粗蛋白测定方法—凯式定氮法
粗蛋白crude protein；crude matter（DM）食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。不仅包括蛋白质这一物质，它涵盖的范围更广，包括含氮的全部物质，及真蛋白质和含氮物（氮化物）。换句话说，粗蛋白是食品、饲料中含氮化合物的总称，食物中以大豆的粗蛋白含量最高，肉类次之。所以说，粗蛋白是一种既包括真蛋白又包括非蛋白的含氮化合物，后者又可能包括游离氨基酸、尿素、硝酸盐和氨等。然而，不同蛋白质的氨基酸组成不同，其氮含量不同，总氮量换算成蛋白质的系数也不同。总之，粗蛋白是食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。我们可以通过粗蛋白测定仪即凯氏定氮仪来测量粗蛋白的含量，测量步骤如：蛋白质含氮量约为16%（这已通过多次试验得出），再用凯氏法测出总氮量，再乘以就可求得粗蛋白的含量。
一、实验原理
蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。这些元素在蛋白质中含量都有一定比例关系，其中含碳50～55%、氢6～8%、氧20～23%、氮15～17%和硫～%。此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。
由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在15～17%，平均值为16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于克蛋白质。所以只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以，就可以计算出样品中的蛋白质含量。含氮有机物与浓硫酸共热，被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，氮进一步与硫酸作用生成硫酸铵。由大分子分解成小分子的过程通常称为”消化”。为了加速消化，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点(290℃→400℃)，加入硫酸铜作为催化剂，过氧化氢作为氧化剂，以促进反应的进行。反应(1)(2)在凯氏烧瓶内完成，反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器及冷凝器三个部分融为一体。由于蒸汽发生器体积小，节省能源，本仪器使用方便，效果良好。
硫酸铵与浓碱作用可游离出氨，借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的H+浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来H+浓度为止，最后根据所用标准酸的量计算出待测物中总氮量。
二、仪器和试剂
1、仪器:消化管或凯氏烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、电炉、100mL 锥形瓶、100mL 量筒、表面皿、酸式滴定管、小漏斗、玻璃珠等。
2、试剂:
（1）血清或卵清蛋白等其他含蛋白质样品；
（2）消化液：30%过氧化氢、硫酸与水的比例为3∶2∶1，临用时配制；
（3）催化剂：硫酸铜(CuSO45H2O)与硫酸钾(K2SO4)以1：3配比研磨混合；
（4）50%氢氧化钠溶液；
（5）2%硼酸溶液;
(6)标准盐酸溶液(约L);
(7)混合指示剂(田氏指示剂)混合指示剂由50mL %甲烯蓝乙醇溶液与%甲基红乙醇溶液混合配成贮于棕色瓶中配用。这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色，变色范围很窄且很灵敏。
三、实验步骤
(一)安装微量凯氏定氮仪
定氮仪由蒸汽发生器、反应室、冷凝管三部分组成。蒸汽发生器包括一个电炉及一个3～5升容积的烧瓶。反应室上边有两个小烧杯，一个供加样，一个盛放碱液。样品和碱液由此可直接到反应室中。反应室中心有一长玻璃管，其上端通到反应室外层，下端靠近反应室的底部。反应室下端底部有一开口，上有橡皮管和管夹。由此放出反应废液。反应所产生的氮可通过反应室上端细管经冷凝管通入收集瓶中。反应室与冷凝管之间由橡皮管相连。
安装仪器时，将蒸汽发生器垂直地固定在铁架台上，用橡皮管把蒸汽发生器、反应室、冷凝管连接起来。橡皮管连接的部位应在同一水平位置。冷凝管下端与实验台的距离以放得下收集瓶为准。安装完毕后，不得轻易移动，以免仪器损坏。要认真检查整个装置是否漏气，以保证所测结果的准确性。
(二)样品的处理
(1)固体样品:随机取一定量研磨细的样品放入恒重的称量瓶中，置于105℃的烘箱中干燥4h，用坩埚钳将称量瓶取出放入干燥器内，待降至室温后称重，随后继续干燥样品，每干燥1h，称重一次，恒0重即可。
(2)血清样品: 取人血(或猪血)放入离心管中，与冰箱中放置过夜。次日离心
除去血凝块，上层透明清液，即为血清。吸出1mL 血清加到50mL 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀备用。溶液如果显混浊，加少量氯化钠再混匀。
(3)卵清蛋白: 取2g 卵清蛋白溶于%NaCl 溶液并稀释至100mL。如有不溶物，离心取上清液备用。
(三)消化
取5支消化管并编号，在1、2、3号管中各加入精确称取干燥样品(注意：加样品时应直接送入管底，避免沾到管口和管颈上)，加催化剂，混和消化液3mL，在4、5号管中各加相同量的催化剂和混合消化液(若样品是液体时，还要加与样品等体积的蒸馏水)作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。摇匀后，将5支消化管放在通风厨内的远红外消煮炉上消化。先用小火加热煮沸，不久看到消化管内物质变黑，并产生大量泡沫，此时要特别注意，不能让黑色物质上升到消化管的颈部，否则将严重地影响样品测定结果。当混合物停止冒泡，蒸汽与二氧化碳也均匀地放出时，适当加强火力。在消化时，应是全部样品都浸泡在消化液中，如在瓶颈上发现有黑色颗粒，应小心地将消化倾斜振摇，用消化液将它冲洗下来。通常消化需要1～3h(对于那些赖氨酸含量较高的样品需要更长的时间)。待消化液变成褐色后，为了加速消化完成，可将消化管取出，稍冷，加30%过氧化氢溶液1～2滴于管底消化液中，再继续加热。消化完毕，取出消化管冷却至室温。
(四)蒸馏
(1)仪器的洗涤:仪器应先经一般洗涤，再经水蒸气洗涤。目的在于洗去冷凝管中可能残留的氨。对于处于使用状态的仪器(正在测定中的仪器)加样前使蒸汽通过1～2min 即可，对于较长时间未使用的仪器，必须用水蒸气洗涤到吸收蒸汽的硼酸—指示剂混合液中指示剂的颜色合格为止。洗涤方法如下：
取2～3个100mL 锥形瓶，加入10mL 2%硼酸、2滴混合指示剂，用表面皿覆盖备用。现煮沸蒸汽发生器，其中盛有2/3体积的用几滴硫酸酸化过的蒸馏水，样品杯中也加入2/3体积蒸馏水进行水封。关闭夹子使蒸汽通过反应室中的插管进入反应室，再由冷凝管下端逸出。在冷凝管下端放一空烧杯以承受凝集水滴。这样用蒸汽洗涤5min 左右，在冷凝管下口放一个准备好的盛有硼酸—指示剂的锥形瓶，位置倾斜，冷凝管下口应完全浸泡于液体内，继续用蒸汽洗涤1～2min，
观察锥形瓶中的溶液是否基本上不变色，若不变色，则证明蒸馏器内部已洗涤干净。下移锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管口约1cm，继续通蒸汽1min。最后用蒸馏水冲洗冷凝管外口，排废开始。用右手轻提样品杯中棒状玻塞，
使水流入反应室的同时，立即用左手关闭夹子，盖好玻塞。由于反应室外层中蒸汽冷缩、压力降低，反应室内废液通过反应室中插管自动抽到反应室外壳中，再在样品杯中加入2/3体积蒸馏水，如此反复三次既可排尽废液及洗涤液。打开夹子将反应室外壳中积存的废液排出，关闭夹子再使蒸汽通过全套蒸馏仪
