发酵工程实验报告产淀粉酶菌株的筛选
姓名：××
班级：生物技术
学号：××
指导老师：×××
产淀粉酶菌株的筛选
××
（长春师范大学生命科学学院生物技术）
【摘要】为筛选产淀粉酶的高产菌株, 利用淀粉水解圈作为筛选模型, 从学校附近土壤中筛选得到产淀粉酶能力较强的细菌。对其酶活力进行测定, 最终得到产淀粉酶的高产菌株。
【关键词】淀粉酶;水解圈;酶活力;高产菌株
Screening of Strains Producing Starch
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(Technology of Biological Life Science College of Changchun Normal University)
[Abstract] for the high-yield strains were screened for amylase, the starch hydrolysis circle as a model for screening, screening from the school near the soil produced amylase ability of the bacteria. Determination of the enzyme activity, high yield strain eventually produced amylase.
[Key words] Amylase;Hydrolysis circle;Enzyme activity;Producing strain
前言：生活中的微生物无处不在，某些微生物给人们带来困扰，但更多的微生物对我们人类有必不可少的作用。淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类的总称,广泛存在于动植物和微生物中, 是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种。特别是20世纪60年代以来,由于酶法生产葡萄糖,以及用葡萄糖生产异构糖浆的大规模工业化, 淀粉酶的需要量越来越大,几乎占整个酶制剂总产量的50% 以上。微生物的许多种类都能产生淀粉酶。淀粉酶种类繁多,特点各异且用途广泛。因为淀粉酶的用途广泛, 各国在对淀粉酶产生菌的筛选方面都做了大量的研究工作,目前所得淀粉酶活力最高可达到260 U /mL左右。虽然不少微生物能产生淀粉酶,但适合商业生产需要的菌株仍然很少, 在淀粉酶生产过程中选择适合的菌株是最重要的前提条件。本文以土壤作为原料, 从中筛选出具有产淀粉酶能力的出发菌株,并对所得的出发菌株进行酶活力测定,使其给工业生产带来经济效益做大量的准备工作。
1. 材料与方法
1.1器材
①培养皿、量筒、试管、滴管、吸水纸、烧杯、移液管、三角瓶、酒精灯、玻璃棒、接种环、镊子、天平、滤纸、pH试纸、试管架、容量瓶等。
②恒温培养箱、高温灭菌锅、无菌操作台、控温摇床、分光光度计、离心机。
③棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、称量纸、试管架、药匙、吸耳球、镊子、酒精棉、废液瓶、胶塞、火柴。
1.2试剂
①牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、NaCl、蒸馏水、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、无菌水、95%乙醇、75%酒精、酵母膏、KH2PO4、碘液、淀粉溶液（0.5%）、蔗糖溶液（1%）、3,5
—二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）、酒石酸钾钠、结晶酚、亚硫酸钠、磷酸缓冲液（0.2mol/L,pH6.8）、6mol/L NaOH。
牛肉膏蛋白胨培养基、固体淀粉培养基、种子培养基、发酵培养基。
1.3菌种
土壤稀释液
2. 操作步骤
2.1培养基的配制
2.1.1操作流程：
称量→溶解→调节pH→分装→加棉塞→包扎→灭菌→摆斜面
2.1.2操作步骤：
（1）称量药品：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏和蛋白胨可分别放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
（2）加热溶解：在烧杯中加入少于所需的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补充所失水分。
（3）调pH：用pH试纸检测培养基的pH值，若pH偏酸，可滴加1mol/L NaoH，边加边搅拌，并随时检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用１mol/l HCL进行调节。注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
（4）分装：按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。分装量：固体培养基约试管高度的1/5；分装入三角瓶内的以不超过其容积的一半为宜，半固体培养基以试管高度的1/3为宜。
（5）加棉塞：培养基分装完毕后，在试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞，以防止外界微生物进入培养基内而造成污染。
（6）包扎：加塞后，将三角瓶的棉花外包一层牛皮纸或双层报纸，以防止灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把装同类培养基的试管扎成捆后，再于棉花塞外一层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
（7）灭菌：将上述培养基于121.3℃高压锅内，高压蒸汽灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。所用培养皿、移液管、涂布棒用牛皮纸包扎好，无菌水、试管包扎，一起高压灭菌。
（8）摆斜面：灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面的长度不超过试管总长的1/2，待其凝固。
2.2 微生物的分离与纯化
2.2.1 土样的采集
（1）地点选取：长春师范学院第一教学楼西侧家属楼门前菜园中的土壤（潮湿）。
（2）采集时间：2013-3-28,10:30.
