HUAZHONG AGRICULTURAL
UNIVERSITY
烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生的研究Research on Callus Induction and Plant
Regeneration of Tobacco Leaves
姓名: 黄金波
CANDIDATE：Huang-Jin Bo
学号: 2012304200510
STUDENT ID：2012304200510
课程: 植物细胞工程实验CURRICULUM：Plant Cell Engineering Experiment
班级: MAJOR: 生技1201班Biotechnology 1201
指导老师：SUPERVISOR：柳俊齐迎春陈浩
Liu-Jun Qi-Ying Chun Chen-Hao
中国武汉
WUHAN，
CHINA
二○一四年十二月DEC, 2014
烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生的研究
黄金波
华中农业大学生命科学技术学院生技1201班
[摘要] [目的]以烟草叶片为材料，通过这次实验，基本掌握植物愈伤组织诱导与植株再
生的原理和方法，熟练掌握相关实验操作技术；另外，通过本次实验，完成烟草植株再生，并对比光照和黑暗等不同方法，对诱导愈伤组织状态和诱导率的影响，进行结果分析。 [方法]在无菌条件下，把烟草叶片剪成1cm2大小的小方块，先通过含0.25mg/L NAA和0.25mg/L BA的MS诱导培养基在光照和黑暗条件下诱导培养；三周后，转接到含0.25mg/L NAA和1.0mg/L BA的MS分化培养基中光照培养；两个月后，观察结果，统计分析。 [结果]诱导培养后，在光照条件下和在黑暗条件下培养的均有67.7%的被污染了；用剩下的33.3%全部接种到分化培养基上培养。结果表明分化率在光照条件下和在黑暗条件下无差别；每个愈伤组织分化芽数在光照条件下明显多于在黑暗条件下诱导；分化芽状态在黑暗和光照条件有一定的区别，分化植株苗在光照和黑暗条件下诱导没有明显区别。 [结论]光照条件和在黑暗条件下诱导可以影响愈伤分化芽数和分化芽状态。
[关键词] 烟草叶片；愈伤组织；细胞工程；分化；诱导；植株再生
Research on Callus Induction and Plant
Regeneration of Tobacco Leaves
Huang-Jin Bo
Huazhong Agriculture University , College of Life Science and Technology ,
Biotechnology 1201
[Abstract] [Objective]Using tobacco leaves as materials, through the experiment, we should
handle the basic principle and method of plant callus induction and plant regeneration，master related experiments’technology; In addition, through this experiment, to complete the tobacco plant regeneration, and compared different methods of callus induction, such as light and dark state, and the effects to the state and induction rate, then analyzing the results. [Method]The tobacco leaf was cut into 1 cm2 size small squares under aseptic conditions. Firstly induced in the MS induction medium with 0.25 mg/L NAA and 0.25 mg/L BA, under the condition of light and dark, respectively; Three weeks later, transferred to MS differentiation medium with 0.25 mg/L NAA and 1.0 mg/L BA culturing under light; Two months later , observing the results, and analyzing the statistics. [Results]After the induction culturing, 67.7% materials were polluted both under the condition of light and dark; rest 33.3% materials were inoculated to the differentiation medium, continuing to cultivate. As a result, it was successfully. The results show that there are no obvious differences between with the light condition and dark condition. Each number of callus bud differentiation under the condition of the light induced significantly more than in the
dark condition; Bud differentiation status have certain difference in dark and light conditions, differentiation of plant seedlings in induced there was no significant difference between light and dark conditions. [Conclusion] the illumination condition and under the condition of dark induction can affect the bud differentiation of callus bud number and status.
[Key Words] Tobacco Leaves；Callus；Cell Engineering Differentiation；Induce；
Plant Regeneration
1.前言
细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学、遗传学、发育生物学等学科的原理和方法，通过某种工程学的手段，在细胞水平或细胞器水平上，按照人们的意愿对细胞进行改造，从而得到目的产物的一门综合科学技术（柳俊等，2011）。近年来，由于包括遗传学、分子生物学、生理学、工程学、生物物理学等学科的快速发展和融合，细胞工程再综合了各大学科的优势以及利用自身的特点后，也得到了极大的发展。
细胞工程技术根据对象分类，可以将其分为植物细胞工程、动物细胞工程和微生物细胞工程。它们之间的原理和方法都是相通的，但是又有微小的区别。植物细胞工程技术的发展源头可以追溯到上世纪初，发展到现在，其实它的应用已经非常的广泛。目前来说，它已被广泛用于医学、能源、制药、农业育种、食品等方面的科学研究和生产应用。下面就主要对动物细胞工程和植物细胞工程技术在生产生活中的一些应用做一些简单的介绍。
1.1动物细胞工程技术及其应用
动物细胞工程主要是应用细胞生物学和工程学的研究手段和原理，通过细胞培养、细胞融合、细胞核移植、胚胎移植、基因转移等技术而发展起来的一门生物技术（叶敏，1984）。目前在细胞工程制药、细胞治疗、干细胞培养、细胞核移植等方面有着非常广泛的应用（李刚等，2002；唐红等，2011；马瑞丽，2007；）。下面就以下几个方面对动物细胞工程技术的一些应用做一些简单的介绍。1.1.1生产单克隆抗体和细胞因子
自1975年英国剑桥大学的科学家利用
动物细胞融合技术首次获得单克隆抗体以来，现在针对各种抗原的单克隆抗体已被广泛应用于生命科学的各个领域，而细胞工程技术的发展对于单克隆抗体的生产无疑是
提供了强大的技术支持。用单克隆抗体可以检测出多种病毒中非常细微的株间差异，尤其在鉴别菌种型及亚型、病毒的变异株以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具