1~3min，可进行下一次蒸馏。
(2)样品及空白的蒸馏: 取5个100mL 锥形瓶，分别加入2%硼酸10mL，混合指示剂2滴，溶液呈紫红色，用表面皿覆盖备用。
把消化管中的消化液全部转移到样品杯中，用约2mL 蒸馏水冲洗消化管，重复3次，把洗涤液都倒入样品杯中，打开样品杯的棒状玻塞，将样品放入反应室，用少量蒸馏水冲洗样品杯后也使之流入反应室，盖上玻塞，并在样品杯中加约2/3体积的蒸馏水进行水封。而后将装有硼酸—指示剂的锥形瓶放在冷凝管口下方，打开存放碱液杯下端的夹子，放10mL40%氢氧化钠溶液于反应室后，立即上提锥形瓶，使冷凝管下口浸没在锥形瓶的液面下。反应液沸腾后，锥形瓶中的硼酸—指示剂混合液由紫红色变为绿色，自变色时开始计时，蒸馏3～5min。移动锥形瓶，使硼酸液面离开约1cm，并用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口外面，继续蒸馏1min，用少量蒸馏水冲洗冷凝管下端尖嘴，将锥形瓶取出，用表面皿覆盖以待滴定。排液和洗涤等操作与前面相同。排废洗涤后，可进行下一个样品的蒸馏(每一个样品要同时做三份，以求得准确结果)。待样品和空白消化液蒸馏完毕后，同时进行滴定。
(五)滴定
全部蒸馏完毕后，用L 标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，直至硼酸—指示剂混合液由绿色变回淡葡萄紫色，即为滴定终点，记录所耗HCl 溶液量。
五、计算
样品的总氮含量(%)=(A—B)×××100/1000×C
若测定的样品含氮部分只是蛋白质(如血清)，则：样品中的蛋白质含量(%)=(A
－B)××14××100/1000×C
A－滴定样品用去的盐酸体积(mL)；B－滴定空白用去的盐酸体积(mL)；C－称量样品的量(g)；－盐酸的摩尔浓度(mol/L)；14－氮原子量；－系数L 盐酸相当于氮)。
若样品中除有蛋白质外，尚有其它含氮物质，则样品蛋白质含量的测定要复杂一些。首先，需向样品中加入三氯乙酸，使其最终浓度为5%，然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品的上清液中的含氮量，得出非蛋白氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步折算出蛋白质含量。
蛋白氮=总氮－非蛋白氮
粗蛋白质含量(%)=蛋白氮×
粗纤维测定方法
粗纤维(Crude Fiber,缩写CF，是膳食纤维的旧称，现已不用。）粗纤维是植物细胞壁的主要组成成分，包括纤维素、半纤维素、木质素及角质等成分。吃些含粗纤维的食物可以帮助消化，加强肠胃功能，是有益处的，但是吃多了很明显会因无法消化而造成腹胀。
1、原理
用浓度准确的酸和碱，在特定条件下消煮样品，再用乙醇除去可溶物，经高温灼烧扣除矿物质的量，所余量为粗纤维。它不是一个确切的化学实体，只是在公认强制规定的条件下测出的概略成分，其中以纤维素为主，还有少量半纤维素和木质素。
2、仪器和试剂
试剂
本方法试剂使用分析纯，水为蒸馏水
(1）硫酸溶液（±）mol/L；(2) 氢氧化钠溶液（±）mol/L；(3）酸洗石棉，加5% 氢氧化钠浸泡．在水浴上回流8h以上，再用热水充分洗涤．然后用20%盐酸干燥，在600--700℃下灼烧后．加水使成混悬物，储存于玻璃瓶中；(4) 95% 乙醇；(5）乙醚；（6）正辛醇（防泡剂）。（丙酮、十氢奈）
仪器设备
(1) 实验室用样品粉碎机，分样筛，孔径1mm(18目)；
(2）分析天平，感量0.0001g；
(3）电力热器（电炉），可调节温度；
(4)电热恒温箱（烘箱），可控制温度在130℃，高温炉，可控制温度在
500-600℃。
(5）消煮器；（6）抽滤装置；（7）干燥器。
(8)古氏坩埚[预先加入酸洗石棉悬浮液30ml（内含酸洗石棉-0.3g再抽干，
以石棉厚度均匀，不透光为宜。上下铺两层玻璃纤维有助于过滤〕。
3、操作步骤
①称取1-2g试样，准确0.0002g。用乙醚脱脂（含脂肪大于10% ，必须
脱脂；含脂肪不大于10% ，可不脱脂）。
②放入消煮器，加浓度准确且已沸腾的硫酸溶液100mL和1滴正辛醇，立即加热，应使其在2min内沸腾，调整加热器，使溶液保持微沸，且连续微沸30min，注意保持硫酸浓度不变。试样不应离开溶液沾到瓶壁上。
③随后抽滤，残渣用沸蒸馏水洗至中性后抽干。
④用浓度准确且已沸腾L氢氧化钠溶液将残渣转移至原容器中并加至200mL，同样准确微沸30min。
⑤立即在铺有石棉的古氏坩埚上过滤，先用25mL硫酸溶液洗涤，残渣无损失地转移到坩埚中，用沸蒸馏水洗至中性，再用15mL乙醇洗涤，抽干。
⑥将坩埚放入烘箱，于（130士2) ℃下烘干2h，取出后在干燥器中冷至室温，称重，再于（550士25) ℃高温炉中灼烧30min，取出后于干燥器中冷却至室温后称重。
4、计算公式
中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维测定方法
中性洗涤纤维（neutral detergent fibre）：植物材料或含植物材料的饲料中不溶于中性洗涤剂的那部分物质，包括纤维素、半纤维素、木质素、二氧化硅、角质蛋白和蜡质等，实际上也是组成植物细胞壁的成分。N D F 是利用中性洗涤剂除去饲料中的蛋白质、淀粉、脂肪和糖类而得到纤维。它代表着饲料容积, 起到填充瘤胃的作用, 决定着家畜的饱腹度, 与家畜的自由采食量呈负相关,N D F 越低, 干物质采食量就越大。
酸性洗涤纤维（acid detergent fibre）：植物材料或含有植物材料的饲料中，不溶于酸性洗涤剂的碳水化合物，包括纯纤维素和酸性纤维素两部分。A D F 指N D F 减去半纤维素的成分, 只代表木质化的纤维素, 与消化率呈负相关, 饲草
A D F 增加,家畜的消化率下降。
一、采用范氏（Van Soest）的洗涤纤维分析法测定中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）原理
植物性饲料经中性洗涤剂煮沸处理，不溶解的残渣为中性洗涤纤维，主要为细胞壁成分，其中包括半纤维素、纤维素、木质素和硅酸盐。植物性饲料经酸性洗涤剂处理，剩余的残渣为酸性洗涤纤维，其中包括纤维素、木质素和硅酸盐。酸性洗涤纤维经72%硫酸处理后的残渣为木质素和硅酸盐，从酸性洗涤纤维值中减去72%硫酸处理后的残渣为饲料的纤维素含量。将72%硫酸处理后的残渣灰化，在灰化过程中逸出的部分为酸性洗涤木质素（ADL）的含量。基于Van Soest 原理的纤维素含量分析系统，Fibertec 纤维分析系统。
二、试剂的配制
1、中性洗涤剂（3%十二烷基硫酸钠）：准确称取乙二胺四乙酸二钠（EDTA，C10H14O8Na2·2H2O，分析纯）和硼酸钠（Na2B4O7·10H2O，分析纯）放入烧杯中，加入少量蒸馏水，加热溶解后，再加入30g十二烷基硫酸钠（C12H25NaO4S，分析纯）和10ml乙二醇乙醚（C4H10O2，分析纯）；再称取g无水磷酸氢二钠（Na2HPO4，分析纯）置于另一烧杯中，加入少量蒸馏水微微加热溶解后，倒入前一个烧杯中，在容量瓶中稀释至1000ml，其中pH 值约为~（pH值一般勿需调整）；1N硫酸：量取约ml浓硫酸（分析纯，比重，98%），徐徐加入已装有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后注入1000ml容量瓶定容，标定。
2、酸性洗涤剂（2%十六烷三甲基溴化铵）：称取20g十六烷三甲基溴化铵
（CTAB，分析纯）溶于1000ml1N硫酸，必要时过滤；
三、测定方法
1、中性洗涤纤维测定：
准确称取样品（通过40目筛）置于直筒烧杯中，加入100ml中性洗涤剂和数滴十氢化萘及无水亚硫酸钠。将烧杯套上冷凝装置于电炉上，在5~10min内煮沸，并持续保持微沸60min。煮沸完毕后，取下直筒烧杯，将烧杯中溶液倒入安装在抽滤瓶上的已知重量的玻璃坩埚中进行过滤，将烧杯中的残渣全部移入，并用沸水冲洗玻璃坩埚与残渣，直洗至滤液呈中性为止。用20ml丙酮冲洗二次，抽滤。将玻璃坩埚置于105℃烘箱中烘2h后，在干燥器中冷却30 min称重，直称至恒重。