（3）采集原则：地点选取后，用小铲子除去5cm表土，取离地面5-10cm处的土壤盛与袋中并标明时间、地点及环境情况。
2.2.2 土壤稀释液的制备
（1）取10g土壤样品加入装有90ml无菌水的无菌烧杯中，轻轻摇晃混匀，制成菌悬液。
（2）再分别取5只试管，分别加入9ml无菌水。然后把土壤菌液和5管9ml的无菌水排列好，依次编号1,2,3,4,5及6号管。
（3）在无菌操作条件下，用无菌移液管吸取1ml 10-1浓度（菌悬液）的菌液于装有9ml
无菌水的2号管中，摇匀即制成10-2浓度菌液，然后再从2号管中取1ml 10-2浓度的菌液于3号管中，摇匀，依次稀释到10-6，这样就得到了10-1—10-6六个稀释度的菌悬液。
2.2.3 涂布平板
（1）倒平板：将配置好并已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基倒入培养皿中，待其凝固。
（2）涂布：分别取10-2—10-6浓度的菌液0.2ml倒入培养皿中，用涂布棒涂匀，做好标记。
2.2.4 培养
将标记好的培养皿倒置放入恒温培养箱，37℃恒温培养24小时。
2.3 平板划线分离微生物
在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种中挑取少量菌样，在淀粉培养基上平板划线分离（如图1），划线的方法多样，目的是获得单个菌落。
图1 平板划线方法
2.3.1 初筛：分别挑取培养24h的五个浓度的菌落到淀粉培养基上，按照上述的划线方法分离菌落，目的是获得单菌落。将划线分离完成的培养皿做好标记，再倒置放入恒温培养箱，37℃恒温培养24小时。
2.3.2 纯化（复筛）：培养24h后取出培养皿，加入少量碘液，观察其透明圈的大小。挑取透明圈较大的单菌落到新的淀粉培养基上，方法同上。重复操作2-3次，最后一次记录菌圈的大小。
2.4 菌种保存:将筛选出来的菌圈较大的菌株接到牛肉膏蛋白胨试管斜面培养基上进行保存。
3.淀粉酶活力的测定
3.1 菌种活化：将保存的菌种转接到斜面培养基，37℃培养24小时，备用。
3.1.1种子液的制备：取一环活化的菌种，接入装量为50ml种子培养基的250ml三角瓶中，37℃,180r/min培养18h。
3.1.2摇瓶培养：分别取1ml种子液，接入盛有50ml发酵培养基的200ml三角瓶中（接种量为2%）。置摇床中，30℃震荡培养24h，转速为160r/min。
3.2 酶的提取：液体培养基在3000r/min的离心机中离心10min，取上清液。
3.3 淀粉酶活力测定
取25ml刻度试管4只，按下表编号并操作，记录实验结果。
表一测定淀粉酶活力表
管号
试剂（ml） 1 2 3 4
pH6.8缓冲液 1 2 1 2 蔗糖溶液 1 1
淀粉溶液 1 1
淀粉酶液 1 1
酶促反应摇匀，37℃水浴5min
DNS试剂 2
显色反应沸水浴5min
光密度（D540）
4.实验结果与分析
4.1 初次培养的细菌：分别为10-2—10-5浓度的菌落（如图2）。
图2 初次培养的细菌
4.2 初筛菌落（如图3）
10-210-310-4
10-510-6
图3 初筛菌落 4.3 复筛菌落（如图4）
10-2 10-3 10-4
10-5 10
-6
10-2
10-3 10-4
10-5 10-6
图4 复筛菌落
4.4 淀粉酶活力的测定
表二复筛菌落直径和水解圈直径的结果
编号水解圈直径d1（cm）菌落直径d2（cm）酶活力（U/g）
1 1.24 0.61 53.4
2 1.01 0.60 46.3
3 0.92 0.6
4 41.7
4 0.87 0.56 44.6
5 0.72 0.60 30.4
3
2
1
4 5
图5 淀粉圈大小图
从图中可以看到淀粉圈的大小，即代表了酶活力强弱，淀粉圈越大越明显，说明酶活力越强，反之越弱。图中1号菌酶活力最强，2、4号菌的酶活力较强，3、5号菌酶活力一般，但相对其他菌活力较好。
5.总结与讨论
5.1实验总结
本实验的最终目的就是要把自然界土壤中混杂的微生物通过以下步骤完成分离纯化，首先利用牛肉膏蛋白胨培养基培养出细菌，然后在把这些菌群通过划线分离的方法接种到淀粉培养基上，此步的目的是获得能分解淀粉的单个菌落。最后挑选几个产淀粉能力强的单个菌落中的菌接种到斜面上，进行保种，这样就获得纯净的能分解淀粉的菌落。
5.2讨论
5.2.1实验可靠性分析
由于实验过程有涉及到无菌操作，所以操作不当或操作方法错误都有可能对实验结果造成影响，使实验结果不准确。但总体上除去这些外在因素，实验结果还是可靠的。
5.2.2实验中的问题及原因分析
○1制备培养基时出现的问题：加热熔解琼脂时液体剧烈沸腾溢出三角烧瓶，导致实验重新进行，浪费了人力物力，由于搅拌不够，出现了糊底的现象。以后的实验中要引起足够的重视
②接种操作时没有尽量避免外界细菌的掺入，使得最后培养得到的菌落可能掺杂了空气中的杂菌，而在灼烧接种环时也有因接种环过热使得一部分菌体被杀死。
③划线时没有严格按照老师的标准，再加上操作不熟练，划的线太过稀疏，分离不明显，未得到太多的单一菌落
6.实验注意事项
1)称药品的牛角匙不能混用，称完药品后应及时盖紧瓶盖。
2)使用高压灭菌锅应严格按照操作程序（如加水、排冷空气、降零）进行，避免发生事
故。灭菌时操作者切勿擅自离开。
3)干热灭菌时消毒箱中物品不要摆得太拥挤，以免阻碍空气流通而影响灭菌效果；灭菌
物品不要与消毒箱内壁的钢板接触，以防包装纸烤焦起火。
4)一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，故从土壤中分离细菌时，要取较高的稀
释度，否则菌落连成一片不能计数。
5)在土壤稀释分离操作中，每稀释10倍，最好更换一次移液管，使计数准确。
6)在接种时候应先用酒精灯将接种环前面的铂丝烧红，即对其进行灭菌；待温度降下来
之后再接种。每次接种完后，要进行下一次接种之前，都要采取同样的方式。
7.参考文献
[1]沈萍，陈向东主编.微生物学实验[M].第四版.高等教育出版社.
[2]谷军主编.淀粉酶的生产与应用[J].生物技术，1994,4(3):1-5.
[3]白坤,于德贵,周冬颖主编.淀粉酶的性质及其液化作用[J].中国酿造,1995(5):1-5.