独特优势。这些都是传统血清法或动物免疫法所做不到的，而且利用细胞工程技术生产的单克隆抗体具有灵敏度高、特异性强的特点，所以诊断非常准确，误诊率与传统血
清学手段相比大大降低（唐红，2011）。
不仅如此，近年来的发展也将细胞工程带入了肿瘤诊断的领域，利用生产的特异性单克隆抗体为肿瘤的检测和治疗提供了新
的思路和方法。比如就有这样的报道，有科学家利用单克隆抗体耦联放射性核素，在肿瘤局部产生足够的电离辐射生物学效应，这在治疗卵巢癌的实验与临床研究已取得较
大进展，给卵巢癌特别是术后复发及化疗耐药患者的治疗带来新的希望（吴嘉涵，2009）。
1.1.2 细胞融合技术
细胞融合指在诱导剂或促融剂作用下，两个或两个以上的异源细胞或原生质体相
互接触，进而发融合并形成杂种细胞的现象。细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技
术之一，不仅在农业、工业的应用领域不断扩大，而且在医药领域也取得了开创性的研究成果。这其中其实也主要包括有单克隆技
术（马瑞丽，2007）。但是，不仅是单克隆技术，细胞核移植技术也得到了很好的发展。自从1997年克隆羊多利诞生以来，相继在很多国家都报道出来已经克隆出各种动物，比如说我国的克隆牛、克隆猪、克隆鼠等。
克隆动物的技术最大的发展前景莫过
于将它与转基因生物反应器结合起来，发展为类似于动物工厂的优势杂种细胞用于生
产各种药物。这其中比较成熟的比如有利用转基因动物乳腺作为生物反应器,生产基因
工程人类蛋白质药物，它可以使成本较微生物发酵、动物细胞培养生产基因工程药物大大降低（李刚等，2002）。
1.2植物细胞工程技术及其应用
植物细胞工程是以细胞的全能性和体
细胞分裂的均等性作为理论依据，在细胞水平上对植物进行操作的育种新技术。植物细胞工程包括染色体工程技术、原生质体培养、花药培养、细胞培养与无性系筛选、组织培养与体系胞杂交、器官与胚胎培养、植物脱毒快速繁殖与人工种子生产技术等（李培夫等，2006）。
植物细胞工程技术目前应用十分广泛，其中在作物育种方面的应用报道的最多。下面做些简单的介绍。
1.2.1在植物作物育种中的应用
我们知道，传统的杂交育种在自交5代
以后可以产生一些同质配子结合的纯合植株，需要经6-8代才可选育出新品系。对于
一年一季的植物，这之间需要花费最少5-8
年的时间，甚至更久。而单倍体育种是通过单倍体培养迅速获得纯合二倍体，从而大大缩短了育种年限，有些单倍体育种只需要两年左右的时间就可以得到纯种，为育种提供了极大的方便，而且选出的品种纯种率高（柳成荫，2011；李培夫等，2006）。
目前我国在植物育种中的应用在很多
方面都有建树。比如说在水稻育种、菊花育种、茶树育种、枣树育种等等都有比较深入的研究（王婷婷，2009；白瑞霞,2007; 邝琦,2010; 邱涛涛,2010）。
1.2.2 在农业生产中的应用
在农业生产方面，目前，根据人们的需要已经相继完善和发展了一些具有特色的
植物细胞工程实用技术，包括植物细胞组织培养技术、无性快繁技术及单倍体育种技术等，这些技术在脱毒苗生产、经济植物快繁、植物新品种选育及有用次生代谢产物生产
方面发挥了重要作用。
植物细胞工程在脱毒苗生产方面的应
用主要是想提高农产品的产量和质量。目前主要采用的方法和手段是茎尖剥离的方法。这在我国都已经得到了很大的推广。我国相继在黑龙江、内蒙古、湖南、湖北、河南和甘肃等地建立了生产脱毒种薯的原种场，目前，草莓、苹果、柑橘和葡萄等经济植物都已建立了脱毒苗生产技术（柳成荫，2011）。在其他方面，植物细胞工程在经济植物快繁方面的应用的技术也十分成熟。例如利用植物快繁技术可以使生根困难的名贵花卉大
量繁殖，还可应用于杂合植物材料的快速繁殖，因为很多优良的观赏植物和经济植物都是杂种，一旦有性繁殖，其后代性状会发生分离。而通过无性繁殖则能够保持其杂合性，并可以大量生产性状均一的商品苗。目前已在木薯、马铃薯、咖啡、橡胶、菠萝、甘蔗和苹果等经济植物上建立了植物快繁技术（杨贺，2010）。
1.2.3培养生产次生代谢物
植物细胞培养作为一种有效生产有重
要价值次生代谢物的技术. 与其他方法相比, 应用植物细胞培养技术生产次生代谢
产物具有以下优点:
(1) 有利于研究植物的代谢途径, 还
可以利用某些基因工程手段探索与创造新
的合成路线, 得到价值更高的产品；
(2) 所获得产物可从培养体系内直接
提取,快速、高效的回收与利用, 简化了分
离与纯化步骤；
(3) 节省大量用于种植原料的土地,
以便土地资源得到高效利用；
(4) 能够减少各种环境因素对产物的
影响, 确保在一个限定的生产系统中连续、均匀生产；
(5) 有利于细胞筛选、生物转化，合成新的有效成分；
(6)可以在生物反应器中进行大规模培养, 并通过控制环境条件提高代谢物产量。
目前植物细胞工程技术应用于生产次
生代谢的产物有植物生长过程中产生的一
些酚类、萜类、含氮化合物（罗凯，2007；谷荣辉等，2013）。这其中很多对于我们有着非常重要的商业价值和药用价值。例如，一些重要的植物代谢产物具有抗癌防癌的
药用功效；我国通过细胞培养已经用于商业化生产的次生代谢物主要有小檗碱、紫杉醇等, 具有很好的抗癌、抑菌消炎活性(张玲华，2006)。除了药用外, 许多次生代谢产物还是食品、化工和农业化学的重要原料, 如用作杀虫剂、染料、调味品和香料等。
总之, 次生代谢物不仅是植物生命活
动不可或缺的物质, 而且对人类社会的生
存发展也起着重要的作用。
1.3本次实验的目的及意义
1.3.1 实验目的
通过实验课程，掌握细胞工程的核心技术----无菌操作技术和植物个体再生技术；通过实验课程和理论课程的学习，了解特殊器官离体发生调控技术；最后，通过整个过程，能够初步掌握本领域的实验设计、结果分析及其报告/论文的撰写。
1.3.2 实验意义
随着各个学科之间的深入融合和快速发展，细胞工程技术也得到了极大的发展，尽管动物细胞工程与植物细胞工程在技术和原理上都存在一定的差异，但其核心技术和原理是相通的，都是利用无菌操作技术和细胞的全能性等。所以通过植物细胞工程实验课程，可以让我们对于细胞工程技术有较为深入的了解和掌握，可以使我们学习到相关关键的操作技术。同时，在整个细胞工程实验过程中，我们还学习到了一些其他的技术，比如制作试管花卉、人工种子等，转基因水稻gus报告基因的瞬时表达和检测等等这些实验，使我们对其中一些的实验非常感兴趣。总之，本次实验既让我们学习到了相关的技术和原理，还激起了我们对其中的一些实验极大兴趣。
2.实验材料与方法
2.1实验材料
2.1.1 材料：无菌烟草苗
2.1.2 培养基
诱导培养基：MS培养基+ 0.25mg/L NAA + 0.25mg/L BA + 8g/L琼脂
分化培养基：MS培养基+ 0.25mg/L NAA + 1.0mg/L BA + 8g/L琼脂
2.1.3 其他器材与试剂
器材：天平、电磁炉、烧杯、移液管、三角瓶、灭菌锅、超净工作台、恒温（25℃）培养室等
试剂：蔗糖、琼脂、MS培养基母液等
2.2 实验方法
2.2.1 无菌苗的培养（老师准备）
2.2.2培养基的配置
按配方加入各培养基成份。
i. 取一大的容量瓶，配制1000ml培养基母液备用。1000ml容量瓶中顺序加入已配好的培养基母液（齐迎春等，2014）：大量元素25ml，微量元素5ml，铁盐5ml，维生素5ml，肌醇5ml，甘氨酸5ml；其中，诱导培
养基中再加入0.25mg/L NAA 、 0.25mg/L BA ；分化培养基中加入0.25mg/L NAA 、1.0mg/L BA。
ii．加好后，加水至总体积的3/4左右，加入20g蔗糖搅拌使溶化，用0.5N的NaOH 和0.5N的HCl调整pH至5.8-6.0。
iii. 加入8g琼脂，置于电磁路炉上加热，搅拌使琼脂完全溶化，再用蒸馏水定容至终体积1000ml；继续加热几分钟使充分混均，分装于三角瓶中，每瓶20ml左右；用记号笔表明培养基类型。
iv.灭菌（老师准备）。将分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件：温度121℃，压力1.1kg/cm2，时间20min。灭菌后的培养基置于无菌室保存备用。
2.2.3 愈伤组织的诱导培养
将烟草叶片用剪刀剪成1cm2大小的小立方块，接种于已灭菌含诱导培养基的三角瓶中。每个三角瓶接种4-6片，注意不要太多；另外，在选取叶片时尽量不要选取叶片的顶芽和芽尖，因为顶芽和芽尖的生长素浓度较高，不利于叶片的诱导；并且，将小叶片的四边都剪一下，以使叶片充分接触培养基。全程都在超净工作台中进行，严格控制无菌操作。
每人接种六个三角瓶，三个放于光照条件（实际为每天十二小时光照）下培养，另外三个置于黑暗条件（全天黑暗）下培养。培养三周。
2.2.4 器官的分化培养