2、酸性洗涤纤维测定
准确称取样品（通过40目筛）置于直筒烧杯中，加入100 ml酸性洗涤剂和数滴十氢化萘及无水亚硫酸钠。将烧杯套上冷凝装置于电炉上，在5~10min内煮沸，并持续保持微沸60min。趁热用已知重量的玻璃坩埚抽滤，并用沸水反复冲洗玻璃坩埚及残渣至滤液呈中性为止。用少量丙酮冲洗残渣至抽下的丙酮液呈无色为止，并抽净丙酮。将玻璃坩埚置于105℃烘箱中烘2h后，在干燥器中冷却30 min称重，直称至恒重。
酸性洗涤木质素和酸不溶灰分（AIA）测定将酸性洗涤纤维加入72%硫酸，在20℃消化3h后过滤，并冲洗至中性。消化过程中溶解部分为纤维素，不溶解的残渣为酸性洗涤木质素和酸不溶灰分，将残渣烘干并灼烧灰化后即可得出酸性洗涤木质素和酸不溶灰分的含量。
四、结果计算
中性洗涤纤维含量的计算：NDF（%）=（W1－W2）/ W×100
式中：W1—玻璃坩埚和NDF重（g）W2—玻璃坩埚重（g）W—试样重（g）酸性洗涤纤维含量的计算：ADF（%）=（G1－G2）/G×100
式中：G1—玻璃坩埚和ADF重（g）G2—玻璃坩埚重（g）W—试样重（g）半纤维素含量的计算：半纤维素（%）=NDF（%）－ADF（%）
纤维素含量的计算：纤维素=ADF（%）－经72%硫酸处理后的残渣（%）
酸性洗涤木质素（ADL）含量的计算：ADL（%）=残渣（%）－灰分（硅酸盐,%）。
饲草的相对值计算方法
饲草相对值(RFV):RFV于1978年由美国饲草和草原理事会下属的干草市场
特别工作组提出，是目前美国唯一广泛使用(销售、库存及根据草食家畜对饲草质量的要求投料)的饲草质量评定指数，其定义为:相对一特定标准饲草(盛花期苜蓿)某种饲草可消化干物质的采食量。RFV的基础是可消化干物质(DDM)的随意采食量，家畜的RFV是由草食家畜的干物质采食量(Dry Matter Intake,DMI，%Bw)和饲草中的DDM含量(%DM)决定的。由于通常DMI与DDM相关性不高，因此，RFV由对DMI和DDM的预测值计算得到。其关系式如下:
RFV=DMI(%BW)×DDM(%DM)/
其中:DMI(dry matter intake，%BW)为饲草干物质的随意采食量，用占体重(BW)的百分比表示;DDM(digestibled dry matter，%DM)为可消化的干物质，用占干物质(DM)的百分比表示;BW(body weight)为体重。它们的预测模型分别为:
DMI(g/，)=+×(NDF，%DM)一×(NDF，%DM)2(绵羊采食
量预测公式，Mertens，1973),DDM(%DM)=一(%DM),DMI和DDM可经各自特定模型分别由NDF与ADF计算得到，是基于大量动物试验数据所预期的盛花期苜蓿DDM的采食量，指的是占体重的百分比。除以，目的是使得盛花期的苜蓿RFV值为100。RFV值大于100的饲草表明相对于基数100，整体上质量较好。目前，美国饲草和草地协会根据干草市场需要，主要以CP、NDF、ADF、DDM、DMI和RFV作为评定指标，制定了豆科、豆科与禾本科混播饲草的6个等级(表3)。
表豆科、豆科与禾本科混合干草质量标准
Table. Quality standards in hay mixed legumes with grass and legumes
注:RFV为100%的标准干草含41%的ADF和53%的NDF。RFV（相对饲喂价值）=DMI*DDM/；DMI=120/NDF；DDM=；
测定蛋白质含量的三种方法原理 院系：xxx 专业：xxx 姓名：xxx 学号：xxx
测量蛋白质三种方法测定原理 【摘要】了解测量蛋白质三种测定方法的基本原理和优缺点。三种方法为考马斯亮蓝法（Bradford法），Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。 【关键词】蛋白质含量测定考马斯亮蓝法 Folin－酚试剂法紫外吸收法 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一目前常用的有两种古老的经典方法，即Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford 法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍。。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。简单列表为： 考马斯亮蓝法 双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。它是一种蛋白定量法 （一）实验原理 考马斯亮蓝G-250（Coomassie G-250）是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收λmax的位置发生红移，在595nm处有最大吸收值。由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在595nm处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收，因此，可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。 （二）Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这
饲料中粗蛋白的测定方法 本标准参照采用ISO 5983—1979《动物饲料—氮含量的测定和粗蛋白含量计算》1.1 主要内容与适用范围 本标准规定了饲料中粗蛋白含量的测定方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。 1.2 引用标准 GB 601 化学试剂滴定分析（容量分析）用标准溶液的制备 1.3 原理 凯氏法测定试样中的含氮量，即在被催化剂的作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮量转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量，乘以换算系数 6.25，计算出粗蛋白含量。 1.4 试剂 1.4.1 硫酸（GB 625）:化学纯，含量为98%，无氮。 1.4.2 混合催化剂：0.4g 五水硫酸铜，6g 硫酸钾或无水硫酸钠，均为化学纯， 磨碎混匀。 1.4.3 氢氧化钠（GB 629）:化学纯，40%水溶液（M/V）。 1.4.4 硼酸（GB 628）:化学纯，2%水溶液（M/V）。 1.4.5 混合指示剂:甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体 积混合，在阴凉处保存期为三个月。 1.4.6 盐酸标准溶液:邻苯二甲酸氢钾法标定。 147 O.lmol/盐酸（HCL）标准溶液：8.3ml盐酸（GB 622）,分析纯，注入1000ml 蒸馏水中。
1.4.8 0.2 mol/盐酸（HCL）标准溶液：1.67ml盐酸（GB 622），分析纯，注入 1000ml 蒸馏水中。 149 蔗糖（HG 3—1001）:分析纯。 1.4.10 硫酸铵（GB 1396）：分析纯，干燥。 1.4.11硼酸吸收液：1%硼酸水溶液1000ml,加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10ml, 0.1%甲基红乙醇溶液7ml，4%氢氧化钠水溶液0.5ml，混合，置阴凉处保存 期为一个月（全自动程序用）。 1.5 仪器设备 1.5.1 实验室用样品粉碎机或研钵。 1.5.2 分析筛：孔径0.42mm（40目）。 1.5.3 分析天平：感量0.0001g。 1.5.4 消煮炉或电炉。 1.5.5 滴定管：酸式（A 级），10、25mL。 1.5.6 凯氏烧瓶：250mL。 1.5.7 凯氏蒸馏装置：常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式。 1.5.8 锥形瓶：150、250mL。 1.5.9 容量瓶：100mL。 1.5.10 消煮管：250 mL。 1.5.11 定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白测定仪。 1.6 试样的选取和制备 选取具有代表性的试样用四分法缩减至200g，粉碎后全部通过40目筛，装于密封容器中，防止试样成分的变化。 1.7 分析步骤 1.7.1 试样的消煮 称取试样0.5g~1g（含氮量5mg~80mg）准确至0.0002g,无损失地放入凯氏烧
