用Dowex 50作为离子交换剂，它是含磺酸基团的强酸型阳离子交换剂，分离的样品为Asp、Gly、His三种氨基酸的混合液，这三种氨基酸分别属于酸性氨基酸、中性氨基酸和碱性氨基酸，它们在pH4.2的缓冲液中分别带负电荷和不同量的正电荷，与Dowex 50的磺酸基团之间的亲和力不同，因此被洗脱下来的顺序亦不同，可以将三种不同的氨基酸分离开来，将各收集管分别用茚三酮显色鉴定。 [操作] 1．装柱前准备：用流水冲洗层析柱、然后用蒸馏水冲洗，柱流水口装上橡皮管放入2-3ml蒸馏水，按压橡皮管内气泡，抬高流出管防止蒸馏水排空。 2．装柱：将处理好的Dowex 50悬液小心倒入层析柱内，待Dowex 50自然下沉至柱下部时，打开下端放出液体，再慢慢加入悬液至Dowex 50沉积面离层析柱上缘约3cm 时停止。装柱时注意防止液面低于交换树脂平面以及气泡的产生。 3．平衡：用pH4.2的柠檬酸钠缓冲液反复加在柱床上面，平衡10分钟，最后接通蠕动泵，调节流速1ml/min。 4．加样：柱内缓冲液的液面与树脂平面相平，但勿使树脂露出液面，马上用滴管加7滴样品在树脂平面上（注意不能使树脂平面破坏），然后加少量缓冲液使样品进入柱内，反复两次，当样品完全进入树脂床后，接通蠕动泵，用PH4.2的柠檬酸钠缓冲液洗脱，分步收集器收集。 5.收集与检测：取12支试管编号，每管加入茚三酮显色液20滴，依次收集洗脱液每管2m1，混匀，置沸水浴15分钟取出，观色，用自来水冷却后在波长570mm处比色、当收集至第二洗脱峰刚出现时，(茚三酮显色)即换用0.1N NaOH溶液洗脱直至第三洗脱峰出现后，停止洗脱。 6．树脂的再生：用o.1N NaOH溶液洗脱层析柱l0分钟。 7．回收树脂，拔去橡皮接收管用洗耳球对着玻璃流出口将树脂吹入装树脂的小瓶内加入0.1N NaOH浸泡。 8．洗脱曲线的绘制：以吸光度为纵座标，洗脱体积为横座标绘制曲线。 [器材] 1. 722型分光光度计 2．层析柱(0.8×18cm) 3．试管 [试剂] 1．0.1N NaOH 2．氨基酸混合液：Gly、Asp、His各10mg溶于30m1 0.06M pH4.2柠檬酸钠缓冲液中。 3．0.06M pH4.2柠檬酸钠缓冲液：取柠檬酸三钠98.0g溶于蒸馏水中，再加入42ml 12N HCl和6m1 80％苯酚(现用可不加苯酚)最终加蒸馏水至5000m1，用pH计调节溶
亲和层析技术 （一）原理 亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。 此法具有高效、快速、简便等优点。 （二）载体的基本要求和选择 理想的载体应具有下列基本条件：①不溶于水，但高度亲水；②惰性物质，非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用。 可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附。纤维素的非特异性吸附强。聚丙稀酰胺凝胶是目前的首选优良载体。 琼脂糖凝胶的优点是亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时，对蛋白质几乎没有非特异性吸附。琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化，活化后性质稳定，能经受层析的各种条件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl处理2h~3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理，不引起性质改变，故易于再生和反复使用。 琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。 （三）试剂与配制 1．Sepharose 4B 2．CNBr（剧毒）
五种电泳技术的比较-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
五种电泳技术的比较 SDSPAGE 名词解释： 相对迁移率（Rf） 问答题: 1.简述SDS-PAGE的基本原理。 2.影响SDS电泳的关键因素有哪些 AGE 名词解释 1.迁移率 2.电渗 3.电泳 问答题 1.影响电泳迁移率的因素有哪些？ 2.试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。 CAME 1.CAME的基本原理是什么？ 2.CAME分离血清蛋白电泳时应注意哪些问题？ PAGE 名词解释 1.凝胶总浓度 2.交联度 问答题 1.与CAME相比，PAGE有哪些特点。 2.试比较CAME与PAGE操作的区别。 3.简述不连续PAGE的原理。 1.琼脂糖凝胶电泳Agarose Gel Electrophoresis Gel Electrophoresis ：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。 特点（characteristic）： 1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动。 2. 电泳操作方法简便，电泳速度快。 3. 分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。 4. 适用于生化，免疫等定性定量测定。 （一）优点（advantage) 1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗。 2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质。 4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定。 6.有热可逆性。