在诱导培养基中培养三周后，取出，将污染的材料废弃，将没有污染的材料接种到含分化培养基的三角瓶中，原则上是将原来一个三角瓶中材料转移到对应的一个含分化培养基的三角瓶中。因为光照条件下和黑暗条件下各有两瓶被污染了，而剩下的材料每个三角瓶又长得太多，所以将剩下的光照条件下的材料转移到了两个分化三角瓶中，将黑暗条件下的材料转移到了三个分化三角瓶中。做好光照诱导和黑暗诱导的标记，置于光照下培养两个月左右，观察结果。
3.实验结果与分析
3.1 实验结果统计
3.1.1 烟草叶片诱导结果统计
烟草叶片诱导成愈伤组织统计表
Statistic for callus induction of tobacco leaves
编号Number
接种数
Inoculation
number
愈伤组织形成数
Callus number
诱导率
Induction
rate
是否污染
Pollution
愈伤组织生长状态
Growth state of callus
L1 6 5 83.33% 是被污染，没形成愈伤组织
L2 5 5 100.00% 是被污染，但均形成愈伤组织，2个
长根
L3 6 6 100.00% 否均长根，形成愈伤组织
D1 5 2 40.00% 是被污染，有一个愈伤组织，且长根D2 5 0 0.00% 是被污染，无愈伤组织形成
D3 5 5 100.00% 否2个长根，4个形成愈伤，1个没
长
3.1.2 烟草叶片分化结果统计
烟草叶片愈伤组织植株再生情况统计表
Statistic for callus differentiation and regeneration of tobacco leaves
编号Number 愈伤组
织来源
Source
of
callus
分化率
Differentiation
rate
愈伤分
化芽数
Number
of
sprout
分化芽状态
State of sprout
愈伤植
株数
Number
of
callus
plant
株苗状
态
State
of
plant
污染率
Pollution
是否有
芽
Is
there
大小
Size
密集程度
Density
L1-1 光照100% 23 有++++ +++++ 1 + 0 L1-2 光照100% 18 有++++ +++++ 3 + 0 L1-3 光照100% 27 有++ ++ 2 + 0 L1-4 光照100% 34 有++++ +++++ 0 o 0 L2-1 光照100% 78 有+ +++++ 8 +++ 0 L2-2 光照100% 26 有+ ++++ 3 ++++ 0 D1-1 黑暗100% 13 有+ + 2 ++++ 0 D1-2 黑暗100% 12 有++++ + 3 ++++ 0 D1-3 黑暗100% 16 有++++ + 3 ++ 0 D2-1 黑暗100% 12 有++++ + 3 ++++ 0 D2-2 黑暗100% 25 有++ ++++ 2 ++ 0 D2-3 黑暗100% 11 有++++ + 1 +++++ 0 D3-1 黑暗100% 7 有++++ + 1 ++ 0 D3-2 黑暗100% 16 有++++ + 7 ++++ 0 D3-3 黑暗100% 9 有++ ++ 2 ++ 0 D3-4 黑暗100% 12 有++++ ++++ 0 o 0 说明：i.L表示光照条件下诱导，D表示在黑暗条件下诱导。
ii.对于分化芽状态，在大小一栏，“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”分别表示小、较小、适中、较大、
大；在是否密集一栏，“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”分别表示稀疏、较稀疏、适中、较密集、密
集。对于株苗状态，“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”分别表示短小、较短小、适中、较大、大；o
表示无。
Note：i.L means induced under the condition of light；D means induced under the condition of dark；
ii.For the state of sprout，in the size column，“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”stand for small、less small、
moderate、less large、large，respectively；in the density column，“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”stand
for sparsity、less sparsity、moderate、less denseness、denseness respectively。To the State of plant，“+”、“++”、
“+++”、“++++”、“+++++”stand for small、less small、moderate、less large、large；o means no plant。
3.2 结果分析
对烟草叶片愈伤组织分化再生进行统计分析，以对比光照和黑暗条件下诱导对于植株再生的影响，整理出以下结果。
3.2.1对分化率的影响
由统计分析可知，不管是在光照条件还是在黑暗条件下诱导，最终分化率都达到了100%，所以光照条件和黑暗条件对于愈伤组织分化率没有影响。
3.2.2对愈伤组织分化芽数的影响
由统计数据可知，在光照条件下诱导总计分化芽数为206颗，在黑暗条件下诱导分化芽数为133颗，平均每个愈伤组织分别诱导出的芽数为34.33颗和13.30颗，经方差分析可得：
光照和黑暗对愈伤组织分化芽数的影响方差分析
差异源SS df MS F P-value F crit 行1140.75 1 1140.75 7.638 0.03966 6.607891 列1817.417 5 363.4833 2.434 0.175644 5.050329 误差746.75 5 149.35
总计3704.917 11
根据方差分析可以得到P值小于0.05，所以在光照条件和在黑暗条件下诱导对愈伤组织分化芽数的影响达到了显著差异，在光照条件下诱导比在黑暗条件下诱导更有利于愈伤组织长芽。
3.2.3 对分化芽状态的影响
对于分化芽状态，不管是在光照条件下还是在黑暗条件下诱导都不影响分化出芽，均能达到100%；对于分化芽的大小，同样可以做方差分析，可以得到光照和黑暗条件下诱导对分化芽的大小没有明显区别；对分化芽的密集程度进行分析，结果显示在黑暗条件下分化芽趋向密集生长，在光照条件下诱导相对长得更稀疏。
3.2.4 对形成植株的影响
由统计表进行方差分析可以得到光照条件下诱导和黑暗条件下诱导对形成植株数以及对于株苗形成的状态均没有显著的影响。
3.3 实验结果分析与讨论
在诱导培养实验中，结果有66.7%的材料被污染了，分析其原因有一下几点：①操作不规范，在操作过程中没有严格地按照无菌操作的实验要求来操作可能导致的污染；
②通风橱放置不是特别合理，当时我在的通风橱在门口，在操作过程中背后有来来往往的同学在走动，使染菌，因为跟我一起在一个通风橱一起做的另外两位同学也被污染了；③可能是在接种完后在拿到培养室的过程中染的细菌，因为这个过程中并不是在无菌的环境中完成的。
4.展望
细胞工程技术目前来说都已经相当成熟。随着社会的发展和市场的需求，细胞工程技术必将继续发挥着其独特的优势以更好的应用于生产生活。动物细胞工程技术将继续聚焦于工程制药，例如单克隆抗体生产、细胞移植和核移植技术、细胞分化与干细胞培养、转基因治疗、人造器官移植等，关键是能够找到更加强大、适用于表达培养的细胞系（马瑞丽，2007；胡显文等，2001）；另外，还要在减少动物和细胞使用量、如何减少或根除免疫排斥等方面攻克难关。将来在更多种类的人源化抗体方面的研究和生产也必将依赖于动物细胞工程的发展（胡显
文等，2001）。
植物细胞工程也同样关注制药方面，植
物细胞生物反应器对于提取药物的有效成分有着很大的发展前景（罗凯等，2007），这其中尤其是对于中药的研究和开发。植物细胞工程在制药方面还有待于真正的工业化开发生产，主要的目标也是大量生产一些天然的药物（赵玉平等，2012）。
细胞工程技术的应用前景还包括其他一些方面，比如用于环境保护、作物育种、农业生产等反面都有着非常大的应用前景。相信随着科学技术的发展，细胞工程技术给人类带来的福音也会越来越多。5.致谢
感谢柳俊老师这个学期对我们的辛勤指导，不管是实验课上还是理论课上，您的科学的实验方法、严谨的学习态度、风趣的教学风格对我的学习、生活都有很大的帮助；感谢齐迎春老师给我们的指导和帮助我们认真地准备实验材料；感谢陈浩老师给我们指导转基因水稻的相关实验；感谢各位师兄师姐对我们的指导；感谢我的队友，感谢我班上的所有同学，感谢身边所有人，让我的世界如此的丰富多彩！