[4]张强,刘成君,蒋芳等主编.耐高温淀粉酶产生菌的分离鉴定及发酵条件与酶性质研究[J].食品与发酵工业,2005,31(2):34-37.
[5]罗志刚,杨景峰,罗发兴编.淀粉酶的性质及应用[J].食品研究与研发,2007,28(8):1-18.
[6]张丽苹,徐岩,金建中主编.酸性淀粉酶的研究与应用[J].酿酒,2002,29(3):4-15.
[7]沈萍主编.微生物学[M].2版.北京:高等教育出版社,2002:63-65.
8.附：本实验用到的各种培养基配方
（1）牛肉膏蛋白胨培养基
牛肉膏 1.5g
蛋白胨 5g
NaCl 2.5g
琼脂 10g
水 500mL
pH 7.0~7.2
121°C灭菌20min
（2）固体淀粉培养基
蛋白胨 10g
NaCl 5g
牛肉膏 5g
可溶性淀粉 2g
蒸馏水 1000mL
琼脂 15~20g
121℃灭菌20min。
(3)种子培养基
蛋白胨 1%
酵母浸出物 0.5%
氯化钠 1% pH自然
（4）液体培养基
牛肉膏 3g
蛋白胨 10g
NaCl 5g
可溶性淀粉 2g
水 1000mL
pH 7.2
121°C灭菌15min
土样中淀粉降解细菌的筛选（设计性实验） 一、实验目的 1.掌握土壤样品中微生物菌种分离和筛选技术的实验设计方案。 2.掌握富集、平板稀释涂布法、分离筛选产淀粉酶菌株的基本原理。 3.初步掌握从土壤样品中分离筛选产淀粉酶菌株的基本技术。 二、实验原理 在自然条件下，产淀粉酶的细菌和其它各种细菌混杂生活在土壤中，要想分离出来必须建立相应的“筛子”。淀粉酶能使淀粉分解成葡萄糖，而淀粉与碘液发生反应形成蓝色化合物。葡萄糖不与碘液发生反应形成蓝色化合物，结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。 微生物酶产生菌的筛选具体分为增殖培养、初筛和复筛过程。增殖培养是通过控制培养基的营养成分和/或培养条件使样品中的目的菌得以大量繁殖,而非目的菌的生长受到抑制或繁殖减缓,从而提高样品中目的菌的数量和比例。初筛是对所得的纯种进行检测。由于淀粉酶是胞外酶，在分离培养基中加适量可溶淀粉通过平板透明圈法来检测淀粉酶产生菌。筛选透明圈比值大的菌株接种到培养基中进行培养，再进行复筛。复筛的目的是淘汰底产菌。 三、实验材料 1、培养基：蛋白胨， NaCl，可溶性淀粉，琼脂，蒸馏水。 2、玻璃仪器: 培养皿10副，试管10支，三角瓶 6个，移液管 10支（1mL7支,10mL 3支），100mL量筒2个,玻璃棒，玻璃珠。 3、其它：酒精灯，硅胶塞,包装绳，包装纸,PH试纸，接种环，电子天平，称量纸,高压蒸汽灭菌锅，摇床，角匙，记号笔等。 四、方法与步骤 1、土壤样品: 食品厂、粮食加工厂、饭店等日常接触淀粉较多的肥沃土壤。 2、培养基的制备 (1)液体培养基：称取蛋白胨1.0 g、NaCl 0.5 g、可溶性淀粉0.2 g溶于装有100 mL蒸馏水的三角瓶中，调pH为7.2至7.4，分装为2个三角瓶,50mL/个,包扎，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。 (2)固体淀粉培养基：称取蛋白胨1.5g， NaCl 0.75g，可溶性淀粉0.3g ，溶于
实验六十淀粉酶产生菌株的筛选 实验项目性质：设计性 所涉及的知识点：无菌技术、富集培养、纯种分离、淀粉酶性质、酶活测定 计划学时：8学时 一、实验目的 1．掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2．巩固以前所学的微生物学实验技术。 3．掌握产酶微生物筛选的方法。 二、实验原理 α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定。 1、采样：即采集含菌的样品 采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。在土壤中，数量最多的当推细菌，其次是放线菌，第三霉菌，酵母菌最少。除土壤以外，其他各类物体上都有相应的占优势生长的微生物。例如枯枝、烂叶、腐土和朽木中纤维素分解菌较多，厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多，果实、蜜饯表面酵母菌较多；蔬菜牛奶中乳酸菌较多，油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌较多等。 2、增殖培养（又称丰富培养） 增殖培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。因此，增殖培养事实上是选择性培养基的一种实际应用。 3、纯种分离 在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。通过上述的增殖培养只能说我们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要得到纯种微生物就必须进行纯种分离。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 4、性能测定 分离得到纯种这只是选种工作的第一步。所分得的纯种是否具有生产上所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。性能测定的方法分初筛和复筛两种。 初筛一般在培养皿上根据选择性培养基的原理进行。例如要测定淀粉酶的活力可以把斜面上各个菌株一一点种在含有淀粉的培养基表面，经过培养后测定透明圈与菌落直径的比值大小来衡量淀粉酶活力的高低。 复筛是在初筛的基础上做比较精细的测定。一般是将微生物培养在三角瓶中作摇瓶培养，然后对培养液进行分析测定。在摇瓶培养中，微生物得到充分的空气，在培养液中分布均匀，因此和发酵罐的条件比较接近，这样，测得的结果更具有实际的意义。 三、实验用品 1．器材 （1）小铁铲和无菌纸或袋。
产淀粉酶细菌菌株的筛选和选育 邢大鹏 （合肥工业大学生物与食品工程学院2008级食品科学与工程专业08-1班） 摘要：从合肥工业大学校园内的土壤中筛选到一株产淀粉酶的细菌菌株。形态及生理生化特征测定结果表明，菌株与芽孢杆菌属(Bacillaceae)中的枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisCohn)种的特征基本一致。然后利用划线分离法和富集培养制备一定量的枯草芽孢杆菌，最后利用DNS法测定其产酶活力。 