粗蛋白测定方法—凯式定氮法 粗蛋白crude protein；crude matter（DM）食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。不仅包括蛋白质这一物质，它涵盖的范围更广，包括含氮的全部物质，及真蛋白质和含氮物（氮化物）。换句话说，粗蛋白是食品、饲料中含氮化合物的总称，食物中以大豆的粗蛋白含量最高，肉类次之。所以说，粗蛋白是一种既包括真蛋白又包括非蛋白的含氮化合物，后者又可能包括游离氨基酸、尿素、硝酸盐和氨等。然而，不同蛋白质的氨基酸组成不同，其氮含量不同，总氮量换算成蛋白质的系数也不同。总之，粗蛋白是食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。我们可以通过粗蛋白测定仪即凯氏定氮仪来测量粗蛋白的含量，测量步骤如：蛋白质含氮量约为16%（这已通过多次试验得出），再用凯氏法测出总氮量，再乘以 6.25就可求得粗蛋白的含量。 一、实验原理 蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。这些元素在蛋白质中含量都有一定比例关系，其中含碳50～55%、氢6～8%、氧20～23%、氮15～17%和硫0.3～2.5%。此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。 由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在15～17%，平均值为16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于6.25克蛋白质。所以只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以6.25，就可以计算出样品中的蛋白质含量。含氮有机物与浓硫酸共热，被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，氮进一步与硫酸作用生成硫酸铵。由大分子分解成小分子的过程通常称为”消化”。为了加速消化，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点(290℃→400℃)，加入硫酸铜作为催化剂，过氧化氢作为氧化剂，以促进反应的进行。反应(1)(2)在凯氏烧瓶内完成，反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器及冷凝器三个部分融为一体。由于蒸汽发生器体积小，节省能源，本仪器使用方便，效果良好。硫酸铵与浓碱作用可游离出氨，借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的H+浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来H
饲料中粗蛋白的测定 一、实验目的 通过饲料样品中粗蛋白的测定，掌握饲料粗蛋白质含量的测定方法。 二、适用范围 本方法适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。 三、实验原理 凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用浓硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。 四、试剂 （1）硫酸：化学纯，含量为98%，无氮。 （2）混合催化剂：0.4g硫酸铜，5个结晶水；6g硫酸钾或硫酸钠，均为化学纯，磨碎混匀。 （3）氢氧化钠：化学纯，40%水溶液（m/V）。 （4）硼酸：化学纯，2%水溶液（m/V）。 （5）混合指标剂：甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为3个月。 （6）盐酸标准溶液：基准无水碳酸钠法标定； ①0.1mol/L盐酸标准溶液：8.3mL盐酸注入1000ml蒸馏水中。 ②0.02mol/L盐酸标准溶液： 1.67mL盐酸注入1000ml蒸馏水中。 （7）蔗糖：分析纯。 （8）硫酸铵：分析纯，干燥。 （9）硼酸吸收液：1%硼酸水溶液1000mL，加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL，0.1%甲基红乙醇溶液7mL，4%氢氧化钠水溶液0.5mL，混合，置阴凉处保存期为1个月（全自动程序用）。 五、仪器设备
（1）实验室用样品粉碎机或研钵。 （2）分样筛：孔径0.45mm（40目）。 （3）分析天平：感量0.0001g。 （4）消煮炉或电炉。 （5）滴定管：酸式，10、25mL。 （6）凯氏烧瓶：250mL。 （7）凯氏蒸馏装置：常量直接蒸馏式或半微量水蒸汽蒸馏式。 （8）锥形瓶：150、250mL。 （9）容量瓶：100mL。 （10）消煮管：250mL。 （11）定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白质测定仪。六、分析步骤 试样的选取和制备: 选取具有代表性的试样用四分法缩减至200g，粉碎后全部通过40目筛，装于密封容器中，防止试样成分的变化。 （1）仲裁法 ①试样的消煮 称取试样0.5～1g（含氮量5～80mg）准确至0.0002g，放入凯氏烧瓶中，加入6.4g混合催化剂，与试样混合均匀，再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠，将凯氏烧瓶置于电炉上加热，开始小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力（360～410℃）直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，至少2h。 ②氨的蒸馏 A. 常量蒸馏法 将试样消煮液冷却，加入60～100ml蒸馏水，摇匀，冷却。 将蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有25mL硼酸吸收液和2滴混合指示剂的锥形瓶内。然后小心地向凯氏烧瓶中加入50mL氢氧化钠溶液，轻轻摇动凯氏烧瓶，使溶液混匀后再加热蒸馏，直至流出液体体积为100mL。降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，继续蒸馏1～2min，并用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流