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细胞工程是指体外人工培养细胞，通过细胞杂交的方法人为改变细胞的某些生物学特性，加速动物或植物个体繁殖，改良种质或创造生物新品种及获得某些有用物质的过程[1]。植物细胞工程是一门以植物组织培养为基础，具有广泛应用前景和实用价值的生物技术，其理论基础是植物细胞的全能性。植物细胞培养是指可以把植物的胚、胚轴、根、茎、叶、花、果实、种子、花粉或分生组织等任一部分离体培养成为植株；植物细胞杂交是指分离植物体上的细胞后用纤维素酶除去细胞壁，使其变为原生质体，在灭活的仙台病毒或PEG 诱导下促进不同品种的两个细胞完成杂交过程，从而培养为杂种植株[2]。目前，根据人们的需要已经相继完善和发展了一些具有特色的植物细胞工程实用技术，包括植物细胞组织培养技术、无性快繁技术及单倍体育种技术等，这些技术在脱毒苗生产、经济植物快繁、植物新品种选育及有用次生代谢产物生产方面发挥了重要作用[3]。1 植物细胞工程在脱毒苗生产方面的应用 长期进行营养繁殖的农作物及果树、蔬菜等 往往会积累许多病毒和类病毒，病毒和类病毒的感染常导致亲本性状退化，使农产品的产量和质 量明显下降。 植物细胞工程可应用于脱毒苗生产，一般多采用茎尖脱毒的方法，通过茎尖组织培养 可以获得无病毒和类病毒感染的再生苗。如茎尖 脱毒获得的脱番茄斑萎病毒（TSWV ）[4] 、脱黄瓜花叶病毒（CMV ）[5]及脱菊花病毒B （CVB ）[6]的再生苗等。近年来，中国相继出现了许多脱毒试管苗生产工厂，黑龙江、内蒙古、湖南、湖北、河南和甘肃等地都建立了生产脱毒种薯的原种场，脱毒马铃薯已经推广了近30万hm 2，平均增产50%以上。目前，草莓、苹果、柑橘和葡萄等经济植物都已建立了脱毒苗生产技术。2 植物细胞工程在经济植物快繁方面的应用 植物快繁是指利用组织培养技术，将来自优良植株的植物组织或细胞进行离体培养，短期内获得大量遗传性状一致的个体的方法。植物快繁技术在农业上有着广泛的应用，如可以使生根困难的名贵花卉大量繁殖，还可应用于杂合植物材料的快繁，因为很多优良的观赏植物和经济植物 植物生理与生物技术 植物细胞工程在农业生产中的应用 柳成荫，杨洪兵 （青岛农业大学生命科学学院，山东青岛266109） 摘要：介绍了植物细胞工程在脱毒苗生产、经济植物快繁、植物新品种选育及有用次生代谢产物生产方面的应用情况。 关键词：细胞培养；细胞杂交；脱毒苗；生物发生器；育种中图分类号：Q813 文献标识码A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2011.05.003 Application of Plant Cell Engineering in Agricultural Production LIU Cheng-yin,YANG Hong-bing （College of Life Science,Qingdao Agricultural University,Qingdao ，Shandong 266109,China ） Abstract :This article introduced the application of plant cell engineering in production of virus-free seedlings,rapid propagation of economic plants,breeding of new plant variety and production of useful secondary metabolites.Key words:cell culture;cell hybridization;virus-free seedlings;bio-generator;breeding 2011，17（5）：9-11 天津农业科学Tianjin Agricultural Sciences 收稿日期：2011-05-10；修订日期：2011-07-26 基金项目：山东省自然科学基金项目（ZR2010CL019）；青岛农业大学院重点课程建设项目（YZDK1003）作者简介：柳成荫（1989-），男，山东青岛人，在读本科生，从事植物逆境生理研究。通讯作者为杨洪兵。
植物细胞工程知识点清单 （一）植物组织培养 1.理论基础（原理）：细胞全能性 2.全能性概念：具有某生物发育所需全部遗传信息的细胞，都具有发育成完整个体的潜能。 3、过程：外植体—脱分化—愈伤组织—再分化—丛芽、不定根—新植株 4、相关概念及实验注意事项 ①外植体：离体植物器官、组织、细胞 ②愈伤组织：高度液泡化，无固定形态的薄壁细胞。全能性高，分化程度低 ③外植体消毒：70%酒精30s—无菌水冲洗—次氯酸钠30min—无菌水冲洗 ④取材：选取形成层部位 ⑤脱分化：23~26o C，避光 ⑥再分化：将愈伤组织转接到分化培养基，光照下培养 ⑦生长素/ 细胞分裂素：比值高—促进生根；比值低—促进发芽 5、植物组织培养概念：在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官，组织，细胞培养在人工配置的培养基上，诱导其产生愈伤组织，丛芽，最终形成完整的植株。 6、地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。 （二）植物体细胞杂交 1、植物体细胞杂交概念：将不同种的植物细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的过程。 2、过程及注意事项： ①去除细胞壁：酶解法（纤维素酶、果胶酶），获得原生质体 ②原生质体融合方法：物理法（离心、震荡、电刺激）；化学法：聚乙二醇 ③细胞融合成功的标志：杂种细胞再生细胞壁 3、融合结果：获得杂种细胞，进而获得杂种植株。 A细胞+B细胞所得杂种植株遗传物质=A+B 4、成功例子：番茄—马铃薯；烟草—海岛烟草；胡萝卜—羊角芹；白菜—甘蓝 5、优点：克服远缘杂交不亲和障碍 6、局限性：不能按照人的要求表达性状 （三）植物细胞工程应用 1、微型繁殖：可以高效快速地实现种苗的大量繁殖（观赏植物，经济林木，无性繁殖作物） 2、作物脱毒：采用茎尖等分生区组织培养来除去病毒（因为分生区附近的病毒极少或没有） 如：马铃薯；草莓；甘蔗；菠萝、香蕉等经济作物 3、人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经人工薄膜包装得到的种子。优点：完全保持优良品种的遗传特性，不受季节的限制；方便储藏和运输 4、作物新品种培育：单倍体育种 5、突变体利用：在组织培养中会出现突变体，通过从有用的突变体中选育出新品种（如筛选抗病、抗盐、含高蛋白的突变体） 6、细胞产物的生产：通过能够产生对人们有利的产物的细胞进行组织培养，从而让它们能够产生大量的细胞产物。 如：生产人参皂甙，三七，紫草，银杏等。 （定向诱导愈伤组织细胞分化为产生特定物质的细胞，提纯产物）
专题二细胞工程知识点梳理填空 概念：应用__________ 和__________ 的原理和方法，通过___________ 或__________ 上的操作，按照人的意愿来改变细胞内的___________ 或获得____________ 的一门综合科学技术。 分类：根据操作对象不同，可分为___________________ 、________________ 。 一、植物细胞工程 理论基础（原理）____________________ 。 1、概念：具有某种生物____________ 的任何一个细胞，都具有发育成_____________ 的潜能。 全能性表达的难易程度： ____________ > 生殖细胞〉__________________ ; ______________ >动物细胞； 2.在理论上，生物的任何一个细胞都具有__________________________________ ，但在生物的生长发育过程中，细胞并不表现___________ ，而是分化成各种_____________________ 。 3.特定的____________ 条件下，细胞中的基因会有 ________ 地表达出各种 _________ ，分化形成不同的细胞，从而构成生物体的不同________________ 。 （一）植物组织培养技术 植物组织培养：在________ 和________ 的条件下，将_________ 的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的_______ 上，给予适宜的培养条件，诱导其产生 ____________ 、丛芽，最终形成完整植株。 1.操作过程： ①② 外植体---- > A - > B—植物体 图中①_________ ，②_______ , A表示 ______ , B表示 ________ 。 2 .细胞脱分化：已__________ 的细胞经过______ 后，失去其特有的________________ 而转变成未分化细胞的过程。 3.胡萝卜的组织培养实验 1 ）实验原理 植物体的根、茎、叶细胞都具有 ___________ ，在一定的______ 和_____ 等条件下，可以脱分化形成______________ 。将愈伤组织转接到含有不同_______ 成分的培养基上，就可以诱导其再分化生 成胚状体或丛芽，进而发育成_____________________________ 。证明了分化的植物细胞仍具 有_________________________ 。 2）实验步骤 ①将__________ 用自来水充分洗净，削去外皮，并切成段。用酒精棉球擦手 ______________ 。