关键词：淀粉酶，产酶，细菌，枯草芽孢杆菌 Amylase production screening and selection of bacteria strains Xing Dapeng Abstract: From the Hefei University of Technology campus in the A strain of soil amylase producing bacteria strains. Morphological, physiological and biochemical characteristics of test showed that, strains and Bacillus (Bacillaceae) in Bacillus subtilis (BacillussubtilisCohn) basically the same kinds of characteristics. Then use the train crossed separation and enrichment of preparation of certain bacillus subtilis, finally, using the DNS method for determining the enzyme production vigor. Key words: amylase, enzyme production, bacteria,Bacillus,stubtilis. 芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。早在1835年，Ehrenberg所描述的“Vibriosubtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn于1872年正式命名的，现作为芽孢杆菌属(Bacillaceae)的模式菌株[1]。从生物学特性来讲，枯草芽孢杆菌具有典型的芽孢杆菌特征，其细胞呈直杆状，大小(0.8-1.2)μm×(1.5-4.0)μm，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，可产荚膜，运动(周生鞭毛)；芽孢中生或近中生，小于或等于细胞宽，呈椭圆至圆柱状；菌落粗糙，不透明，扩张，污白色或微带黄色；能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌[2]。 1997年，Kunst F.等人首先完成了枯草芽孢杆菌的完整基因组序列测定，并将结果发表在《Nature》杂志上[3]。
土样中淀粉降解细菌的筛选 小组成员：袁少锋付晓俊沈豪曹凯方洁梅 一、实验目的 1.掌握土壤样品中微生物菌种分离和筛选技术的实验设计方案。 2.掌握富集、平板稀释涂布法、分离筛选产淀粉酶菌株的基本原理。 3.初步掌握从土壤样品中分离筛选产淀粉酶菌株的基本技术。 二、实验原理 在自然条件下，产淀粉酶的细菌和其它各种细菌混杂生活在土壤中，要想分离出来必须建立相应的“筛子”。淀粉酶能使淀粉分解成葡萄糖，而淀粉与碘液发生反应形成蓝色化合物。葡萄糖不与碘液发生反应形成蓝色化合物，结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。 微生物酶产生菌的筛选具体分为增殖培养、初筛和复筛过程。增殖培养是通过控制培养基的营养成分和/或培养条件使样品中的目的菌得以大量繁殖,而非目的菌的生长受到抑制或繁殖减缓,从而提高样品中目的菌的数量和比例。初筛是对所得的纯种进行检测。由于淀粉酶是胞外酶，在分离培养基中加适量可溶淀粉通过平板透明圈法来检测淀粉酶产生菌。筛选透明圈比值大的菌株接种到培养基中进行培养，再进行复筛。复筛的目的是淘汰低产菌。 三、实验材料 1、培养基：蛋白胨， NaCl，可溶性淀粉，琼脂，蒸馏水。 2、玻璃仪器: 培养皿10副，试管10支，三角瓶 6个，移液管 10支（1mL7支,10mL 3支），100mL量筒2个,玻璃棒，玻璃珠。 3、其它：酒精灯，硅胶塞,包装绳，包装纸,PH试纸，接种环，电子天平，称量纸,高压蒸汽灭菌锅，摇床，角匙，记号笔等。 四、方法与步骤 1、土壤样品:三食堂附近 2、培养基的制备 (1)液体培养基：称取蛋白胨1.0 g、NaCl 0.5 g、可溶性淀粉0.2 g溶于装有100 mL蒸馏水的三角瓶中，调pH为7.2至7.4，分装为2个三角瓶,50mL/个,包扎，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
实验一淀粉酶产生菌的筛选 一、实验要求： 1、写出完整的分离纯化淀粉酶产生菌的实验步骤； 2、写出分离培养基及其相关试剂所需的量、仪器、器皿所需的量； 3、掌握从土壤分离酵母菌的方法和技术，从样品中分离出所需菌株； 4、学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养淀粉酶产生菌的培养 条件和培养时间。 二、实验原理：用梯度稀释法来分离淀粉酶产生菌 三、实验材料： 1.培养皿、移液管、刮铲、显微镜等, 2.可选取厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤 ; 3.培养基与试剂 :牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、可溶性淀粉、蒸馏水、琼脂粉。 四、实验步骤： 1、选定采土点后，铲去表土层2-3cm，取3-10cm深层土壤5g，装入灭过 菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌相的变化。 2、培养基的配置，(1) 分离培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀 粉 即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中再加入15g琼脂粉 pH调至7.2 121℃灭菌15min 待冷却至50℃左右时 于超净工作台倒平板。注: 先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状 再加到溶化好的培养基中 调匀; (2) 分离培养基液体培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉,即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中 pH调至7.2,121℃灭菌15min。 3、取所采的土样5g加入到三角瓶中,加入无菌水45mL,30℃摇床振荡30min制成土 壤悬液 ,此时的稀释度为10-1。另取7支试管 分别记作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8个梯度 每支试管内加入9mL无菌水。用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液加入到10-2试管中混匀, 再从此试管中吸取1mL加入到10-2试管中, 依此类推直至10-7试管。分别从10-6、10-7、10-8三个稀释度的试管中吸取100uL悬液, 均匀涂布于分离培养基平板上, 于27℃培养1-2天，等长出菌落后, 将检测试剂卢戈氏碘液加入到平板中, 菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株, 因淀粉遇碘变蓝色 ,如菌落周围有无色圈说明该菌能分解淀粉。将水解圈直径与菌落直径之比较大菌株,即产酶能力较强的菌株的进行编号。 4、纯化; 将保存的菌株用接种环沾取少量培养物至平板上, 并进行2-3次划线分离, 挑取单菌落至平板上, 培养后观察菌苔生长情况并镜检验证为纯培养。将纯化后产酶能力较强菌株保存至斜面培养基中培养.