粗蛋白测定方法一凯式定氮法 粗蛋白crude protein ；crude matter (DM)食品、饲料中一种蛋白质含量 的度量。不仅包括蛋白质这一物质，它涵盖的范围更广，包括含氮的全部物质，及真蛋白质和含氮物(氮化物)。换句话说，粗蛋白是食品、饲料中含氮化合物的总称，食物中以大豆的粗蛋白含量最高，肉类次之。所以说，粗蛋白是一种既包括真蛋白又包括非蛋白的含氮化合物，后者又可能包括游离氨基酸、尿素、硝酸盐和氨等。然而，不同蛋白质的氨基酸组成不同，其氮含量不同，总氮量换算成蛋白质的系数也不同。总之，粗蛋白是食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。我们可以通过粗蛋白测定仪即凯氏定氮仪来测量粗蛋白的含量，测量步骤如：蛋白质含氮量约为16% (这已通过多次试验得出)，再用凯氏法测 出总氮量，再乘以就可求得粗蛋白的含量。 一、实验原理 蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。这些元素在蛋白质中含量 都有一定比例关系，其中含碳50?55%、氢6?8%、氧20?23%、氮15?17% 和硫?％。此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。 由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在15?17%，平均值为16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于克蛋白质。所以只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以，就可以计算出样品中的蛋白质含量。含氮有机物与浓硫酸共热，被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，氮进一步与硫酸作用生成硫酸铵。 由大分子分解成小分子的过程通常称为”肖化”为了加速消化，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点(290C-400C )，加入硫酸铜作为催化剂，过氧化氢作为氧化剂，以促进反应的进行。反应(1)(2)在凯氏烧瓶内完成，反应(3) 在凯氏蒸馏装置中进行，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器及冷凝器三个部分融为一体。由于蒸汽发生器体积小，节省能源，本仪器使用方便，效果良好。 硫酸铵与浓碱作用可游离出氨，借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢 复溶液中原来H+浓度为止，最后根据所用标准酸的量计算出待测物中总氮量。 二、仪器和试剂
蛋白质含量测定法（一） 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 五种蛋白质测定方法比较
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（Biuret法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材
粗蛋白测定方法 什么是粗蛋白，粗蛋白跟蛋白质又有什么区别，如何测量饲料中粗蛋白的含量，粗蛋白的含量高是不是一定代表着蛋白质的含量高。我想，当你看到这个题目时，肯定会联想到这一连串的问题中的其中几个。那么接下来，我就来详细介绍下粗蛋白的概念、粗蛋白测量 和其他关于饲料中粗蛋白含量的问题。 粗蛋白概念： 粗蛋白不仅包括蛋白质这一物质，它涵盖的范围更广，包括含氮的全部物质。包括真蛋白质和含氮物(氨化物)。食物中粗蛋白含量以大豆最高,肉类次之。粗蛋白英文为crude protein。粗蛋白是食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。由于一般蛋白质中含氮量约为16%，故在概略分析中，常用凯氏(Kjeldahl)法测出总氮量，再乘以系数6.25来求得。实际上，它是食品、饲料中含氮化合物的总称，既包括真蛋白又包括非蛋白含氮化合物，后者又可能包括游离氨基酸、嘌呤、吡啶、尿素、硝酸盐和氨等。此外，不同蛋白质的氨基酸组成不同，其氮含量不同，总氮量换算成蛋白质的系数也不同，如小麦和多数谷物的换算系数为5.80，水稻5.95，大豆5.7，多数食用豆和坚果5.3，牛奶6.38等。粗蛋白只是一个粗 略的概念。 粗蛋白含量： 下面我介绍几种常见物质的粗蛋白含量，仅供大家参考。 薏苡仁粗蛋白含量：13%-14% 棉粕粗蛋白含量：可达40%以上 农大白早糯玉米粗蛋白含量：3.41% 蠡玉168 粗蛋白含量：9.63％ 台湾大青枣粗蛋白含量：0.86% 上文介绍了几种农产品或水果的粗蛋白含量情况，如果需要更多的资料，大 家可自己查阅。 粗蛋白测定： 方法一：最简便也是最快键的方法，就是用蛋白质测定仪来测量。 本标准参照采用ISO 5983—1979 《动物饲料──氮含量的测定和粗蛋白含量 计算》。 1 主题内容与适用范围 本标准规定了饲料中粗蛋白含量的测定方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。 2 引用标准 GB 601 化学试剂滴定分析（容量分析）用标准溶液的制备
饲料中粗蛋白测定方法 YKK standardization office【 YKK5AB- YKK08- YKK2C- YKK18】
饲料中粗蛋白测定方法 1、原理 凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数，计算出粗蛋白含量。 2、试剂 硫酸（GB625）：化学纯，含量为98％，无氮。 混合催化剂：硫酸铜，5个结晶水（GB665），6g硫酸钾（HG3—920）或硫酸钠（HG3—908），均为化学纯，磨碎混匀。 氢氧化钠（GB629）：化学纯，40％水溶液（m/V）。 硼酸（GB628）：化学纯，2％水溶液（m/V）。 混合指示剂：甲基红（HG3—958）％乙醇溶液，溴甲酚绿（HG3—1220）％乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月。 盐酸标准溶液：邻苯二甲酸氢钾法标定，按GB601制备。 2.6.1盐酸标准溶液：c（HCl）=L。盐酸（GB622，分析纯），注入1000mL蒸馏水中。 盐酸标准溶液：c（HCl）=L。盐酸（GB622，分析纯），注入1000mL蒸馏水中。 蔗糖（HG3—1001）：分析纯。 硫酸铵（GB1396）：分析纯，干燥。
硼酸吸收液：1％硼酸水溶液1000mL，加入％溴甲酚绿乙醇溶液10mL，％甲基红乙醇溶液7mL，4％氢氧化钠水溶液，混合，置阴凉处保存期为一个月（全自动程序用）。 3、仪器设备 实验室用样品粉碎机或研钵。 分样筛：孔径（40目）。 分析天平：感量。 消煮炉或电炉。 滴定管：酸式，10、25mL。 凯氏烧瓶：250mL。 凯氏蒸馏装置：半微量水蒸气蒸馏式。 锥形瓶：150、250mL。 容量瓶：100mL。 消煮管：250mL。 定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动。 4、试样的选取和制备 选取具有代表性的试样用四分法缩减至200g，粉碎后全部通过40目筛，装于密封容器中，防止试样成分的变化。 5分析步骤 试样的消煮 称取试样～1g（含氮量5～80mg）准确至，放入凯氏烧瓶中，加入混合催化剂，与试样混合均匀，再加入12mL硫酸和2粒玻璃
分析化学 结课作业 常见蛋白质测定方法的总结与比较 材料科学与技术学院 林化13-1班 刘旺衢 130534106
常见蛋白质测定方法的总结与比较 刘旺衢 （北京林业大学材料科学与技术学院林化13-1班 130534106，10083） 蛋白质是构成生物体细胞组织的重要成分。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源。具有糖类和脂肪不可替代的作用。蛋白质与营养代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质运转、遗传等密切相关,是对人类最重要的物质之一。准确精密的测定蛋白质，关乎人类的生产、生活、生存。目前测定蛋白质含量的方法有多种,如凯氏定氮法、紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法、酚试剂法等几种方法,下面本文将总结比较这五种蛋白质的测定方法。 一、凯氏定氮法 凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准酸滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数计算蛋白质含量，即含氮量*6.25=蛋白含量。 凯氏定氮法具有灵敏度高, 样品用量少，最低可检出0.05mg氮；精密度、准确度高,平行误差一般小于0.5%；应用范围广,适用于一切形态的食品与生物样品；仪器装置简单,试剂廉价的优点。 但也存在操作比较繁琐费时,特别是蒸馏定氮过程的效率低,不利于大批样品的测定；定氮的结果既包括有机氮,也包括无机氮,有机氮中除蛋白氮外,还包括非蛋白氮,测定的结果只能是粗蛋白质的含量；在蛋白质氨基酸构成有差异的