攀枝花学院 Panzhihua University 植物细胞工程应用及发展前景 院（系）：生物与化学工程学院 专业：生物工程 班级：2009级生物工程 学生姓名：顿茹兰学号:20091020092007
植物细胞工程应用及发展前景 顿茹兰 200910902007 攀枝花学院生物与化学工程学院, 四川攀枝花617000 【摘要】植物细胞工程是一门以植物组织培养为基础,具有广泛应用前景和实用价值的生物技术。目前根据人们的需要已经相继完善和发展了一些具有特色的实用技术,这些技术的发展和应用,使植物细胞工程在人类现生活中的地位更加突出,并发挥着越来越重要的作用。 【关键词】植物细胞工程应用发展前景 植物细胞工程是一门以植物组织培养为基础,具有广泛应用前景和实用价值的生物技术。随着该技术的不断完善和发展,植物细胞工程已经在部分经济植物的育种和繁殖中发挥着十分重要的作用。目前根据人们的需要已经相继完善和发展了一些具有特色的实用技术,包括植物细胞培养技术、无性快繁技术、制备转基因植物、单倍体育种及胚胎培养等[5]。这些技的发展和应用,使得植物细胞工程在人类的现代生活中的地位更加突出,并在经济植物快繁、植物新品种选育和有用次生代谢产物的生产方面发挥了重要的作用。 一、植物细胞工程的概念 植物细胞工程（plant cell engineering）是以植物细胞为基本单位在体外条件下进行培养、繁殖和人为操作，改变细胞的某些生物学特性，从而改良品种加速繁育植物个体或获得有用物质的技术。植物体的细胞中，含有该植物所有的遗传信息。在合适的条件下，一个细胞可以独立发育成完整的植物体。利用细胞的这种全能性，生物学家通过组培来繁殖名贵花卉、消灭果树上的病毒，以及通过对细胞核物质的重新组合，进行植物遗传改造等。 1、植物细胞工程的简要概述 在合适的条件下，一个细胞可以独立发育成完整的植物体。利用细胞的这种
专题2细胞工程 2.1植物细胞工程 2.1.1植物细胞工程的基本技术 课时训练5植物细胞工程的基本技术 1.植物细胞表现出全能性的必要条件是()。 A.给予适宜的营养和外界条件 B.导入其他植物细胞的基因 C.脱离母体后,给予适宜的营养和外界条件 D.将成熟筛管的细胞核移植到去核的卵细胞内 解析:植物细胞全能性是指具有细胞核的高度分化的植物细胞,在离开母体后,在适宜的营养和外界条件下,细胞首先发生脱分化,然后恢复细胞分裂形成愈伤组织,再在一定的诱导因素作用下发生分化,最后形成具有根、茎、叶的完整植株。高度分化的植物细胞的全能性只有在离开母体后才能表现出来。成熟筛管细胞无细胞核,D项错误。B项中,导入其他植物细胞的基因属于基因工程,与细胞的全能性没有必然的联系。 答案:C 2.可以成为植物组织培养条件的是()。 ①CO2②有机物③生长素④细胞分裂素⑤水⑥矿质元素 A.①③⑤⑥ B.②③⑤⑥ C.②③④⑤⑥ D.①②⑤⑥ 解析:植物组织培养的条件是营养物质、激素和其他适宜条件,在愈伤组织形成之前不能进行光合作用,不需要CO2。 答案:C 3.植物体细胞杂交是利用不同物种的两个细胞融合成一个杂种细胞的过程。该过程是指()。 A.不同植物的精子与卵子的融合 B.不同植物原生质体的融合 C.完整的两个体细胞的融合 D.植物花粉细胞的两两融合 解析:植物体细胞杂交是不同植物的原生质体融合为一个杂种细胞的过程。精、卵结合过程为受精作用,花粉细胞不是体细胞。 答案:B 4.在离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中,下列哪一项条件是不需要的?() A.消毒灭菌 B.适宜的温度 C.充足的光照 D.适宜的养料和激素 解析:形成愈伤组织,需要在消毒灭菌条件下进行是肯定的,因为只有在消毒灭菌条件下,才能保证培养出的组织细胞不被感染,否则培养基内将长出许多霉菌,与离体细胞争夺营养与生存空间,不能形成愈伤组织。由于此阶段形成的是愈伤组织,并没有形成具有根、茎、叶的植物体,因此不需要光照。 答案:C 5.不能用于人工诱导原生质体融合的方法是()。
植物细胞工程应用及发展前景学号：110321219 姓名：郑善敏学院：机电工程学院班级：1103212 摘要: 本文主要阐述了植物细胞工程的发展前景及在农业、园林、医药、转基因技术中的应用现状。植物细胞工程是一门以植物组织培养为基础, 具有广泛应用前景和实用价值的生物技术。目前根据人们的需要已经相继完善和发展了一些具有特色的实用技术, 这些技术的发展和应用, 使植物细胞工程在人类现代生活中的地位更加突出, 并发挥着越来越重要的作用。 关键词: 植物细胞工程应用发展前景 1. 植物细胞工程的概念 以植物细胞为基本单位在体外条件下进行培养、繁殖和人为操作，改变细胞的某些生物学特性，从而改良品种加速繁育植物个体或获得有用物质的技术。植物体的细胞中，含有该植物所有的遗传信息。在合适的条件下，一个细胞可以独立发育成完整的植物体。利用细胞的这种全能性，生物学家通过组培来繁殖名贵花卉、消灭果树上的病毒，以及通过对细胞核物质的重新组合，进行植物遗传改造等。 1.1植物细胞工程的简要概述 在合适的条件下，一个细胞可以独立发育成完整的植物体。利用细胞的这种全能性，生物学家通过组培来繁殖名贵花卉、消灭果树上的病毒，以及通过对细胞核物质的重新组合，进行植物遗传改造等。所谓细胞工程，是指以细胞为基本单位进行培养、增殖或按照人们的意愿改造细胞的某些生物学特性，从而创造新的生物和物种，以获得具有经济价值的生物产品。细胞工程根据研究材料的不同，可分为植物细胞工程和动物细胞工程。 1.2植物细胞工程的目的 细胞工程的目的，是得到人们所需要的生物产品。要使已经改造好的细胞产生大量具有经济价值的产物，就必须依靠下游加工过程，也就是我们常说的下游工程。它的作用就是大量培养细胞，并从培养液中分离、精制出有关的生物化工产品。由于植物细胞的高度易碎性，对剪切力的敏感、细胞有去分化和聚集作用，增殖时间长等独特性，使其大规模培养技术明显比微生物和动物细胞的发展缓慢。但通过不懈的努力，现在已经具备在２万升规模的生物反应器中培养烟草细胞的能力。而日本的三井石化也已经在使用750L发酵罐通过培养植物细胞而生产紫草宁，且产量较
精品文档用心整理 人教版高中生物选修三 知识点梳理 ）巩固练习 重点题型（ 常考知识点 植物细胞工程（植物克隆技术） 【学习目标】 1、简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术。 2、体验植物组织培养技术。 3、列举植物细胞工程的实际应用。 【要点梳理】 要点一：克隆——无性繁殖系【植物细胞工程（植物克隆技术）369167克隆】 1.分子水平的克隆: DNA复制很多碱基序列相同的DNA 2.细胞水平的克隆 细胞细胞分裂很多遗传物质相同的细胞 3.个体水平的克隆 组织、器官细胞分裂遗传背景相同的新个体 要点二：植物细胞工程的基本技术 1.细胞的全能性 （1）遗传基础 生物体细胞一般都是由受精卵经有丝分裂形成的，因而都含有生物体的一整套遗传物质，都具有发育成完整 个体的潜能。 （2）不能表现的原因 在生物体上不能表现出其全能性，只能通过细胞分化形成不同的组织、器官，这是因为在特定的环境、激素等的影响下基因选择性表达的结果。 2.植物细胞表现其全能性的条件 （1）脱离母体。 （2）植物组织培养时，培养基中除含有一定的水分、无机盐外，还要添加一定的植物激素（如生长素、细胞分裂素），这有助于愈伤组织分化为不同组织和器官。 （3）在植物组织培养的前期对光照无需求，在后期需要光照条件，这有利于细胞生长、分化。 3．植物组织培养 （1）过程： 在无菌条件下，将植物体的器官或组织片段（如芽、根尖或花药）切下来，放在适当的人工培养基上进行离体培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。这种组织的细胞排列疏松而无规则，是一团无定形的薄壁细胞——愈伤组织。原来已经分化，并且具有一定功能的体细胞（或性细胞）丧失了原有的结构和功能，又重新恢复了分裂功能，叫做细胞的脱分化。将处于脱分化状态的愈伤组织，移植到合适的培养基上继续培养（在适当的光照、温度等条件下）愈伤组织就会重新进行分化，产生出植物的各种组织和器官（如根、茎、叶等），进而发育成一棵完整的植株，这个过程叫做植物细胞的再分化。