从土壤中分离和筛选产淀粉酶活性的芽孢杆菌及部分鉴定 试验 一、实验目的 1、通过本实验的学习，学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法； 2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定,对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练； 3、培养综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。 4、根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株。 二、实验原理 1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。待实验前取样即可。 2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。 3、芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。细菌富集一段时间后，生长环境不利，会产生芽孢，再在80-90℃温度下杀死菌体，可使芽孢得到富集。 4、芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25℃到75℃以上；最低生长温度大约5℃到45℃；生长最低pH值，从—8到2左右；耐盐范围从低于2%的NaCl到25%NaCl；营养
明胶（22℃）7天内液化1厘米或1厘米以上。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源。 5、在含有淀粉的鉴别培养基的平板上，具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。 二、实验材料 1、土壤样品 实验前三天在距土壤表层5-8厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样 2、药品 可溶性淀粉、蛋白胨、Nacl、牛肉膏、琼脂粉、碘、碘化钾、磷酸氢二钠、柠檬酸、盐酸 3、试剂： （1）配制稀碘液： 原碘液：称取碘和碘化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500ml，贮存于棕色瓶中。 稀碘液：吸取原碘液，加入碘化钾用水溶解定容至500ml，贮存于棕色瓶中。 （2）可溶性淀粉溶液：称取2.00g可溶性淀粉于烧杯中，用少量水调成浆糊状，边搅拌边缓慢加入70ml沸水中，然后用水冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100ml。（溶液现配现用） （3）磷酸缓冲液（pH=）：称取45.23g磷酸氢二钠和8.07g柠檬酸，用水溶解并定容到1000ml，用pH计校正后使用
实验一淀粉酶产生菌的筛选 及酶活力测定 指导老师：辛树权 生命科学学院08级生物技术（三）班豆豆 同组人：xx xxx 摘要：自然界是微生物的大本营，实验室微生物几乎都是从自然界中选育出来的。我们从学校的花坛中采集一些土壤样本，拿到实验室中，进行淀粉产生菌的筛选。利用土壤制成菌液，将其涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基上进行纯化，再用淀粉培养基培养，最后通过淀粉透明圈的大小来判断淀粉产生菌产淀粉的能力。再使用分光光度计精确测量淀粉酶的酶活力。关键词：淀粉酶；分离；纯化；透明圈；酶活力；摇瓶；分光光度计 一、实验目的： 1、学习从土壤中分离微生物的方法； 2、学习淀粉酶产生菌的筛选方法 3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法。 二、实验原理： 土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌种产淀粉的能力。
淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括α－淀粉酶和β-淀粉酶等，α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的α-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。 三、实验器材及试剂： 1.、材料：长春师范学院家属楼前小菜园 2培养基： （1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板） （2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉 20g, 硝酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化钠 0.5g, 硫酸镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼脂 20g, 水 1000毫升，调整pH值到7.2～7.4。） （3）摇瓶培养：淀粉培养液。 3、试剂： 碘液、2%可溶性淀粉、pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、 0.5mol/L乙酸、0.85%生理盐水。 4、器材： 培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。
土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案 一、综述： 淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研 【】究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用1。 常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽 【】【】孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌2、凝结芽孢3。由于芽孢杆菌属 是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤【】和植物体表面及水体中4。所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的要求 1．了解生物分离提纯的原理和方法技术 2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法 3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法 4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力 5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 三、实验原理 自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。 土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的 【】土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少5。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