（二）缺点(disadvantage) 1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 4.与PAGE相比，分子筛(molecular sieve)作用小，区带少。 应用 1. 适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、鉴定及纯化 2. 临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的分离与检测 3. 为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生化指标 影响迁移的因素 the size of the molecule conformation of the molecule the agarose concentration of a gel Voltage 百分浓度和分辨率限制 Most agarose gels are made with between 0.7% (good separation or resolution of large 5–10kb DNA fragments) and 2% (good resolution for small 0.2–1kb fragments) agarose dissolved in electrophoresis buffer. Up to 3% can be used for separating very tiny fragments but a vertical polyacrylamide gel 聚丙烯酰胺is more appropriate in this case. Low percentage gels are very weak and may break when you try to lift them. High percentage gels are often brittle and do not set evenly. 1% gels are common for many applications. 琼脂糖凝胶分离血浆脂蛋白 原理：血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后，以琼脂糖凝胶为支持介质，在pH8.6巴比妥缓冲液中电泳，根据各脂蛋白的组成、大小、形状分离成不同区带。 pH 8.6 > pI ，各种脂蛋白均带负电，电泳时由负极到正极；VLDL为圆 形，受阻力小，LDL形态不规则，受阻力大，所以VLDL跑在前。 加样槽在负极，由负极到正极分别是CM\LDL\VLDL\HDL 2.醋酸纤维薄膜电泳Cellulose acetate membrane electrophoresis，CAME 特点：低吸附作用，低电渗作用，样本用量少，亲水性 1.Low sorption 2.Low electroosmosis 3.Small sample 4.Hydrophilic 电泳图谱不齐 ①点样时血清点加不均匀 ②薄膜局部干燥 ③电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少 ④缓冲液变质 ⑤电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行 电泳图谱分理不清 ①点样时血清点加不均匀
摘要 膜分离技术是指在某种驱动力的作用下利用膜对混合物中各组分的选择透过性的差异实现物质分离的技术。膜分离技术的驱动力可以是膜两侧的压力差、电位差或浓度差。膜分离现象中的物质迁移现象是一种不可逆的传质过程。膜分离现象早在250多年以前就被发现但是膜分离技术的工业应用是在20世纪60 年代以后。 中国的膜分离技术的发展是从1958年对离子交换膜的研究开始的数十年来取得了长足的进步。目前中国研究所涉及的领域遍及膜科学与技术从材料的应用到产品的开发等方面。经过20年的努力中国在膜分离技术的研究开发方面已涌现出一批具有实用价值接近或达到国际先进水平的成果。但从总体上讲中国的膜分离技术和世界先进水平相比还有不小的差距还有待于进一步研究开发。