2.1.1 植物细胞工程 教学目标 1、简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术 2、列举植物细胞工程的实际应用 3、尝试进行植物组织培养 教学重点 1、植物组织培养的原理和过程 2、植物体细胞杂交的原理 3、植物细胞工程应用的实例 教学难点 植物组织培养的实验 教学过程 复习： 细胞分化： 1、概念：在个体发育过程中，由一种或一个细胞通过增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生 稳定性差异的过程 注意：不改变细胞数目，不改变遗传，增加了细胞种类 2、原因：相同的基因在特定的时间和空间内进行选择性表达的结果 3、特点： ①普遍性：单细胞生物没有细胞分化 ②持久性：细胞分化存在于生物体的整个生命进程中，但在胚胎时期达到最大限度 ③不可逆性：分化的细胞要维持分化后的状态直到死亡 4、结果：产生了不同的组织和器官 5、意义：个体发育的基础（包括细胞分裂和细胞分化） 细胞全能性： 1、概念：已经分化的细胞，仍然具有发育成完整个体的潜能(起点：细胞、组织、器官；终点：完整个体) 举例：壁虎断尾后再生（×）；皮肤烧伤后再生（×）；种子长成幼苗（√）；植物扦插（√）； 受精卵发育成婴儿（√）； 2、物质基础：每个细胞里有该种生物全套的遗传信息（所以单个卵细胞或精子也可发育成完整个体，体现全能性） 3、条件：①离体②营养物质③外界条件 4、发挥顺序 植物细胞》动物细胞 受精卵＞生殖细胞（卵＞精子）＞体细胞 体细胞：分裂能力强的细胞＞分裂能力弱的细胞（分化程度低＞分化程度高） 注意：①受精卵是未分化的细胞，所以全能性最高 ②生殖细胞是分化程度高，全能性也高（特例）
细胞工程：是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞水平或细胞器水平上的操作，按照 人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。 分类：植物细胞工程和动物细胞工程 一、植物组织培养 1、理论基础：植物细胞全能性 2、流程： 相关知识点： ①取材：根尖、茎尖、芽尖等分生组织，分裂能力强，全能性易发挥 ②脱分化（诱导培养基） 实质：使细胞恢复分裂能力 a ．概念：让已经分化的细胞经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转变成未分化的细胞的过程 形式：固体 b ．培养基 无机物：水、无机盐 成分 有机物：氨基酸、维生素、蔗糖 植物激素：生长素和细胞分裂素 注：培养基中加入蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压 另外，脱分化培养基上可加入2,4－D ，促进愈伤组织的产生和生长 c ．条件：黑暗（因为在光照条件下容易分化成维管组织，不利于产生大量的愈伤组织） 无菌（一旦污染，迅速生长的各种杂菌不仅会与培养物争夺营养，而且杂菌会产生大量对培养 ③愈伤组织：排列疏松，高度液泡化的无定形状态的薄壁细胞。（分化程度低，全能性高） ④再分化（分化培养基） 实质：基因的选择性表达 a ．概念：脱分化产生的愈伤组织继续培养又可以重新分化成根或芽等器官的过程 b ．培养基：同脱分化培养基 c ．条件：光照（有利于诱导形成叶绿素） ⑤植物激素的使用对植物组织培养的影响 高→有利于根的形成 a ．使用比例： 低→有利于芽的分化 适中→促进愈伤组织的形成 先生长素后细胞分裂素：有利于细胞分裂，但不分化 b ．使用顺序 先细胞分裂素后生长素：细胞既分裂又分化 同时使用两种激素：分化频率提高 离体的植物细胞、 组织或器官（外植体） 脱分化 已分化 未分化 生长素 细胞分裂素
植物细胞工程综合大实验（一） ——培养基配制和无菌操作 一、实验目的与要求 熟练掌握器皿的洗涤 MS培养基的配制分装 培养基和物品的高压灭菌 实验室的消毒灭菌 植物材料的取材及流水冲洗 无菌操作 材料的培养观察 二、实验原理 植物细胞的全能性。 三、仪器设备与器具 电子天平、移液枪、冰箱、高压锅、超净工作台、 三角瓶、烧杯、容量瓶、培养皿、搪瓷缸、镊子、 解剖刀、酒精灯、试剂瓶、玻璃棒、线绳、pH试纸、封口膜、试管刷、洗涤剂、打火机等。 四、实验材料 彩云阁茎段（用于诱导愈伤组织） 茎节（用于诱导芽） 五、实验方法与步骤 （一）器皿的洗涤
一般器皿 有培养物但未污染的器皿 有培养物且污染的器皿 （二）MS培养基的配制分装 1、MS培养基母液的配制 母液A-F，每组配制A-E 100ml、F 50ml 0.1%升汞的配制 75%酒精的配制 6-BA NAA 2、MS培养基的配制 按每人配制100ml，分5小瓶。 过程如下；每组按1L配制，先取容器内加70%的蒸馏水； 加入蔗糖30g/L；量取母液A-F；加入PGR（自己设计）；用容量瓶定容；用0.1-1N NAOH或HCl调整pH5.6-5.8；每人分100ml；加琼脂粉8g/L；分装到5个小三角瓶中、封口。 （三）培养基和物品的高压灭菌 培养基、无菌水（每组至少5瓶）、空瓶（每组至少2个）、烧杯（每组至少1个）、培养皿（每组至少一套）、接种工具（2套），包好或者分好以备高压灭菌。 高压锅的使用。 （四）实验室的消毒灭菌
75%的酒精擦拭超净工作台内表面，新洁尔灭水进行超净工作台外表面、培养架表面、墙壁及其他房间表面的擦拭。 （五）植物材料的取材及流水冲洗 选取适宜的彩云阁茎节及茎段，切割成适宜大小后放在流水下冲洗。 （六）无菌操作 演示。 （七）材料的培养观察 接种完的材料放在培养室的培养架上进行培养。培养初期每天观察一次，持续1周。之后每2-3天观察一次。 统计指标： 污染率（%）= （污染的外植体个数／接种外植体的总数）×100%。 愈伤组织诱导率（%）= （长愈伤外植体个数／接种外植体总数）×100%。 芽诱导率（%）= （长芽外植体个数／接种外植体的总数）×100%。（八）结果与分析
2.1.1植物细胞工程的基本技术知识点 一、细胞工程的含义及分类： 1、含义：应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞水平或细胞器水平的操作，按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合性科学技术。 （1）原理和方法： 。 （2）操作水平： 水平或 水平 （3）目的：改变细胞内的 或 。 2、种类： 根据操作对象分： 细胞工程和 细胞工程 植物细胞工程包括：植物组织培养、植物体细胞杂交。 动物细胞工程包括：动物细胞培养、动物细胞融合、动物细胞核移植、单克隆抗体技术 二、细胞的全能性： 1、概念：已经分化的细胞，仍具有发育成完整个体的潜能。 2、细胞全能性的原因：一般生物体的每一个细胞都包含该种生物的 。 3、现实表现：在生物的生长发育的过程中，细胞 全能性，而是 。 原因：在特定时间和空间条件下，细胞中的基因会 表达出各种 ，分化形成不同的细胞，从而构成生物体的不同组织和器官。 4、全能性的高低： ①受精卵＞配子＞体细胞 ②植物细胞＞动物细胞（动物细胞核具有全能性） ③具有分裂能力的细胞＞不分裂的细胞 ④分化程度低的细胞＞分化程度高的细胞。 三、植物组织培养技术 （一）过程： 1、原理： 的原理 2、条件：①离体的植物细胞、组织、器官（外植体）。②无菌。③人工配置的培养基（固体培养基，含有琼脂）。④适宜的条件：水、矿物质、有机物。⑤植物激素：生长素（诱导细胞分裂和根的分化）和细胞分裂素（促进细胞分裂和不定芽的分化）。⑥早期避光，后期光照。 3、愈伤组织：由排列疏松、无一定形态、高度液泡化的薄壁细胞组成。 4、脱分化：让 的细胞，经过诱导后，失去其 而转变成 细胞的过程。 5、再分化：愈伤组织在一定的培养条件下，分化出 ，形成完整的小植株。 一定的营养、激素 （ ） 离 体的植物细胞、 组织、器官 愈伤 组 织 完整 植 新植株
HUAZHONG AGRICULTURAL UNIVERSITY 烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生的研究Research on Callus Induction and Plant Regeneration of Tobacco Leaves 姓名: 黄金波 CANDIDATE：Huang-Jin Bo 学号: 2012304200510 STUDENT ID：2012304200510 课程: 植物细胞工程实验CURRICULUM：Plant Cell Engineering Experiment 班级: MAJOR: 生技1201班Biotechnology 1201 指导老师：SUPERVISOR：柳俊齐迎春陈浩 Liu-Jun Qi-Ying Chun Chen-Hao 中国武汉 WUHAN， CHINA