微生物与转基因技术 摘要微生物目前已是生物技术领域主要的模式生物之一，微生物可以为转基因技术提供工具酶、基因载体；微生物本身也常作为目的基因的受体细胞。通过转基因的方式，可以将人类所需要的基因转移到特定物种上，从而表达出人类想要的性状。本文综述了转基因微生物在食品、农业、医药以及环境保护、传统工业改造等领域研究与应用的国内外现状。在食品生产领域，转基目微生物主要用于食品用群制剂的生产，如凝乳酶．淀粉酶，蛋白酶等，转基因酵母也应用于啤酒的生产．在农业生产领域，转基因微生物主要用于微生物农药、微生物肥料和饲料酶制剂的生产．在医药生产领域，转基因微生物主要用于兽用和人用疫苗的生产，以及利用转基因镟生物生产某些药物。此外，转基因微生物在环境保护，传统工业的改造、印染业，以及新能薄开发等方面也有应用，本文也同样大致介绍了一些目前国内外关于微生物转基因方面的前沿研究。 关键词微生物转基因，DNA重组技术，目的基因，基因载体 1引言 转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段[1]的来源可以是提取 特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的基因片段。基因片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。1980年代以来，现代生物技术迅速发展，在医药、农业、食品、化工、环境和能源等领域发挥了巨大的经济效益和社会效益。自1982年美国FDA批准了世界上第一例基因工程药物重组人胰岛素的正式生产以来，以基因工程药物为主的各种基因工程产品陆续实现商品化生产。其中，转基因微生物是基因工程产品的重要组成部分，在农业生产、食品加工、医药生产以及环境保护等领域得到了广泛的应用。 2微生物与转基因技术 1.微生物与转基因工具酶 转基因技术中，需要一些基本的工具酶，如对供体生物的DNA进行切割以获得目的基因的限制性核酸内切酶、DNA聚合酶类、DNA连接酶、核酸外切酶、反转录酶等。 DNA聚合酶类包括DNA聚合酶Ⅰ、KlenowDNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、耐热DNA聚合酶等。耐热DNA聚合酶是一类在高温下具有聚合活性的DNA聚合的，来自于嗜高温的细菌，方要应用于PCR反应中，具体种类有产自嗜热水生菌的TaqDNA聚合酶、VentDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶、TthDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶，其中Taq DNA聚合酶，使DNA的体外复制变得异常简便和常规化，大大加快了生物工程、基因组等分子生物学研究的进程，年销售利润达到上亿美元。 依赖于DNA的RNA聚合酶包括SP6噬菌体RNA聚合酶、T4噬菌体RNA聚合酶或T7噬菌体RNA聚合酶，这类酶无需引物，但识别DNA上特异性位点（启动列），合成RNA。 核酸酶S1，来源于米曲霉，具有3’->5’外切核酸酶活性，能特异性降解单链DNA或RNA 的核酸酶，基因工程中用于黏性末端的平切。 核酸酶BAL31，来源于交替单胞菌BAL31，对单链DNA和RNA具有类似核酸酶S1的催化活性，能同时从3’-端和5’-端降解双链DNA并使其缩短大约25%长度，催化反应需要Ca2+。基因工程中用于缩短DNA和构建嵌套缺失体也应用于限制酶图谱制作等。 2.微生物与转基因载体
产淀粉酶（α-淀粉酶）细菌菌株筛选 一、实验目的： 1.掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2.巩固以前所学的微生物学实验技术。 3.学习淀粉酶活性的测定方法。 二、实验原理： 1.α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其 是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。 2.从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初 步筛选、分离纯化和性能测定。 a)采样：即采集含菌种的样品 采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多， 然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土 壤可说是微生物的大本营。例如厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分 解菌较多。 b)富集培养： 富集培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于 待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从 而便于我们从其中分离到这类微生物。 c)初步筛选： i.（选择培养基）初筛使用选择培养基对菌种进行培养，通过培养基的特殊 成分，来筛选出目的菌种，从而进行培养。 ii.（鉴别培养基）初筛利用鉴别培养基，通过添加一些特殊的试剂或成分来鉴别出目的菌种，从而筛选出来并对其进行培养。 d)分离纯化： 通过上述的筛选只能说我们要分离的目的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中 的杂菌除去，从而得到纯种的菌落。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线 分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 e)性能测定： 分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须 要进行性能测定后才能决定取舍。 三、实验材料： 1.培养基配制： a)培养基按以下比例配制后，加蒸馏水调至100%； b)富集培养基：可溶性淀粉1%、蛋白胨1%、葡萄糖0.5%、NaCl 0.5%、牛肉膏 0.5%、pH7.0； c)分离培养基：玉米粉2%、黄豆饼粉1.5%、琼脂粉0.8%、CaCl 0.02%、MgSO4 0.02%、 NaCl 0.25%、K2HPO40.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸铵0.075%（溶解后加入）、 Na2HPO40.2%、pH7.0。 2.主要试剂和溶液的配制： a)2%淀粉溶液：准确称取淀粉2g溶于100ml 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。 b)0.1mol/L的柠檬酸缓冲液、pH=1.0的盐酸
高产淀粉酶菌株的筛选 一：前言 1. 掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2. 巩固以前所学的微生物学实验技术。 3. 学会筛选高产淀粉酶菌株。 关键词：产淀粉酶、芽孢杆菌、酶活力、筛选 1.α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。 2. 从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初步筛选、分离纯化和性能测定。 a) 采样：即采集含菌种的样品采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。例如厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多。 b) 富集培养：富集培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。 c) 初步筛选： i. 初筛使用选择培养基对菌种进行培养，通过培养基的特殊成分，来筛选出目的菌种，从而进行培养。 ii. 初筛利用鉴别培养基，通过添加一些特殊的试剂或成分来鉴别出目的菌种，从而筛选出来并对其进行培养。 d) 分离纯化：通过上述的筛选只能说我们要分离的目的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中的杂菌除去，从而得到纯种的菌落。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 e) 性能测定：分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。 二、实验材料：接种环、试管、三角瓶、培养皿、移液管、高压蒸汽灭菌锅、玻璃棒、量筒、酒精灯、纱布、棉花、面线绳、恒温培养箱载玻片可见分光光度计显微镜紫外操作台 实验试剂：牛肉膏、蛋白胨、淀粉、NaCl、琼脂粉、蒸馏水、卢卡式碘液、95%乙醇、蕃红、革兰氏碘液 培养基配制：牛肉膏1.3g、蛋白胨2.5g、NaCl 1.3g、淀粉2g、溶于250mL蒸馏水中，一边加热再慢慢加入5g琼脂粉 三：实验步骤 1培养基的制备及其仪器的灭菌