1 膜分离技术概述 1.1 膜分离技术 目前己经深入研究和开发的膜分离技术有微滤、超滤、纳滤、反渗透、电渗析、渗透汽化和气体分离、膜蒸馏、支撑液膜、膜萃取、膜生物反应器、控制释放膜、仿生膜以及生物膜等过程。表 1 列出了工业应用膜过程的分类及其基本特性。 微滤是最早使用的膜分离技术是在压力差作用下进行的筛孔分离、使不溶物浓缩的过程主要用于滤除0.05~10um的悬浊物质颗粒。主要应用于截留颗粒物、液体澄清以及除菌。 超滤是在压力差作用下进行的筛孔分离过程。 纳滤是从水溶液中分离除去中小分子物质的过程( 分子量为300~500）其原理是在超滤和反渗透间提供了一种选择性媒介在浓缩有机溶质的同时也可脱盐。 反渗透是以压力差为推动力的膜分离过程渗透与反渗透都是通过半透膜来完成。 电渗析是在直流电作用下以电位差为推动力实现溶液的精制、纯化或淡化。 液膜是依据溶解、扩散等原理通过液相薄膜将两个组成不同而又互溶的溶液
第六章吸附与离子交换分离原理 第一节吸附 一、概念：指流体与固体多孔物质接触时，流体中的一种或多种组分传递到多孔物质外表面和微孔表面并附着 1935年亚当斯、霍姆斯开始创制离子交换树脂，我国南开大学何炳林教授为鼻祖 例子：制备软水、各种抗生素（大孔网状树脂）的制备等 一、交换原理 应用合成的离子交换树脂作为载体，将溶液中的物质，依靠库仑力吸附在树脂上，然后用合适的洗脱剂将吸附物从树脂上洗脱下来，达到反应、分离、浓缩、提纯的目的。画示意图说明交换过程。 二、交换特点 树脂无毒性、能再生使用、基本不用溶剂，设备简单，操作方便。 三、用途 反应、产物分离提纯、脱色、转盐、去盐、制备软水等 四、离子交换树脂的组成 具有网状立体结构，含有高分子活性基团的高分子聚合物（不溶、稳定） 单元结构的组成：网络骨架（R）、功能活性基（-SO3，-N(CH)3-）、与活性带相反电荷的活性离子（可交换H+、OH-、Na+） 第二节离子交换树脂的分类及理化性能 一、分类（不同的分法有四种） 1．按树脂骨架（R）分：烯型（聚苯乙烯）、酸型（聚丙烯酸）、烷型（聚环氧氯丙烷）、胺型（环氧氯丙烯型多烯多胺型）、酚-醛型等 2．按树脂合成的方式：共聚（加成）型（聚苯乙烯）、缩聚型（酚-醛） 3．按骨架的物理结构 微孔（凝胶型）：2~4nm，分子链间距拉开，水干后闭合，孔为暂时性的。 大孔：100~1000nm，孔径大小不受外界条件影响，孔为永久性的。 等孔：树脂内部的孔道大小均匀，Frieded-Grafts反应生成二次甲基桥链 4．按活性基团 含酸性基团的阳离子交换树脂、含碱性基团的阴离子交换树脂 5．其他树脂 敖合树脂：含有敖合能力基团，对某些离子具有特殊选择力。 两性树脂：同时含有酸、碱两种基团的树脂，主要勇于苦咸水的淡化及废水处理。 二、活性基团分类的四种类型树脂 1．强酸基团的阳离子交换树脂 活性基：-SO3H、-CH2SO3H、-PO(OH)2、-PHO(OH)次磷酸基团 树脂特点：稳定、电离程度不受PH的影响，任何情况下可发生交换，交换快，再生剂用量较大3~5倍。 2．弱酸阳离子交换树脂
实训一离子交换层析分离氨基酸 目的要求 1．熟悉离子交换层析技术的基本原理和方法 2．熟悉离子交换层析分离氨基酸的基本原理和操作 实验原理 氨基酸是两性电解质，有一定的等电点，在溶液pH小于其pI值时带正电，大于其pI 时带负电。故在一定的pH条件下，各种氨基酸的带电情况不同，与离子交换剂上的交换基团的亲和力亦不同。因而得到分离。 本实验选用Dowex 50作为离子交换剂，它是含磺酸基团的强酸型阳离子交换剂，分离的样品为Asp、Gly、His三种氨基酸的混合液，这三种氨基酸分别属于酸性氨基酸、中性氨基酸和碱性氨基酸，它们在pH4.2的缓冲液中分别带负电荷和不同量的正电荷，与Dowex 50的磺酸基团之间的亲和力不同，因此被洗脱下来的顺序亦不同，可以将三种不同的氨基酸分离开来，将各收集管分别用茚三酮显色鉴定。 试剂和器材 1．试剂 （1）0.1N NaOH （2）氨基酸混合液：Gly、Asp、His各10mg溶于30m1 0.06M pH4.2柠檬酸钠缓冲液中。（3）0.06M pH4.2柠檬酸钠缓冲液：取柠檬酸三钠98.0g溶于蒸馏水中，再加入42ml 12N HCl 和6m1 80％苯酚(现用可不加苯酚)最终加蒸馏水至5000m1，用pH计凋溶液pH至 4.2。（4）茚三酮显色液：称取85mg茚三酮和15mg还原茚三酮，用10m1乙二醇溶解。 （5）Dowex 50的处理：Dowex 50用蒸馏水充分浸泡后，用6N HCl浸泡煮沸1h，然后用蒸馏水洗去HCl至树脂呈中性，换15％NaOH浸泡1h，用蒸馏水洗去NaOH至树脂pH呈中性，最后用pH4.2柠檬酸钠缓冲液浸泡备用。 2．器材 （1）7220型分光光度计 （2）层析柱(0.8×18cm) （3）试管 操作方法 1．装柱前准备 用流水冲洗层析柱、然后用蒸馏水冲洗，柱流水口装上橡皮管放入2-3ml蒸馏水，按压橡皮管内气泡，抬高流出管防止蒸馏水排空。 2．装柱 将处理好的Dowex 50悬液小心倒入层析柱内，待Dowex 50自然下沉至柱下部时，打开下端放出液体，再慢慢加入悬液至Dowex 50沉积面离层析柱上缘约3cm时停止。装柱时注意防止液面低于交换树脂平面以及气泡的产生。 3．平衡 用pH4.2的柠檬酸钠缓冲液反复加在柱床上面，平衡10min，最后接通蠕动泵，调节流速 1ml/min。 4．加样 柱内缓冲液的液面与树脂平面相平，但勿使树脂露出液面，马上用乳头滴管加7滴样品在树脂平面上（注意不能使树脂平面破坏），然后加少量缓冲液使样品进入柱内，反复两次，当样品完全进入树脂床后，接通蠕动泵，用PH4.2的柠檬酸钠缓冲液洗脱，部分收集器收集。 5.收集与检测 取12支试管编号，每管即加入茚三酮显色液20滴，依次收集洗脱液每管2m1，混匀，置沸水浴15min取出，观色，用自来水冷却后在波长570mm处比色、当收集至第二洗脱峰刚