一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1.试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。 （2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2.器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 （三）操作方法 1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。 2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。 三、Folin—酚试剂法（Lowry法） （一）实验原理
蛋白质的测定方法 1、原理 蛋白质是含氮有机化合物，与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后在碱性条件下蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量再乘以换算系数，即位蛋白质含量。 2、试剂 2.1、硫酸铜 2.2、硫酸钾 2.3、硫酸 2.4、2%硼酸溶液 2.5、混合指示剂：1份0.1%的甲基红与3份0.1%溴甲酚绿混合。 2.6、30%氢氧化钠溶液。 2.7、0.1M 盐酸标准溶液。 3、操作步骤 3.1、样品处理：称取0.1g-0.15g 固体样品置于消化管内再加入0.2g 硫酸铜，3g 硫酸钾及10ml 硫酸，然后放入消化装置中设定温度430℃，消化3h 。 3.2、打开蒸馏装置的电源，开启作为冷凝水的自来水龙头。 3.3、将消化好的消化管置于蒸馏装置的托盘上，落下安全门。 3.4、仪器开启后，按“设定”键光标显示在“换算系数”栏目中输入需要换算的数值6.25。 3.5、按“↑”键将光标移入“碱量”栏目中，输入需要的碱量体积50ml 。 3.6、按“↑”键将光标移入“吸收液量”栏目中，输入需要的吸收液量的体积30ml 。 3.7、按“↑”键将光标移入“样品量”栏目中，输入需要的样品量质量。 3.8、按“↑”键将光标移入“样品编号”栏目中，输入样品编号。 3.9、按“RUN ”键开始蒸馏工作，同时保存设定的参数。 4.0、滴定至终点时，仪器自动停止蒸馏。 4.1、按“保存”键返回主界面，再按“数据键”进去查看数据，选择要查看的样品编号，按“确定”键查看结果。 4、结果 ()00.014 6.25100HCl V V C M -???=?粗蛋白含量（%） V －样品消耗盐酸标准溶液的体积，单位ml ； V 0－试剂空白消耗盐酸标准溶液的体积，单位ml ； M －样品质量，单位g ； 0.014－盐酸标准溶液1ml 相当于氮克数； 6.25－氮换算成蛋白质的平均系数；
动物性蛋白质饲料 胃蛋白酶消化率的测定过滤法 参考标准：GB/T 17811-2008 一、适用范围 二、实验原理 已脱过脂的试样,用温热的胃蛋白酶溶液(酶液浓度和用量与酶解试样质量恒定),在恒温、持续不断地振摇或搅拌下消化16小时,过滤分离不溶性残渣,洗涤、干燥,测定残渣的粗蛋白质含量。同时测定空白和脱脂未酶解试样的粗蛋白质含量。 三、实验用品
三、实验内容
取下载有残渣的滤纸(用滤纸将残渣包裹好),无损地移入100烧杯中并置于105℃烘箱内烘干。 5 粗蛋白质 的测定将上述已烘干的滤纸包无损地移入 凯氏烧瓶中，按《FOSS 定氮仪测定 饲料中粗蛋白含量的方法》测定残 渣粗蛋白质的质量分数（ω 2 ）。同 时，称取脱脂风干的样品0.3 g（精 确至0.0002 g），直接按《FOSS 定 氮仪测定饲料中粗蛋白含量的方 法》测定脱脂未酶解的样品中粗蛋 白质的质量分数（ω 1 ）。 测定残渣粗蛋白质时应从每个 样品残渣粗蛋白质中减去酶液 的空白值。 6 计算X- 试样胃蛋白酶消化率，以质 量分数计（%）； ω 1 - 脱脂未酶解的样品中粗蛋 白质的质量分数（%）； ω 2 - 脱脂酶解后的残渣中粗蛋 白质的质量分数（%）。 重复性：1每个试样脱脂风干后取两份试料进行酶解，平行测定残渣粗蛋白质的质量分数，以其算术平均值为测定结果（保留三位有效数字），测定结果的相对≤6%； 2 每个试样脱脂风干后取两份试料进行平行测定粗蛋白质的质量分数，以其算 粗蛋质含量允许相对偏差 >25% 1％ 10% 饲料中粗蛋白测定方法 1、原理 凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数 6.25，计算出粗蛋白含量。 2、试剂 2.1 硫酸（ GB 625）：化学纯，含量为 98％，无氮。 2.2混合催化剂：0.4g硫酸铜，5个结晶水（GB 665）,6g硫酸钾（HG 3 —920）或硫酸钠（ HG 3—908），均为化学纯，磨碎混匀。 2.3 氢氧化钠（ GB 629）：化学纯， 40％水溶液（ m/V）。 2.4 硼酸（ GB 628）：化学纯， 2％水溶液（ m/V）。 2.5 混合指示剂：甲基红（HG 3—958）0.1％乙醇溶液，溴甲酚绿（HG 3—1220） 0.5％乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存 期为三个月。 2.6 盐酸标准溶液：邻苯二甲酸氢钾法标定，按 GB 601制备。 2.6.1 盐酸标准溶液：c （HCl） =0.1mol/L。8.3mL 盐酸（GB 622,分析纯），注入 1 000mL 蒸馏水中。 2.6.2 盐酸标准溶液：c（HCl）=0.02mol/L。1.67mL 盐酸（GB 622, 分析纯），注入 1 000mL 蒸馏水中。 2.7 蔗糖（ HG 3—1001）：分析纯。 2.8 硫酸铵（ GB 1396）：分析纯,干燥。 2.9硼酸吸收液：1%硼酸水溶液1 OOOmL,加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL， 0.1％甲基红乙醇溶液 7mL， 4％氢氧化钠水溶液 0.5mL，混合，置阴凉处保存期为一个月（全自动程序用）。 3、仪器设备 3.1 实验室用样品粉碎机或研钵。 3.2分样筛：孔径0.45mm （40目）。 3.3 分析天平：感量 0.0001g。 3.4 消煮炉或电炉。 3.5 滴定管：酸式， 10、25mL。 3.6 凯氏烧瓶： 250mL。 3.7 凯氏蒸馏装置：半微量水蒸气蒸馏式。 3.8 锥形瓶： 150、250mL。 3.9 容量瓶： 100mL。 3.10 消煮管： 250mL。 3.11 定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动。 4、试样的选取和制备 选取具有代表性的试样用四分法缩减至200g,粉碎后全部通过 40目筛，装于密封容器中，防止试样成分的变化。 几种蛋白质含量测定方法的比较 【摘要】：蛋白质含量测定方法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。目前常 用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法（Bradford），Folin —酚试剂法（Lowry）杜马斯燃烧法。