二○一四年十二月DEC, 2014
烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生的研究 黄金波 华中农业大学生命科学技术学院生技1201班 [摘要] [目的]以烟草叶片为材料，通过这次实验，基本掌握植物愈伤组织诱导与植株再 生的原理和方法，熟练掌握相关实验操作技术；另外，通过本次实验，完成烟草植株再生，并对比光照和黑暗等不同方法，对诱导愈伤组织状态和诱导率的影响，进行结果分析。 [方法]在无菌条件下，把烟草叶片剪成1cm2大小的小方块，先通过含0.25mg/L NAA和0.25mg/L BA的MS诱导培养基在光照和黑暗条件下诱导培养；三周后，转接到含0.25mg/L NAA和1.0mg/L BA的MS分化培养基中光照培养；两个月后，观察结果，统计分析。 [结果]诱导培养后，在光照条件下和在黑暗条件下培养的均有67.7%的被污染了；用剩下的33.3%全部接种到分化培养基上培养。结果表明分化率在光照条件下和在黑暗条件下无差别；每个愈伤组织分化芽数在光照条件下明显多于在黑暗条件下诱导；分化芽状态在黑暗和光照条件有一定的区别，分化植株苗在光照和黑暗条件下诱导没有明显区别。 [结论]光照条件和在黑暗条件下诱导可以影响愈伤分化芽数和分化芽状态。 [关键词] 烟草叶片；愈伤组织；细胞工程；分化；诱导；植株再生 Research on Callus Induction and Plant Regeneration of Tobacco Leaves Huang-Jin Bo Huazhong Agriculture University , College of Life Science and Technology , Biotechnology 1201 [Abstract] [Objective]Using tobacco leaves as materials, through the experiment, we should handle the basic principle and method of plant callus induction and plant regeneration，master related experiments’technology; In addition, through this experiment, to complete the tobacco plant regeneration, and compared different methods of callus induction, such as light and dark state, and the effects to the state and induction rate, then analyzing the results. [Method]The tobacco leaf was cut into 1 cm2 size small squares under aseptic conditions. Firstly induced in the MS induction medium with 0.25 mg/L NAA and 0.25 mg/L BA, under the condition of light and dark, respectively; Three weeks later, transferred to MS differentiation medium with 0.25 mg/L NAA and 1.0 mg/L BA culturing under light; Two months later , observing the results, and analyzing the statistics. [Results]After the induction culturing, 67.7% materials were polluted both under the condition of light and dark; rest 33.3% materials were inoculated to the differentiation medium, continuing to cultivate. As a result, it was successfully. The results show that there are no obvious differences between with the light condition and dark condition. Each number of callus bud differentiation under the condition of the light induced significantly more than in the
专题2细胞工程 2.1.2植物细胞工程的实际应用 寄语：世事洞明皆学问，人情练达即文章。 【学习目标】1、理解微型繁殖技术的应用。 2、了解单倍体育种过程和优点。 【课题重点】植物细胞工程应用的实例。 【课题难点】列举植物细胞工程的实际应用。 【学习过程】 一、植物繁殖的新途径 1.微型繁殖 （1）微型繁殖技术：用于优良品种的技术。 （2）特点：①保持优良品种的。 ②高效快速地实现种苗。 （3）实例：20世纪60年代，荷兰的科学家就成功地实现了利用 来培育兰花。 2.作物脱毒 （1）材料：植物的（如）。分生区附近的病毒极少，甚至。 （2）脱毒苗：切取（例如茎尖）进行组织培养获得的。 （3）优点：使农作物。 3.人工种子 （1）概念：一植物组织培养得到的、、顶芽和等为材料，经过人工包装得到的种子。（2）特点：①后代无。 ②不受、和限制。 (3)人工种子的制备，如图人工种子主要由三部分组成，一是胚状体 (分生组织)，它相当于天然种子的胚，是有生命的物质结构；二是 供胚状体维持生命力和保证其在适宜的环境条件下生长发育的人工胚乳； 三是具有保护作用的“人工种皮”。 二、作为新品种的培育 1.单倍体育种 染色体加倍 （1）方法：离体培养植株纯合子植株。 （2）优点：①后代是纯合子，能。②明显缩短了。 2.突变体的利用 （1）产生原因：在植物的组织培养过程中，易受和
（如、等）的影响而。 （2）利用：筛选出对人们有用的，进而培育成。 三、细胞产物的工厂化生产 1.细胞产物种类：、脂肪、糖类、、香料、生物碱等。 2.技术：植物技术。 3.实例：我国利用植物组织培养技术实现了大量生产；另外，三七、紫草和银杏的也都已经实现了工厂化生产。 课堂小结 1.微型繁殖技术 微型繁殖是快速繁殖优良品种的植物组织培养技术，实际上是无性生殖的一种。在繁殖的过程中，细胞进行有丝分裂，因此亲、子代细胞内DNA相同，具有相同的基因，因此能保证亲、子代遗传特性不变。利用这种技术能高效快速实现种苗的大量繁殖。 优点：选材少、培养周期短，繁殖率高，便于自动化管理。 组织培养（微型繁殖）主要是一种无性繁殖。如果培养的是体细胞，得到的植株同亲代基因型完全相同，所得个体能保持母体的一切性状；但如果培养的是生殖细胞，如花药，得到的植株是单倍体，应为有性生殖中的单性生殖。 2.作物脱毒、人工种子与单倍体育种 作物脱毒主要是强调微型繁殖的取材一定是无毒的（如茎尖、根尖），才能繁殖出无毒的幼苗。 人工种子采用的也是微型繁殖的技术，但是只需培育得到胚状体、不定芽、顶芽和腋芽，包上人工种皮就可以形成人工种子。人工种子与微型繁殖得到的幼苗一样能保持亲本的优良性状，另外还可不受气候、季节和地域的限制。胚状体的获取途径：①由已脱分化的外植体直接产生②由愈伤组织产生③由悬浮细胞培养产生。 单倍体育种的优点是后代无性状分离，后代都是纯合子，能够稳定遗传，明显缩短育种年限。应用染色体变异的原理。 【习题巩固A级】 1．植物的微型繁殖技术，是指( ) A．植物体细胞杂交技术B．嫁接C．营养繁殖D．植物组织培养 2．下列育种措施，可以增加植物突变体出现的是( ) A．采用嫁接方法培育苹果新品种 B．将鱼的抗冻蛋白基因导入烟草受精卵中，培育抗冻烟草 C．用紫外线对组织培养中的愈伤组织进行照射