复杂体系的分离技术凝胶电泳分离技术 徐正凤（10141512165）
凝胶电泳分离技术 摘要：凝胶电泳（Gel electrophoresis），也可称为胶体电泳或扁平式电泳法。凝胶电泳分离技术用途非常广泛，尤其是在生物学和化学的领域，是用于分离不同物理性质（如大小、形状、等电点等）的分子的技术，一般可用于质谱、聚合酶链式反应、克隆、DNA测序或者免疫印迹检测之前来进行部分提纯分子。本文将通过对凝胶电泳分离技术的概念，原理，特点和应用四部分的简要介绍，使读者对该技术有一定初步的了解。 第一部分基本概念 一、凝胶 凝胶（gelatum）又称冻胶，是指溶胶 或溶液中的胶体粒子或高分子在一定条件 下互相连接，形成空间网状结构，结构空 隙中充满了作为分散介质的液体或气体， 这样一种特殊的分散体系称作凝胶。IUPAC 给出的凝胶定义是非流动性的胶态网络或 者是贯穿其整个体积由流体膨胀聚合物网络。（凝胶） 凝胶是一种充分稀释的交联系统，在稳定状态下没有流动性。凝胶的主要成分是液体，但由于液体中的三维交联网络，凝胶在很多方面有着与固体相近的特性。凝胶可以包含共价聚合物网络结构，氢键、结晶、螺旋结构，玻璃状结构，层状结构和微粒无序结构。凝胶可分为弹性凝胶和脆性凝胶，弹性凝胶失去分散介质后，体积显著缩小，而当重新吸收分散介质时，体积又重新膨胀，例如明胶等；脆性凝胶失去或重新吸收分散介质时，形状和体积都不改变，例如硅胶等。由溶液或溶胶形成凝胶的过程称为胶凝作用。 在凝胶电泳分离技术中，凝胶作为分离分子的基质，在分离蛋白质或小的核酸（DNA、RNA、或寡核苷酸）的时候，通常是用不同浓度的丙烯酰胺和一个交联剂聚合而成，形成不同大小网眼的聚丙烯酰胺网状系统，最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。 二、电泳
第四节层析分离技术 层析法又称色谱法，色层法或层离法(chromatography)，是广泛应用的一种生物化学技术。层析法有多种类型，液体作为流动相的称为液相层析，气体作为流动相的称为气相层析。 按层析过程的机理不同，层析法可以分为下列几种类型： 吸咐层析：利用吸咐剂表面对不同物质吸咐性能的差异进行分离。 分配层析：利用不同物质在流动相和固定相之间的分配系数或溶解度不同，使物质分离。 离子交换层析：利用不同物质对离子交换剂亲和力不同而分离。 凝胶层析：利用某些凝胶对不同分子量的物质阻滞作用不同进行分离，亦称分子筛层析。 亲和层析：利用某些蛋白质能与配体分子特异而非共价地结合进行分离。 层析法采用的方式主要是柱层析和薄层层折，前者将固定相或载体装入柱内，使被分离的物质沿一个方向移动而达到分离，后者将吸附剂涂布成薄层，使样品在薄层上进行分离。 一、吸附层析 氧化铝，硅胶等物质具有吸咐其它一些物质的性质，而且对各种被吸附物质的吸附能力不同。吸附力的强弱，除与吸附剂本身的性质有关外，也与被吸附物质的性质有关。 (一)柱层析法 柱层析是用一根玻璃管。管内加吸附剂粉末，用溶剂湿润后，即成为吸咐柱，然后在柱顶部加入要分离的样品溶液，假如样品内含两种成分A和B，则二者被吸咐在柱上端，形成色圈，样品溶液全部流入吸附柱之后，加入合适的溶剂洗脱，A与B也就随着溶剂向下流动而移动，最后达到分离。 在洗脱过程中，管内连续发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的现象。例如被吸附的A粒子被溶解随溶剂下移，但遇新的吸附剂，又将A吸附，随后，新溶剂又使A溶解下移。由于溶剂与吸附剂对A与B的溶解力与吸附力不完全相同。A 与B移动的距离也不同，连续加入溶剂，连续分段收集洗脱液。各成分即可顺序洗出。
离子交换层析（色谱） 一、原理 离子交换层析(Ion exchange chromatography, IEC)是利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的层析法。 荷电溶质在离子交换剂上的分配系数可用下式表示： I — 流动相的离子强度，A 和B 为常数， 为离子强度无限大时溶质的分配系数，是静电相互作用以外的非特异性吸附引起的溶质在离子交换剂上的分配。 离子交换基： 阴离子：DEAE （二乙胺乙基）； QAE （季胺乙基） 阳离子：CM （羧甲基）；SP （磺丙基） 对于蛋白质等两性电解质，在物理意义上，B 为溶质的静电荷数与离子价数之比。在pH 偏离等电点的溶液中，蛋白质溶质的静电数常为两位数以上，故B 值较大，即蛋白质的分配系数对离子强度非常敏感。在同一离子强度下，不同蛋白质的分配系数相差非常大（几个数量级）。 洗脱方式： 恒定洗脱法：洗脱液（流动相）的离子强度不变； 缺点：对于在吸附柱上分配系数相差较大的蛋白质很难实现很好的分离。 