其中Bradford 法灵敏度颇高，比紫外吸收法灵敏10～20 倍,比Biuret法灵敏100 倍以上。凯氏定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。过去Folin—酚试剂法法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以在本公司订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。测定农产品中全氮的凯氏定氮法在许多国家已被杜马斯然烧定氮法所代替，杜马斯燃烧法是基于在高温下(大约 900 ℃），通过控制进氧量、氧化消解样品的原理而进行氮测定的。这6种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，每种方法都有其优缺点，在选择方法时应考虑：⑴实验对测定所要求的灵敏度和精确度；⑵蛋白质的性质；⑶溶液中存在的干扰物质；⑷测定所要花费的时间 【关键词】：凯氏定氮法双缩脲法紫外吸收法考马斯亮蓝法 Folin—酚试剂法杜马斯燃烧法 一、凯氏定氮法 1.1原理 凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4 个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。 1.2特点 凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法样品的最佳消化条件为硫酸铜2.50 g, 硫酸钾0.10 g,浓硫酸4.00 mL；硫酸铜的用量为影响消化时间的主要因素,硫酸钾和浓硫酸用量为第二和第三主要因素；用此最佳条件做实验, 消化时间仅为12 min；与其他硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸用量方法对比,该法所需消化时间最短,试剂用量减少,可降低实验成本,也降低了对环境的污染。 凯氏定氮法适用范围广泛，测定结果准确,重现性好，但操作复杂费时,试剂消耗量大。若采用模块式消化炉代替传统的消化装置, 可同时测定几份样品，节省时间,提高了工作效率，适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。 二、双缩脲法(Biuret ) 2.1原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180 ℃左右加热,放出1 个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以1 个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。 粗蛋白测定仪的原理及功能 粗蛋白测定仪也叫蛋白质测定仪，是专门用来测定蛋白质含量的仪器设备，该仪器的应用可以很好地帮助工作人员解决蛋白质含量测定上的苦恼。半自动测定，不仅测定过程得到了很大程度上的简化，对于目前标准化、严格化的蛋白质测定工作而言更是带来高效与严谨。我们都知道，蛋白质是动植物和人类生存重要的营养成分，其中氮是蛋白质构成的特有元素。根据含氮量可以换算出食品中蛋白质的含量。而采用粗蛋白测定仪以及配套使用的多功能高温消解仪测定蛋白质的含量，与其它测定方法比较，该方法则更省时、省力、数据准确可靠、便于检测分析。 托普云农KDN-08C粗蛋白测定仪也叫蛋白质测定仪，是以国际凯氏定氮法为依据进行设计制造的，仪器的工作原理具体如下：此仪器主机采用蒸气自动控制发生器，在液位稳压器的配合下，使蒸气在数十秒时间内平稳输出供蒸馏器使用。第一执行机关控制下的碱液流经蒸馏管进入定量消化管，使固定在酸液里的氨在碱性条件下挥发。第二执行机关控制下的蒸气对碱性条件的试样再进行蒸馏，使氨彻底挥发，挥发的氨被冷凝器冷凝下来，完全地被固定在硼酸之中，然后用标准酸对其滴定到终点，计算出氮的含量，再乘以换算蛋白质的系数得出蛋白质的含量。 以上就是粗蛋白测定仪的原理介绍，经过近几年的发现，粗蛋白测定仪已经拥有了快速、准确、自动、环保等优势，以快速这点优势为例，以前在对蛋白质检测时，可能需要几个小时，而现在只需要短短的几分钟就能够得到准确的检测结果，并且检测时间的缩短，更是带来了效率的提升，极大的提高了蛋白质实验检测的效率。据了解，目前粗蛋白测定仪已经广泛的应用于食品、肥料、土壤、谷物、化工等诸多行业领域内。 粗蛋白测定仪功能特点： 1、KDN凯氏定氮仪，采用微电脑进行过程控制。 2、自动式蒸馏控制、自动加水、自动水位控制、自动停水。 3、各种安全保护：消化管安全门装置，蒸汽发生器缺水报警，水位检测故障报警。 4、仪器外壳采用特制喷塑钢板，工作区域采用ABS防腐面板，防化学试剂腐蚀和机械损坏表面，耐酸耐碱。 5、水位检测，低水位报警，仪器控制系统故障能自动断电。 6、采用自来水水源，适应性广，对实验要求低。 饲料粗蛋白测定的测定方法 Method for the determination of crude protein in feedstuffs 本标准参照采用ISO5983-1979《动物饲料-氮含量的测定和粗蛋白含量计算》。 1 主题内容与适用范围 本标准规定了饲料中粗蛋白含量的测定方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。 2 引用标准 GB 601 化学试剂滴定分析（容量分析）用标准溶液的制备 3 原理 凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收液吸收后，再用酸滴定。测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白的含量。 4 试剂 4.1硫酸（GB625）:化学纯，含量为98%，无氮。 4.2混合催化剂 0.4g 硫酸铜，5个结晶水（GB665），6g 硫酸钾（HG3-920）或硫酸钠（HG3-908），均为化学纯，磨碎混匀。 4.3 氢氧化钠（GB629）：化学纯，40%水溶液（M/V）。 4.4硼酸（GB628），化学纯，2%水溶液（M/V）。 4.5混合指示剂溶液 甲基红（HG3-958）0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿（HG3-1220）0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月。 4.6盐酸标准溶液，c(HCl)=0.1mol/L、0.02mol/L 配制如下： 移取8.3mL 盐酸(分析纯)，于1000mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。此溶液为c(HCl)=0.1mol/L。 移取1.67mL 盐酸(分析纯)，于1000mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。此溶液为c(HCl)=0.02mol/L。 4.7蔗糖，分析纯。 4.8硫酸铵，分析纯，干燥。 4.9硼酸吸收液 1%硼酸水溶液1000mL，加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL，0.1% 甲基红乙醇溶液7mL，4%氢氧化钠水溶液0.5mL，混合，置阴凉处保存期为一个月(全自动程序用)。 饲料中粗蛋白质的测定 一、目的 掌握饲料中粗蛋白质的测定方法，并测定饲料中粗蛋白质的含量。 二、原理 饲料中纯蛋白质和非蛋白氮总称粗蛋白质。凯氏法的基本原理是用浓H 2SO4在还原性催化剂(CuSO4、K 2SO4、Na 2SO4等)的催化作用下消化饲料样本，使其中的蛋白质和非蛋白氮都变为NH ４＋，NH ４＋立即被浓H 2SO4吸收成为(NH 4)2SO4，(NH 4)2SO4在浓碱作用下放出NH 3，通过蒸馏，氨气随水蒸汽沿冷凝管流入硼酸吸收液被硼酸吸收并与之结合成为四硼酸铵，然后以甲基红溴甲酚绿混合指示剂作指示剂，用标准HCL 溶液滴定，求出氮含量，根据不同饲料再乘以一定的换算系数(通常用6.25计算)，即为粗蛋白质的含量。 