2.1.1植物细胞工程的基本技术 【学习目标】1、简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术。 2、尝试进行植物组织培养。 【学习重点】1、植物组织培养的原理和过程 2、植物体细胞杂交的原则 【学习难点】植物组织培养的实验 课 前 案 读课本，独立完成下列问题 （要求：能准确写出关键词与句，以课本为准） 一、细胞工程 1．概念：应用 和 的原理和方法，通过 或 上的操作，按照人的意愿来改变细胞内的 或获得 的一门综合科学技术。 2．分类：根据操作对象不同，可分为 、 。 二、植物细胞的全能性 1、植物细胞的基本结构包括 、 、 、 。 2、植物细胞主要的增殖方式是 ，细胞分化是指 ，_____________________________________________________________________________原因是 。 3、全能性是指 ，表现为全能性的原因是 。 4．在理论上，生物的任何一个细胞都具有 ，但在生物的生长发育过程中，细胞并不表现 ，而是分化成各种 。 5．特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会有 地表达出各种 ，分化形成 不同的细胞，从而构成生物体的不同 。 三、植物组织培养技术 1．原理：植物细胞具有 ，具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成 的潜能。 2．过程: 离体植物的 ??→ ?脱分化 _ 组织??→ ?再分化幼根和芽或 胚状体 ??→ ?发育 完整植株。 3．细胞脱分化：已 的细胞经过诱导后，失去其特有的 而转变成未分化 细胞的过程。 4．植物组织培养：在 和 的条件下，将 的植物器官、组织、细 胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生 、丛芽，最终形 成完整植株。 四、胡萝卜的组织培养实验 1、实验原理 生物体细胞一般都是由受精卵经过有丝分裂形成的，因而都含有该生物的全套的遗传信息，都 具有发育成完整个体的潜能。因此，植物体的根、茎、叶细胞都具有 ，在一定的营养和激素条件下，可以脱分化形成 。将愈伤组织转接到含有不同激素成分的培养基上，就可以诱导其再分化生成胚状体或丛芽，进而发育成 。 2、实验步骤 ①．将 用自来水充分洗净，削去外皮，并切成段。用酒精棉球擦手 。 ②．在超净工作台(或接种箱)上将胡萝卜段用酒精溶液消毒30s 后，立即用 清洗2～3次，再用 处理30min 后，立即用无菌水清洗2～3次。 ③．用 的滤纸吸去胡萝卜段表面的水分。然后，在 瓷砖上，用无菌的解剖刀将胡萝卜段切成1 cm 厚的横切片，再选取有 的部位，切取1 cm 。左右的小块。 ④．将 接种到培养基上，用锡箔纸封盖瓶口，并用橡皮筋扎紧。然后，在培养瓶上贴上标签，写明材料名称、接种日期和小组号。 ⑤．将接种后的胡萝卜组织块，放在 恒温避光条件下培养。4d 后，检查培养材料的污染情况；14d 后，观察愈伤组织的生长状况。然后，在恒温箱中继续避光培养。在培养过程中，注意定期观察和记录愈伤组织的生长情况。 ⑥．培养一段时间后，将生长良好的 转接到分化培养基上，培养一段时间后，胡萝卜的愈伤组织就可以诱导出 。然后将试管苗移栽到大田，培养成 。 五、植物体细胞杂交技术 1．概念：不同种植物的 ，在一定条件下融合成 ，并把杂种细胞培育成新的 的技术。 2．过程 离体的细胞果胶酶纤维素酶???→ ?不同细胞原生质体--------→原生质体融合 →杂种细胞→杂种植株。 【预习自测】 1、下列细胞的全能性最高的是 ( ) A 、植物的卵细胞 B 、植物的花粉 C 、被子植物的受精卵 D 、被子植物的叶肉细胞 2．下列属于组织培养的是 ( ) A ．花粉培育成单倍体植株 B ．芽发育成枝条 C ．根尖分生区发育成成熟区 D ．未受精的卵细胞发育成个体 3．组织培养的理论根据是 ( ) A ．培养基中营养物质全面 B ．细胞的全能性 C ．细胞的分裂 D ．细胞的分化 4．愈伤组织细胞在一种包含所有必需物质的培养基中培养了几个小时，其中一种化合物具有放射性(氚标记)。当这些细胞被固定后镜检．利用放射自显影技术发现放射性物质集中于细胞核、线粒体和叶绿体。可以肯定标记的化合物是 （ ） A 一种氨基酸 B ．尿嘧啶核苷酸 C ．胸腺嘧啶脱氧核苷酸 D ．葡萄糖
2.1.1植物细胞工程基本技术 【内容与解析】 本节课要学的内容植物细胞工程基本技术指的是植物组织培养，其核心是植物组织培养的原理和过程,由于它还与植物体细胞杂交的原理、植物细胞工程应用的实例等有…紧密的联系,所以在本学科有…重要的地位，。教学的重点是植物组织培养的原理和过程，解决重点的关键是植物组织培养的实验。【教学目标与解析】 1．教学目标 （1）简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术 （2）列举植物细胞工程的实际应用 2．目标解析 （1）简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术就是要学生知道组培过程中的每一个步骤且要明白每个过程中的特点，植物体细胞杂交技术是要学生知道它的定义和如何实现这个过程中的每一步骤。 【问题诊断分析】 在本节课的教学中，学生可能遇到的问题是植物体细胞杂交的原理不理解，产生这一问题的原因是…学生对这类问题的认识尚浅。要解决这一问题，就要…给予学生一定的理论知识，及事例分析。 【教学过程】 问题一：为什么植物的一个花瓣就可以培育出完整的植株呢？ 设计意图：…通过此问题引出植物组织培养 师生活动; 1、什么是细胞的全能性？表现全能性的条件？ 2、为什么运用植物组织培养技术能把植物离体器官、组织或细胞培养成完整植物体？ 3、克隆羊“多莉”的诞生说明了什么？ 4、生物体内的细胞为什么没有表现出全能性，而是分化成不同的组织器官？ 问题二：植物组织培养技术： 问题1．植物组织培养技术的概念是什么？ 问题2．植物组织培养技术的原理是什么？ 问题3．植物组织培养技术通常选用的材料有哪些？ 问题4．植物组织培养的培养基含有哪些成分？ 问题5．分析图2—5，概述植物组织培养技术的基本过程。 问题6．什么是脱分化？什么是再分化？什么是愈伤组织？ 展示马铃薯——番茄杂种植株的图片，根据设想来引出植物体细胞杂交 问题三：植物体细胞杂交技术： 问题1．什么是植物体细胞杂交技术？它具有什么优点？ 问题2．在进行植物体细胞杂交之前，为什么要去除细胞壁？通常用什么方法去除细胞壁？去除细胞壁以后的植物细胞叫什么？ 问题3．怎样诱导两个不同原生质体的融合？原生质体融合完成的标志是什么？这与细胞中哪种细胞器有关？ 问题4．为什么两个原生质体能发生融合，这与细胞膜的什么特性有关？ 问题5．如果两个来源不同的原生质体发生了融合，下一步该做何处理？ 问题6．如何将杂种细胞培育成杂种植株？ 问题7．分析图2—9，概述植物体细胞杂交的基本过程。 1
高中生物选修3植物细胞工程知识点 1.细胞脱分化：就是让已分化的细胞，经过诱导后，失去特有的结构和功能而 转变成未分化细胞的过程。 2.愈伤组织：细胞排列疏松而无规则，高度液泡化的成无定形状态的薄壁细胞 团。 3.外植体：用于植物组织培养的离体器官组织或细胞。 4.具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜 能，也就是说，每个细胞都具有全能性的特点。 5.全能性的原理：细胞具有发育成完整个体所必需的全套基因，而不是全部基 因。 6.全能性表达的标志：已分化的细胞形成完整的个体，若只是形成某种组织器 官，则不能体现全能性。 7.全能性的高低比较： （1）受精卵>生殖细胞>体细胞 （2）体细胞:植物细胞>动物细胞 （3）分化程度低的细胞>分化程度高的细胞 （4）幼嫩细胞>衰老细胞 （5）分裂能力强的细胞>分裂能力弱的细胞 8.外植体经过脱分化形成愈伤组织;愈伤组织经过再分化形成芽和根;芽和根进 而形成植株。 9.脱分化过程进行有丝分裂；再分化过程进行有丝分裂的同时也进行分化。 10.植物组织培养：就是在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、 细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。 11.植物细胞杂交：就是将不同的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞， 并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。目的：获得杂种植物体。用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁；杂交过程的关键：原生质体间的融合；人工诱导的方法：包括物理法和化学法，物理法包括：离心、振动、电激；化学法包括：聚乙二醇。 12.植物细胞杂交的优点： （1）打破了物种之间的生殖隔离，实现了远源杂交。 （2）扩大了遗传重组的范围。 13.微型繁殖技术：把用于繁殖优良品种的植物组织培养技术，叫做植物的微型 繁殖技术。 14.人工种子：就是以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材 料，经过人工薄膜包装得到的种子。 15.作物新品种的培育： （1）单倍体育种（有性生殖）优点：极大地缩短了育种的年限。 （2）突变体的利用优点：能够产生新性状。