线性梯度洗脱法或阶段梯度洗脱法： 除GFC 以外的层析操作均采用此种方法。 在洗脱过程中，流动相的离子强度线性增大或阶段梯度增大，因此溶质的分配系数连续降低，移动速度逐渐增大，使恒定洗脱条件下难于脱附的溶质得到洗脱。 线性梯度洗脱和阶段梯度洗脱法的优缺点如下： （1）线性梯度洗脱法： 优点：流动相离子强度（盐浓度）连续增大，不出现干扰峰，操作范围广； 缺点：需要特殊的调配浓度梯度的设备。 （2）阶段梯度洗脱法： 优点：利用切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗 脱，不需要特殊梯度设备，操作简单； 缺点：因为流动相浓度不连续变化，容易出现干扰峰。 此外，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象，因此洗脱操作参数（如盐浓度体积）的设计较困难。 离子交换(IEC)的应用及特点 GFC — 主要用于产物的初步纯化和中后期脱盐 IEC — 是蛋白质、肽和核酸等生物产物的主要纯化手段 IEC 分离的特点： （1）料液处理量大，具有浓缩作用，可在较高流速下操作； （2）应用范围广泛，优化操作条件可大幅度提高分离的选择性，所需柱长较短； （3）产品回收率高； （4）商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，价格也远低于亲合吸附剂。 疏水作用层析（色谱） 一、原理 疏水作用层析(Hydrophobic interaction chromatography, HIC)是利用表面偶联弱疏水性基团的疏水吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法。 二、疏水性吸附剂：将下表所列的各种凝胶过滤介质偶联上疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂。 常用的疏水性配基：苯基、短链烷基（C 3~C 8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。 吸附特点： 疏水性吸附作用的大小与配基的疏水性（疏水链长度）和配基密度成正比，故配基修∞+=m I A I m B )(∞m
蛋白质离子交换层析技术（一篇较好的综述，转载） 已有 210 次阅读2011-9-30 10:50|个人分类:蛋白实验技术|离子交换剂, 关键词, 蛋白质, 技术 蛋白质离子交换层析技术 摘要：本文介绍了离子交换的基本理论、影响分离纯化的因素、常见的离子交换剂和树脂的处理，以及离子交换层析的基本操作方法。列举了离子交换层析技术的一些最新应用。 关键词：离子交换层析基本理论树脂处理操作方法应用进展 Protein Ion Exchange Chromatography Technique Abstract:The basic theories of ion exchange, factors that can influence the separation and purification of proteins, common ion exchangers, ways of processing the resin and basic operating method of ion exchange chromatography are introduced. Some latest applications of this technique are enumerated. Keywords: Ion exchange chromatography; basic theories; resin processing; operating method; advancement of application 近年来，随着基因工程和细胞融合技术的发展，利用细菌发酵和动植物细胞培养表达蛋白质成为一种常规技术。和其它生物产品的生产过程一样,蛋白质的生产过程一般也分为上、中、下游过程。上、中游过程是运用生物技术生产目标产物,下游过程是指对含有目标产物的物料进行处理、分离、纯化、加工目标产物。为了生产高纯度、高活性的生物制品，生物工程技术研究经费的30％需花费在分离纯化工艺过程的研究上，调查结果显示，利用传统的分离纯化技术纯化分离阶段的平均生产费用占总生产成本的80％。 在众多的蛋白质分离纯化技术中,层析是一门关键技术, 它通常在分离工序的后部,决定着产品的纯度和收率。和其它分离技术相比,层析技术具有分离效率高、适用性广和过程易于放大、易于自动化的特点,因而得到了广泛的应用[1]。 本文将对其中的离子交换层析技术作详细介绍。 1 基本理论 1.1 离子交换的概念