南昌大学实验报告 淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定 一、实验目的： 1、学习从土壤中分离微生物的方法； 2、学习淀粉酶产生菌的筛选方法 3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法。 二、实验原理： 土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌种产淀粉的能力。 淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括α－淀粉酶和β-淀粉酶等，α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的α-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下
降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。 三、实验器材及试剂： 1、培养基： （1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板） （2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉20g,硝酸钾1g,磷酸氢二钾,氯化钠,硫酸镁,硫酸亚铁,琼脂20g,水1000毫升，调整pH值到～。） （3）摇瓶培养：淀粉培养液。 2、试剂： 碘液、2%可溶性淀粉、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、L乙酸、%生理盐水。 3、器材： 培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。 四、实验步骤：
发酵工程实验报告产淀粉酶菌株的筛选 姓名：×× 班级：生物技术 学号：×× 指导老师：×××
产淀粉酶菌株的筛选 ×× （长春师范大学生命科学学院生物技术） 【摘要】为筛选产淀粉酶的高产菌株, 利用淀粉水解圈作为筛选模型, 从学校附近土壤中筛选得到产淀粉酶能力较强的细菌。对其酶活力进行测定, 最终得到产淀粉酶的高产菌株。 【关键词】淀粉酶;水解圈;酶活力;高产菌株 Screening of Strains Producing Starch ×× (Technology of Biological Life Science College of Changchun Normal University) [Abstract] for the high-yield strains were screened for amylase, the starch hydrolysis circle as a model for screening, screening from the school near the soil produced amylase ability of the bacteria. Determination of the enzyme activity, high yield strain eventually produced amylase. [Key words] Amylase;Hydrolysis circle;Enzyme activity;Producing strain 前言：生活中的微生物无处不在，某些微生物给人们带来困扰，但更多的微生物对我们人类有必不可少的作用。淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类的总称,广泛存在于动植物和微生物中, 是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种。特别是20世纪60年代以来,由于酶法生产葡萄糖,以及用葡萄糖生产异构糖浆的大规模工业化, 淀粉酶的需要量越来越大,几乎占整个酶制剂总产量的50% 以上。微生物的许多种类都能产生淀粉酶。淀粉酶种类繁多,特点各异且用途广泛。因为淀粉酶的用途广泛, 各国在对淀粉酶产生菌的筛选方面都做了大量的研究工作,目前所得淀粉酶活力最高可达到260 U /mL左右。虽然不少微生物能产生淀粉酶,但适合商业生产需要的菌株仍然很少, 在淀粉酶生产过程中选择适合的菌株是最重要的前提条件。本文以土壤作为原料, 从中筛选出具有产淀粉酶能力的出发菌株,并对所得的出发菌株进行酶活力测定,使其给工业生产带来经济效益做大量的准备工作。 1. 材料与方法 1.1器材 ①培养皿、量筒、试管、滴管、吸水纸、烧杯、移液管、三角瓶、酒精灯、玻璃棒、接种环、镊子、天平、滤纸、pH试纸、试管架、容量瓶等。 ②恒温培养箱、高温灭菌锅、无菌操作台、控温摇床、分光光度计、离心机。 ③棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、称量纸、试管架、药匙、吸耳球、镊子、酒精棉、废液瓶、胶塞、火柴。 1.2试剂 ①牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、NaCl、蒸馏水、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、无菌水、95%乙醇、75%酒精、酵母膏、KH2PO4、碘液、淀粉溶液（0.5%）、蔗糖溶液（1%）、3,5
毕业论文开题报告 生物工程 高性能淀粉酶菌株的筛选 1 选题的背景和意义 淀粉酶是能催化淀粉和糖原水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一类酶的总称，在淀粉糖工业、食品工业、医药、纺织、洗涤剂、青贮饲料、微生态制剂以及酿酒行业中被广泛应用。淀粉酶是最早用于工业化生产并且迄今为止仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一[1、2]。 不同种类的淀粉酶水解淀粉会生成不同的产物。根据淀粉酶水解淀粉的作用方式可分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶。α-淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，所得产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为α构型，同时该酶能使淀粉浆的粘度下降，又称为液化酶；β-淀粉酶是从淀粉的非还原性末端切下一分子的麦芽糖，又被称为糖化酶，其产物还原性末端葡萄糖单位碳原子为β构型；葡萄糖淀粉酶是从底物非还原末端依次水解α-l，4糖苷键和分支的α-1，6-糖苷键，生成葡萄糖。异淀粉酶是只水解糖原或支链淀粉分支点的α-1，6-糖苷键，切下侧枝链[3]。 淀粉酶是工业中最重要的酶。如今，在生物制药领域，它也具有重要的作用。虽然淀粉酶具有很多来源，但是微生物来源的淀粉酶，特别是α-淀粉酶和葡糖淀粉酶，在商业上发挥着重要的作用。由于淀粉是可以由淀粉酶水解的惟一天然物质，分离有效的微生物菌株生产对生淀粉有效性高的淀粉酶是非常理想的。应用新的耐热性葡糖淀粉酶可以促进淀粉的水解过程，而使用α-淀粉酶可以使整个过程一步便可以完成，具有经济效益。现在，必须开发具有双重功效的，如液化作用和糖化作用的微生物菌株如淀粉分解酵母。也应该开发具有有效β-淀粉酶活性的菌株，β-淀粉酶可以用来生产麦芽糖浆。可以用农业和工业上的废物作为淀粉酶生产的底物，从而降低开支，也解决了废物的处理和污染问题。在工业上的作用，淀粉酶的耐热性已成为非常重要的性质，因此，我们也应该努力从耐热和极端耐热的微生物中生产淀粉酶。另外，将淀粉酶的应用范围拓宽如应用于生物制药领域也具有积极的意义。