上述原理的主要化学反应如下： 2.(NH 4)2SO4+2NaOH →2NH 3↑+2H 2O+Na 2SO4 3.H 3BO ３+NH 3→NH 4H 2BO 3 4.NH 4H 2BO 3+HCL →NH 4CL+H 3BO 3 三、仪器设备 1.实验室用样品粉碎机：40目网筛。 2.分析天平：感量0.0001。 3.电子天平: 感量0.001。 4. 六联电炉: 6×1000W 。 5.改良式半微量凯氏定氮仪(图1)。 6.酸式滴定管:25ml 。 7.凯氏烧瓶:100ml 。 8.烧杯:250ml 。 9.三角瓶:150ml 。 10.容量瓶:100ml 。 11.移液管:10ml。 12.量筒: 10ml 。 13.量筒:25ml。 四、试剂 1.浓H 2SO 4 ：化学纯,含量为98%，无氮。 2.混合催化剂：CuSO 4:Na 2 SO 4 =1:10 化学纯。 3.甲基红—溴甲酚绿混合指示剂：0.1%甲基红酒精溶液与0.5%溴甲酚绿酒精溶液等体积混合，阴凉处保存期不超过三个月。此混合指示剂在碱性溶液中呈蓝色，中性溶液中呈灰色，强酸性溶液中呈红色。在硼酸吸收液中呈暗紫色，在吸收氨的硼酸溶液中呈兰色。 4.2%硼酸吸收液：溶2g化学纯硼酸于100ml蒸馏水中，加甲基红—溴甲酚绿混合批示剂0.4ml。 5.40%饱和NaOH溶液：溶40克氢氧化钠（化学纯）于100ml蒸馏水中。 6.0.05mol/l的HCL标准液：取分析纯浓HCL(比重1.19)4.2ml，加蒸馏水稀释至1000ml，用基准物质标定。将基准无水碳酸钠（分析纯）于270-300℃灼烧40分钟称重，至恒重，准确称取0.013-0.015克，溶于50ml 蒸馏水中，加2滴甲基红—溴甲酚绿混合指示剂，用欲配的0.05mol/lHCL滴定至暗紫红色，记录HCL用量 五、测定步骤 1.样本的消化： 精确称取饲料样本0.5-1g，以硫酸纸卷无损的移入消化管中，再加入5氺硫酸铜0.4克，无水硫酸钾或硫酸钠6克，加10ml浓硫酸后将凯氏烧瓶放于通风橱的电炉子上消化(为防止消化时液体溅失，可再加两粒玻璃珠)。 注意：先低温加热(100-200℃)，注意防止泡沫浮起，待泡沫消失后，提高加热温度(约360-410℃) 至沸腾。消化时要经常转动凯氏烧瓶，如果有黑色炭粒不能全部消化，待烧瓶冷却后，补加少量浓硫酸后继续消化至溶液澄明无黑点并呈蓝绿色为止，移出电炉，放于凯氏消化架上冷却。 2.转移：将冷却的消化液加少许蒸馏水约20ml，摇匀后无损移入100ml容量瓶，再用蒸馏水反复冲洗烧瓶数次，直至消化液全部转入容量瓶中，冷却至室温后以蒸馏水定容至刻度。即为试样分解液。 3.空白实验：另取凯氏烧瓶一个，加入混合催化剂（同前），浓硫酸10ml，同样消化至澄清，冷却后按上述方法转移至容量瓶中，定容至刻度备用。 饲料粗蛋白测定方法 1适用范围 本标准适用于配合饲料和单一饲料。 2原理 凯氏法测定试样含氮量，即在催化剂上，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱并蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，用酸滴定测出氮含量，乘以氮与蛋白质的换算系数6.25计算粗蛋白质量。 此法不能区别蛋白氮和非蛋白氮，只能部分回收硝酸盐和亚硝酸盐等含氮化合物。 3仪器设备 ①实验室用样品粉碎机或研钵。②分析筛：孔径0.45mm(40目)。③分析天平：感量0.0001g。④消煮炉或电炉。⑤滴定管：酸式，25或10ml。⑥凯氏烧瓶：100或500ml。⑦凯氏蒸留装置：常量直接蒸馏式或半微量水蒸汽蒸馏式。⑧锥形瓶：150或250ml。⑨容量瓶：100ml。 4试剂 ①硫酸(GB 625—77)：化学纯。②硫酸铜(GB 665—78)：化学纯。③硫酸钾(HG 3-920-76)：化学纯或硫酸钠(HG 3-908-76)：化学纯。④氢氧化钠(GB 629-77)：化学纯,40 g溶成100 IIll配成40％水溶液(W／V)。⑤硼酸(GB628-78)：分析纯，2 g溶于100ml水配成2％溶液(W／V)。⑥混合指示剂：甲基红(HG 3-958-76)0.1％乙醇溶液，溴甲酚绿(HG 3—1220-79)0.5％乙醇溶液，两溶液等体积混合，阴凉处保存期1个月以内。⑦0.05N盐酸标准溶液(邻苯二甲酸氢钾法标定)：4.2ml 盐酸(GB 622—77)，分析纯，注入l 000 rm蒸留水中。⑧蔗糖(HG 3—1001—76)：分析纯。⑨硫酸铵(GB 1396-78)：分析纯。 5试样的选取和制备 取具有代表性试样，粉碎至40目，用四分法缩减至200g，装于密封容器中，防止试样成分的变化或变质。 液体或膏状粘液试样应注意取样的代表性。用干净的、可放入凯氏烧瓶的小玻璃容器称样。 6测定步骤 实验七蛋白质含量测定 测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。 [目的要求] 1．掌握测定蛋白质的含量基本方法。 2．了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。 一、染料法 [实验原理] 在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。 该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。 [器材] 吸量管；试管；721型分光光度计 [试剂] 1.标准牛血清白蛋白溶液：配成0.1mg/ml的溶液。 2.待测蛋白质溶液。 3.染料溶液：称取考马斯亮蓝G-250 0.1g溶于95%的酒精50ml，再加入85%的浓磷酸100ml，用水稀释至1000ml,混匀备用。 [操作步骤] 按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值（A）。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 2．样品测定： 取1ml样品溶液（约含25～250微克蛋白质），加入染料溶液5ml混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。 二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 [实验原理] 在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为1～10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 [试剂] 1．双缩脲试剂：取CuSO4·5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量蒸馏水溶解，再加2.5mol／L NaOH溶液300ml，KI 1.0g，然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。 2．标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10g/L的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。 [器材] 1．试管：15×150mm 试管7只； 2．1ml，5ml移液管； 3．坐标纸； 4．721分光光度计。 [操作步骤]饲料中粗蛋白测定方法
几种蛋白质含量测定方法的比较
粗蛋白测定仪的原理及功能
饲料中粗蛋白含量的测定
饲料中粗蛋白质的测定
饲料粗蛋白测定方法
蛋白质含量测定方法汇总
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