五种电泳技术的比较 SDSPAGE 名词解释： 相对迁移率（Rf） 问答题: 1.简述SDS-PAGE的基本原理。 2.影响SDS电泳的关键因素有哪些？ AGE ?名词解释 1.迁移率 2.电渗 3.电泳 ?问答题 1.影响电泳迁移率的因素有哪些？ 2.试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。 CAME 1.CAME的基本原理是什么？ 2.CAME分离血清蛋白电泳时应注意哪些问题？ PAGE 名词解释 1.凝胶总浓度 2.交联度 问答题 1.与CAME相比，PAGE有哪些特点。 2.试比较CAME与PAGE操作的区别。 3.简述不连续PAGE的原理。 1.琼脂糖凝胶电泳Agarose Gel Electrophoresis ?Gel Electrophoresis ：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。 ?特点（characteristic）： 1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动。 2. 电泳操作方法简便，电泳速度快。 3. 分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。 4. 适用于生化，免疫等定性定量测定。 （一）优点（advantage) 1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗。 2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质。 4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定。 6.有热可逆性。 （二）缺点(disadvantage) 1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。
2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 4.与PAGE相比，分子筛(molecular sieve)作用小，区带少。 应用 1. 适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、鉴定及纯化 2. 临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的分离与检测 3. 为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生化指标 影响迁移的因素 ?the size of the molecule ?conformation of the molecule ?the agarose concentration of a gel ?Voltage 百分浓度和分辨率限制 ?Most agarose gels are made with between 0.7% (good separation or resolution of large 5–10kb DNA fragments) and 2% (good resolution for small 0.2–1kb fragments) agarose dissolved in electrophoresis buffer. ?Up to 3% can be used for separating very tiny fragments but a vertical polyacrylamide gel聚丙烯酰胺is more appropriate in this case. ?Low percentage gels are very weak and may break when you try to lift them. High percentage gels are often brittle and do not set evenly. 1% gels are common for many applications. 琼脂糖凝胶分离血浆脂蛋白 原理：血清脂蛋白经饱和丹黑B预染后，以琼脂糖凝胶为支持介质，在pH8.6巴比妥缓冲液中电泳，根据各脂蛋白的组成、大小、形状分离成不同区带。 ?pH 8.6 > pI ，各种脂蛋白均带负电，电泳时由负极到正极；VLDL为圆形，受阻力小，LDL形态不规则，受阻力大，所以VLDL跑在前。 加样槽在负极，由负极到正极分别是CM\LDL\VLDL\HDL 2.醋酸纤维薄膜电泳Cellulose acetate membrane electrophoresis，CAME 特点：低吸附作用，低电渗作用，样本用量少，亲水性 1.Low sorption 2.Low electroosmosis 3.Small sample 4.Hydrophilic 电泳图谱不齐 ①点样时血清点加不均匀 ②薄膜局部干燥 ③电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少 ④缓冲液变质 ⑤电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行 电泳图谱分理不清 ①点样时血清点加不均匀 ②薄膜局部干燥 ③电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少 ④缓冲液变质