毕业论文文献综述 生物工程 高性能淀粉酶菌株的筛选及培养基优化进展 1 前言 淀粉酶( amylase，EC 3. 2. 1. 1)以淀粉或糖原为底物,是能够催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一群酶的总称。它能从分子内部水解α- 1, 4- 糖苷键, 广泛存在于动物、植物和微生物中。如今淀粉酶在酶市场销售中占据了约25％的比例，应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织、石油开采等行业。由于该酶是一种有内切活性的淀粉酶, 可在中性pH 条件下将淀粉水解为糊精、寡糖、麦芽糖和葡萄糖等, 从而使黏稠的淀粉糊很快失去黏性而液化, 碘的呈色反应很快消失, 故又称为淀粉液化酶[1，2]。此外它也可作为促消化剂运用于食品[3]、医药工业．淀粉酶的巨大潜力使其在当今社会中需求量日益提高．因此，如何获得高产量、高活性的淀粉酶显得至关重要。 2 淀粉酶生产菌株的筛选 2.1 初筛 将在土壤中收集得到的菌株划线接种在淀粉培养基平皿上培养2～4 d，采用革兰氏碘液染色，在菌落周围有透明圈产生证明为产淀粉酶。用游标卡尺分别测量透明圈直径和菌落直径，根据两者比值大小初步确定酶活性的高低。[4] 但应保存所有产淀粉酶的菌株以用来复筛，因为同一菌株在不同的培养基以及不同的培养条件下产酶的情况可能不同。在平皿上生长和在发酵液中培养也可能会有很大的差别。 2.1 复筛 在淀粉酶生产菌株筛选的过程中，最关键的是其产物，也就是淀粉酶的酶活的检测。由于测定原理和底物性质的不同，淀粉酶的测定方法已经超过200种以上。[5]这些方法可以归纳为两类：天然淀粉底物方法和（分子组成）确定的底物方法。以天然淀粉底物为底物的测定方法，如淀粉分解法、糖化法和色素淀粉法等。由于天然淀粉分子结构的不确定，故不同植物来源的淀粉和不同批号的淀粉，其分子结构和化学性质不尽相同，因此难以达到方法学标准化，测定误差较大。[6]目前除碘·淀粉法和DNS外，这类方法已被淘汰。使用（分子组成）确定的淀粉酶底物和辅助酶与指示酶组成的淀粉酶测定系统，可以改进酶反应的化学计
淀粉酶产生菌的筛选
实验1 淀粉酶产生菌（细菌）的筛选 一、实验目的 掌握完整的分离纯化淀粉酶产生菌的方法和技术 二、基本原理 土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌种产淀粉的能力。 三、材料与器材 1、菌源 校园土样 2、培养基： 淀粉培养基：蛋白胨 10g，NaCl 5g，牛肉膏 5g，可溶性淀粉 2g，蒸馏水1000ml，琼脂 15~20g，121℃高压灭菌锅灭菌 20 min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒摇瓶若干。 3、器材 培养皿若干个、1ml移液管1根、刮铲 1把、锥形瓶若干个、高压灭菌锅、超净工作台、试管若干、摇床 四、实验步骤
1、选定采土点后，铲去表土层2-3cm，取3-10cm深层土壤10g，装入灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌相的变化。 2、称取土样10g，放入盛有90mL蒸馏水并带有玻璃珠的锥形瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将细胞分散。 3、初筛：用一支1mL移液管从中吸取0.1mL土壤悬液加入盛有淀粉培养基的培养皿中，重复两次。后置于培养箱中培养。 检测：培养出菌落后向培养皿均匀的喷洒碘液，有明显的透明圈的菌落即为活性较高的淀粉酶产生菌。 4、复筛：选取步骤3活性较高的淀粉酶产生菌菌落移植进盛有淀粉培养基的摇瓶中，放于摇床中培养。 测定：把所有摇瓶中的菌株发酵液用琼脂平板法测定一遍（同步重复2~3块板），将其中活性圈大而清晰的菌株发酵液进一步采用精确检测法测定，选出较优良的菌株2~3株，并移植进斜面中培养。 五、实验结果
实验一--淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定---副本-(2)
本科学生实验报告 学号： 124120463 姓名： 学院：生命科学学院专业、班级： 12级生物技术班实验课程名称：酶工程实验一 教师：吴倩 云南师范大学教务处编印
实验一淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定 一、目的要求 1、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会应用微生物生态知识分离产酶微生物。 2、掌握淀粉酶活性测定的原理，学会淀粉酶活性的测定方法。 二、基本原理 （一）淀粉酶产生菌的分离 1.菌种的采集 ①要获得产生某种酶的菌种，可从富含该酶作用底物的场所去采集。 ②胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致，因此要筛 选具有某一特性的酶时，只要到相应的环境中采样即可。 2.富集培养 ①原理：采集到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需 的菌大量繁殖，而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选。 ②富集的方法：控制培养的温度、pH和营养成分等。 3.菌种的分离 ①淀粉与碘液反应会形成蓝色化合物。 ②淀粉酶能使淀粉分解为葡萄糖，而葡萄糖与碘反应不会形成蓝色化合物， 结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。 （二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制 1.原理：根据淀粉酶水解淀粉生成还原性糖，还原糖与3，5 -二硝基水杨酸 共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。 2.酶活定义：在一定pH5.5、37℃条件下，每分钟内从底物溶液中分解释 放1μmol葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位U/g。 酶活计算公式：酶活（U/g）=A×5×K×N×1000/（T×W） A:样品的OD值(平均值) K:标准曲线的斜率 N:稀释倍数5:0.2毫升反应液转换为1毫升体积 T:反应时间（min）1000:转换因子1mmol=1000μmol W:葡萄糖的分子量（180.2g/mol） 3绘制标准曲线 ①先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波 长下分别测定它们的吸光度A。 ②以A为横坐标，浓度c为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标 准曲线。 ③然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲 线上找出对应的被测溶液浓度或含量 三、器材
菌种筛选方法 在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。 1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化 反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图5.6.1。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图5.6.1 平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。 1) 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。 2) 变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。 3) 透明圈法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就会形成透明圈，透明圈的大小反映了菌落利用此物质的能力。在培养基中掺入可溶性淀粉、酪素或CaCO3可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或产酸能力的大小。 4) 生长圈法利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，若待分离的菌在缺乏上述营养物的条件下，能合成该营养物，或能分泌酶将该营养物的前体转化成营养物，那么，在这些菌的周围就会有工具菌生长，形成环绕菌落生长的生长圈。该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌。工具菌往往都是对应的营养缺陷型菌株。